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Les prélèvements EN BIOCHIMIE

Le prélèvement de l’échantillon à analyser est le premier


échelon de toute analyse, les analyses biochimiques portent le
plus souvent sur le sang total, sérum), les urines, divers liquides
(LCR, liquide pleural,..) ou biopsie.

1)-Sang veineux

a-Modes de prélèvement
Le prélèvement est effectue au niveau des veines superficielles
du pli du coude a l’aide d’une aiguille bien coupante en acier
inoxydable et ce après avoir placer un garrot afin que la
circulation artérielle ne soit pas arrêtée.
L’aiguille est montée sur une seringue mais elle doit se remplir
d’elle même sans tirer le piston.
Enfin, le sang prélève est reparti sur des tubes spéciaux selon
l’examen demande.

b-Conditions de prélèvement
Le prélèvement doit répondre à certaines conditions :
- Il doit être effectue le matin et a jeun afin d’éviter les
variations nycthémérales, en général un jeun de 3a 10
heures suffit.
- Le sujet doit être en état de repos ; allonge ou détendu.
- Il faut rassurer le patient et le placer dans un endroit
confortable et éviter toute émotion (variation de la
concentration du glucose, acide gras, phosphate sous
l’influence des décharges d’adrénaline).
c-Matériels de prélèvement :

- Le matériel doit être sec et propre (aiguille, seringue,


tube, bouchon).
- Le sang ne doit pas être trituré ni secoué brutalement mais
agiter par simple retournement dans un tube bouche.
- Eviter toute hémolyse qui empêche la réalisation de
nombreux dosages sur le sérum et plasma.

d- Les récipients :

Tubes en verre ou en plastique (polyéthylène),munis d’un


bouchon adapte.

Pour l’identification de échantillon, on lui attribut un numéro qui


est propre au sujet, ce qui facilite par la suite les
enregistrements.

e-Les anticoagulants :

L’anticoagulant permet d’obtenir après centrifugation du sang, le


plasma avec son fibrinogène(+ culot globulaire).
Les principaux anticoagulants sont : EDTA, héparine, citrate.
En absence d’anticoagulant, le sang coagule en quelques minutes,
et après centrifugation, on sépare le sérum sans fibrinogène
(caillot de fibrine contient les éléments figures).
Le sérum ne peut plus alors coaguler ce qui est préférable pour
les pipetes et les automates afin d’éviter le bouchage des
micro-tubules.
2) Prélèvement d'urines :

a. Prélèvement :

- Urine de 24 h : La collecte des urines de 24h est très utile


mais on est confronté à un problème de stockage et de
conservation du fait de l'importance du volume recueilli.
Les urines de 24 h sont utilisées principalement dans la
détermination de glycosurie, de la créatininurie et de
l'albuminurie de 24 h.
La collecte de ces urines de 24h par diurèse spontanée doit
respecter certaines conditions, à savoir :
- Faire uriner le sujet à 8h du matin puis jeter ces
premières urines et recueillir toutes les urines jusqu'au
lendemain 8h du matin.
- Recueillir sur récipient propre (bouteille d'eau minérale par
exemple)
- Conserver dans un endroit frais.
On mesure la diurèse après homogénéisation de l'échantillon.

- Echantillon urinaire unique : La confection de l'échantillon


unique nécessite une standardisation car la composition des
urines varie selon l'heure du jour, l'activité et l'état du sujet.
En général, il faut recueillir les urines à une heure fixe le matin
et, si possible, utiliser le même procédé que celui des urines de
24h pour recueillir les urines émises en une heure.

N.B  ! Les urines sont utilisées à des fins analytiques, pour


l'établissement de bilans d'exploration rénale le plus souvent.
Centrifugation

Le sang doit être centrifuge le plus rapidement possible


après le prélèvement.
La centrifugation est utilisée généralement pour précipiter
les éléments cellulaires contenus dans un liquide normal ou
pathologique
Le but de la centrifugation du sang prélevé sur un
anticoagulant est l’obtention du plasma.
Le but de la centrifugation d’un sang prélevé sur un tube sec
est l’obtention du sérum.
Pour obtenir le plasma ; on centrifuge pendant 3 minutes a
3000-5000 t/min, pour une centrifugeuse ordinaire, il se forme
une couche inférieure constituée des éléments figures, le plasma
surnage.
Pour séparer le sérum ; décoller le coagulum des parois de
verre a l’aide d’une fine baguette et centrifuger, le sérum peut
aussi être sépare après rétraction du caillot quelques heures a
37ºC.
Les tubes sont places dans les portoirs de la centrifugeuse
de façon équilibrée et sont soumis à un mouvement de rotation
rapide.
Après centrifugation on décante immédiatement le sérum ou
le plasma dans un ou plusieurs tubes correctement étiquetés.
Le plasma et le sérum peuvent être conserves dans des
tubes bouches plusieurs jours a +4ºC, congelés a -20ºC.

N.B  ! La plupart de leurs constituants se conservent


indéfiniment. On prépare ainsi les sérums de contrôle.
BILAN LIPIDIQUE

Etant hydrophobes, les lipides ne peuvent circuler dans le sang


que s’ils sont lies a des polypeptides appelés Apoprotéines.
Un bilan lipidique ne peut être effectue que sur un tube sec
contenant un sérum provenant d’un sujet a jeun depuis 12
heures.
Ce bilan lipidique comprend :

1. Aspect du sérum :
Pouvant être ; clair, opalescent, lactescent.
L’aspect du sérum représente un grand intérêt, chez un sujet
normal, l’aspect du sérum :
 Apres centrifugation  clair.

 Apres conservation 24 heures a +4ºC clair

2. Dosage des lipides :

 Cholestérol total : test enzymatique, colorimétrique.

 Triglycérides : dosage colorimétrique et enzymatique.

3. Analyse des lipoprotéines :


 Cholestérol HDL.
 Electrophorèse des lipoprotéines sur acétate de
cellulose.
 Apo AI , ApoB
A-Dosage du cholestérol :

Généralités :

Le cholestérol est un stéroïde possédant un groupe


hydroxyle secondaire en position C3.
Il est synthétise dans de nombreux tissus, en particulier
dans le foie et la paroi intestinale.
Les trois quarts environ du cholestérol sont synthetisés
dans l’organisme et un quart est apporté par l’alimentation.
Les dosages du cholestérol sont utilises pour le dépistage
d’un risque d’athérosclérose,
Ainsi que pour le diagnostic et le traitement de maladies
avec taux de cholestérol élevé
Et de troubles du métabolisme des lipides et des
lipoprotéines.

Principe :

Test colorimétrique enzymatique.

L’addition, à l’échantillon, du réactif R1 (réactif


cholestérol) conduit au déclenchement de la réaction ;

La concentration en cholestérol est déterminée par voie


enzymatique a l’aide de cholestérol-estérase et de cholestérol
–oxydase, l’indicateur quinonemine est formé à partir du phénol
et la peroxydase.

*Cholestérol estérifié + H2O cholestérol estérase

cholestérol + acide gras


Cholestérol oxydase
* Cholestérol + O2 cholestène-4-one-3
+ H2O2
Peroxydase
*2H2O2 + phénol + 4 AAP quinonèimine + 4H2O

AAP : amino-4-antipyrine.
Quinoneimine est un dérivé de coloration rose, l’intensité de
la coloration developpée est directement proportionnelle à la
concentration en cholestérol, et est mesurée par
spectrophotométrie.

 Composition des réactifs

Réactif 1 :
Tampon Pipes pH 6.90 ………………. 50mmol/l
Phénol ……………………………….. 24mmol/l
Cholate de sodium ……………………. 0.5mmol/l

Réactif 2 :
Amino-4-antipyrine …………………… 0.5mmol/l
Cholestérol estérase …………………… ≥ 200U/l
Cholestérol oxydase ………………….. ≥ 250U/l
Peroxydase ……………………………. ≥ 1000U/l

 Etalon :
Cholestérol 2g/l (200mg/dl =5.17mmol/l).

 Stabilite des réactifs :


Les réactifs sont conservés à 2-8°C et à l’abri de la lumière.

 Réactifs de travail : préparation


- Dissoudre le réactif 2 avec le réactif 1.
- Attendre environ 15mn avant utilisation.
- La solution obtenue peut être conservée pendant une
semaine à 20-25°C et 3mois à 2-8°C.
 Echantillons :
Sérum.
Plasma recueilli sur héparine.

 Valeurs normales :
1.50 – 2.60 g/l
150 – 260 mg/dl
3.87 – 6.71 mmol/l

 Mode opératoire :
La méthode ci-dessous est la méthode manuelle pour
spectrophotométrie.
Ce réactif peut être utilise pour la plus part des automates.

Blanc Etalon Dosage

Réactif du 1ml 1ml 1ml


travail
Eau 10µl _ _
distillée
Etalon _ 10µl _
Echantillon _ _ 10µl

Longueur d’onde : 500 nm


Température : 37ºC.
Cuve : trajet optique 1cm.
Zéro de l’appareil : blanc réactif
Mélanger et lire la densité optique Do après 5mn d’incubation.
La coloration finale est stable au moins 1h.
 Calcul :
(Do dosage / Do etalon) x n.
g/l n=2
mg/dl n = 200
mmol/l n = 5.17
n = concentration de l’étalon.

 Performances :

Linéarité :
Le réactif est linéaire jusqu’à 5g/l en méthode manuelle
(500mg/dl) (12.9mmol/l).
Si la concentration en cholestérol est superieure a 5g/l,
diluer échantillon au ½ avec une solution de NaCl a 9g/l et
refaire le test.

Limite de détection :
Détermination selon le protocole recommandé par Vassault et
Coll. , la limite de détection
est égale a 30mg/l.

Sensibilité :
La sensibilité fonctionnelle est égale à 100mg/l.

 Interférences :
Selon les recommandations de la SFBC, diverses substances
sont ajoutées, en quantités croissantes, à un pool sérique
humain frais de titre normal ou pathologique.
Les tests montrent que les triglycérides, le glucose, l’acide
ascorbique et l’hémoglobine n’interfèrent pas aux
concentrations testées (triglycérides jusqu’à 5g/l, glucose
jusqu’à 10g/l, acide ascorbique jusqu’à 50mg/l et hémoglobine
jusqu’à 5g/l).
Variations physiopathologiques :

 Variations physiologiques :

- La concentration en cholestérol varie avec l’age.

- Elle est plus élevée chez l’homme que chez la femme.

- Varie en fonction des exercices physiques, régime


alimentaire et pendant la grossesse.

 Variations pathologiques :

1- les hypercholestérolémies 
Toutes dominées par l’évaluation du risque atherogene.

2 aspects schématiques :

A/Hypercholestérolémies primaires :

Maladies congénitales ; dans ce cas, il faut rechercher les


anomalies de l’équilibre glycémique et de l’uricémie.

b/ Hypercholesterolemies secondaires a :


- un diabète sucré
- myxoedeme
- la goutte
- maladies hépatiques (cholestase).
- Pancreatites aigues ou chroniques.
- Hypothyroïdie
- Corticothérapie.

2-Les hypocholestérolémies :assez rares mais


significatives :

- Maladies métaboliques congénitales.


- L’insuffisance hépatocellulaire.
- Maladies infectieuses.
- Syndrome nephrotique
- Hyperthyroïdies.
- Denutrition.

Age (années) Risque modéré Risque élevé


20-29 >2g/l >2.20g/l

30-39 >2.20g/l >2.40g/l

> 40 >2.40g/l >2.60g/l

B-Dosage du HDLcholesterol :
Principe :

C’est une méthode de précipitation sélective ; Les


chylomicrons, VLDL,LDL, sont précipites par addition de
l’acide phosphotungstique et des ions Mg2+ a échantillon,
on détermine la concentration en HDL qui restent dans le
surnageant après centrifugation.

Echantillon :

Sérum
Plasma recueilli sur l’héparine

Réactifs :

Réactifs de précipitation :
Acide phosphotungstique ……………1.58g
MgCl2………………………………...5.08g
Eau distillée……………………QSP1000ml

Mode opératoire :

- 200 ul de serum + 500 ul de réactif precipitant.


- mélanger et laisser reposer pendant 5-10 mn a Tº
ambiante.
- Centrifuger pendant 10 mn a 4000 tours/mn.
- Récupérer le surnageant et effectuer le dosage du
cholestérol sur HITACHI. (resultat en g/l)
- Multiplier le resultat obtenu par 3.5 g/l

Valeurs normales:
Age Homme Femme
0-19 ans 0,31-0,47 g/l 0,41-0,70 g/l
20-49ans 0,37-0,65 g/l 0,50-0,82 g/l
50-59ans 0,42-0,65 g/l 0,58-0,92 g/l

Calculs : Concentration CH-HDL = DO échantillon x 2.19.


2.19 : Facteur de correction.

Normes :
 LDLc = CT – ( TG/5 + HDLC ) : < 1.26 g/l

 LDLc /HDLc : < 3.60 g/l.

 CT / HDLc : < 5.20 g/l

Interpretation :

Le cholesterol HDL est un bon cholesterol, il temoigne d’un


metabolisme equilibre, donc protection contre l’atherosclerose.
Par contre, le cholesteril lie au VLDL et LDL, c’est le mauvais
cholesterol :
C’est le facteur atherogene majeur ; Augmentation dans les
maladies athéromateuses
et les hyperlipoprotéinemies de type II a, II b, III.

C-Dosage des triglycerides :

Généralités :
Les triglycerides sont des esters du glycerol et de trois acides
gras a longue chaine.
Ils proviennent en partie des aliments et sont en partie
synthetises dans le foie.
Les dosages de triglycerides sont indiques, pour le diagnostic et
le traitement,en cas de diabete sucre,de nephrose, d’obstruction
des voies biliaires,de troubles du metabolisme des lipides,ainsi
que dans de nombreuses maladies endocrinologiques.

Principe :  Dosage colorimetrique enzymatique

Par l’action de lipase speciale ,les triglycerides sont hydrolyses


enzymatiquement en glycerol et en acide gras libres, le glycerol
est ensuite transforme selon le schema suivant :

Lipoprotéine lipase
Triglycéride + H2O Glycérol + acide gras.

Glycérol kinase
Glycérol + ATP Glycérol-3-phosphate +
ADP.
Mg ² +
Glycérol-3-phosphate oxydase

Glycérol-3-phosphate + O2 H2O2 + DHAP

Peroxydase
2 H2O2 + 4-AAP + ESPAS Quinonéimine + 4 H2O.

DHAP : déshydroacétone phosphate.


ESPAS : N-ethyl-N-sulfopropyl-N-anisidine.
4-APP : 4 Amino-antipyrine
L’intensite de la coloration est proportionnelle a la concentration
en triglycerides dans l echantillon.

Réactifs :
Réactif 1 :
Tampon Pipes pH7.50 …………………50mmol/l.
ESPAS …………………………………1mmol/l.

Réactif 2 :
Lipoprotéine lipase ……………………. 1100U/l.
Glycérol kinase ……………………….. 800U/l.
Glycérol-3-phosphate oxydase ………… 5000U/l.
Peroxydase ……………………………. 350U/l.
4-AAP ………………………………… 0.7mmol/l.
ATP …………………………………… 0.3mmol/l

Etalon :
Glycérol (équivalent triglycéride) 2g/l = 200mg/l = 2.28
mmol/l.

Stabilite des reactifs :


Les réactifs sont stables si conservé à une température 2-8°C
et à l’abri de la lumière.

Réactif de travail :
Dissoudre le réactif 2 dans le réactif 1 et attendre environ
15mn avant utilisation.

Stabilite :
Ces réactifs sont stables ; 6 semaines à température 2-8°C
5 jours à température 20-25°C.

Echantillon :
-Serum
-Plasma recueilli sur heparine.
-Il faut respecter les 12h de jeun pour avoir une exploration
correcte.
Mode opératoire :

Blanc Etalon Dosage


Réactif de 1ml 1ml 1ml
travail
Eau distillée 10µl _ _
Etalon _ 10µl _
Echantillon _ _ 10µl

- agiter, et incuber 5 minutes a 37º C.


- régler le zéro de l’appareil avec le blanc réactif.
- transverser dans une cuve de 1 cm de trajet optique.
- Lecture a une longueur d’onde = 546 nm.
- La coloration est stable 60 mn a Tº ambiante.

Calcul :

DO dosage / DO étalon x n
g/l n=2
mg/l n = 200
mmol/l n = 2.28
n : concentration de l’étalon.

Performance :

 Linéarité 
Le réactif est linéaire jusqu’à 10g/l en méthode manuelle
(100mg/dl) (11.4mmol/l).
Pour des valeurs superieures, il est necessaire de diluer
l’echantillon avec une solution physiologique et de multiplier le
resultat par le facteur de dilution.
 Limite de détection :
Elle est egale a 0.080g/l.
 Sensibilité :
La sensibilité fonctionnelle est égale à 0.25g/l.

Interférences :

Selon les recommandations de la SFBC diverses substances


sont ajoutées en quantités croissantes à un pool sérique
humain frais de titre normal ou pathologique.
Ces tests montrent que le glucose, l’hémoglobine et la
bilirubine n’interfèrent pas aux concentrations testées :
glucose jusqu’à 10g/l, hémoglobine jusqu’à 5g/l, bilirubine
jusqu’à 80mg/l.

L’interférence la plus importante est celle de l’acide


ascorbique : une sous-estimation d’environ 10% se produit
pour des teneurs supérieures en acide ascorbique à 50mg/l.

Valeurs normales :

Homme : 0.60 – 1.65 g/l


60 – 165mg/l
0.68 – 1.88mmol/l
Femme : 0.40 – 1.40g/l
40 – 140mg/l
0.46 – 1.60mmol/l

# les variations de triglycerides traduisent celles des


lipoproteines riches en glycerides
( chylomicrons, VLDL).

# Ils augmentent chez les femmes recevant des


oeustroprogestatifs et pendant la grossesse.

Variations pathologiques :
En dehors des dyslipemies primitives, une elevation des
triglycerides est observee dans :

 Obesite moyenne et diabete.


 Syndrome nephrotique.
 Hypothyroidie.
 Pancreatite et stade initial de l’hepatite.
 Cholestase.
 Dysfonctionnement thyroidien.
 Certains traitements ; corticoides, diuretiques, ß
bloquants.
Une baisse de triglycerides associee a une hypocholesterolemie
se rencontre dans :
 l’insuffisance hepatocellulaire grave.
 Le syndrome de malnutrition ou denutrition.
 Hypolipidemies congenitales.
D. Lipidogramme : Electrophorèse des
lipoprotéines :

Principe :
Les apolipoproteines, comme toutes les protéines sériques,
ont la propriété de se charger négativement en milieu
basique pH 8,6, grâce à leur propriété amphotère et a un
pH isoélectrique inférieur au pH du milieu.
Le chargement des lipoproteines négativement va
permettre leur migration en présence d'un courant
électrique de la cathode vers l'anode avec des vitesses
dépendantes de leur charge et de leur poids moléculaire.
Les lipoprotéines de charges différentes occupent des
zones différentes : Il y a séparation des lipoproteines.
L’électrophorèse de zone sur acétate de cellulose est
utilisée pour l’étude des lipoprotéines, la bande d’acétate
de cellulose est imbibée de tampon véronal sodique pH 8,6.
Réactifs et matériel :
- Bande acétate de cellulose pouvant porter 8 échantillons :
La bande d'acétate de cellulose n'est pas exactement la
même utilisée en électrophorèse des protéines; sa
composition est légèrement différente pour permettre une
migration sélective des lipoproteines seuls.
- Tampon véronal sodique : tampon HR Buffer 
Reconstitué dans 750 ml d’eau distillée, il peut être
conservé 2 mois à température ambiante.
- Rouge ORO :
A dissoudre dans 1000 ml de méthanol. Le mélange doit
être agité 4-5 heures, filtré puis conservé 6 mois maximum
à température ambiante en flacon ambré.
- Lipo Bags : petits sachets plastiques hermétiquement fermés.
- Papier Buvard, papier Pont
- Chambre de migration
- Alimentation en courant électrique
- Plateau échantillons
- Applicateur
- Micro pipette de 10 µl
- Méthanol pur (pur à 99,8%)
Technique :
Verser 50 ml de tampon (reconstitué à 750 ml d’eau distillée
chacun des compartiments extérieurs de la cuve de migration.
Tremper 2 papiers pont dans le tampon, puis les disposer par-
dessus chaque cloison en s’assurant qu’ils sont en contact avec le
fond du compartiment contenant le tampon. Couvrir la cuve, afin
d’éviter l’évaporation.
Tremper 30 mn le nombre désiré de bandes d’acétate,
descendre lentement le portoir et de façon progressive dans le
tampon (environ 45 sec).
Utiliser une micropipette pour remplir chaque puit du plateau
échantillon avec 10µl de sérum précisément. Il est préférable
pour éviter l’évaporation des sérums de préparer les échantillons
dans les puits 5 mn avant la fin de la réhydratation des bandes.
Sortir la bande d’acétate du tampon, la sécher entre deux
buvards neufs et calibrés. Placer une goutte d’eau sur la plaque
d’alignement. poser le côté brillant sur la plaque en alignement
avec le trait "Cathode application". Dans cette position,
l’échantillon N°1 sera du côté gauche au moment de l’application.
deux méthodes de repérage du premier échantillon sont
possible, soit avec le marqueur HELENA, soit en découpant la
bande d’acétate dans l’angle gauche. Ne pas excéder 1 millimètre
de découpe.
Rapidement charger l’applicateur en baissant franchement
les cavaliers dans les puits contenant les sérums 3 ou 4
fois. La première application doit être déposée sur un
buvard. Ceci rend la deuxième application plus uniforme.
Charger de nouveau l’applicateur comme précédemment, le placer
rapidement sur la plaque d’alignement, appuyer franchement et
compter 5 secondes. Disposer rapidement la bande dans la cuve
de migration, acétate vers le bas (sur les ponts de papiers). Pour
assurer un meilleur contact, poser une lame de verre sur la
bande dans le sens de la largeur mettre le couvercle et attendre
une minute avant de lancer la migration.
Migration à 180 volts pendant 20 minutes.
Coloration :
Préparer la solution colorante environ 5 mn avant la fin de
l’électrophorèse.
Dans un bac à coloration mélanger : 30 ml de Rouge ORO +10 ml
de Soude 1N Tremper la plaque (Acétate vers le haut) dans la
solution colorante pendant 15 minutes (Un temps de coloration
plus important entraînerait un fond de bande plus marqué et une
diminution des prés Bêta).
Décoloration :
Sortir la plaque du colorant et à l’aide d’un coton mouillé ou du
doigt, retirer délicatement le précipité sur les deux faces de la
bande en maintenant celle-ci sous un filet d’eau.
Introduire ensuite la bande humide dans un lipo-bag (sac
plastique) imbibé d’eau. Fermer celui-ci en chassant les
éventuelles bulles d’air.
Lecture : Lire à l’aide d’un densitomètre muni d’un filtre 525 nm.
On obtient une courbe représentant les pourcentages et
intensités des différentes bandes, avec trois bandes
distinctives : préβ,β et α.
La lecture des plaques doit se faire rapidement après la mise en
sac plastique.
Facteurs interférents : les échantillons prélevés sur
Héparine ne doivent être utilisés car l’Héparine altère la
mobilité des fractions.
Valeurs normales :
Alpha α 15 à 40% Pré Bêta  (préβ): 5 à 22%
Bêta β: 40 à 55%
Chylomicrons : 0 à 2%
Interprétation :
La fraction α lipoproteine (HDL) représente la fraction la plus
rapide, elle est située prés de l'anode (+).
La fraction β lipoproteine (LDL) est généralement la plus
importante et se place prés du point d'application.
La fraction préβ lipoproteines (VLDL) migre entre les deux
fractions.
La mobilité des préβ varie en fonction de la résolution de la
bande, du type de préβ et de son pourcentage. L'intégrité de
cette fraction diminue avec l'âge de l'échantillon. Les
chylomicrons, s'ils sont présents, restent au point d'application.

Résultats et interprétation cliniques :

1-Les principales lipoprotéines et leurs compositions :

Densité 0,920- 0,940- 1,006- 1,063-


0,940 1,006 1,063 1,210
Noms des fractions Chylomicron VLDL LDL HDL
(ultracentrifugation) s
Noms des fractions Chylomicron Pré β Β α
(électrophorèses) s
Composition TG 86% 49% 13% 13%
Chol 4% 25% 44% 20%
Prot 2% 13% 25% 40%
Phospho 8% 13% 8% 27%
lipides
Pourcentages 0 à 2% 5 à 22% 40 à 55% 15 à 40%
normaux à jeun

2- Classification et identification des hyperlipoprotéinémies


(HLP) selon Lévy et Fredrickson :
Fredrickson classe les hyperlipoproteinémies en six classes :
Hyperlipoproteinémie de type I : Hypertriglycéridémie
exogène
Hyperlipoproteinémie de type IIa : Hypercholestérolémie pure
Hyperlipoproteinémie de type III : Dys β lipoproteinémie
Hyperlipoproteinémie de type IV : Hypertriglycéridémie
endogène
Hyperlipoproteinémie de type IIb : Hyperlipidémie combinée
familiale
Hyperlipoproteinémie de type V : Hypertriglycéridémie mixte

BILAN PROTIDIQUE
A-Dosage des protéines totales : méthode de Biuret

Principe :

Les liaisons peptidiques réagissent avec le sulfate de cuivre en


milieu alcalin, donnant une coloration bleue dont l’intensite est
appréciée a 546 nm, elle est proportionnelle a la quantite de
proteines dans l’echantillon, le reactif de Biuret est realise par
le tartrate double de sodium et de potassium en présence d’iode
en milieu alcalin.
C’est une reaction simple, rapide, très specifique mais peu
sensible.
Elle s’applique difficilement aux solutions diluées. ( seuil : 10-20
g/l).

Echantillon
Serum, ou plasma recueilli sue heparine ou EDTA.
Conservation 6j entre +4ºC et +25ºC.

Reactifs :

- Etalon : albumine à 60g/l


- Réactif de Biuret :
Tartrate double de sodium et de potassium.
Iodure de potassium
Sulfate de cuivre CuSO4, 5 H2O
Chlorure de sodium 0,2 N
Ce réactif est d’excellente conservation à l’obscurité, et à l’abri
de la lumière.
Mode operatoire :

Blanc Etalon Dosage

H2O distillee 20µl - -


Etalon - 20 µl -
Sérum - - 20µl
Réactif de Biuret 1 ml 1ml 1 ml

- Longueur d’onde : 546 nm.


- Temperature d’incubation : 20 -25º C
- Cuve : 1cm de trajet optique
- Melanger et incuber 30 mn. Lire l’extinction de l’essai
contre le blanc.

La limite de dilution est atteinte pour essai =0.700.

Dans le cas d’extinctions plus élevées, diluer l’echantilllon


dans le rapport 1+1, a l’aide de solutions physiologiques de
NaCl et refaire le dosage : resultat x 2.

-Calcul :La concentration des protéines totales dans


l’échantillon est donnée par la formule :

C = DO dosage / DO étalon x concentration de


l’étalon en g/l
-Variations physiologiques :
- Adulte : 60-75 g/l.
- Nouveau-né 50-70 g/l, et atteint les valeurs de l’adulte au
cours de la troisième année.
- Prématuré : 40-60 g/l.
les proteines varient en fonction de l’exercice physique, et en
fonction du rythme circadien.

-Variations pathologiques :

1-Hypoproteinemies :
- Par defaut d’apport.
- Insuffisance hepatique , cirrhose.
- Fuite renale massive ; nephrite aigue.
- Diarrhees exsudatives.
- Brulures cutanees.
- Fuite digestive.

2-Hyperproteinemies :
- hypergammaglobulinemies en cas d’infection.
- Hémoconcentration suite a une déshydratation d’origine
digestive, cutanée ou respiratoire.
- Diabète insipide
- Rhumatisme articulaire
- Lupus érythémateux dessiminé
B-Dosage de l’albumine :
Methode colorimetrique 

Principe :
a Ph = 4.20, le vert de bromocresol se fixe selectivement
sur l’albumine en donnant
une coloration bleue.

Composition des reactifs :


Reactif 1 :
Tampon succinate, pH 4.20 …………….75mmol/L
Vert de bromocresol……………………0.14g/L
Brij 35………………………………….7 ml/L

Etalon :
Albumine bovine ………………….50 g/L ( 5g/dL - 724
µmol/L )

Stabilite des reactifs :


Les reactifs, conserves a 2-8ºC et a l’abri de la lumiere,
sont stables jusqu'à
la date de peremption.

Echantillon :
Sérum ou plasma recueillis sur heparine.

Mode opératoire :
- Spectrophotomètre : 628nm.
- Cuve 1cm de trajet optique.
- Température d’incubation 20 – 25°C.
- Pour chaque dosage, un blanc réactif et un étalon
suffisant.
Blanc Etalon Dosage
Réactif 1ml 1 ml 1 ml
Eau distillee 10 µl - -
Etalon - 10µl -

Echantillon - - 10µl

Mélanger, laisser reposer 5mn à température ambiante, lire à


628nm contre le blanc réactif.

Calcul :
Concentration de l’albumine = Do dosage / Do étalon x
concentration de l’étalon(50g/l).

valeurs normales :
38 - 54 g/l
3.8 – 5.4 g/dl
550 – 782 µmol /l.

C- Electrophorese des protéines :

Principe :

C’est une methode physique de fractionnement des


proteines plasmatiques en solution, les molecules
proteiques acquierent une charge electrique, et si on les
met dans un champ electrique, elles migrent.
Le sens de la migration depend du pH de la solution
étudiée, et ceci, par rapport au Ph
isoelectrique des proteines.
La vitesse de migration depend essentiellement de la
charge electrique de la proteine.
Elle depend egalement de :
- Temperature
- Le courant electrique continu
- pH ( ionisation des molecules)
- Force ionique du tampon ; l’influence de la mobilite
electrophoretique doit etre suffisante
pour la solubilisation et la separation durant la migration.

Ainsi, on depose le serum au centre de la bande d’acetate de


cellulose imbibée du tampon
veronal sodique a pH =8.6.
Les proteines chargees negativement, lorsqu’elles sont
soumises a un champ electrique de 180
volt, se deplacent vers l’anode avec une vitesse qui depend de
la charge, a la fin de la migration,
les proteines occupent des zones differentes, On les révèle
par colorationau rouge ponceau,
puis on fait la lecture après intégration densitometrique.

Matériels :

1/- Solution de dilution :


KI ……..5g
NaOH ……..8g (0.8N)
Amener le volume à 100ml.

2/- Réactif de transparisation :


Methanol pur …………. 418.75ml
Acide acétique pur ……… 161.25ml
Clear aid …………………25ml

3/- Rouge ponceau :


acétate sulfosalicylique ………….50g
Ponceau …………………………. 2.5g
eau distillée ……………………… 500ml

4/- Tampon véronal :


1sachet dissous dans 750ml d’eau distillée.

5/- accessoire nécessaire :


alimentation
redresseur de courant (500V/100mA)
chambre de migration
micropipette 10µl
étuve IOD
bac de colorations
portoires

Kit applicateur Helena comprenant : multiplicateur, plaque


comportant des puits, support d’alignement, papier buvard,
papier Wattman.

6/- Réactifs consommables :


Bande acétate
Tampon HR buffer (1sachet dans 750ml d’eau distillée)
Rouge panceau (1 boite diluée dans 1000ml)
Solution clarifiante (clair aid)
Contrôle Kentrol normal
Contrôle Kentrol anormal
Feuille de résultat
Papier buvard
Pont papier
Méthanol pur
Acide acétique pur

Mode operatoire :
- On pratique a l’electrophorese des proteines seriques sur
une plaque d’acetate de cellulose en tampon veronal
sodique a pH = 8.6 a 9.
- On depose sur la bande une faible quantite de serum 3 µl
environ ( et non pas du plasma ce qui explique l’absence de
fibrinogene) ; Application centrale.
- On applique, puis on declenche le champ electrique puis la
migration des differentes fractions proteiques.
- Puis, on procede a la coloration ;
 Plonger la plaque dans le
rouge ponceau pendant 6 min.
 Décoloration, 3 min,
dans des bains successifs d’acide acetique a 5%
chacun.
 Déshydratation dans un
bain de methanol pendant 4 min.
 Transparisation dans
un melange de 72 % de methanol et 4% de solution
clarifiante + 24% d’acide acetique pendant 5 a 10 min.
 Séchage : mettre a
l’etuve pendant 10 min entre 50 et 60º C.

 Lecture apres essuage


de la plaque, a l’appareil, on obtient, ainsi, un profil
proteique avec des taux specifiques pour chaque
fraction. La Lecture est appréciée par
enregistrement densitométique dans un appareil
intégrateur.
Valeurs normales :Chez l’adulte et l’enfant :

Pourcentage Concentration
Albumine 50-60% 32-50 g /l
α1globuline 4-6% 1-4 g/l
α2globuline 7-11% 6-10 g/l
βglobuline 11-16% 6-13 g/l
γglobuline 13-19% 7-15 g/l

Albumine

α1 α2 β Υ

+ –
Valeurs pathologiques :

Hypoalbuminemie : due peut etre a :


-Dénutrition.
-Insuffisance de synthese ou une exageration des pertes
de proteines :
-cirrhose.
-Syndrome nephrotique.
Augmentation des α1 et α2 globulines avec synthese accru
de proteines
inflammatoire :Haptoglobine,CRP,orosomucoide :Dans le
syndrome inflammatoire.
Hypoglobulinemie par :
-Defaut quantitatif.
-Defaut quantitatif (des lymphocytes β mature).
-Hyper gamma-globulinemie par stimulation polyclonale du
systeme immunitaire.

- Syndrome néphrotique: baisse de l’albumine et des


gammaglobulines
avec un pic en alpha2-globuline dû à la compensation par
l’orsomucoide
(Chapeau mexicain).

- gamma-globulinopathies monoclonales :Pic monoclonal des


gammaglobulines dans certaines formes de
tumeurs.

- Cirrhose décompensée: Bloc bêta-gamma.

- Agammaglobulinémies : tracé plat des gammaglobulines


Génétique ; souvent létale acquise ; sida et radiothérapie.

BILAN GLUCIDIQUE

Généralités :

La glycemie est un des paramètres les plus demamdés en


biochimie clinique.
Le glucose sanguin ayant 2 origines :
L’alimentation : 20 % du glucose absorbe au niveau intestinal
est stocke au niveau hepatique.
Les 80% restants paeent dans la circulation generale.

Endogene : provenant du foie, par 2voies metaboliques ; la


glycogenolyse et la neoglucogenese.
C’est un substrat qui fournit l’energie indispensables aux
fonctions cellulaires.

Dosage :
Il fait appel a de nombreuses methodes :
- Methodes basees sur le pouvoir reducteur du glucose.
- Methodes basees sur la formation de derives
furfuraliques.
- Methodes enzymatiques.
La methode la plus utilisee au laboratoire est une methode

enzymatique colorimetrique a la GOD – POD.

Echantillon :
Serum, ou plasma recuelli sur fluorure, heparine ou EDTA.

 Principe :

GOD
Glucose + H2O+ O2 acide gluconique + H 2 O2

POD
H2 O2 + phénol + amino 4 antipyrine 4 H2O +
quinonemine coloré 
 Réactifs :

Etalon : Glucose …………………………………. 5.55mmol/l (1g/l ).


Chromogène : amino-4-antipyrine ………………0.25mmol/l.
GOD (glucose oxydase) ……………………………≥ 20.000 UI/l.
POD (peroxydase).≥ 1.000 UI/l.
Tampon phosphate pH 7.2 ………………………… 100mmol/l.
Phénol ……………………………………………... 16mmol/l.

 Mode opératoire :

Dosage Etalon Témoin

Sérum 10 µl ― ―

Etalon ― 10 µl

Réactif 1 ml 1 ml 1 ml

Bien mélanger, incuber 30mn à l’obscurité à température


ambiante ou 15mn à 37°C.
Lire à 500nm les DO du dosage et de l’étalon contre le blanc
reactif.
puis se référer à la courbe étalon, établie sur étalon de
glucose : 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4 g/l.
La coloration est stable au moins 2heures si les tubes ne sont
pas exposés à la lumière.
La conservation s’effectue à 2-8°C jusqu’à la date de péremption
indiquée.
NB  : Si les concentrations obtenues sont supérieures à 5g/l,
faire un nouveau dosage sur une dilution de l’échantillon au ¼ a
l’aide d’une solution physiologique, puis multiplier le résultat par
le facteur de dilution appliqué.

Calculs :

Glucose(ml/l) = DO du dosage / DO étalon x 5.55.

Glucose(g/l) = DO du dosage / DO étalon x 1.

Valeurs usuelles :

- Adulte : 0.7 à 1.1g/l (ou 3.9 à 6.1mmol/l).

- Nourrisson < 0.5 g/l ; hypoglycemie physiologique.

Valeurs pathologiques :

Hypoglycemie :

Chez l’adulte, elle est definie par une glycemie inferieure a


0.5g/l a jeun, lors d’un malaise ou apres stimulation, elle est
parfois secondaire a :

 Insuffisance hepatique, thyroidiennes, hypophysaires ou


surrenales.
 Deficites enzymatiques des voies metaboliques du
glucose.
 Adenome des ilots de Langerhans.
 Gastrectomie
 Glycogenoses ; fructosemie et galactosemie congenitales.
Hyperglycemie :

 Des hyperglycemies secondaires peuvent s’observer en


cas d’hyperthyroidie, des affections hypophysaires, ou
surrenliennes ( maladie de Cushing).
 L’hyperglycemie est surtout le signe fondamental du
diabete sucre ;

- Chez l enfant le diabete sucre se revele de facon brutale par


les signes cardiaux de la maladie souvent associee a une
cetose.La glycemie est superieure a 2g/l (11mmol/l).
Chez l’adulte le diagnostic est certain lorsque sont presents les
signes cardiaux de la maladie et une hyperglycemie superieure a
2g/l.Dans ce groupe,on distingue les diabetes sucres
insulinodependants(de type II),selon que l’hyperglycemie
associee ou non a une cetose.

B I L A N R E N A L

Le Rein assure un rôle de filtre pour le plasma sanguin d’autre


part, c’est un régulateur qui contribue à assurer l’équilibre
constant du milieu intérieur .
Il excrète une urine dont la composition varie avec les besoins
d’épuration de l’organisme .
Il élimine certains substances indésirables pour l’organisme , la
filtration commence par le glomérule dont la membrane est
sélective , les petites molécules peuvent passer librement le
travail du diurèse dépend du débit sanguin et de l’état du
métabolisme .

NB  : Le néphron est l’unité fonctionnelle du rein les principaux


paramètres de l’exploration rénale sont  :

A-Dosage de l’urée

Seul le foie est capable de synthétiser l’urée, elle est chez


l’homme le terme principal du catabolisme protidique .
Elle s’élimine à 90% dans les urines et la sueur, un peu dans les
selles .
Dans le rein l’urée suit le mouvement de l’eau, et la quantité
éliminée est étroitement liée à la diurèse .
Son taux sanguin normal oscille entre 0,20 et 0,40 g/l et son
taux urinaire est de 20 à 35 g/l .
Les écarts de la ration protéique alimentaire peuvent allonger la
fourchette et donnent les limites 0,15 – 0,50 g/l. Une élévation
de l’urée sanguine peut être due à une insuffisance rénale ,
parfois seulement fonctionnelle, majorée par une
deshydratation , on a un hypercatabolisme azoté .
L’abaissement du taux urinaire s’observe dans les insuffisances
hépatiques évoluées .

Technique de détermination de l’urée  : Methode de


Berthelot

Principe  :

c’est une méthode enzymatique,suit la réacton suivante :

Urée + 2 H2O Uréase 2 NH3 + CO2.


Des ions ammonium réagissent avec le salicylate et l’hyochlorite
avec formation d’un
Derive colore vert.

Echantillon :

Serum , plasma recueilli sur EDTA, ou urines.


- ne pas utiliser de serum lipemique.
- Conservation du serum ou plasma a +4ºC trois jours, diluer
l’urine dans le rapport
1/100 avec de l’eau distillee.

Reactifs :

1-Tampon /Urease/ Salicylate :


- Tampon phosphate 120 mmol/l , pH = 7.
- Urease : > 5UI /ml.
- Salicylate de Na : 62.5 mmol/l.
2-Hypochlorite :
Hypochlorite de Na 6 mmol/l
Soude 150mmol/l
3- Standard : Uree : 30 mg/dl ou 5 mmol/l.

Mode operatoire :

- Longueur d’onde = 590 nm


- Cuve : 1cm de trajet optique
- Mesure : contre le blanc réactif .

Blanc Etalon Echantillon


Etalon / 10 µl /
Echantillon / / 10 µl
réactif R1 1000 µl 1000 µl 1000 µl

Mélanger incuber , pendant au moins 5 mn à 37°C ou 10 mn à 20


– 25 °C .

Réactif R4 1000 µl 1000 µl 1000 µl

Melanger et incuber pendant au moins 5mn a 37°c ou 10mn à 20


– 25 °C .
Lire l’étalon et l’échantillon contre le blanc réactif.
Stabilité de la réaction : 2 heures

Calcul :

Sérum = Do échantillon x concentration de l’etalon


Do étalon

Valeurs normales :

- Sérum = 0,15 - 0,45 g/l


- Urine = 20 – 35 g/24h

Linéarité :

- Sérum - le test est linéaire jusqu'à une concentration


de 2g/l .
Pour les concentration plus élevés , faire une délutions au ½ dans
le sérum sole ( Nil à 0,9% )
Urine le test est linéaire jusqu'à 42 g/l .
Pour les concentration supérieurs faire une dilution le résultat
sera multiplie par 2 .
Lecture au spectrophotomètre à 600 nm .

Variations pathologiques :

Augmentation :
Insuffisance renale aigue ou chronique.

Diminution :
Stade terminal de l’insuffisance hepatique.

B / Dosage de la Créatinine :

La créatinine plasmatique et urinaire sont le reflet de la masse


musculaire = paramètre très fixe .
La clearance de la créatinine a une valeur très importante pour
établir l’existence d’une insuffisance rénale et pour la
surveillance de celle ci :
- La créatinine n’est pas liée au régime alimentaire .
- La créatinine provient de la déshydratation de la
créatine qui, est elle, même provient de la créatine
phosphate des muscles .
- L’élimination de cette substance est exclusivement
urinaire .
Elle subit la filtration glomérulaire et elle n’est ensuite ni
réabsorbée ni sécrétée , donc se clearance mesure le volume du
filtrat glomerulaire formé par seconde.
Il est difficile d’interpréter un seul résultat ( 1 seul
paramètre ) donc les paramètres : créatinine urinaire et
plasmatique , sa clearance , urée sanguine et urinaire et
l’ionogramme sont fondamentaux chez les sujets présentant une
insuffisance rénale .

Technique de détermination de la créatinine :

Principe :
En milieu alcalin, la creatinine forme avec le picrate un complexe
jaune orange dont l’intensite de coloration est proportionnelle a
la concentration en creatinine.

Echantillon : - sérum , plasma recueilli sur héparine, EDTA .


- Urine = diluer l’urine au 1/5
l’hemolyse est genante.
Ne pas utiliser des serum lipemiques.

Reactifs :
1- standard creatinie 2mg/100ml.
2- Acide picrique 35 mmole/l.
3- NaOH 0.32 mmol/l.

Mode operatoire :
1 – Déproteinisation  :
Acide trichloro acétique TAC 1 ml
Sérum plasma 1 ml

Bien agiter au votrex , laisser reposer 10mn puis


centrifuger à 3500 trs /mn pendant 10mn .
On recueille le surnageant.
2 – Révélation :

Blanc Etalon Surnageant Urine diluée


Eau distillée 0,5ml / / /
Etalon / 0,5ml / /
T.C.A 1.2 N 0,5ml 0,5ml / 0,5ml
Surnageant / / 1 ml /
Urine diluée / / / 0,5ml
NaOH 1.6N 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
Ac picrique 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml

Bien agiter, laisser reposer 20 à 30mn à une T = ou < 25°c , lire


contre le blanc à 520 mn .
Stabilité de la réaction : 1 heure .

Calcul :
a/ sérum ou plasma :

Créatine en mg/l = Do échantillon x 20


Do étalon

b/ urine :
Créatinine en mg/l = Do échantillon x 20 x 50
Do étalon

Valeurs normales :
Serum :
Homme : 6- 11 mg/l
Femme : 5- 9 mg/l
Enfant moins de 5ans : 4 –6 mg/l.

Valeurs pathologiques :
La creatininemie constitue comme l’uree un index de
l’insuffisance renale.
Pour pouvoir interpreter, il faut l’associer a la clearance de la
creatinine, ce qui permet de surveiller le traitement et le
pronostic.
Si la creatinie sanguine > 20 mg/l, il ya altertation de 50% de la
fonction renale.

C-Clearance a la créatinine :

La clearance rénale d'une substance est le volume de plasma


débarrassé de cette substance en une minute ou en une seconde
par le rein. Elle s'exprime en ml/mn ou en ml/sec.
La clearance la plus souvent calculée est la clearance à la
créatinine, substance exclusivement filtrée. Cette clearance
mesure la quantité de plasma filtré grâce au glomérule de la
créatinine qu'il contient, c'est donc un test de filtration
glomérulaire.
La clearance à la créatinine est calculée à partir des résultats
de créatininémie et de créatininurie :

C = U x V x 1,73
P x S

C = clearance de la créatinine en ml/mn


U = concentration urinaire en mole /l
V = volume urinaire / mn
P = concentration plasmatique en mole /l
1,73 = surface corporelle standard en m2
S = surface corporelle du patient en m2
N.B  ! En routine, on assimile le rapport des surfaces
à 1, car on a rarement cette donnée sur le malade, la clearance C =
UxV/P

 Chez un sujet normal, la clearance à la créatinine est de 75 à


125 ml/mn

Variations pathologiques  :

Atteinte rénale bénigne : CLC = 50 - 75ml /mn


Atteinte rénale modérée : CLC = 15 - 50 ml /mn
Atteinte rénale grave : CLC = 5 - 15 ml /mn
Mauvais pronostic : CLC < 5 ml /mn
B I L A N H E P A T I Q U E

Actuellement, les examens les plus courants en médecine


hépatique suivent le type de symptômes qu’ils explorent .
La classification de FAUVERT repose sur 5 groupes de tests .
1 / Tests de rétention ou de cholestase .
2 / Tests de cytolyse hépatique .
4 / Tests d’epuration plasmatique .
5 / Tests de la réaction inflammatoire .

I-Tests de rétention ou la cholestase :

Ces tests impliquent l’étude de la fonction biliaire du foie .


En effet le foie évacue vers la bile de nombreuses substances
telles que la bilirubine, les sels biliaires, le cholestérol et
certaines enzymes .

Pigments biliaires Bilirubine et dérives :

La bilirubine est un pigment biliaire jaunâtre responsable de la


couleur de la bile et provenant de la dégradation de la
biliverdine, elle même dérivée de l’hémoglobine.
Insoluble dans l’eau, la bilirubine circule dans le sang combinée à
l’albumine .
On la désigne à ce stade sous le nom de bilirubine libre,
indirectes ou non conjuguée son taux sanguin normal est
inférieur à
10 mg /l de sang de la circulation, elle passe dans la cellule
hépatique , ou elle est conjuguée ( bilirubine directe ) à
l’acide gluconique .
Elle est éliminée dans la bile ( son taux sanguin est pratiquement
nul ) .
Une partie en est réabsorbée dans l’inter et le reste transformé
en stercobilinogène et éliminé..
L’augmentation du taux de bilirubine dans le sang entraîne son
passage dans les tissus de l’ictère .
Donc le dosage s’effectue sur les paramètres suivants :
 Bilirubine dont bilirubine totale, la directe et la libre,
ceci pour la bilirubine sérique .
 Bilirubine unitaire qui est normalement absente sauf dans
le cadre des ictères par obstruction .
 Urobilinogène et Urobiline qui sont des dérives .
Technique de dosage de la bilirubine :

Bilirubine totale

Témoin essai Essai


Solution N° 1 100 µl 100 µl
Solution N° 2 / 50 µl
Solution N° 3 500 µl 500 µl
Echantillon 100 µl 100 µl

Mélanger et attendre 10à60 mn à 20 – 25 °C

Solution N° 4 500µl 500 µl

Mélanger et attendre 5mn à 20 – 25’c lire contre témoin essai


à 578nm.

Résultat :
Bilan totale = 108 x Do mg/l

Bilirubine directe
Témoin essai Essai
Solution N° 1 100 Ml 100 Ml
Solution N° 2 / 50 Ml
Eau distilée 1 ml 1 ml
Echantillon 100 µl 100 µl

Mélange et attendre 5 mn à 20 - 25 °C
Lire contre le témoin essai à 546nm.

Résultat
Bilirubine directe = 144 x DO

Les résultats sont exprimés en mg/l.

* composition des réactifs :

- Solution 1 : acide sulfanilique.


- Solution 2 : nitrite de sodium.
- Solution 3 : mélange de révélateur : - cafeine.
- benzoate de sodium.
- acétate de sodium.
- Solution 4 : soude + tartrate double de sodium et calcium.

a) les valeurs physiologiques : Valeurs normales :


Bilirubine totale < ou = 13 mg/l
Bilirubine directe < ou = 3 mg/l

b) Variations pathologiques :
Lorsqu'on trouve un taux de bilirubine totale élevé (>14,5 mg/l),
on doit toujours doser la bilirubine conjuguée. La bilirubine libre
est calculée à partir de ces deux valeurs :
Bilirubine libre = Bilirubine totale - Bilirubine conjuguée
Selon les valeurs obtenus, on pourra retrouver la cause de
l'augmentation de la bilirubine totale.

BRB libre très augmentée :


- par destruction exageree des GR, et donc les incapacités de
conjuguaison du foie sont dépassées.
- anémie hélolytique , ictère tardif (enfant et adulte).
- hémoglobinopathie.
- ictère hémolytique néo – natale.

Remarque : quand la BRB libre est supérieur à 180 mg/l , il y a


risque d’ictère nucléaire chez le nouveau – né , car il est
liposoluble donc affinité avec le système verveau centrale :
* séquelles neurologiques et psychomoteurs.
* faire immédiatement exsanguino- transfusion .
- par déficit de la glucuronoconjugaison.

BRB conjuguée très augmenté :


- les hépatites , cancer du foie , cancer de la tete du pancréas.
- les cirrhoses , lithiases biliaires.

* augmentation du libre + la conjuguée :


- maladie de Dubin johnson .
-syndrome de Rotor = trouble de la fonction d’excrétion
hépatique

II / Test de cytolyse hépatique :

Une cytolyse hépatique correspond à la destruction d’un certain


nombre de cellules.
Les augmentations d’activité de certains enzymes sériques sont
plus spécifiques que celles d’ions minéraux ( K, Mg , Fe ) .
Le foie est l’organe le plus riche en enzymes, les deux tiers des
proteines de la cellule hepatique sont des enzymes.
Les enzymes liberees par les hepatocytes sont directement
deverses dans le sang, sans passage par le compartiment
interstitiel et lymphatique, d’ou la precocite de l’augmentation
de ces activites en cas d’infection hepatique
Transaminase : Les tissus riches en transaminases sont surtout
le foie et les muscles dont le cœur .Deux transaminases sont
dosée dans le sérum sanguin :

* Transaminase glutanopyruviques ( GPT / ALAT ) :


elle catalyse la reaction suivante en presence du coenzyme
phosphopyridoxal :
ALAT
Alanine + acide alpha cetoglutamique Acide
pyruvique + Acide glutamique
Son dosage se repose sur la reaction suivante :

Acide pyruvique lactate deshydrogenase ( LDH ) Lactate

NADH , H+ NAD +

Disparition à 340 nm

Donc il suffit de rapporter les substrats suivants pour doser


son taux d’activité:

Alanine , acide alpha cetogtutamique, NADH , H+ , et


l’enzyme LDH .

* Transaminases glutaminaoxaloaceltique : ( GOT /


ASAT )
De même mais le dosage se repose sur les réactions
suivantes :

ASAT
Acide alpha cetoglutarique + Aspartate Ac
oxaloacetique + Ac glutarique

Acoxalocentique Malate deshydrogenase ( MDH ) malate

NADH, H+ NAD +

Disparition à 340 nm .

Le NAD+ absorbe a 260 nm alors que le NADH2 absorbe a 260


et 340 nm.
Le dosage se fat suivant la consommation du NADH2 a 340 nm.

Valeurs physiologiques :
ASAT < 37 UI /l.
ALAT < 41 UI /l.

Variations pathologiques :
Dans les hepatites aigues : tres nette augmentation (jusqu'à
100fois la valeur normale).Cette augmentation precede de
plusieurs jours l’apparition de l’ictere.Le retour a la normale
s’effectue en 3 a 4 semaines en l’absence de complications.
Hepatites chroniques : persistance de l’augmentation des
aminotransferases (deux fois la normale)pendant environ 3mois.
Au dela de cette periode,cette infection hepatique fait
craindre une hepatite chronique agressive
Autres infections hepatiques :augmentation des
aminotransferases dans les icteres obstructifs,les cirrhoses et
les tumeurs
malignes du foie.
Infections cardiaques :
-Infarctus du myocarde : le myocarde est riche en (asat)
qui augmente en cas d’infarctus du myocarde.Le debut
d’augmentation se situe vers la 6 eme heure
environ,retour a la normale vers le 5 eme jour.
-Infections cardiaques : elles augmentent dans les
infections cardiaques qui engendrent une atteinte hepatique de
2
transaminases.

BILAN HYDRO - MINERAL

1- Calcium :
- Dans le plasma sanguin circulant,environ la moitie du
calcium present est sous forme ionisee libre Ca++
(phosphates de calcium ou bicarbonates de calcium).L’autre
moitie est en presque totalite liee aux proteines (serum-
albumine surtout).
- Dans l’urine,tout le calcium est sous forme ionisee.
- Une faible partie (environ 5% )du calcium circulant est
«complexe»,non ionise,lie a divers acides organiques,aux
phosphates et surtout aux nitrates.L’ensemble [calcium
ultra filtrable ou dialysable].seul le calcium ionise Ca++ est
physiologiquement actif.

 Principe : Méthode colorimétrique


En milieu neutre, le Ca forme avec l’arsenazo III un complexe
dont l’absorbance est proportionnelle à la concentration en
calcium dans l’échantillon.

 Réactifs :
Réactif 1 :
Tampon Mes pH6.50 ……………..100mmol/l.
Arsenazo III ……………………… 200µmol/l

Etalon :
Calcium 100mg/l = 10mg/dl = 2.5mmol/l.

Les réactifs, conservés à 2-8°C et à l’abri de la lumière, sont


stables jusqu’à la date de péremption indiquée.

 Réactif de travail :
Le réactif est prêt à l’emploi.
L’échantillon peut être :
Sérum.
Urine diluée au 1/3 avec de l’eau distillée. Le pH est ajusté à
3-4 avec de l’HCl, N/10.

 Valeurs normales :
Sérum : 88 – 102 mg/l
8.8 – 10.2mg/l
2.2 – 2.55mmol/l
La calcémie s’interprète toujours en fonction du taux de
protéines plasmatiques.

 Mode opératoire :
Longueur d’onde : 650nm.
Température : 37°C

Blanc Etalon Dosage


Réactif de travail 1ml 1ml 1ml

Eau distillée 20µl _ _

Etalon _ 20µl _
Echantillon _ _ 20µl

Régler le zéro de l’appareil.


Mélanger et lire la densité optique Do après 1mn d’incubation.
La coloration finale est stable au moins 1h.

 Calcul :
Do dosage / Do étalon x n
mg/l n = 100
mg/dl n = 10
mmol/l n = 2.5
n : concentration de l’étalon.
Pour le dosage du calcium dans les urines tenir compte du
facteur de dilution. Multiplier la concentration mesurée par 3.

 Performance :
* Linéarité :Le réactif est linéaire jusqu’à 150mg/l = 15mg/l =
3.75mmol/l.
Limite de détection : 0.85mg/l.

INTERFERENCES :

Selon les recommandations de la SFBC, diverses substances


sont ajoutées, en quantités croissantes, à un pool sérique
humain frais de titre normal ou pathologique.
Ces tests montrent que, l’hémoglobine, le magnésium et la
bilirubine n’interfèrent pas aux concentrations testées
(hémoglobine jusqu’à 5g/l, magnésium jusqu’à 90mg/l,
bilirubine jusqu’à 300mg/l).
Les interférences les plus importantes sont celles de l’acide
ascorbique, des triglycérides et du cholestérol : une
surestimation d’environ 10% se produit pour des teneurs en
acide ascorbique supérieure à 0.3g/l, en cholestérol supérieur
à 6g/l et en triglycéride supérieur à 4g/l.

NB  : le volume d’échantillon parallèlement à celui de l’étalon


et du blanc peut être augmenté jusqu’à 25µl sans modification
des performances`.

Diagnostic d’une hypocalcemie :


Elle peut etre cliniquement muette chez l’adulte,mais des qu’elle
atteint 2m moles chez le nouveau ne,chez le nourisson et chez le
jeune enfant,elle peut s’exterioriser par le syndrome tetanique :
*La calcemie est une urgence pediatrique devant toute
crise convulsive dont le diagnostic n’est pas evident.
Principales causes :
*Les hypoproteinemies,puisque la moitie du calcium
plasmatique est liee aux proteines.
*En pediatrie neonatale :La tetanie avec vomissements et
acces de cyanose pose un veritable probleme de reanimation.Il y
a une hypocalcemie physiologique vers 2mmoles/l qui doit ceder
en quelques jours.Penser au rachitisme,avec phosphatemie
abaissee,phosphatase alcaline elevee,devant une hypocalcemie
transitoire du nourisson.
*Chez l’adolessant et l’adulte,on observe trois causes
principales d’hypocalcemie :
-Il y a l’hyperparathyroidie souvent iatrogene
chirurgie thyroidienne avec un abaissement de la calcemie,de la
calciurie et de la phosphaturie et une augmentation de la
phosphatemie.
*Ce syndrome biologique,tres voisin de celui de
l’insuffisance renale est tres evocateur si le rein est intact et
s’il cede a la parathormone exogene.
*L’osteomalacie avec une hypocalcemie,une
hypophosphatemie,et une aug +mentation des phosphatases
alcalines.
*L’insuffisance renale chronique associant hypocalcemie
hypocalciurie a l’hyperphosphatemie.Une hyperparathyroidie
reactionnelle peut passer au premier plan du tableau
clinique.

Diagnostic d’une hypercalcemie :


L’hypercalcemie est souvent cliniquement muette ce qui justifie
la presence du calcium plasmatique dans un bilan systematique de
depistage, qui peut reveler un Adenome parathyroidien.
Des signes digestifs, neuromusculaires et psuchiques, un
sundrome cardio-vasculaire s’associe a un syndrome renal, vite
au devant de la scene, nephropathie hypercalcemique avec
lithiase et nephrocalcenose provoquant fuite urinaire d’eau,
d’ions Na+, K+,H+,
( soif et polyurie avecalcalose metabolique).
C’est une veritable urgence lorsqu’il ya desydratation associant
un syndrome douloureux abdominal et des troubles psychiques.
Un tel tableau pour une hypercalcemie peut etre l’indication
d’une epuration extrarenale urgente.
La principale cause est la destruction osseuse :
 Cancers secondaires des os a forme osteolytique avec
hypercalciurie.
 Adenome hyperparathyroidien qui associe hypercalcemie –
hypercalciurie+ hypophosphatemie – hyperphosphaturie.
 Myelome multiple et autres osteopathies.

2-Phosphore 

Principe :
En milieu acide et en presence de molybdate d’ammonium, le
phosphore forme un complexe phosphomolybdique dont
l’absorbance dans l’ UV ( 340nm) est proportionnelle a la
concentration en ions phosphates.

Reactifs :
- reactif molybdate. ( prêt a l’emploi)
- Etalon ; 50 mg/l.
La conservation des reactifs se fait a +4ºC jusqu'à la date de
peremption, a l’abri de la lumiere.

Echantillon :
- Serum non hemolyse ou plasma heparine ( wviter l’utilisation du
fluor).
- Urines de 24 h, acidifiee a pH =3-4, et diluees au 1/10 dans
l’eau distillee.

Stabilite du phosphore dans l’echantillon : 7 jours a +4ºC ou a


temperature ambiante.

Mode opératoire :

Blanc Etalon Echantillon


Eau distillée 10µl _ _
échantillon _ _ 10µl
Etalon _ 10µl _
Réactif 1ml 1ml 1ml

Mélanger, incuber pendant 10mn à 20 – 25°C, lire l’absorbance


de l’étalon et l’échantillon contre un blanc réactif.

Calcul :
Do échantillon / Do étalon x concentration de l’étalon (mg/l).
Valeurs normales :

Serum ou plasma Urines


Adultes Enfants
1000 mg /24h
25–42 mg/l Jusqu'à60mg/l

Linearite :
Pour des taux > 100 mg/l, diluer l’echantillon avec de l’eau
distillee.

3- Magnesium

Principe du dosage :
En milieu alcalin, la calmagite bleue forme avecv le magnesium un
complexe rose dont l’intensite de coloration est proportionnelle
a la concentration du magnesium presente dans l,echantillon
L’EDTA et le cyanure de K eliminent les interferences du calcium
et des metaux

Reactifs :
Etalon mg ………………. 20 mg/l
Reactif calmagite……………187 umole /l
Hydroxyde de K……………. 44.5 umole/l
EDTA……………………….250 umole/l
Cyanure de K ………………..6.14 mmole/l
Polyvinyl de pyrrolidone……..1.2 mmole/l.

Materiel :
Verrerie doit etre completement debarrasse de toutes traces
de Mg, pour cela on utilise un materiel neuf (tubes – embouts).

Echantillon :
Serum, ou plasma recuielli sur heparine, non hemolyse.
Urine diluee au 1/10 dans de l’eau distillee, acidifiee a pH = 3.4
avec HCl dilue.

Mode operatoire :

Blanc Etalon Echantillon


Eau distillée 20µl _ _
échantillon _ _ 20µl
Etalon _ 20µl _
Réactif calmagite 2ml 2ml 2ml

Bien melanger au votrex, lire a 546nm contre le blanc reactif.


Coloration stable pendant 1 heure a l’abri de la lumiere.
Calculs :
Do echantillon
[Mg] = Do etalon x n

n : concentration de letalon e= 20 mg/l

la methode est lineaire jusqu'à 50 mg/l, pour des taux


superieurs, diiluer le serum.

Valeurs normales :
Serum : 18 -25 mg/l
LCR 28-35 mg/L
Urine 300 –1000 mg/l.

Variations pathologiques :
Hypermagnesemie :
Insuffisance renale chronique.
Hypomagnesemie :
Malabsorption
Carence d’apport
Deficit enzymatique.
CONTROLE DE QUALITE

Le contrôle de qualité est un système très important qui


s’impose au niveau de chaque laboratoire, il permet d’éviter les
erreurs en les décelant précocement : c’est le but essentiel de
tous système de contrôle ; ces erreurs qui surviennent de façon
inattendue dans tout laboratoire peuvent être détecter et donc
corriger avant que le résultat ne soit délivrer au malade avec
toutes les conséquences sur la santé du malade et de perte de
crédibilité du laboratoire.
Le contrôle de qualité est défini comme une science qui permet
de déceler et corriger toutes les erreurs au niveau du
laboratoire.
Les erreurs d’un laboratoire ne peuvent être détecter qu’au
niveau du même laboratoire, grâce à son propre système de
contrôle.

Donc il est imposé à tout laboratoire, pour éviter les erreurs


possibles en les décelant à temps. Les erreurs sont
inattendues ; elles doivent être détectées et corrigées avant la
remise du résultat, pour éviter des conséquences néfastes.
Chaque laboratoire doit détecter ses erreurs par son propre
contrôle.

2. Quelques définitions :
*Contrôle de qualité : Science qui permet fréquence (%)
de détecter les erreurs et de les
corriger.
Elle se définit par deux critères :
la précision et l'exactitude.

Soit X0 une valeur vraie, lorsque les mesures


sont répétées « n » fois pour un même xo
prélèvement, par une même technique,
les valeurs de X se distribuent en une
valeurs attribuées répartition serrée autour de X0.

*Exactitude : Concordance entre le résultat trouvée et le


résultat le plus probable.
*Précision : Concordance d'une série de mesure d'un échantillon
dans une même série de manipulation = Répétabilité au cours de
plusieurs séries de manipulation = reproductibilité dans la
journée.
Moins une technique est précise, plus les résultats sont
dispersés.

3) Différents types d'erreurs :


Erreurs grossières : Les erreurs grossières affectent la
précision et l'exactitude.
La répartition est dispersée, la moyenne  s'éloigne de x. Ces
erreurs sont dues à l'inattention : erreurs de transcription,
confusion de tube, de prise d'essais, de réactif, de calcul.

Fréquence
Fréquence

A gauche, une
répartition
normale.
A droite, une
répartition dispersée
due à une erreur
grossière.

valeurs attribuées

Erreurs systématiques : Elles affectent l'exactitude


seulement.
La répartition est serrée mais la moyenne  s'éloigne de X0. Il
en résulte une déviation des résultats par défaut ou par excès.
Ce type d'erreur est du à l'altération d'un réactif, d'un appareil
de mesure.
Erreurs fortuites : Dites aussi aléatoires affectent la
précision seulement.
Elles sont inévitables car sont dues à l'opérateur.
N.B  !  : Les différents types d'erreurs sont maîtrisées
par l'automatisation.

4) Causes d'erreurs :

Phase préanalytique : les causes d'erreurs sont la prise de


médicaments et le régime alimentaire principalement. Pour
éviter de commettre des erreurs durant cette phase, il est utile
de surveiller trois paramètres :
*Le patient : On doit assurer au niveau du laboratoire une
réception correcte, efficace et précise avec interrogatoire du
patient sur son jeûne, son rythme nycthéméral, d'éventuelles
aménorrhées chez les patientes, la prise de médicaments
particuliers…
*Les prélèvements : ils doivent être de bonne qualité,
pratiqués dans des conditions adéquates, avec un matériel et
des récipients propres.
*L'identification : elle consiste en la numérotation correcte du
prélèvement et la transcription des bons d'analyses.

Phase analytique : Pour éviter les erreurs durant cette phase,


il faut mettre au point l'organisation interne du laboratoire
(répartition géographique des locaux, des unités d'analyses…),
l'éducation du personnel (formation, information, roulement, …)
ainsi que l'application des consignes rédigées sur le manuel
pratique de maintenance et de travail.
Les techniques d'analyse doivent être validées avant d'être
adopter au niveau du laboratoire. Il faut qu'elles soient fiables
du point de vue : Praticabilité et Efficacité.
*Praticabilité : c'est la commodité d'exécution d'une technique.
Elle dépend du temps de la réaction, de la toxicité des réactifs,
de leur coût, de la possibilité d'automatiser la technique…
*Efficacité : c'est l'assurance d'un bon résultat. Elle est
prouvée par la concordance entre le contexte clinique et
biologique et la reproductibilité des résultats.
Apres validation, on établit une fiche technique qu'on suit à la
lettre et on contrôle quotidiennement la reproductibilité des
résultats.
Le suivi des recommandations de la fiche technique ne suffit pas
à éviter les erreurs, on doit aussi faire attention aux :
- Réactifs : durée de conservation, date de péremption,
condition de reconstitution et de fractionnement, économie du
réactif sans nuire à la qualité de la réaction.
- Etalonnage : concentration de l'étalon, fiabilité des dilutions.
- Matériel : maintenance et contrôle des appareils.

Phase post analytique : Durant cette phase, on doit valider les


résultats et les transcrire avant de les rendre. On doit éviter
toute erreur de calcul, de transcription sur les registres ou sur
les fiches de contrôle et de présentation des résultats (unités,
fourchettes de normalité, interprétation et communication des
résultats).

5) Moyens de contrôle : le contrôle se fait au moyen d'étalons


et de sérum et de moyens statistiques.
Moyens statistiques : L'étude statistique dans le contrôle de
qualité réside dans l'établissement de la courbe de Gauss :
Pour un même matériel, toute grande série de mesures fournie
des résultats qui se repartissent systématiquement par rapport
à une moyenne de fréquence augmentant selon la classique
courbe ou histogramme de Gauss.
Exemple: On prend pour une étude statistique une
population saine à la quelle on mesure la glycémie par la
technique GOD/ POD ; on obtient la courbe de Gauss suivante :
pourcentage de cas (%)
2,5 %

Glycémie (g/l)
0,7 0,98 1,1

La courbe de Gauss se définie par trois indices :

 La moyenne  = ξ Xi Xi étant une valeur que prend l'aléatoire X,


N N le nombre de cas (impair, généralement
31)

ξ ( - Xi) 2
 L'écart type δ = N - 1

L'écart type dit aussi "déviation standard" exprime


l'importance de la déviation autour de la moyenne.
Les valeurs normales se répartissent dans 95% des cas entre les
valeurs :
(2 δ et + 2 δ )

pourcentage de cas (%)

80 %

95,5 %

99,7 %
Glycémie(g/l)
-3δ -2δ -δ  +δ +2δ +3δ
 Le coefficient de variation Cv :
Cv = δ x 100

Le Cv exprime la précision de la réaction.
Plus le Cv est fiable, plus la méthode est précise et plus la
répartition est serrée.

Etalon et sérum de contrôle :


*Etalon : Une solution étalon est une solution de concentration
connue contenant un à deux substrats. Il existe deux types
d'étalons :
-L'étalon primaire : étalon de haute pureté.
-L'étalon secondaire : étalon moins pur car dilué.
*Sérum de contrôle : C'est l'équivalent d'un sérum humain avec
tous les paramètres disponibles dans le sérum et dosable par les
techniques du laboratoire. Il existe deux types de sérum de
contrôle :
-Sérum de contrôle interne : C'est un sérum dont la valeur
moyenne est obtenue par mélange de plusieurs sérums de
malade. On rajoute tous les jours des sérums jugés normaux
pour obtenir un sérum de valeur moyenne normale.
-Sérum de contrôle externe : Ce type de sérum est
généralement livré sous forme lyophilisée et reconstitué par de
l'eau distillée. Il est ensuite aliquoté dans plusieurs petits cônes
et conservé au congélateur à - 20 °C, pour éviter le gaspillage.

Au niveau du laboratoire, deux sérums de contrôle externes


sont utilisés :
Précipat® : sérum dont les valeurs sont égales aux valeurs
pathologiques.
Précinom®  : sérum dont les valeurs sont égales aux valeurs
normales.
Ces sérums peuvent être extraits d'humains ou de bovins.
Pour chaque technique, on accompagne le dosage des échantillons
et de l'étalon d'un sérum de contrôle. Les résultats ne peuvent
être interprétés si les valeurs obtenues pour le sérum de
contrôle ne sont pas comprises dans la fourchette de valeurs
attendues.
Le contrôle se fait sur plusieurs jours (31 jours), pour chaque
jour, une valeur est trouvée ; elle doit être marquée sur la
courbe des valeurs contrôle.Si la déviation de la courbe se fait
toujours du même coté (plus de 3 points successifs du même
coté de la courbe), il faudra chercher la cause d'erreur et
l'éviter.
AUTOMATES

ELEXIS

C’est un système d’analyse multisérie entièrement


automatique pour la détermination des tests immunologique
utilisant le procédé de ECL.
Le système effectue des mesures sur des échantillons de
sérum, de plasma et des urines mais au niveau du laboratoire
on utilise principalement le plasma
En fonction du test les résultats sont exprimés de manière
soit qualitative soit quantitative.
Les échantillons des patients, les réactifs, les diluants, les
calibrateurs et les contrôle nécessaires à une analyse de
routine sont chargés sur le plateau échantillon/réactif
L’analyseur est chargé de 2 flacons contenants le réactif
système PROCELL et 2flacons contenants le réactif système
CLEANCELL :
- PROCELL : solution tampon nécessaire à la cellule de
mesure pour effectuer la réaction ECL.
- CLEANCELL : sert à nettoyer la cellule de mesure

Les marqueurs tumoraux

1. Généralités :

Ce sont des molécules synthétisées par les cellules cancéreuses


à un stade d’évolution de la tumeur, ces protéines anormales du
point de vue caractéristique et taux, passent dans le sang ou
d’autres liquides biologiques(ascite ; LCR ; liquide pleural….) ; ou
le biologiste pourra les apprécier :
- Qualitativement par les bandelettes réactives.
- Quantitativement par un appareil de mesure.
N.B : un bon marqueur devrait idéalement présenter une
bonne spécificité d’organe ou de tissu afin de diagnostiquer la
localisation tumorale, de plus la sensibilité devrait permettre
un diagnostic précoce.
En pratique on s’apercevait que l’augmentation de la sensibilité
entraîne le plus souvent une perte de spécificité.
Il est rare qu’un seul marqueur suffise à l’établissement du
diagnostic ceci explique la tendance actuelle qui consiste à
rechercher d’autre marqueur en complémentarité des autres
marqueurs pour augmenter la sensibilité et la spécificité,
plutôt spécifique mais qui manque de sensibilité qui est le plus
faible taux détecter par l’appareil.

2. Definition :

C’est des molécules de natures souvent glycoproteique


produites par des cellules tumorales trouvées en quantité
détectable dans la circulation se sont soit :
 Des hormones : bHCG, calcitonine.
 Des enzymes : NSE.
 Antigène de différenciation : CA15-3.
 Antigènes onco-fœtaux : AFP, ACE.
Suite à l’utilisation d’anticorps monoclonaux ces molécules
antigéniques reconnues comme étant des marqueurs peuvent
être doser et sont utiles dans le diagnostic et le suivie du
cancer.
Les plus connus et détecter par cette méthode sont : C15-3,
CA19-9, CA125.

Les marqueurs tumoraux


DOSAGE PAR ECL(électro-chimiluminescence) :

 Principe :

Le procédé peut être utilisé de nombreuses molécules y


compris les composés de RUTHENIUM, OSMOIUM, et de
RHENIUM.
L’ECL est une réaction de chimiluminescence au cour de
laquelle des éléments fortement réactifs sont générés à la
surface d’une électrode à partir d’un précurseur Stable ex :
Le RUTHENIUM pour ELEXIS.
Ces éléments très réactifs réagissent entre eux pour
produire de la lumière ; les réactions de chimiluminescences
qui entraînent l’émission de la lumière à partir de complexe de
rhutenium sont déclenchées électriquement plutôt que
chimiquement.
Ces réactions obtenues en appliquant une tension à l’électrode
qui maintien les microparticules tapissées de
STREPTAVIDINE sur lesquelles sont fixés les immuns
complexes.
3réactif :
Anticorps marqués à la biotine.
Anticorps marqués au rhutenium.
Microparticule magnétique.
Le test propose 3 principes pour détecter l’anticorps :
** par compétition.
** par sandwich.
** par immuno-capture.
On utilise surtout la méthode sandwich.
Un cycle analytique dure 20mn :
 1ere réaction : dure 18mn : l’échantillon est distribué
dans des cuvettes réactionnelles avec un anticorps anti-
analyte (AFP, HCG….) biotiné c’est à dire à la biotine et
autre anticorps marqué avec le RHUTENIUM, l’analyte
se comportant comme un antigène va être pris en
sandwich entre ces 2 anticorps dont chacun est dirigé
contre un site diffèrent de fixation au niveau de la
molécule, on incube pendant 9mn, le résultat est la
formation du complexe.
 2eme réaction : les microparticules magnétiques, sur
lesquelles est fixée la STREPTAVIDINE, sont ajoutées ;
après 9mn l’anticorps marqué à la biotine se fixe sur la
STREPTAVIDINE.
 3eme réaction : à la fin de la 2eme incubation le mélange
réactionnel est transféré de la cuvette vers la cellule de
mesure, les complexes sont retenus par un aimant sur
l’électrode, l’excès du réactif et des autres constituants
de l’échantillon seront éliminé par flux de procell.
 4eme réaction : la réaction de chimiluminescence est
déclenchée électriquement pour générer la lumière dont
la quantité est proportionnelle à la quantité d’antigène
dans l’échantillon.
Le calcul de la concentration d’antigène et l’évaluation sont
effectuer au moyen d’une courbe de calibration présente en
mémoire au niveau de l’ELEXIS tracée à partir de 6 points
dans le laboratoire maison, nous on trace une courbe à partir
de 2 points qui doit être superposable à la première courbe.

5.APPLICATIONS CLINIQUES :

5.1 Dépistage d’un cancer chez un sujet sain :

- Calcitonine et AFP : sont utiles pour le dépistage d’un


cancer chez les sujets appartenant à des populations à
risque.
La calcitonine est une hormone produite par les cellules C de
la thyroïde, les normes varient d’un laboratoire à un autre.
Une augmentation modérée du taux basal associé à une
augmentation de ce taux 2 fois après injection de
Pentagastrine, qui stimule les cellules cancéreuses, suggère la
présence d’un cancer médullaire de la thyroïde, grâce à leur
grande sensibilité le dosage de la Calcitonine sérique est très
important dans le dépistage d’un cancer médullaire de la
thyroïde chez les sujets à risques et le dépistage de µCMT
guérissable.
Mais cet intérêt est limité car on ne peut pas distinguer entre
un µCMT et une hyperplasie benigne des cellules C de la
thyroïde lorsque les taux sont faibles.
L’AFP est une glycoprotéine, c’est la principale retrouvée chez
le fœtus, elle disparaît à la naissance.
On la trouve également chez le sujet adulte dans certains
situations :
Physiologiques : femme enceinte.
Pathologiques : hépatopathies bénignes.
3% des cas de cirrhose.
4% des cas d’hépatite virale.
80% des cas de carcinome hépatocellulaire CHC.
- PSA : c’est l’antigène spécifique de la prostate, il n’est pas
spécifique de cancer mais spécifique d’organe, son
augmentation est observée dans 55 à 86% en cas
d’hyperplasie prostatique benigne, et 96% des cas de
cancer prostatique.
A un taux critique on calcul PSA libre puis on effectue le
rapport :
PSA libre / PSA total
Si le taux est > 0.20 : c’est une hyperplasie bénigne.
Si le taux est < 0.20 : on pratique une biopsie pour orienter le
diagnostic.

5.2 détection d’un cancer chez les malades symptomatiques et


asymptomatiques :

Les marqueurs utiles pour le dépistage d’un cancer le sont


aussi pour la détection des tumeurs.
 AFP : utiliser pour la détection de rumeurs germinales de
testicules.
 ß HCG : L’HCG est une hormone dimérique composée de 2
sous unités α et β liées de façon non covalente. Les 2 sous
unités sont codées par des gènes différents de ce fait les
2 sous unités libres peuvent être trouvées dans la
circulation indépendamment de HCG dimèrique c’est le cas
de cancer testiculaire germinal qui sécrétant β HCG. Plus
de 90% des malades ont au moins l’un des marqueurs : AFP,
β HCG, α HCG ou HCG libre dans le sang. L’AFP et β HCG
sont 2 marqueurs importants dans le diagnostic du cancer
testiculaire ou coriocarcinome placentaire.
 CA 19-9 : glycoprotéine mucineuse de PM élevé ; des
taux élevés jusqu’à 37U/ml sont trouvés dans des
affections bénignes du pancréas, ces taux vont de 7 à 19%
et dans 80% des cancers pancréatiques.
 NSE : Enolase Neurospécifique, c’est une enzyme de la
glycolyse formée de 2 sous unités α β ou. La NSE est
trouvée dans les neurones et les cellules neuro-endocrine,
un taux sérique élevé traduit le développement de tissus
neuro-endocriniens anormaux. L’augmentation est observée
chez 65 à 85% des malades ayant un cancer bronchique des
petites cellules, de ce fait le dosage de NSE peut
contribuer au diagnostic d’un cancer du poumon à petites
cellules chez les malades ayant une maladie broncho-
pulmonaire d’origine indéterminée répétée. Donc le NSE
peut détecter un cancer.

5.3 Surveillances des maladies cancéreuses et la détection d’une


récidive :

L’intérêt des marqueurs dans la surveillance est la détection


d’une récidive et surtout évaluer le pronostic de la maladie qui
est l’intérêt majeur.
La valeur pronostic peut se manifester selon 2 aspects
différents :
 Aspect statique : c’est la concentration du marqueur qui
est le reflet de la masse tumorale sécrétante.
 Aspect dynamique : c’est la vitesse de décroissance de la
concentration du marqueur sous l’effet d’un traitement.
Les marqueurs utiles pour le dépistage et la détection de
certains cancers présentent un intérêt limite, ces
marqueurs ont un intérêt surtout pour la surveillance grâce
à leur sensibilité.
Leur dosage peut détecter la présence d’une maladie
résiduelle alors que l’examen clinique et les techniques
d’imagerie médicale ne donnent pas d’information. Une
augmentation significative du taux d’un marqueur peut relever
une récidive tumorale plusieurs mois avant l’évidence clinique
ou radiologique. Lors d’un traitement des tumeurs
productrices, il faut faire le dosage plusieurs semaines
surtout après l’initiation d’une chimiothérapie qui peut
provoquer une augmentation transitoire (les cellules éclatent
sous l’effet de la chimiothérapie et libèrent les marqueurs, on
obtient un pic avant digestion des marqueurs par le
médicament) ex : après un examen clinique de prostate.
Parmi ces marqueurs ACE, CA 125, CA 15-3.

- ACE : c’est l’antigène carcino-embryonnaire, produit par


des cancers d’histologie aussi différentes que les cancers
du sein, poumon, rein…il est ubiquitaire, c’est une
glycoprotéine trouvée à la surface cellulaire, les
concentrations varient de 2.5 à 5ng jusqu’à 10ng chez les
fumeurs. De nombreuses maladies bénignes peuvent
entraîner l’augmentation de l’ACE telle que : - maladie
hépatique : hépatite, cirrhose.
- maladies inflammatoires gastro-intestinales :
RCEH(réctocolite enterohépatique) ; maladie de Crohn.
L’augmentation de l’ACE dans :
36% des cas chez les malades stade A et B.
74% des cas chez les malades stade C.
83% des cas chez les malades stade D.
Le dosage de l’ACE n’est pas utile pour le diagnostic précoce
d’une tumeur mais l’intérêt majeur est le pronostique de
maladie et surtout pour la surveillance des maladies traitées.
L’élévation du taux d’ACE est le meilleur indicateur de la
récidive.

- CA 125 : c’est une glycoprotéine détectée grâce à un


anticorps monoclonal OC125, elle est plus ou moins
spécifiques des organes génitaux femelles surtout l’ovaire,
elle augmente dans :
Le cancer ovarien.
Dans 1% des cas sains surtout la femme enceinte, dans 6%
des cas ayants une maladie bénigne (kystes ovariens, fibrome,
endométriose ) ou une métaplasie ovarienne.
Le début d’une grossesse, hépatite, pancréatite.
Son intérêt majeur est dans le suivie thérapeutique et les
contrôles de l’évolution des cancers séreux de l’ovaire.

- CA 15-3 : C’est le marqueur le plus spécifique du cancer


du sein non métaplasique, 99% des sujets sains ont un taux
de CA15-3 inférieur à la normale ; il augmente dans 10 à
30% des cas de cancer du sein non métaplasique. La
sensibilité du CA15-3 est fonction de la taille de la tumeur
mammaire : il exista une bonne corrélation entre le taux de
CA15-3 et la taille de la tumeur primitive et l’extension
métaplasique, donc le CA15-3 est d’autant plus élevé que la
tumeur est évolutive.

L’intérêt majeur est la surveillance de la décroissance du


taux d’un marqueur chez un malade sous traitement :
suivie et surveillance.
Et surtout c’est la detection des récidives infracliniques,
et la prise en charge.

L’analyseur automatique  l'Hitachi ® :


Définition : L'Hitachi est un automate qui à pour rôle l’analyse
de plusieurs paramètres ; les plus utilisés en routine sont :
- Glycémie. - GPT - Protéines
totales
- Urée. - GPO. - Albumine.
- Ac. urique. - Amylase. - Cholestérol
- Phosphore. - Calcium. - Créatinine.
-Triglycérides.

Il existe néanmoins 46 tests programmables sur cet automate


seul les tests dont les réactifs sont disponibles et ceux qui sont
plus fréquemment demandés sont pratiqués.

Ces analyses sont effectuées sur différents types


d’échantillons : sérum, plasma, urines. En pratique, on utilise
seulement les sérums des patients recueillis sur prélèvement
de sang sur tube sec ou sur tube hépariné.
L’analyseur Hitachi® reproduit les mêmes méthodes d’analyse
que celles utilisées en manuel, à la différence prés que les
erreurs de manipulation sont évitées.

Ce sont, en outre, des microméthodes utilisant des volumes de


sérum et de réactif très faibles de l’ordre du microgramme. Ces
techniques sont précises car standardisées et utilisant des
micropipettes et une aspiration automatique.
Composition de l'Hitachi : L’appareil Hitachi comprend 2
unités :

L’unité analytique  : Se compose de 7 systèmes opérationnels :


- Un système de contrôle.
- Un système Echantillons.
- Un système Réactifs.
- Un système Rinçage réactifs.
- Un système de Cellules réactionnelles.
- Un système mesure photométrique.
- Un système ISE = sert à doser Na+, K+ ; , Cl–

L’unité de contrôle  :  se compose de :


- Un moniteur.
- Un clavier.
- Une imprimante.
Ces 2 unités sont reliées de manière à ce que les résultats des
analyses effectuées dans l’unité analytique soient transmis à
l’unité de contrôle.

Structure générale de l'unité analytique

1. Rotor pour échantillons

2. Pipettes à échantillons

1. Solution dilution ISE

4. Disque de réaction/ Bain d` incubation

2. Pipettes à réactifs
3. Agitateurs automatiques

7. Photomètre
L’unité analytique comporte  :
- Un rotor ou portoir tournant à échantillons qui peut
supporter jusqu’à 50 malades. Une partie du rotor est réservée
à l’urgence, elle peut supporter jusqu'à 20 malades. Le rotor
tourne pour mettre l’échantillon approprié sous la pipette à
échantillon.
- Des pipettes qui aspirent puis transportent les sérums et les
réactifs vers les cupules réactionnelles puis vers le système
photométrique :
1 pipette échantillon.
2 pipettes réactifs.
2 agitateurs automatiques. (Les agitateurs
automatiques mélangeant l’échantillon après l’addition de
chaque réactif.)
2 pipettes verticales qui servent à laver les cuves.
- Des compartiments réfrigérés de l’unité analytique
comportent :
*2 compartiments pour les réactifs
* 1 compartiment pour les contrôles de qualité et les
calibrateurs
Ces compartiments restent réfrigérés même lorsque
l’appareil est éteint (seul le compartiment de réfrigération
reste allumé).

- Lorsque le système ISE est sélectionné, l’échantillon est


déposé dans le compartiment dilution ISE.
- Lorsque le système chimiophotométrique est sélectionné,
l’échantillon est déposé dans la cupule réactionnelle du
disque réactionnel.
- Après que l’échantillon a été déposé dans la cellule
réactionnelle, les pipettes de réactifs ajouteront les
différents réactifs, ces additions sont séparées par des
durées de réaction plus ou moins court.
- L’incubation se passe dans les cellules réactionnelles
immergées dans un bain-marie réglé à 37°C. Les cellules
réactionnelles tournent à travers le trajet optique du
photomètre et la mesure est faite.
- L’unité de rinçage des cellules jette les produits de réaction
et lave les cupules réactionnelles pour leur réutilisation.

Les réactifs : Ils sont fournis en kits avec leurs codes à barre
respectifs. Ils doivent être placés dans le compartiment qui
leur est réservé. A chaque nouvelle manipulation, le niveau des
réactifs est vérifié automatiquement. L’unité de contrôle
signale toute déficience en réactifs.

L’eau désionisée utilisée dans les dilutions et le rinçage :


L'eau désionisée est obtenue par passage de l’eau de
distribution publique sur une résine échangeuse d'ions. Cette
résine est reliée à un cadrant de contrôle qui signale chaque
fois que l’aiguille est en zone rouge qu'il faut changer la résine.
La qualité de l’eau est mesurée à chaque fois et détermine si la
désionisation est encore valable ou si la résine est trop chargée
pour désioniser l’eau.
La résine échangeuse d'ions est changée tous les 5 à 7 jours,
selon que l’aiguille soit dans le rouge ou pas. Il faut choisir une
résine de bonne qualité pour obtenir le maximum de durée
d’utilisation. La résine est fournit dans des fûts fermés
hermétiquement et qui ne doivent être ouvert que lorsque
cette résine n’est
plus utilisable pour éviter toute altération.
Caractéristique de l’analyseur HITACHI® :

- Système informatisé permettant la modification des


données et l'impression des résultats. Ce système utilise
des disquettes portant les programmes des tests à
effectuer.
- Calibration valable pendant 24 heures.
- Echantillons rangés par code à barre.
- Réactifs rangés par code à barre.
- Utilisation de différents types d'échantillons : urine, sérum
ou plasma.
- Température standardisée internationalement, pour tous les
tests, à 37°C.
- Stockage réfrigéré des réactifs pour 8 contrôles et 17
calibreurs.
- Réalisation de tests qualitatifs et quantitatifs,
potentiomètriques ou photométriques.

Avantages de l’analyseur HITACHI® :

- Complètement automatique  : il suffit d’enregistrer le


numéro de l’échantillon et les analyses à effectuer, de
remplir les portoirs à échantillon et de régler l’appareil
grâce à une calibration à chaque nouvelle manipulation,
chaque 24 heures environ.
- Discret  : cet appareil n'émet pas de bruit.
- Résultats statistiquement fiables
- 360 tests par heure => Rapide.
- Utilisation de microcupules => Réduction des possibilités
d'évaporation et économie en échantillons et en réactifs
- Fonction maintenance automatisée.
Rôle du technicien sur HITACHI® :

Mise en marche de l’appareil  : Chaque matin, l'Hitachi® est


mis en marche de la manière suivante :
- Eteindre le compartiment réfrigération 0.
- Brancher le câble de l'appareil sur le tableau onduleur.
- Appuyer sur touche 1 de l'onduleur pour qu'il se mette en
marche et vérifier ses batteries.
- Attendre jusqu'à l’apparition d’une lumière verte qui ne
clignote plus et reste stable au vert.
- Mettre en marche le compartiment de réfrigération I.
- Poursuivre comme d’habitude

Calibration  : L’analyseur est régler sur deux types de


calibrations :
Calibration initiale
Recalibration
Lors de la calibration initiale effectuée chaque matin après la
mise en marche de l’appareil, on dépose dans le compartiment
de calibration les échantillons suivants :
Dans l’emplacement C1 : sérum précinorme ®.
Dans l’emplacement C2 : sérum précipate ®.
Dans l’emplacement S18 : CFAS.
Dans l’emplacement S 19 : NaCl 9 ‰ eau physiologique.
Après avoir déposé ces solutions dans des petits tubes
coniques et fermer le couvercle de l’appareil, on démarre la
calibration.
La calibration se fait en deux points :
Un point CFAS
Un point Eau physiologique (NaCl à 9 ‰)
On obtient, grâce à l’unité de contrôle, les résultats de
calibration pour les paramètres programmés sur l'appareil.
Après ce dosage, une liste de calibration est imprimée :
Pour chaque paramètre, on obtient une valeur CFAS et une
valeur NaCl à 9‰
En cas d’anomalies, on retrouve au lieu de la valeur attendue un
point d’interrogation signalant qu’il faut lancer une
Recalibration.
Si la seconde calibration ne marche toujours pas, le paramètre
en question ne pourra pas être dosé pour les échantillons de
patients.
Les sérums de contrôle précinom® et précipate® sont soumis
également au dosage des paramètres. Si les valeurs de contrôle
sont trop éloignées des valeurs attendues pour un paramètre
donné, celui ci ne pourra être doser pour les échantillons de
patients à tester.

Programmation : Après mise en marche de l'appareil et


calibration, le technicien doit programmer l'appareil pour qu'il
effectue les différents dosages pour les différents
échantillons. La programmation peut se faire de deux
manières :
Programmation paramètre par paramètre
Programmation patient par patient
La seconde méthode est la plus pratique et la plus utilisée. Le
technicien, à l'aide d'une liste regroupant les analyses à
effectuer pour chaque malade, inscrit sur l'unité de contrôle le
numéro de l'échantillon et les analyses à effectuer pour cet
échantillon. Les résultats pourront ainsi être récupérés au fur
et à mesure que l'unité analytique effectue les dosages.

N.B  ! Si au cours de la manipulation on entend un bip sonore


(discontinu) et si on constate que sur l’onduleur la lumière
verte centrale est éteinte et que qu’une lumière orange est
allumé, c'est signe d'une baisse de tension ou d'une coupure de
courant. L’onduleur assure une marche normale de l’appareil au
maximum 15 mn sans électricité ce qui permet de terminer le
plus rapidement ses applications et d'éteindre l’Hitachi® .

Fermeture de l'Hitachi® : lorsque le travail est terminé :


*Eteindre l’appareil devant.
*Eteindre le compartiment de réfrigération.
*Eteindre l’onduleur en appuyant sur la touche 0.
*Débrancher le câble d’alimentation de l’appareil
(tableau onduleur).
*Brancher le câble sur le tableau secteur.
*Allumer le compartiment de réfrigération.
ANNEXE : BIOCHIMIE DES LIQUIDES
BIOLOGIQUES
Il s'agit de :
* Liquide céphalo-rachidien  : L.C.R.
* Liquide d'ascite.
* Les urines.

1) L.C.R
L.C.R  :
Rappels : Le liquide céphalo-rachidien (LCR) constitue le
milieu circulant du système nerveux central, son volume est de
140 ml  30 chez l’adulte et il est renouvelé 6 à 7 fois par jour.
Les échanges sang – LCR se font à travers la barrière hémato-
encéphalique et toute altération de cette barrière provoque
une transsudation accrue des protéines vers le LCR, soit en cas
de compression mécanique, d’accidents vasculaires ou
infections telle que la méningite.

La ponction lombaire : est un examen souvent appréhendé par


le malade, et pourtant, ce geste s'effectue la plupart du temps
sans entraîner de douleurs.
Ce prélèvement de liquide céphalo-rachidien dans lequel baigne
le cerveau et la moelle épinière se réalise en introduisant une
aiguille entre deux vertèbres, dans le bas du dos. Il est
indispensable pour diagnostiquer une méningite et isoler un
germe, mais utile aussi dans certaines maladies touchant le
cerveau ou les méninges. Cette ponction ne nécessite pas de
préparation particulière et doit s'effectuer au cours d'une
hospitalisation.
Le malade doit se mettre, de préférence, assis au bord du lit,
le dos arrondi, en embrassant un oreiller, position qui permet
aux vertèbres de s'écarter légèrement, facilitant ainsi
l'introduction de l'aiguille. Si la position est difficile à obtenir,
on peut installer le malade allongé sur le côté, les jambes
repliées en chien de fusil et le dos arrondi.
Le médecin enfonce alors l'aiguille après désinfection de la
peau et, éventuellement, anesthésie locale, mais la douleur
cutanée lors de l'anesthésie ou de la ponction est pratiquement
équivalente. Le passage de l'aiguille à travers les tissus jusque
dans le canal rachidien, qui contient, à un niveau supérieur, la
moelle, entraîne juste une sensation de brûlure de très courte
durée.
Après avoir prélevé un peu de ce liquide, dans plusieurs tubes,
le médecin retire l'aiguille et comprime le point de ponction
pendant quelque temps.
Après le prélèvement, il faut rester allongé pendant au moins
vingt-quatre heures, bouger le moins possible et boire
beaucoup d'eau pour éviter d'avoir mal à la tête. En effet, la
soustraction d'une petite quantité de liquide céphalo-rachidien
suscite une diminution de la pression de ce liquide, ce qui est
une source possible de céphalées.
Si, toutefois, de telles douleurs apparaissaient, des
médicaments antalgiques vous seraient prescrits. Ces céphalées
durent rarement plus de deux à trois jours.
On a une hyper-protéinorachie de 5 g/l qui peut aller jusqu’à 10
à 20 g/l. cette augmentation contraste avec une réaction
cytologique faible, on évoque la compression médullaire :
- Soit extrinsèque  : c’est la tuberculose osseuse de la moelle
épinière = raclé.
- Soit intrinsèque  : tumeur de la moelle épinière.
Autres cas d’augmentation :
- les pachyméningites,
- polyréticulonévrite de Guillain Borne,
- sclérose en plaques,
- diabète surtout avec neuropathie,
- Accidents vasculaires.

Glycorachie : C’est le taux de glucose dans le liquide céphalo-


rachidien.
a. Dosage  : Se fait de la même manière que celui de la
glycémie, le principe des réactions mises en jeu étant le
même, seules les valeurs changent.
b. Valeurs normales  : Un taux normal du glucose dans le LCR
varie entre 50-100 mg/ 100 ml ou 2,8 à 4,2 mmol /1.
c. Variations pathologiques  :
L’hyperglycorachie est rencontrée dans l’encéphalite
épidement et dans le cas de zona (maladie infectieuse due à un
virus appartenant au groupe des Herpès – virus (ce même virus
provoque la varicelle).
L’hypoglycorachie ou diminution du taux de glucose dans le LCR
est observée dans le cas des Méningites purulentes.

2) Liquide d'ascite
d'ascite  :
La ponction d'ascite : concerne le liquide présent dans la
cavité péritonéale. Elle s'effectue à l'aide d'une aiguille fine
que l'on introduit dans la cavité péritonéale, en piquant le côté
gauche de la paroi abdominale. Sans douleur, elle peut
éventuellement être réalisée au cabinet du médecin.
L'analyse de ce liquide permet de l'attribuer à un
fonctionnement défectueux du foie, des reins ou du cœur ou à
une inflammation du péritoine, parfois d'origine infectieuse ou
tumorale.
Enfin, l'on peut profiter de la ponction pour évacuer une
grande partie de ce liquide.
Dosage des protéines : Par la méthode de Biuret.
Réaction de Rivalta : Dans un verre contenant 50 ml d`acide
acétique à 5%, ajouter une goutte du liquide biologique.
Rivaltat (+)  : la goutte se divise en plusieurs stries
blanchâtres ressemblant à la fumée de cigarette : liquide
exsudatif (riche en protéines.)
Rivaltat (-)  : la goutte tombe sans changement : liquide
transudatif (pauvre en protéines.)
Variations pathologiques : * Transsudat  : cas de cirrhose.
* Exsudat  : cas d'insuffisance
cardiaque, certains cancers de l'abdomen, tuberculose
péritonéale, pancréatite obstructive, hypertension portale …

3) Les urines
urines  : L'étude comportera :
* Chimie des urines.
* Dosage de la protéinurie.
* Protéines bence-Jones.
L'ensemble est traité dans le chapitre «bilan rénal ». 
C o u r b e s é t a l o n s

Principe des courbes étalons :

Pour préparer une courbe étalon à partir d'une solution mère


de concentration Ci, on utilise la loi de dilution :

Ci Vi = Cf Vf

Ci étant la concentration de la solution mère.


Cf étant la concentration de la solution fille.
Vi étant le volume prélevé de la solution mère.
Vf étant le volume finale de la solution fille.
(Vf - Vi) sera le volume d'eau distillée à ajouter au volume Vi
pour compléter à un volume final Vf.

1)-Dosage de la glycémie :

On prépare la courbe d'étalonnage à partir d'un étalon à Ci =


4g/l, soit Cf la concentration finale de chaque solution fille S1
S2 S3 et S4 ;

On opère les dilutions selon le protocole suivant :


Solution Vf Ci Vi Concentration finale
s

S1 100 µl 4g/l 12.5 0.5g/L

S2 100 µl 4g/l 25µl 1 g/L

S3 100 µl 4g/l 50 µl 2 g/L

S4 100 µl 4g/l 75 µl 3 g/L

Après préparation de solutions de concentrations


différentes en glucose, on effectue la réaction de dosage et on
lit les densités optiques obtenues à partir de chaque dilution.
On opère en parallèle le dosage des solutions suivantes

N Précinorm® : sérum ayant une concentration normal en


glucose
P Précipath® : sérum ayant une concentration pathologique en
glucose S5 : solution de glucose de concentration de 1 g/L

On lit par ordre croissant de concentrations, de la plus faible à


la plus élevée.
On obtient la courbe étalon DO = f ( C ) ci-jointe :

A partir de cette courbe étalon, tout sérum à doser sera


mis en contact avec les mêmes réactifs suivant la même
technique. On lira la DO pour chaque sérum à tester et on
extrapole sur la courbe étalon la concentration
correspondante.
3)Dosage de la créatinine : On utilise une solution étalon
de Ci 200 mg/l.

On fixe le volume final Vf à 1 ml.

Cf en mg/l Vi en ml (Vf -Vi) en ml


100 0,5 0,5
80 0,4 0,6
60 0,3 0,7
50 0,25 0,75
40 0,2 0,8
20 0,1 0,9

Chaque solution étalon préparée subira la même technique de


dosage. Les DO obtenues pour chaque dilution sont de :

Cf en mg/l DO
20 0,106
40 0,253
50 0,310
60 0,406
80 0,545
100 0,697
On trace une courbe à partir de ces DO : DO = f (C).

Pour trois sérums S1, S2, S3 de DO lues, on extrapole de la


courbe les concentrations correspondantes, on compare avec
les valeurs de l'Hitachi :

Sérums DO C lue sur la courbe C lue sur l'Hitachi


étalon
S1 0,057 9 mg/l 7 mg/l
S2 0,298 45 mg/l 40 mg/l
S3 0,083 12 mg/l 11 mg/l
2)-Dosage des protéines totales :

C étalon = Ci = 200 g/l


Vf = 100 µl
On applique toujours la loi Ci Vi = Cf Vf pour déterminer les
volumes à mesurer.
Ces micro volumes sont prélevés à l'aide de micropipettes
réglables permettant de diminuer les erreurs sur le
prélèvement.

Cf en g/l Vi en µl Vf - Vi en µl
120 60 40
100 50 50
80 40 60
60 30 70
40 20 80
20 10 90

Après préparation de la gamme étalon, chaque solution sera


dosée par la même méthode : dosage des proteines totales par
la technique de Biuret.
Les DO mesurés à la fin de la réaction sont :

Cf en g/l DO
20 0,216
40 0,342
60 0,394
80 0,508
100 0,756
120 0,810
On test en même temps un sérum contrôle S C, dont on trouve la
DO 0,387 satisfaisante (correspond à 60 g/l, valeur indiquée
par le prospectus accompagnant le sérum de contrôle)
On prend deux sérums de malades aux quels on fait subir le
même dosage de proteines totales, on obtient les DO suivantes
qu'on converti en concentrations.
Les concentrations obtenues par la courbe sont comparés avec
celle de l'Hitachi :

Sérums DO C de la C de
courbe l'Hitachi
S1 0,465 71 g/l 75 g/l
S2 0,431 65 g/l 63 g/l

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