TECHNIQUES D’ANALYSES MICROBIOLOGIQUES

OBJECTIFS DE CE TP

A la fin du TP de techniques d’analyses microbiologiques, chaque étudiant doit être capable de :

- Caractériser un micro-organisme sur le plan morphologique, biochimique et métabolique

- Faire un antibiogramme en évaluant la sensibilité d’un microorganisme à différents agents antibactériens
- Maitriser l’ensemencement d’une galerie API
- Maitriser la lecture des résultats d’une galerie API

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 SEANCE 1 :

INTRODUCTION

Un germe isolé et purifié peut subir un certain nombre de tests, conduisant à son identification. On réalise a cette
effet, différentes observations portant sur :

- Des caractères morphologique (micro et macroscopiques)

- Des caractères physiologiques
- Des caractères biochimiques et métaboliques
- Des caractères immunologiques

Tous ces tests se placent en fin d’analyse d’un produit (prélèvement pathologique etc…) et ne peuvent se faire
que sur des souches microbiennes isolés et purifiées. Certains tests sont présomptifs, d’autres confirmatifs.
L’association de certains de ces différents tests permet à l’aide d’un tableau dichotomique d’identification, de
donner le genre ou l’espèce à laquelle appartient un microorganisme recherché.

Etape d’une analyse conduisant à l’identification d’un microorganisme:

 Produit à analyser
 Sélection d’un type de microorganisme
- Milieu nutritif électif
- Milieu sélectif
- Milieu nutritif différentiel
- Milieu d’enrichissement
 Isolement et purification sur tube incliné ou en boîte de Pétri
 Identification d’un germe purifié
- Des caractères morphologique (micro et macroscopiques)
- Des caractères physiologiques
- Des caractères biochimiques et métaboliques
- Des caractères immunologiques

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SEANCE 1 : LES CARACTERES MORPHOLOGIQUES DES BACTERIES

I- LES CARACTERES MORPHOLOGIQUES

1. Macroscopiques

L’observation de l’aspect macroscopique des colonies permet d’effectuer une première caractérisation, avec une
orientation possible des résultats au cours de l’identification. Les éléments d’identification macroscopiques sont :

- Pour la gélose solide en boite de pétri et en tube incliné

Forme Punctiforme, circulaire, ondulé, lobé, érodé, filamenteuse, rhizoïde, striation

radiale, striation concentrique, en fuseau dans la masse
Taille Diamètre de la colonie
Couleur Pigmentation de la colonie ou autour de la colonie
Opacité Transparente, translucide, opaque
Hauteur ou coupe Plate, élevé, convexe, en dôme, ombiliquée
de la colonie
Surface Lisse, rugueuse, émoussée, brillante, sèche, poudreuse, plissée.
Consistance Visqueuse, granulaire
Odeur Présente ou absente

- Pour le milieu nutritif liquide

Trouble Intense, faible : pigmentation ou non.
voile Masse cellulaire en surface, collerette
Dépôt Agrégation de cellule au fond du tube
Odeur Caractéristique

2. Microscopiques
Ce sont les premiers tests à réaliser puisqu’ils peuvent décider de la voie d’identification à suivre (par exemple on
ne ferra un test de catalase que pour différencier les bactéries GRAM + et ce test n’est pas effectué pour les
bactéries GRAM - qui ne possèdent pas de catalase).

2.1. Observation à l’état frais

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Ce test permet de déterminer la forme, l’arrangement et la mobilité des bactéries. Il consiste en l’observation
d’une goutte de suspension bactérienne, préparée avec de l’eau physiologique et placée entre lame et lamelle.
L’observation se fait sur microscope ordinaire.

Technique

- Déposer une goutte d'une culture en milieu liquide sur une lame de verre.
- Recouvrir la goutte d'une lamelle couvre objet (la culture ne doit pas déborder les contours de la lamelle).
- Observer immédiatement au microscope (objectif x10 ; x25 et x40)
- Après observation jeter immédiatement la lame dans un bocal contenant de l'eau de Javel.

2.2. Techniques de coloration complexe : Coloration de Gram

C'est une double coloration qui nous permet de connaître la forme, l'arrangement, la pureté ainsi que la nature
biochimique de la paroi des cellules purifiées. Cette coloration permet de classer les bactéries selon leur capacité
à fixer le cristal violet. Celles qui possèdent une enveloppe externe sont décolorées lors du lavage à l’éthanol
(Gram-), alors que celles qui n’en possèdent pas vont retenir le colorant (Gram+).

Technique :

- Préparer et fixer un frottis bactérien à la chaleur du bec Bunsen.

- Recouvrir au violet de Gentiane pendant 1min. Eliminer l'excès par l'eau de robinet
- Ajouter du Lugol : laisser agir pendant 1 minute. Eliminer l'excès par l'eau de robinet
- Traiter à l'alcool 95° pendant 30 secondes, puis rinçage à l'eau de robinet;
- Recolorer à la Fuschine pendant 1 à 2 minutes, rinçage à l'eau de robinet puis séchage.

L'observation se fait à l’objectif x 100 en ajoutant de l'huile à immersion. Les bactéries Gram positif se colorent en
violet alors que les Gram négatif se colorent en rose.

2.3. Techniques de colorations particulières : Coloration des spores : méthode au vert de

Malachite

Le but : Permet la mise en évidence des spores dans les bactéries.

La Technique :

- Faire un frottis des bactéries sur une lame propre et sèche ;

- Sécher le frottis ;

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- Fixer à l’alcool puis rincé à l’eau, ou à la flamme en passant trois fois dans la flamme (ou au-dessus du
bec) ;
- Colorer avec une solution de vert Malachite à 5% pendant 10 minutes ;
- Rincer à l’eau distillée ;
- Colorer à la safranine ou au mercurochrome à 5% pendant 1 minute ;
- Rincer à l’eau distillée ;
- Sécher.
- Observer le frottis à l’immersion (objectif ×100).

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SEANCE 2 : LES CARACTERES PHYSIOLOGIQUES

II – LES CARACTERES PHYSIOLOGIQUES

1. Sensibilité des cellules aux facteurs environnants (en milieu liquide).

1.1. Influence de la température d’incubation
Chaque microorganisme a une température optimale de croissance que l’on peut aisément déterminer, en
incubation à différentes températures (5, 20, 37, 55°C) pendant 2 à 7 jours, les tubes contenant le micro-
organisme à tester.

1.2. Influence de la température sur la cellule = résistance.

Il s’agit ici de mesurer la thermorésistance des cellules, les formes les plus résistantes à la chaleur étant les
spores.
Pour cela, une culture liquide de 24 h (au moins) est traitée à 60°C et à 80°C pendant des temps compris entre 1
et 20 minutes, les tubes traités sont refroidis et 0,1ml est étalé à la surface d’une gélose nutritive.
Seules les formes ayant supporté la chaleur donneront des colonies.

1.3. Influence de la pression osmotique du milieu sur la croissance

Il s’agit ici de mesurer l’effet de la pression osmotique sur la croissance. Par exemple, le staphylocoque supporte
des concentrations en NaCl de 75 g/l.

2. Mobilité (voir ci-dessous)

3. Etude des types respiratoires

3.1. Culture en aérobiose

Les microorganismes aérobies peuvent être cultivés sur milieu gélosé incliné en tubes ou en boites de Pétri.
L’ensemencement s’effectue en surface par stries (ou étalement au râteau dans les boites). La culture se
développe en surface.

- La culture en tubes de milieu liquide bouchés coton cardé ne permet qu’une aérobiose incomplète. On l’utilise
dans le cas où le rendement de culture importe peu.

- Incubation à 37°C pendant 24 heures.

3.2. Culture en anaérobiose

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- Une anaérobiose partielle avec atmosphère enrichie en CO2 peut être facilement réalisée en utilisant un
récipient fermé (dessiccateur) dans lequel on place une bougie allumée à côté des boites de Pétri ou des tubes
de milieux. Le récipient est fermé et la bougie s’éteint au bout de quelques instants en ayant consommé de
l’oxygène et libéré du gaz carbonique.

- Incubation à 37°C pendant 24 heures.

Lecture:

Lorsqu’il y a une croissance, la bactérie est anaérobie.

Remarque : pour la distinction de tous les types respiratoires (aérobie, anaérobie stricts, micro-aérophile, aéro-
anaérobie facultatifs) on ensemence les germes dans la gélose VF (viande foie sans nitrate).

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SEANCE 3 : LES CARACTERES BIOCHIMIQUES ET METABOLIQUES

II. LES CARACTERES BIOCHIMIQUES ET METABOLIQUES

Grâce à cette étude, il est possible de connaître certaines caractéristiques du métabolisme des bactéries isolées.

Les tests biochimiques permettent donc de vérifier si la bactérie a un métabolisme oxydatif ou fermentatif, s’il y a
formation d’un acide à la suite de l’utilisation d’un hydrate de carbone (ex : glucose, arabinose, sorbitol ...), si un
composé particulier est utilisé comme seule source de carbone (ex : citrate, malonate ...), si un acide aminé peut
être transformé (ex : arginine, lysine, tryptophane ...), si un enzyme particulier est présent (ex : oxydase, catalase,
pectinase ...) ou si des molécules complexes sont dégradées (ex : gélatine, amidon ...).

A – Propriétés métaboliques de respiration

1. Mise en évidence de la catalase

Principe:

La catalase est un enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène (H2O2) avec dégagement
d'oxygène selon la réaction suivante.

Technique:

Sur une lame, déposer quelques gouttes d’eau oxygénée (à 10 volumes) ; suspendre alors une colonie (ou une
goutte de bactéries provenant d’un milieu liquide) à l’aide d’une pipette Pasteur (risque de faux positifs avec du
matériel métallique comme l’anse de platine).

Lecture:

Si la catalase est présente ; il y a dégagement gazeux ou effervescence. (Bulle d’O2) : germe Catalase+.

Dans le cas contraire ; Catalase - : pas d'effervescence.

Remarque : vérifier que l’eau oxygénée n’est pas dénaturée.

2. Mise en évidence de l’oxydase = cytochrome oxydase.

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 Principe

Ce test permet la détection de la phénylène-diamine-oxydase ou le cytochrome oxydase; enzyme entrant dans

divers couples d'oxydoréduction. Agissant sur un substrat incolore, cet enzyme entraîne la formation d'une semi-
quinone rouge. Cette dernière, très instable, s'oxyde rapidement pour donner un autre composé avec
développement d’une coloration violette.

La technique

Introduire dans une boite de pétri stérile et vide, un papier filtre stérile, ensuite déposer quelques gouttes de
réactifs diméthyl-para-phénylène diamine. À l'aide d’une pipette pasteur ou d’une anse de platine, prendre la
bactérie à identifier (culture de 18-24heures) et la frotter sur une portion bien définie du papier filtre.

Lecture:

Apparition d'une coloration violette immédiatement : la souche est dite oxydase positive. Si le papier filtre reste
incolore, la souche est dite oxydase négative.

B – Les propriétés métaboliques d’utilisation des sucres et des composés organiques dérivés.

1. Milieux d’études de la voie d’attaque des glucides : Milieu HUGH et LEIFSON

Milieu de type MEVAG : Milieu d'Étude de la Voie d'Attaque des Glucides. Ce sont des géloses molles permettant
permet de déterminer la voie d'attaque des glucides. Ils contiennent un indicateur de pH (bleu de bromothymol,
qui prend une couleur jaune en milieu acide) et un sucre (glucose, arabinose, xylose, etc...). L’utilisation du sucre
est mise en évidence par une acidification du milieu conduisant à un changement de couleur du milieu (Virage de
l’indicateur).

Principe

De l'étude du métabolisme énergétique il découle que un glucide peut être catabolisé par voie respiratoire ou par
voie fermentative. Le milieu de Hugh et Leifson permet de distinguer entre les deux processus. La dégradation
d'un glucide s'accompagne généralement d'une acidification du milieu :

- lors des respirations le glucide est oxydé en CO2, par le dioxygène (ou un autre oxydant minéral) ;

- lors des fermentations le glucide est oxydé en acides, alcools, qui sont libérés dans le milieu qu'ils acidifient
sensiblement. Toutes les voies fermentaires ne sont cependant pas également acidifiantes.

Technique (prévoir 2 tubes contenant le même sucre)

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 - Régénérer au bain-marie bouillant, 5 ml du milieu de Hugh et Leifson contenu dans des tubes à vis.
Laisser refroidir en surfusion (ramener à 45-50°C)
- Ajouter aseptiquement 0,2ml du sucre à tester (solution stérile à 25% de glucose, arabinose, xylose,
maltose, galactose, saccharose, cellobiose ou de trehalose) pour obtenir une concentration finale en
sucre de 1%.
- Agiter (l'agitation doit être douce pour éviter l'entrée d'air) et laisser le milieu se solidifier (en le plassant
sous l'eau froide par exemple).
- Ensemencer par piqûre centrale les deux tubes de Hugh et Leifson, l'un sera recouvert d'une couche
d'environ 1-1.5cm d'épaisseur d’huile de paraffine stérile (tube anaérobie),
- Ne pas revisser à fond le bouchon du tube aérobie (tube sans huile de paraffine).
- Incuber les tubes ensemences et les témoins à l'étuve à 30°C pendant 24 à 48 heures.

Lecture:

Tube fermé anaérobiose : avec Tube aérobiose ; sans paraffine Métabolisme

paraffine
- + Oxydatif
+ + Oxydatif / Fermentatif
+ - Fermentatif

Remarque : il est prudent de prévoir 1 témoin positif et 1 témoin négatif par série (tubes non ensemencés), car
une coloration jaune non significative peut apparaître à la surface des tubes.

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SEANCE 4. LES CARACTERES BIOCHIMIQUES ET METABOLIQUES (suite)

2. Visualisation de la production éventuelle de gaz à partir d’un sucre

Dans un milieu liquide (le bouillon nutritif) contenant du glucose à 1%, additionné 0.004 % de rouge de phénol
(Indicateur colorée). Introduire des petites cloches renversées (cloche de Durham) dans le milieu. Stériliser le
milieu avant d’inoculer. Homogénéiser le milieu sans faire entrer de l’air dans les cloches.

Lecture

La cloche est entrainée vers la surface lorsqu’il y a production de CO2 à partir du substrat carboné. Et le milieu
vire au rouge après utilisation du sucre et acidification du milieu.

Exemples : Milieu au vert brillant pour les coliformes et milieu MRS pour étude du caractère hétéro-fermentaire
des bactéries lactiques.

3. Étude des différentes voies fermentatives intermédiaires : Production d’acide et d’acétoïne =

milieu de Clark et Lubs

Principe

Cette étude permet d’effectuer une différenciation entre la fermentation des acides mixtes (réaction rouge de
méthyle : RM) et butylène glycolique (réaction Voges-Proskauer, VP). Ces deux réactions ont un intérêt différent,
mais elles peuvent être effectuées sur le même milieu et le plus souvent, se vérifiant mutuellement, une souche à
RM+ est habituellement VP- et vice versa. Les tests se déroulent en fin de croissance.

Réaction au rouge de méthyle : elle consiste à mettre en évidence l’acidification finale d’un milieu glucosé par la
fermentation du glucose, cette acidification provoque le virage du rouge de méthyle (rouge à un pH ≤ 5; jaune pH
≥ 5.8).

Réaction de Voges-Proskauer (Production d’acétoïne) : certaines bactéries sont capables de produire de

l’acétyl-méthyl carbinol, soit à partir de deux molécules d’acide pyruvique, soit, le plus souvent au cours de la
fermentation de 2-3 butylène glycolique.

En présence d’une base forte l’acétoïne donne une coloration rouge au milieu oxygéné (oxydation en diacétyle).

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Le diacétyle formé réagit avec le groupement guanidine de α-naphtol pour donner un composé rouge.

Technique :

Une colonie de la souche à étudier est ensemencée sur le milieu Clark et Lubs puis incuber à 30°C pendant 24 à
48 heures.

3.1. Test RM = test au rouge de méthyle pour la production d’acides

- Prélever 2 ml du milieu de Clark et Lubs incubé 4 jours à 37°C.
- Ajouter 2 gouttes de rouge de méthyle (0,5% dans l’alcool à 60°).

Lecture

Si le milieu prend une teinte rouge : RM+ le milieu a été acidifié

Si le milieu prend une teinte jaune : RM – le milieu a un pH supérieur ou égal à 4,6.

3.2. Le test VP : Réaction de VOSGES-PROSKAUER pour la production d’acétoïne

- Prélever 1 ml du milieu Clark et Lubs incubé 2 jours à 37°C
- Ajouter 0,5 ml d’alpha-naphtol (6% dans l’alcool à 60°)
- Ajouter 1 ml de NaOH 16%.
- Agiter et laisser reposer 10 minutes.

Lecture

Si le milieu devient violet en surface = VP+ il y a eu production d’acétoïne

Si le milieu reste incolore = VP- pas d’acétoïne formée

3. Utilisation des composés organiques intervenant dans le métabolisme des sucres

- Test d’utilisation du Citrate sur milieu de SIMMONS (milieu synthétiques)
Le citrate est le premier composé du cycle de Krebs. On met en évidence dans le milieu, l’utilisation du citrate
comme seule source de carbone. S’il est utilisé, le milieu s’alcalinise.

Principe

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Le citrate est le premier composé du cycle de Krebs. On met en évidence dans le milieu, l’utilisation du citrate
comme seule source de carbone. Seules les bactéries possédant une enzyme citrate perméase seront donc
capables de se développer sur ce milieu.

L'utilisation de citrate provoque l'alcalinisation du milieu.

Technique

- On prélève à l’öse une colonie toujours à partir d’un milieu gélosé,

- On fait une suspension dans l’eau distillé stérile
- On ensemence la pente du milieu citrate Simmons contenu dans un tube à vis incliné, en faisant une strie
longitudinale en surface au moyen d’une anse. Les tubes sont légèrement fermés (bouchon peu vissée)
- L'incubation se fait à 37°C pendant 1 à 5 jours. L’observation a lieu chaque jour.

Remarque : on inocule à partir d’un milieu gélosé pour éviter d’apporter des substances nutritives au milieu
synthétiques que constitue le milieu de SIMMONS

Lecture

La croissance de la bactérie sur le milieu indique que cette dernière possède du citrate Perméase. Donc, le milieu
s’alcalinise et devient bleu si le citrate est utilisé.

C – Les propriétés métaboliques de fermentation des glucides

1. Fermentation du glucose et du lactose – milieu de KLIGLER

Ce milieu est employé pour la recherche des bactéries fermentatives du glucose et du lactose (entérobactéries en
particulier). Le principe est basé sur l’utilisation préférentielle du glucose avant utilisation éventuelle du lactose ou
des peptones, bien que le glucose soit en faible quantité.

On y mesure également la production d’hydrogène sulfure (H2S) et la production de gaz dues aux fermentations

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 Technique

A l’aide de l’öse en fil droit, ensemencer en stries la surface inclinée. Terminer l’ensemencement en faisant une
piqûre centrale dans le culot. Placer les tubes 24 h à 37°C (bouchon peu vissé).

Lecture

Dans le culot (en anaérobiose relative) le glucose est toujours attaqué par voie fermentaire et bien qu’il
soit en proportion faible son attaque entraine une acidification importante, avec ou non production de gaz.
Culot jaune (l’indication de pH vire au jaune) et s’il y a dégagement de CO 2 lors de la fermentation =
bulles de gaz dans le culot.
Sur la pente (aérobiose), le glucose est attaqué surtout par voie oxydative. L’acidification produite sera
donc faible, d’autant que la quantité de glucose présente dans le milieu est faible.

- Si la bactérie est lactose -, la dégradation des acides aminés très active, et entrainant la formation de
produits alcalins, va neutraliser la pente qui, après 24h d’incubation, apparait rouge

- Si la bactérie est lactose +, elle oxyde et fermente la quantité importante de lactose présente dans le
milieu et l’acidifie suffisamment pour que l’alcalinité due au métabolisme protéique n’interfère pas en 24h.
la pente apparaîtra jaune

Des points ou des zones noires peuvent apparaître, elles sont dues à l’utilisation du thiosulfate qui, transmé en
H2S réagit avec le citrate ferrique pour donner du sulfate de fer noir (FeS).

2. Fermentation du mannitol : milieu mannitol-mobilité-Nitrate

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Technique

A l’aide d’un fil droit, on ensemence par piqure centrale une gélose molle (milieu MMN) coulée en tube droit. Le
tube est ensuite incubé à 37°C pendant 24h.

Le milieu est acidifié et jaunit si le mannitol est fermenté.

Ce milieu semi-solide (gélose molle à 5%) permet de coupler la capacité d’une bactérie à fermenter le mannitol à
celle de sa mobilité. Les germes mobiles diffusent à partir de la piqure d’ensemencement et créent un trouble
dans tout le milieu. Les germes immobiles se développent le long de la piqure centrale.

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SEANCE 5. LES CARACTERES BIOCHIMIQUES ET METABOLIQUES (suite)

D – mise en évidence du métabolisme protéique

1. Action des protéases

Une protéase hydrolyse les protéines ou les peptides de façon plus ou moins spécifique en libérant des acides
aminés. On peut mettre en évidence cette protéolyse en utilisant des substrats protéiques tels que la gélatine ou
la caséine.

1.1. hydrolyse de la gélatine

Les bactéries qui ont une activité protéolytiques forte, produisent en général une gélatinase. La gélatinase ou
collagénase est une protéase qui hydrolyse le collagène en acides aminés ou en peptides.

L'hydrolyse ou la liquéfaction de gélatine est montrée par un test dans lequel l'organisme se développe dans un
milieu nutritif solidifié par la gélatine.

La technique

Un milieu à la gélatine est préparé, stériliser à l’autoclave et réparti dans les tubes à essais.

- Ensemencer le milieu par piqure centrale après refroidissement et incuber pendant 24-48h à 30°C.
- Enlever les tubes de gélatine nutritive de l'incubateur et les placer dans le réfrigérateur à 4°C pendant 30
minutes ou dans un bain de glace pendant 3 à 5 minutes.
- Notifier si la surface du milieu est liquide ou gel. Si la gélatine nutritive est liquide, ceci indique que la
gélatine a été hydrolysée par la bactérie. Si aucune hydrolyse ne se produisait, le milieu demeurera un
gel.

1.2. Hydrolyse de la caséine

La caséine est un mélange des phosphoprotéines (un polymère complexe des acides aminés essentiels)
trouvées en lait de vache jusqu'au degré environ de 2,5% en poids. Il existe en lait comme sel hydrosoluble de
calcium d'une phosphoprotéine et peut être hydrolysée par une série d'enzymes appelées caséinase.

La technique

Mélanger 1 g d'agar suspendu dans 50 ml d’H2O au lait écrémé en poudre de 5 g suspendu dans 50 ml d’H2O
pour faire 100 ml "agar de lait écrémé" ou utiliser une gélose nutritive mélangée à la caséine 1%.

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Autoclave et couler les boites.

- Couler le milieu stérile dans une boîte de Pétri

- Laisser solidifie
- Inoculer la surface du milieu avec une strie d'inoculum
- Incuber les boites inversées à 30°C pour 48 h

Lecture

Des halos claires apparaissent au bout de 24 h d’incubation et sont visibles autour des colonies : bactéries
caséinase-positives.

2. Récherche de l’uréase

Principe:

Toutes les bactéries hydrolysent l'urée grâce à la réaction suivante

Seule, une uréase très active aboutit finalement à la réaction :

Le CO2 et le NH3 se combinent en donnant le carbonate d'ammonium:

Le carbonate d'ammonium entraine l’alcalinisation du milieu que l’on peut mettre en évidence à l’aide d’un
indicateur au rouge de phénol.

Technique:

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Dans les tubes d’urée agar, et à l’aide d’une anse stérile, on ensemence des colonies de la souche test âgée de
24h, on incube à 30°C pendant 24 heures.

Lecture:

La lecture s’effectue comme suit :

- L’uréase est positive s’il y a virage de couleur du jaune vers le rouge violacé ou vers le rose rouge.
- L’uréase est dite négative s’il n’y a pas de changement de couleur.

3. Recherche de l’hydrogène sulfureux (H2S)

Les acides aminés soufrés sont catabolisés en H2S. On peut le mettre en évidence sur le milieu KLIGLER (cf. ci-
dessus C.1.)

4. Recherche des décarboxylases : Lysine décarboxylase (LDC), Ornithine décarboxylase (ODC) et

Arginine dihydrolase (ADH)

Principe:

Les décarboxylases ou carboxylases, scindent les acides aminés entraînant la formation de l'amine
correspondant avec la libération de CO2 suivant la réaction :

Il s'agit d'enzymes induites dont la synthèse est favorisée par un pH acide (pH =3.5-5.5) et des conditions
d'anaérobiose.

Les décarboxylases sont:

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Technique:

Le test est réalisé avec le milieu Möeller réparti dans 4 tubes à hémolyse différents:

- le premier tube constitue le témoin. Il contient essentiellement du glucose en petite quantité et du pourpre
de bromocrésol comme indicateur de pH.
- les trois autres tubes contiennent en plus du milieu témoins, un des trois acides aminés suivants :
Arginine, Lysine ou Ornithine.
- après ensemencement, 1ml d’huile de paraffine stérile est ajouté dans chaque tube et le tout sera incubé
à 30°C pendant 24 à 48h.

La lecture:

la réaction est positive lorsque le témoin vire au jaune (acidification du milieu due à l'utilisation du glucose).
Les tubes contenant l'acide aminé restent violet = phénomène due à l'alcalinisation du milieu :

- utilisation du glucose,
- puis utilisation de la lysine avec décarboxylation par la LDC et libération de cadavérine (base)
la réaction est négative lorsque les tubes contenant l'acide aminé et le témoin virent au jaune = acidification
du milieu
- utilisation du glucose
- Pas utilisation de la lysine

E. Mise en évidence du métabolisme lipidique

1. Recherche de lipase

Technique

Une gélose en boite de Pétri, additionnée de tween 80 à 16ml/l (monoléate de sorbitol), est ensemencée en
piqure (ou par spots) à partir d’une culture en milieu solide de la souche à étudier. Incuber 24-48h à 37°C. Après
incubation, les colonies de souches lipase (+) sont entourées d’un halo opaque formé suite à la précipitation
d’acides gras issus de la lipolyse.

2. Recherche de lécithinase

Principe

La lécithine purifiée étant très coûteuse on utilise comme source de lécithine le jaune d'oeuf, jaune d'œuf qui est
incorporé dans une gélose ordinaire.

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Technique

Faire une strie à la surface du milieu (Gélose Trypticase-Soja additionnée de jaune d'œuf stérile), ou
éventuellement des touches. Incuber pendant 24 h ou plus à 37°C.

Lecture

Après 48 h une zone opaque peu apparaître autour de la colonie, elle est due aux produits insolubles résultant de
l’hydrolyse de la lecithine par les bactéries possédant une lécithinase.

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SEANCE 6 : L’antibiogramme

III - L’antibiogramme :

1. Antibiogramme standard par la méthode des disques

L’antibiogramme définit in vitro la sensibilité des bactéries pathogènes. On utilise largement la méthode des
disques, qui permet de voir le diamètre d’inhibition de croissance autour des disques imprégnés d’antibiotiques.
On définit ainsi un phénotype de résistance naturel ou acquis.

Principe

Le principe de cette méthode très utilisée en microbiologie (antibiogrammes) repose sur la diffusion du composé
antimicrobien en milieu solide, dans une boîte de Pétri, à partir d’un point précis, avec création d’un gradient de
concentration après un certain temps de contact entre le produit et le microorganisme.

L’effet du produit antibactérien sur la cible est apprécié par la mesure d’une zone d’inhibition, et en fonction du
diamètre d’inhibition la souche bactérienne sera qualifiée de sensible, d’intermédiaire ou de résistante.

Matériel par groupe

- Disques de celluloses imprégnées d’antibiotique. Liste des antibiotiques à utiliser : Pénicilline (Pen) 6μg,
kanamycine (K) 30µg, triméthoprime (Tri) 25µg, gentamycine (GEN) 120μg, érythromycine (Ery) 15µg,
vancomycine (VA) 5mcg, chloramphénicol (Cmp) 30μg, tétracyclines (TE) 30µg, ampicilline (AM) 10µg,
et bacitracine (B) 10µg.
- Boite de pétri + de gélose
- Culture microbienne en suspension
- Râteau ou écouvillons

Technique

Préparation de l’inoculum :
- A partir d’une culture jeune de 18 à 24 h, préparer une suspension de 6 à 10 colonies dans 10 ml d’eau
physiologique.
- Ajuster l’opacité équivalente à celle produite par le tube 0,5 de la gamme de Mc Farland
- Réaliser une dilution au 1/100 de la suspension microbienne équivalant à 0,5 Mc Farland. (concentration
de 106 bac/ml ou 106 CFU/ml).

Ensemencement :

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 - Couler la gélose dans une boite de pétri. Laisser prendre en masse
- Prélever 100 µl de la suspension bactrienne, la déposer à la surface de la gélose, l’étaler avec un râteau.
- S’assurer que la surface de la gélose est bien séchée (10 à 15 mn), et y déposer les disques de
celluloses imprégnées d’antibiotique correspondant à l’aide des distributeurs ou à la pince en appuyant
légèrement
- Placer la boite de pétri à basse température +4°C pendant 15 à 30mn afin de permettre aux antibiotiques
de diffuser dans la gélose avant que les bactéries ne commencent à se multiplier
- Retirer la boite du réfrigérateur et la placer dans l’incubateur, à la température optimale de la croissance
du germe à étudier (37 °C) pendent 24 h.

Lectures

L’activité de chaque antibiotique sera appréciée, par le diamètre de l’auréole d’inhibition provoqué autour du
disque.

La sensibilité aux différentes antibiotiques est classée selon le diamètre des zones d’inhibition comme suit : non
sensible (-) pour le diamètre moins de 8 mm ; sensible (+) pour un diamètre entre 9 à 14 mm; très sensible (+ +)
pour un diamètre entre 15 à 19 mm et extrêmement sensible (+++) pour le diamètre plus que 20 mm

2. Détermination des paramètres d’inhibition: CMI, CMB par la macro méthode de dilution en milieu
liquide.
Principe
Il repose sur le virage de la coloration de l’indicateur coloré (rouge phénol) qui passe du rouge au jaune
dû à la libération dans le milieu des métabolites acides issus du métabolisme des bactéries au cours de leur
croissance. En absence de croissance, il n’y a pas de changement de coloration.

Préparation de l’inoculum (voir ci-dessus)

Mode opératoire

2.1. Détermination de la CMI

- Effectuer des dilutions au ½ de la solution mère (10 ml de bouillon TSB + antibiotique + bleue de
bromothymol) dans 5 ml de Bouillon nutritif TSB + bleue de bromothymol contenu dans les tubes à vis.
Pour chaque antibiotique, on obtient ainsi une progression géométrique de raison 2 de premier terme
2,16 mg/mL s’étalant jusqu’à 0,001055 mg/mL.

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 - Ensemencer dans chaque tube, un volume de 500 µl d’inoculum
- Les témoins sont réalisés ainsi qu’il suit :
Témoin négatif : antibiotique à différentes concentrations + bouillon TSB + bleue de bromothymol
Témoin positif : inoculum bactérien + bouillon TSB + bleue de bromothymol sans antibiotique
- Incuber les tubes pendant 24h à 37 °C.

Lecture
Après incubation, le virage du bleue de bromothymol au jaune indique la croissance visible des bactéries, tandis
que la persistance de la coloration verte imdique l’effet antibactérien de l’antibiotique testé. La CMI est
déterminée comme étant la plus petite concentration ayant inhibée toute croissance visible.

2.2. Détermination de la CMB

La CMB est déterminée par subculture.

- Introduire une pipette pasteur stérile dans les milieux de cultures contenus dans des tubes à vis aux
concentrations supérieures ou égales à la CMI
- ensemencer par stries sur milieu gélosé dans les boites de Pétri contenant un milieu neuf (Muller
Hinton).
- incubés les boites de pétrie couvercle vers le bas, pendant 24 heures à 37 °C.

Lecture
La CMB est considérée comme la plus petite concentration d’antibiotique pour laquelle aucune croissance n’est
visible à l’œil nu dans les boites de Pétrie.
Le calcul du rapport CMB/CMI permet de déterminer l’effet bactéricide (CMB/CMI <4) ou bactériostatique
(CMB/CMI ≥ 4) de l’antibiotique testé.

SEANCE 7 : Systèmes d’identifications microbiennes commerciales : La galerie API 20 E

IV - Systèmes d’identifications microbiennes commerciales : La galerie API 20 E

Introduction

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API 20 E est un système standardisé pour l'identification des Enterobacteriaceae et autres bacilles à Gram
négatif, comprenant 21 tests biochimiques miniaturisés, ainsi qu'une base de données.

Principe

La galerie API 20 E comporte 20 microtubes contenant des substrats déshydratés. Les microtubes sont inoculés
avec une suspension bactérienne qui reconstitue les tests. Les réactions produites pendant la période
d'incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs.

La lecture de ces réactions se fait à l'aide du Tableau de Lecture et l'identification est obtenue à l'aide du
Catalogue Analytique ou d'un logiciel d'identification.

Technique
Préparation de la galerie
Réunir fond et couvercle d'une boîte d'incubation et répartir environ 5 ml d'eau dans les alvéoles du fond
pour créer une atmosphère humide.
Inscrire la référence de la souche sur la languette latérale de la boîte. (Ne pas inscrire la référence sur le
couvercle, celui-ci pouvant être déplacé lors de la manipulation)
Retirer la galerie de son emballage individuel et la déposer stérilement dans la boîte d'incubation.

Préparation de l'inoculum
• Prélever une seule colonie bien isolée sur milieu gélosé MH (Utiliser préférentiellement des cultures jeunes de
18 à 24 heures).
• Réaliser une suspension bactérienne dans un tube contenant de l’eau distillé ou de l’eau physiologique stérile
(opacité ou turbidité égale à 0,5 sur l’échelle Mc Farland). Cette suspension doit être utilisée extemporanément.

Inoculation de la galerie

• Remplir tubes et cupules des tests CIT, VP et GEL avec 150µl de la suspension bactérienne.

• Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des autres tests.

• Créer une anaérobiose dans les tests ADH, LDC, ODC, H2S, URE en remplissant leur cupule d'huile de
paraffine.

• Refermer la boîte d'incubation.

• Incuber à 37°C pendant 18-24 heures.

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Lecture et interprétation

Lecture de la galerie
Après incubation, la lecture de la galerie doit se faire en se référant au Tableau de Lecture
Si 3 tests ou plus sont positifs, noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées puis révéler les
tests nécessitant l'addition de réactifs :
- Test TDA : ajouter 1 goutte de réactif TDA. Une couleur marron-rougeâtre indique une réaction positive
à noter sur la fiche de résultats.
- Test IND : ajouter 1 goutte de réactif JAMES. Une couleur rose diffusant dans toute la cupule indique
une réaction positive à noter sur la fiche de résultats.
- Test VP : ajouter 1 goutte des réactifs VP 1 et VP 2. Attendre au minimum 10 minutes. Une couleur rose
ou rouge indique une réaction positive à noter sur la fiche de résultats. Une faible coloration rose
apparaissant après 10 minutes doit être considérée négative.

Remarque : Le test de la recherche de production d’indole doit être réalisé en dernier, car cette réaction libère
des gaz qui risquent d’altérer l’interprétation d’autres tests de la galerie.

Si le nombre de tests positifs avant ajout des réactifs est inférieur à 3 :

- Réincuber la galerie 24 heures de plus sans rajouter les réactifs.
- Révéler les tests nécessitant l'addition de réactifs (voir paragraphe précédent).

Interprétation de la galerie

L'identification est obtenue à partir du profil numérique.

Détermination du profil numérique :

Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et une valeur 1, 2 ou 4 est indiquée pour
chacun. La galerie API 20 E comportant 20 tests, en additionnant à l'intérieur de chaque groupe les valeurs
correspondant à des réactions positives, on obtient 7 chiffres ; la réaction de l'oxydase qui constitue le 21ème test
est affectée de la valeur 4 lorsqu'elle est positive.

Identification :

Elle est réalisée à partir de la base de données.

* à l'aide du Catalogue Analytique : Rechercher le profil numérique dans la liste des profils.

* à l'aide du logiciel d'identification : Entrer manuellement au clavier le profil numérique à 7 chiffres.

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