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APPROCHE MOLiCULAIRE DE LA RiSISTANCE

A LA METICILLINE DE STAPHYLOCOCCUSAUREUS

Eric Sevin a,*, Odile Larmaraud-Sevin a, Patrick Legrand a

R&urn6 methicillin using other mechanisms (penicillinase overproduction,


methicillin-specific hydrolytic enzyme, PBP modifications). Particular
Staphylococcus aureus est I’une des espbces bacteriennes les plus
methods are needed for the phenotypic detection of methicillin-resis-
couramment rencontrees au laboratoire de microbiologic mbdicale.
tance: antibiograms on NaCI-supplemented agar or incubated at
Elle est & I’origine de nombreuses infections, dont certaines sont
30 “C. Molecular defection of mecA gene by PCR permits to detect
graves. Elle r&siste aujourd’hui & de nombreux antibiotiques initiale-
that resistance on strains for which phenotypic detection has failed.
ment actifs, comme les penicillines G ou A, par production de p6nicilli-
nase. Les souches hospital&es peuvent r&sister Bgalement aux pbni-
Stap/ty/ococcus aureus - methicillin - resistance - pheno-
cillines du groupe M (m&icilline, oxacilline) par modification des
typic detection - genotypic detection.
protbines liant la penicilline (PLP). En effet, ces souches produisent
une PLP2a, beaucoup moins affine pour les 6-lactamines que les PLP
habituelles. Cette PLP2a est codee par le gene mecA dont I’expres-
sion est sous la dependance de genes rbgulateurs. Cette m&icillino-
resistance peut &re d’expression homogbne ou h&&og&ne. De rares
1. Introduction
souches peuvent r&sister a la m&icilline par d’autres mbcanismes
es staphylocoques sont parmi les bactbries les plus frbquemment
(hyperproduction de p&icillinase, enzyme hydrolysant spbcifiquement
la m&icilline, modifications de PLP). La detection phbnotypique de la
L rencontrbes au laboratoire de bact&iologie mbdicale. Parmi eux,
Staphylococcus aureus est incontestablement I’esp8ce la plus virulente,
m&icillino-rksistance nbcessite des mbthodes particuli&es (antibio- puisqu’elle produit un nombre important de toxines et d’enzymes extra-
gramme sur milieu hypersalb ou incub& a 30 “C). Une detection mok- cellulaires. Elle peut btre g I’origine de pathologies nombreuses et varibes,
culaire du gene mecA par PCR permet de rWler cette r&.istance allant du simple panaris, jusqu’aux infections les plus s&&es comme
chez des souches mal d&ectc+es par les mbthodes ph6notypiques. les septi&mies, endocardites, pneumopathies, cellulites, infections
ost6oarticlaires, dont le pronostic peut etre tr&s r&et-v&

Stap/ty/ococcus aureus - mbticilline - rbistance - dbtec- Au d&but des an&es 1940, la pbnicilline G Btait t&s active sur les
tion phbnotypique - diagnostic mol6culaire. staphylocoques. Cependant, des souches r&sistantes sont apparues
rapidement : elles Btaient en effet capables d’hydrolyser I’antibiotique
en synthetisant une enzyme appelbe pbnicillinase capable de
Summary rompre le cycle 6-lactame. Aujourd’hui, la p&valence des souches pro-
ductrices de pbnicillinase atteint 90 % au sein des staphylocoques
Staphylococcus aureus is one of the most common species met in do& [27], et la pbnicilline G ne peut done plus &re consid&&e
medical microbiology laboratories. It causes many infectious diseases, comme un antistaphylococcique.
and some of them are severe. Today, it can resist to many antibiotics,
Pour d&jouer ce mbcanisme de r&istance, les laboratoires pharma-
that were initially fully active, such as G or A group penicillin, by pro- ceutiques ont synth&i& d&s les ant-&es 1960 de nouvelles pbnicil-
ducing a penicillinase. Hospital strains can also resist to M group lines, capables de r&sister B I’action hydrolytique de la pbnicillinase des
penicillins (methicillin, oxacillin) by modi&ing the B-lactam target: staphylocoques par I’adjonction d’un radical volumineux sur le cycle
penicillin binding protein (PBP). Indeed, these strains produce a new D-lactame. Ce sont les pbnicillines semi synthdtiques du groupe M :
PBP, called PBP 2a, of which affinity for R-lactams is much lower meticilline (qui n’est plus commercialisbe aujourd’hui), oxacilline, cloxa-
cilline et dicloxacilline. Toutefois, un nouveau mode de resistance a BtB
than the one of common Staphylococcus PBI? This PBP2a is enco-
mis en Evidence en 1961 chez S. aureus qui s’oppose & I’action de
ded by mecA gene, of which expression is under control of several
la m&icilline et de ses d&iv&. II s’agit d’une modification de la cible
regulation genes. The expression of methicillin-resistance can be
des O-lactamines : les protbines liant la pbnicilline ou PLP, impliqubes
homogeneous or heterogeneous. Some strains can resist to dans la synthbse du peptidoglycane. Cette r&istance, croisbe pour
I’ensemble des O-lactamines, a BtB d&nommbe r&istance intrinseque
& la m&icilline ou B I’oxacilline. Elle est I’objet de notre propos.

a Service de bact&iologie - virologie - hygiene (Pr C. J. Soussy)


HBpital Hen+Mondor
51, avdu Markhal de Lattre-de-Tassigny 2. kpid6miologie de la resistance
94010 Cr6teil cedex
a la meticilline
l Correspondance
article recu le 2 juin 1999,accept6 le 2 juillet 1999. La p&valence de la m&icillino-rbsistance est variable selon les pays
0 Else&r, Paris. et reste particulkrement Blev6e en France (tableau I).

Revue Fra.n@e des Laboratoires, septembre 1999, N” 3 t 5 25


Diagnostic mol&zulaire en pathologie infectieuse

3.2. Rappels sur le mode d’actlon des B-lactamines

Les &lactamines assurent une inhibition competitive de la transpep-


tidase en se fixant de facon covalente sur I’enzyme. Ceci est rendu pos-
sible par le fait que ces antibiotiques ont une analogie structurale impor-
I I tante avec la sequence terminale D-Ala-D-Ala du pont qui relie les
ltalie 81 chaines glycaniques, cette sequence &ant le substrat de I’enzyme. La
Grece 77 fixation de la f3-lactamine sur la transpeptidase va empbcher la reac-
Esoaane 54 tion de transpeptidation (done bloquer la polymerisation de la paroi
bacterienne), alterer la structure de la paroi en la rendant notamment
France 79
moins stable, plus fragile et incapable de resister a la pression osmo-
Portugal 67 tique interne t&s clew&e. Ceci provoquera secondairement la lyse de
Autriche 53 la bacterie [21.
Belgique 67 Les enzymes cl&s impliquees dans ces reactions, les transpeptidases,
Allemagne 37 sont appelees proteines liant la penicilline (PLP) et sont done les cibles
des R-lactamines 1131.
Royaume-Uni 13
Pay&as 0 Plusieurs PLP sont retrouvees chez une mbme espece bacterienne.
Ainsi, S. aureus en comprend quatre [131. Les Wactamines vont pou-
Suisse 14
voir inhiber une ou plusieurs d’entre elles. Cependant, il faudra inhi-
Suede 0 ber plus d’une PLP [I 31 pour obtenir une action antibacterienne cor-
I Danemark 0 I recte.

3.3. MBcanismes de r&istance j la meticilline

L’infection a Staphylococcus aureus resistant s la meticilline @ARM)


Selon les criteres du Comite de I’antibiogramme de la Societe fran-
est etroitement reliee a I’hospitalisation : les SARM sont isoles dans
caise de microbiologic (CA SFM), une souche de staphylocoque est
I’ensemble des unites de court sejour, et plus particulierement en reani-
consideree comme meticillino-resistante si la concentration minimale
mation et en chirurgie, mais ils le sont egalement tres frequemment
inhibitrice de I’oxacilline est superieure a 2 mg/l. Les differents meca-
dans les unites de soins de suite, de readaptation et de tongue duree. nismes de r&istance rencontr& chez Staphylococcus sont les sui-
Ces dernieres annees en France, les comites de lutte contre les infec- vants.
tions nosocomiales (CLIN) des etablissements de soins ont mis en
place un important programme de lutte contre les batteries multire- 3.3.1. R&stance intrinsgque B la m&iciiiine
sistantes. Capplication de ce dernier a abouti a une diminution des like au gene mecA
SARM, jusqu’a obtenir un taux moyen de 30 % au sein de I’espece
a I’heure actuelle (tableau I/) [6]. 3.3.1.1. La PLP2a
Cette resistance intrinseque est due a la production d’une PLP addi-
tionnelle non retrouvee chez les staphylocoques sensibles a la meti-
cilline, la PLP 2a ou PLP 2’, en plus des quatre PLP habituelles.
3. R&stance A la m&icilline
Cette proteine a ete initialement mise en evidence par Tomasz qui a
chez Staphylococcus aureus obtenu des mutants resistants en soumettant des souches de
S. aureus a des concentrations progressivement croissantes de peni-
cilline du groupe M. L’etude des PLP de ces mutants a montre une
3.1. Rappels sur la synthese de la paror de S. aureus tres forte diminution de la production des PLP normales, au profit de
la PLP 2a [25].
Les batteries sont protegees par une paroi epaisse et t&s solide appe-
lee peptidoglycane. II s’agit d’une structure reticulce composee de Les Wactamines ont une affinite diminuee pour la PLP 2a par rapport
longues chaines glycaniques reliees entre elles par des ponts pepti- aux PLP normales : elles ne peuvent inhiber la PLP 2a qu’a des concen-
diques. La synthese de ce compose est sous la dependance de plu- trations t&s au-dessus de celles qu’on peut esperer atteindre in vivo.
sieurs enzymes : la transglycosylase qui synthetise la chaine glycanique, Certaines penicillines comme la penicilline G ou I’ampicilline I’inhibent
& partir de sous unites monosaccharidiques (acide N-acetyl muramique mieux que la meticilline, sans toutefois dtre suffisamment actives pour
et N-acetyl glucosamine) et la transpeptidase, qui acheve la reaction &re utilisees en therapeutique [8].
de reticulation des chaines glycaniques prealablement synthetisees Par rapport aux autres PLP, la PLP 2a est beaucoup plus autonome
par formation des ponts peptidiques. Cette derniere enzyme est pre- puisque, contrairement aux autres, elle est capable de realiser a elle
sente dans I’espace periplasmique et est la cible des R-lactamines [21. seule la synthese de la paroi bacterienne [131. Cinhibition des autres

SARWS. aureus Yo (n = 1850 souches)


Tous hbpitaux 41,7 39,7 36,3 37,i 365 35,6
- dont court sejour 39,7 36,0 32,3 33,0 30,8 29,4
- dont moyenllong sejour 53,5 56,3 60,2 58,8 69,l 65,7

26 Revue Franqase des Laboratolres, septembre 1999, N-315


PLP chez les staphylocoques producteurs de PLP 2a ne va done pas La figure 7 resume I’intervention des differents systemes regulateurs
avoir I’action inhibitrice attendue : les quatre PLP normales vont etre sur I’expression du gene mecA.
progressivement inhibees, et la PLP 2a prendra le relais pour la pour-
3.3.7.4. Les a&es genes impliques dans I’expression
suite de la synthese du peptidoglycane [l].
de la resistance a la meticilline lice au gene mecA
Cependant, on a pu montrer que le peptidoglycane synthetise par la
Des genes auxiliaires appeles fern (pour facteurs essentiels a la resis-
PLP 2a n’avait pas la meme qualite que la paroi bacterienne normale
tance a la meticilline) sont necessaires pour I’expression a haut niveau
[13]. En microscopic electronique, des aberrations morphologiques peu-
de la meticillino-resistance [13]. Leur existence a ete initialement sus-
vent etre observees (paroi plus fine...), le degre de reticulation de la paroi
pectee devant la disproportion retrouvee entre le niveau de resistance
est considerablement diminue [13], et le peptidoglycane est surtout
et la quantite de PLP2a produite dune souche a I’autre. En effet, on
constitue de monomeres ou de dim&es, au detriment des t&ram&es
a observe que des souches de CMI 1,5 mg/l produisaient la meme
qui sont habituellement majoritaires [l]. Ainsi, les SARM parviennent
quantite de PLP2a que de souches dont la CMI est 1500 mg/l [22].
a se multiplier avec une paroi synthetisee par une PLP anormale, mais
qui provoque beaucoup d’alterations morphologiques, qui au total, ne Cuatre genes fern ont depuis ete identifies : fernA, femB, femC, et
sont pas favorables a leur bonne croissance. femD. Ils sont tous situ& en position chromosomique [13] et (au moins
pour fernA), ils sont retrouves chez toutes les souches de S. aureus,
Les souches de .S. aureus resistant a la meticilline par ce mecanisme
independamment de la presence du gene mecA. lls ne sont pas res-
expriment le plus souvent une resistance a haut niveau. Toutefois, une
ponsables a eux seuls de la resistance a la meticilline, mais peuvent
caracteristique importante des souches de SARM est I’absence de cor-
augmenter le niveau de resistance chez une souche de SARM. Leur
relation entre la quantite de PLP 2a produite et le niveau de resistance
role p&is demande encore a etre approfondi.
a la meticilline [13].
3.3.7.4. Expression phenotypique de la resistance a la meticilline
3.3.1.2. Le gene mecA et son origine
lice au gene mecA
La PLP 2a est codee par un gene chromosomique designe mecA, de
Cexpression de la resistance a la meticilline a comme caractere majeur
1,2 kb [l], qui n’est pas retrouve chez les souches de staphylocoque
d’etre heterogene, c’est-a-dire que seule une proportion don&e et
sensibles a la meticilline. Son inactivation par le transposon Tn551
constante de colonies filles exprime la resistance.
redonne la sensibilite a la meticilline a un SARM.
Tomasz et toll. ont reparti les souches de SARM selon le niveau de
Chypothese la plus probable quant a l’origine du gene mecA et de son
resistance a la meticilline en quatre classes 1241, detaillees dans le
systeme regulateur serait qu’il resulterait de la fusion du gene dune
tableau 111.La classe 4 correspond aux souches dites resistantes
O-lactamase staphylococcique et d’un gene codant pour une PLP
homogenes, puisque 100 % de la population exprime une resistance
ancestrale d’origine inconnue. Cet evenement initial serait apparu chez
a haut niveau. Les trois autres classes regroupent des SARM hete-
une souche de staphylocoque a coagulase negative. Le gene ainsi
rogenes, puisqu’elles comprennent deux populations : l’une majoritaire,
forme aurait ensuite dissemine par transposition au sein des differentes
especes de staphylocoques [281.

3.3.1.3. La regulation du gene mecA


Cette regulation se fait au niveau transcriptionnel. Deux systemes chro-
mosomiques sont impliques dans ce contrble : le systeme mecflmecR7
et le systeme blal/blaRl.
Le premier est sit& en amont du gene de structure mecA [la], il regule
la synthese de la PLP2a. Le second est en amont du gene de struc-
ture b/aZ qui code pour la penicillinase, et en regule la synthese, en plus
de celle de la PLP2a [25]. Les produits des genes de ces deux sys-
temes presentent deux a deux de fortes homologies de structure et exer-
cent le meme type de regulation :
- les produits des genes b/a/ et mecl sont des represseurs: ils inhibent
la transcription du gene mecA (et de bfaZ pour blah ;
- les produits des genes blaR7 et mecR7 sont des antirepresseurs,
qui &vent la repression due aux genes b/a/ et mecl[28].
Les deux systemes n’ont pas la meme importance quantitative : le sys-
I blaI-blaR1
present ou absent

teme mecMmecR7 (quand il est fonctionnel) exerce une inhibition bien


plus forte que celle exercee par le systeme blallbfaR7 sur la transcription
lPrCsent 1 1Absent 1
du gene mecA. Ainsi, d&s que le systeme mecfImecR7 est fonction-
nel dans une souche, la transcription du gene mecA est t&s fortement
inhibee : la souche apparait sensible par les techniques usuelles d’an-
tibiogramme. Cependant, et grace au contr8le par le systeme
I 1
b/a//b/aRl, la meticilline sera lentement inductrice de la resistance chez Gbne mecA R&prim6 Exprim6 Exprimd
ces souches, et il faudra done les interpreter comme resistantes [la].
Mode irductibls
La majorite des souches cliniques actuelles de SARM auraient un sys-
teme mecMmecR7 non fonctionnel, ce qui laissera au systeme
blallblaR7 le soin de reguler la transcription du gene mecA chez ces
souches : dans ce cas la resistance est rapidement inductible par une
penicilline du groupe M [20, 291.
Enfin, si aucun des deux systemes regulateurs n’est fonctionnel, la
PLP2a est produite normalement et la souche apparait resistante.

Revue Fran&.e des Laboratoires, septembre 1999, N” 315


Diagnostic moldculaire en pathologie infectieuse

dont la CMI de la m&icilline augmente en passant de la classe 1 & 3, 4.1.1. Facteors influenqant I’expression
I’autre minoritaire qui exprime une r&stance & haut niveau. de la mCticillino-r6sistance
Les travaux de Tomasz ont pu montrer que ces classes sont d’une t&s 4.1.1,1. Temperature d’incubation
grande stabilitk [7] : pour une souche donnke, on aura toujours la
L’abalssement de la temperature d’incubation de 37 “C B 30 “C favo-
meme proportion de la souche minoritaire exprimant un haut niveau
rise I’expresslon, et done la d&ection, de la ksistance h&rog&ne [lo].
de rr%istance, qui restera Iui aussi toujours du m6me niveau. Cette
exceptionnelle stabilitb est vraisemblablement sous le contrBle d’un 4.1.1.2. Concentration en NaCl du milieu de culture
syst&me non encore prkisk Selon certains auteurs, une mutation De mbme, cette ksistance h&rogkne s’exprime mieux en conditions
chromosomtque dite chr pourrait &re impliqube dans la resistance hypertoniques. Ainsi, I’utilisation de milieux contenant 20 % de sac-
a haut niveau [l 91. charose ou 5 ‘J/ode NaCl en facilite la detection [51.
Par ailleurs, le milieu hypersak favorise la production de la p&nicilli-
3.3.2. Rhsfstance 6 la mCticil/ine non li6e au g&e mecA
nase staphylococcique. Ceci peut faire apparaitre des souches sen-
Ces souches expriment une resistance & bas niveau. Leur CMI de sibles B l’oxacilline faussement rksistantes, ce qui peut poser des pro-
la m&icilllne est comprise entre 1 et 4 mg/l. bkmes de detection sur ce type de milieu [I 6, 171.

3.3.2.1. Hyperproduction de p6nicillinase 4.1.1.3. pH du milieu de culture


Ces souches appekes BORSA (pour Borderline Staphylococcus Le pH le plus adapt6 g la detection de la rtkistance h&&og&ne est
aureus) par MacDougal [161 ne posskdent pas leg&e mecA. Elles de 7,3 [lo].
produisent de grandes quantites de p&nicillinase, qui hydrolyse rapi-
4.1.1.4. lnoculum
dement les pknicillines du groupe A, mais lentement les p&icillines
du groupe M. On observe done une ritsistance ti bas niveau vis-&vis Cutilisation d’un inoculum fort (1 O7 UFC/ml) peut Bgalement faciliter
de ces dernihres. Cependant, la sensibilitb a ces mokcules est res- la detection de la m&icillino-r&sistance.
taurke si on leur associe un inhibiteur de O-lactamase [S].
4.7.7.5. Dur& d’incubafion
Toutefois, d’autres facteurs que I’hyperproduction de pbnicillinase
De meme, la prolongation de I’incubation de I’antibiogramme (48
semblent impliqu& dans le comportement de ces souches.
heures) est un facteur qui permet une meilleure detection de la r&is-
Les valeurs de CMI de ces souches sont t&s dependantes des
tance.
conditions de culture. Ainsi I’utilisation d’un milieu hypersak entraine
une artificielle augmentation des CMI. 4.1.2. R6alisation de I’antibiogramme
3.3.2.2. Production de m&icillinase par diffusion en g&lose

Une enzyme particulike, dite m&ticillinase [15] a BtB d&rite comme Afin d’opkrer la detection phbnotyplque la plus efficace de la resistance
pouvant induire une m&cillino-&istance. Son rBle chez les isolats a I’oxacilline chez .S. aureus au laboratoire de microbiologic medicale,
cliniques reste i?~prtkiser. le Comitk de I’antibiogramme de la Sock%& franqaise de microbiolo-
gie [4] prkonise d’utiliser un disque d’oxacilline charge & 5 pg et une
3.3.2.3. Modification des PlP
incubation de 24 heures a 30 “C sur milieu de Mueller-Hinton non sup-
Ces souches, dites MODSA (pour Modified PBP S. aureus) [23] pr& plement& en chlorure de sodium ou g 37 “C sur milieu hypersak. La
sentent des modifications sur les quatre PLP habituelles de teneur en chlorure de sodium de ce dernier milieu varie de 2 & 5 %
S. aureus, ne produisent pas de p&nicillinase et ne pos&dent pas selon les auteurs.
le gene mecA.
Cutilisation des deux techniques conjointes peut amkliorer la sensibilite
Caffinitk de leurs PLP rnodifibes pour les l3-lactamines est moindre et la spkcificitb de cette dbtection.
que celle des souches sensibles, et elles expriment done une r&is-
Selon les Etudes, la sensibilitb des techniques utilisant I’antibiogramme
tance a bas niveau, mais qui est de type homogkne.
pour la detection de la rksistance & I’oxacilline est variable, mais infk-
Ces souches ont BtB isokes initialement par 1’8qulpe de Tomasz qui rieure & 100 % : pour certains auteurs, elle atteint 97 ‘J/osi on prend
a montre qu’il est possible de selectionner in vitro de tels mutants. comme reference la detection molkulaire du gene mecA par PCR
[141. Un certain nombre de souches de SARM ne sont done pas
dbtectbes kistantes par I’antibiogramme.
4. Dktection phknotypique En cas de doute, on pourra done s’adresser B d’autres mbthodes, non
de la r&istance a la meticilline phknotypiques, en recherchant par exemple le gene mecA par biolo-
gie mokulaire.
au la boratoire
4.1.3. Antibiogrammes en milieu liquide
A I’heure actuelle, c’est I’oxacilline, g la place de la mkticilline, qui est
Diverses methodes plus ou moins automati&es permettent la rhali-
utilisbe au laboratoire pour mettre en Evidence la m&icillino-rksistance
sation des antibiogrammes en milieu liquide et la detection de la r&is-
chez le staphylocoque.
tance B l’oxacilline des staphylocoques. Par exemple, les automates
VitekB (bioM&ieux) et Microscan (Baxter) sont des microm&hodes
4.1. Antibiogramme
de cinktique de croissance bactbrienne en milieu liquide. Ce sont des
Plusieurs parambtres physico-chimiques entrent en jeu dans I’ex- adaptations de la mkthode de determination des CMI par microdilu-
pression de la resistance Ii&e au gene mecA. II est important de les tion.
prendre en compte au laboratoire pour dktecter au mieux la mkticil- Si on prend comme r&f&ence la m&hode gknotypique de detection
lino-r&istance. En effet, la modification des conditions de culture peut du gene mecA par PCR, la sensibilitb de ces methodes utilisant I’an-
augmenter la proportion de colonies filles qui expriment la rksistance tibiogramme en milieu liquide est bonne, proche de celle de I’anti-
& haut niveau. biogramme par diffusion en milieu g&lo& (95 g 97 % [14]).

28 Revue FranCake des Laboratoires, septembre 1999, No315


Diagnostic molkulaire en pathologie infectieuse

4.2. Autres mkthodes 5. Diagnostic moltkulaire


4.2.1. Criblage (screening)
de la rbsistance A I’oxacilline
li6e au g&ne mecA
II s’agit d’une autre technique phdnotypique, peu utilisbe en France.
Sur une g&lose Mueller-Hinton (hypersalbe ou non selon les auteurs) chez les staphylocoques
contenant 6 mgll d’oxacilline, la souche de staphylocoque a Studier
est ensemencee en strie. La gblose est incubbe 18 heures & 37 “C.
La souche est consid&e resistante si la culture est positive. 5.1. Recherche du gkne mecA par biologie molkulaire

Cette technique pr&ente I’int&& de permettre une detection aisle


5.1.1. DCtection du gene mecA par hybridation
des souches resistantes quel que soit le mecanisme de leur r&sistance
[91, cependant elle demande encore a Btre valid&e. La detection du g&e mecA par hybridation mol&ulaire avec une
sonde marquee est une technique qui prbsente une t&s bonne sp&
4.2.2. Tests rapides de sensibilit6 B I’oxacilline cificite [26]. Cependant, un certain nombre d’inconv8nients y aff&
rent : un grand nombre de cellules bactbriennes sont requises si l’on
Quelques tests rapides de detection de la m&icillino-rbsistance sont veut que le signal don& par la sonde d’hybridation soit detectable
commercialis&. Ainsi, le ‘1systeme d’identification MRSA BBL (et la sensibilite de la technique depend done de la quantitb de
Crystala * (Becton-Dickinson) permet une detection en quatre heures germes disponibles). D’autre part, les isotopes radioactifs Btaient sou-
des souches de SARM ti partir d’une culture sur g&lose. Une sus- vent utilis&s comme marqueurs, mais les sondes froides aujourd’hui
pension bactbrienne est placbe dans un support rempli d’un milieu de couramment employees permettent de pallier ti I’utilisation de ces
culture liquide contenant 4 mg/l d’oxacilline et un indicateur fluorescent isotopes [261.
inhibe par I’oxyg&ne dissout dans le milieu. Si la souche Btudiee par-
Les techniques d&rites dans la littbrature utilisent des sondes recon-
vient a croitre dans ce milieu, elle respire I’oxygbne, dont la quantite dimi- naissant une portion du gene mecA et marquees par un ester d’acri-
nue; ce qui entraine une levee de I’inhibition de la fluorescence. dinium chimiluminescent [121. Pour certains auteurs qui ont &al&
Cobservation d’une fluorescence permet done de dire que la CMI de ces techniques, leurs sensibilite et sp&ificit& peuvent Btre Bquiva-
la souche est superieure g 4 mg/l, done qu’elle est rksistante. lentes B celles de la PCR quand elles sont utilisees dans des condi-
Si cette technique est sbduisante sur le plan pratique, il faut dire que tions optimales (notamment de prise d’essai) [12].
sa sensibilitb est moyenne, notamment pour dbtecter les souches de Cependant, ces mbthodes sont B I’heure actuelle progressivement
SARM h&&og&nes. Globalement, elle est proche de 75 % compa- abandon&es, au profit de techniques reconnues comme plus sen-
rativement a la recherche du gene mecA par PCR [14]. sibles, comme la polymerase chain reaction ou PCR. De ce fait,
Certains auteurs ont utilisb ce kit directement a partir des flacons d’h& aucun kit d’hybridation ne semble plus commerciali& aujourd’hui.
moculture positifs B staphylocoque, mbme si ce n’est pas sa finalit& RBcemment, et afin de sensibiliser ces techniques d’hybridation, les
premibre. Ceci demande a btre cependant rigoureusement Bvalub selon methodes dites (1ADN branch&s’ (bDNA) ont 6% &al&es ill]. Elles
qu’il s’agit de SARM homog&nes ou h&rog&nes et considerant qu’il permettent un gain certain en termes de sensibilitb, puisque dans
est impossible de calibrer I’inoculum. ce cas un signal peut &e obtenu avec une prise d’essai bien
moindre [l 11.
4.2.3. Recherche de la PLP2a
5.1.2. DCtection du gene mecA par PCR
Des reactifs rbcemment commercialis& permettent de rechercher la
PLP2a. Les tests se pratiquent directement sur les colonies bact& Par opposition aux methodes d’hybridation, I’amplification in vitro
riennes et reposent sur une agglutination de particules de latex sen- de I’ADN par PCR est connue comme &ant une technique rapide,
sibilisees par des anticorps monoclonaux (Mastalex MRSA, Mast sensible et spbcifique. Elle nbcessite en outre une prise d’essai
Diagnostics, Amiens), apr&s une phase d’extraction. Ce test a I’avan- beaucoup plus faible et les isotopes radioactifs ne sont pas n&es-

tage d’stre simple et rapide mais sa sensibilitb et sa sp&cificitb deman- saires 1261.

dent encore & &tre &al&es. Plusieurs techniques ont BtB d&rites dans la IiWrature. Dans notre
laboratoire, nous utilisons une m&hode adaptbe de celle d&rite par
4.3. Conclusion sur les mkthodes phenotypiques Unal et al. [26]. BriBvement, I’ADN staphylococcique est d’abord
extrait : une culture bactbrienne est centrifugbe ; puis le culot de
Comme nous I’avons vu, aucune des techniques phenotypiques ne per-
met une detection absolue de la rbsistance, puisque aucune n’atteint
une sensibilitb de 100 % (si on prend comme rbf&ence la recherche
du gene mecA par PCR). Elles laissent parfois persister des ambi-
guWs. II faudra dans certains cas oti elles ne permettent pas de tran-
cher, avoir recours a des m&hodes plus sensibles utilisant la biolo-
gie mol&zulaire (PCR).D’autre part, ces techniques ne permettent pas
la detection des souches qui possedent le gene mecA, mais qui ne
I’expriment pas. Plusieurs travaux ont montrb que de telles souches
pouvaient exprimer cette r&sistance apr&s induction par une O-la&a-
mine [221, et il serait done intbressant de pouvoir les dbtecter.
Cimportance de cette * r&sistance potentiellen est cependant encore
mal dbfinie cliniquement [la, 221.
Le coQt en reactifs de la detection phenotypique de la resistance B
l’oxacilline d’une souche de staphylocoque se situe entre 3 et 1 1 FF
selon les techniques utilisbes.

Revue Frany&e des Laboralolres, septembre 1999, No 315


Diagnostic molkculaire en pathologie infectieuse

centrifugation est remis en suspension dans 50 ul de lysostaphine 5.2. Conclusion sur les m&thodes genotypiques
(100 ug/ml), et place 10 minutes au bain marie a 37 “C. Y sont ajou-
tes 50 ul de solution de proteinase K (100 ug/ml) et 150 ul de tam- Comme on I’a dit, les methodes genotypiques presentent I’avantage
pon JRIS (0,i M ; pH 7,5). Censemble est ensuite incub 10 minutes majeur d’etre plus sensibles que les techniques phenotypiques. La

a 37 “C et place au bain marie bouillant pendant 5 minutes. PCR est d’ailleurs consideree aujourd’hui comme la reference a
laquelle on compare les techniques de detection de la meticillino-resis-
Cet extrait d’ADN est alors amplifie par PCR a I’aide des amorces
tance chez les staphylocoques.
definies par Unal et al. (5’- GAC CGA AAC AAT GTG GAA TTG
Les techniques d’hybridation tombent en desuetude a I’heure actuelle :
GCC -3’ et 5’- CAC Cll GTC CGT AAC CTG AAT CAG C -3’). Les
la PCR leur est nettement p&f&&e, notamment a cause de sa meilleure
&apes thermiques de I’amplification sont les suivantes: denaturation
sensibilite. Toutefois, la methode utilisant le bDNA peut btre promet-
a 94 “C, 1 minute ; hybridation a 55 “C, 1 minute 30 secondes ; elon-
teuse puisqu’elle peut presenter les memes sensibilite et specificite
gation a 72 “C, 1 minute 30 secondes. Trente cinq cycles sont rea-
que la PCR, et il conviendra de valider I’utilisation en routine des futurs
l&s.
kits de detection.
Cidentification du fragment amplifie peut se faire par I’evaluation de
Enfin, il convient d’insister sur I’int&&t qu’il peut y avoir a dbtecter rapi-
sa taille (1 ,l kb) apros electrophorese en gel d’agarose. Si I’on sou- dement la meticillino-resistance chez S. aureus puisqu’on peut dans
haite parfaire cette &ape de detection de I’amplicon, on pourra etu- ce cas mettre en place immediatement les mesures destinoes B Bviter
dier le polymorphisme de la longueur des fragments de restriction la dissemination des SARM et adapter correctement le traitement anti-
(restriction fragment length polymorphism ou RFLP) apres coupure biotique. Les methodes genotypiques ont I’avantage de cette rapidite.
par des endonucleases. Les enzymes C/al et Hinull produisent apres
Le cout en reactifs de la detection moleculaire de la resistance B I’oxa-
coupure de I’amplicon trois fragments dont les tailles sont 439, 375
cilline d’une souche de staphylocoque se situe entre 18 et 20 FF.
et 288 paires de bases. Enfin, on peut egalement mettre en ceuvre
une technique d’hybridation utilisant une sonde marquee comple-
mentaire d’une partie de I’amplicon.
6. Conclusion
Ces methodes, aujourd’hui relativement simples, sont applicables
dans tout laboratoire Bquipe pour la biologie moleculaire et per-
armi les differents mecanismes de resistance a la meticilline, la
mettent un gain notable en termes de sensibilite
rapport aux techniques phenotypiques.
et specificite
Elles peuvent etre pratiquees
par
P resistance Ii&e au gene mecA est de loin la plus repandue. Son
expression heterogsne pose de reels problemes de detection par les
egalement directement a partir de certains prelevements, comme par
techniques phenotypiques.
exemple les hemocultures [3, 21, 301. Dans ce cas, afin de s’af-
II appartient au laboratoire de microbiologic medicale de mettre en
franchir de I’effet des substances inhibitrices de I’amplification pre-
ceuvre les techniques les mieux adaptees a la detection de cette resis-
sentes dans le sang, il convient d’amplifier dans le meme temps une
tance, en fonction de ses moyens, ceci afin de permettre I’instaura-
autre portion du genome du staphylocoque (PCR multiplex) qui ser-
tion d’un traitement efficace. Pour tester I’oxacilline, il conviendra done
vira de temoin d’amplification. Plusieurs genes sont utilisables dans
de modifier les techniques habituelles d’antibiogramme en utilisant un
ce but, comme par exemple le gene de la gyrase (gyrA), present chez
milieu de Mueller-Hinton incube a 30°C, oulet un milieu enrichi en chlo-
tous les staphylocoques [301 ou celui de la thermonuclease (nut),
rure de sodium. Malgre cela, des ambiguttes peuvent persister, qui ne
specifique de S. aureus (et de staphylocoques plus rares comme
seront levees que par la detection moleculaire de la resistance a I’oxa-
S. lugdunensis, S. schleiferi, S. intermedius), ce gene permettant cilline, consistant en la recherche du gene mecA par PCR, pour les
en outre d’orienter le diagnostic d’espece [31. laboratoires equip& pour la biologie moleculaire.

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