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L1 – SVT

Travaux Pratiques

Cycle de la matière

Introduction à la microbiologie

Consignes de sécurité :

- Le port de la blouse pendant toute la séance de TP est obligatoire.


- Les blouses sont à manches longues et en coton, pas de matières synthétiques qui
s’enflamment !
- La tenue vestimentaire doit être conforme avec les règles d'hygiène et de sécurité en
laboratoire : éviter les chaussures ouvertes (tongs, sandales, …), protéger les jambes
non couvertes par la blouse (éviter shorts, jupes, …), privilégier les vêtements amples
en coton.
- En cas de doute sur une manipulation, TOUJOURS demander confirmation aux
encadrants.
- Eviter tout comportement agité, irréfléchi ou précipité, et rester attentif aux
expériences en cours autour de soi qui peuvent présenter des risques (soi-même ou
voisins)
- Flammes : ne pas porter de gants à proximité d’une flamme !!!
Faire attention pour ceux et celles qui ont des cheveux longs, les attacher !
- Le port des gants est interdit pour toute phase de rédaction / prise de notes
- Le pipetage à la bouche est strictement interdit !!!
- Pesées : choisir la balance et le contenant en fonction de la masse du produit à peser.
Ne pas faire de grands déplacements d’air autour de la balance pendant la pesée.
- Déchets : suivre les consignes données par les encadrants.
- Chaque binôme ou trinôme est tenu de nettoyer sa paillasse à la fin de chaque
séance.

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TP1 : Présentation des TP et premières manipulations

Les buts de cette séance sont de :

- présenter les objectifs des 3 séances de TP


- expliquer les règles de travail en conditions stériles
- préparer les milieux de cultures que vous allez utiliser pour les TP 2 et 3
- effectuer vos premières manipulations en conditions stériles

Important : lors de ces TP, nous travaillerons avec une souche non virulente d’Escherichia
coli (E. coli). Il s’agit d’une bactérie présente naturellement dans la flore intestinale. Cette
bactérie est utilisée depuis des années comme organisme modèle unicellulaire procaryote
(génétique, biologie moléculaire, microbiologie, …).

Tous les déchets biologiques produits pendant et après les séances de TP doivent
impérativement être détruits (eau de Javel ou autoclave (15 min à 121°C)). Des poubelles
spécifiques seront disponibles en salle de TP (en cas de doute demandez à vos encadrants).

La verrerie en contact avec les bactéries sera également passée à l’autoclave avant d’être
lavée.

Préparation des milieux de culture :

Le milieu de culture utilisé lors de ces TP est le milieu LB (Luria Broth).

- milieu liquide → pour 1L : Tryptone : 10 g, Yeast Extract : 5 g, NaCl : 10 g


- milieu gélosé → pour 1L : Tryptone : 10 g, Yeast Extract : 5 g, NaCl : 10 g, agar : 15g
➔ les volumes de milieu à préparer seront déterminés lors des séances, en fonction du
nombre d’étudiants.

Mises en cultures :

Ces premières expériences vous permettront à la fois de mieux appréhender les expériences en
conditions stériles et de vérifier la qualité de votre travail.

- en milieu liquide :

➔ prélever un volume (à déterminer en TP) de LB liquide stérile et l’introduire dans un


tube en verre stérile, reboucher la bouteille stock ainsi que le tube et le placer à 37°C

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➔ prélever du LB liquide stérile (volume à déterminer en TP), reboucher le tube ainsi


que la bouteille stock. Prélever de la culture mère (volume à déterminer en TP) et
l’introduire dans le deuxième tube à essai

- sur milieu gélosé :

➔ fabriquer un râteau grâce à une pipette Pasteur (démonstration faite par les
encadrants). Ce râteau vous permettra d’étaler des bactéries à la surface d’un milieu de
culture gélosé contenu dans une boîte de Pétri
➔ Prélever 100 µL de LB liquide stérile et les déposer au centre de la boîte, répartir le
LB à la surface du milieu, sans enfoncer le râteau dans le milieu
➔ Prélever 100 µL de culture mère et les déposer au centre de la boîte, répartir la
suspension bactérienne à la surface du milieu, sans enfoncer le râteau dans le milieu
➔ Placer les boîtes à l’envers (couvercle en bas), à l’horizontale, dans une étuve à 37°C

Les résultats seront observés après une incubation à 37°C sur la nuit.

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TP2 : préparation de boîtes, nouvelles méthodes de culture

- Faire fondre les milieux LB gélosés et placer les bouteilles au bain marie
- Préparation des boîtes (LB agar +/ - streptomycine 50 µg/mL)
- Préparer 1 tube à bouchon vissé par étudiant, contenant du LB + agar (1,5 mL)

Action d’antibiotiques sur la croissance de notre souche de bactérie :

- Etaler 100 µL de culture de bactéries (cf. TP1)


- Déposer 3 disques d’antibiotiques différents par boîte (préparer 2 boîtes avec des
antibiotiques différents par binôme)
- Placer les boîtes à 37°C

Mise en culture « stab » :

- Effectuer une inoculation, en conditions stériles, dans le tube à bouchon vissé


contenant 1,5 mL de LB agar à l’aide une pointe (öse) stérile
- Conserver les tubes à température ambiante

Mise en culture en stries :

Le but de cette expérience est d’obtenir des colonies bactériennes isolées

- La démonstration de cette technique sera faite par les encadrants


- Chaque étudiant préparera une boîte
- Placer les boîtes à 37°C

Les résultats seront observés après une incubation à 37°C sur la nuit.

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TP3 : suivi de croissance bactérienne


Il existe plusieurs méthodes, souvent complémentaires, pour suivre la croissance d’une
population bactérienne. Lors de ce TP, nous utiliserons une méthode simple, basée sur la
variation de la densité optique de la culture. Cette méthode est facile à mettre en œuvre mais
n’indique pas si toutes les bactéries sont encore vivantes.

Chaque groupe de TP disposera de 3 milieux de culture différents (les conditions seront


précisées en début de séance).

- Inoculer (la concentration vous sera précisée au début du TP) les 3 milieux avec la
culture mère.
- Prendre (stérilement) un échantillon et placer la culture sous agitation constante à
37°C
- Mesurer la DO600nm pour le temps t=0 (début de l’expérience)
- Toutes les 20 min, prélever stérilement un échantillon de chaque culture afin de
mesurer la DO600nm
- Replacer aussitôt les cultures dans les conditions de croissance
➔ Tracer les courbes de croissance DO = f(t) et comparer

Utilisation de la culture « stab » :

- Prélever des bactéries de la culture « Stab » et effectuer des stries sur une boîte LB
agar + streptomycine 50 µg/mL (1 par étudiant)
- Placer les boîtes à 37°C

Les résultats seront observés après une incubation à 37°C sur la nuit.