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SUPERINTENDENCIA NACIONAL DE SERVICIOS DE SANEAMIENTO

II CURSO NACIONAL

ENTRENAMIENTO EN CONTROL DE CALIDAD DE DEL AGUA EN SISTEMAS DE AGUA

POTABLE
Octubre 2002
Blga. Margarita Aurazo de Zumaeta

1. CONDICIONES PARA LA TOMA DE MUESTRA, TRANSPORTE, CONSERVACION Y

PREPARACION DE LA MUESTRA BACTERIOLÓGICA
1.2 Identificación :
Una muestra debe ser bien identificada y toda la información sobre la misma debe ser
completa (N°` de muestra, datos, local, pH, temperatura, cloro residual y otras
informaciones necesarias para que los resultados puedan ser interpretados
correctamente).

1.3 Agente neutralizador de cloro residual:

Para un muestreo de aguas tratadas se deberá adicionar a un frasco de recolección,
antes de su esterilización, 0,1 ml de solución de triosulfato de sodio al 1.8% para cada
100 ml de muestra, para neutralizar el cloro residual.

Esta cantidad de triosulfato de sodio, es suficiente para neutralizar concentraciones de

hasta 5 mg / L de cloro residual, siendo adecuado para una muestra de rutina. En
situaciones especiales, como por ejemplo en emergencias, en que el cloro residual
puede ser mayor, se requiere una mayor cantidad de tiosulfato

1.4 Agentes quelantes :

Para recoger muestras de aguas contaminadas sospechosas de contener
concentraciones superiores a 0,01 mg/L de metales pesados tales como cobre, zinc,
etc., se deberá adicionar en el frasco de recolección. antes de su esterización, 0,3 ml
de una solución de EDTA al 15% para cada 100 ml de muestra

1.5 Transporte y conservación:

Después de recolectada una muestra deberá ser enviada al laboratorio lo antes
posible. Un tiempo máximo ideal entre el muestreo y el inicio del examen es de 8
horas, el tiempo limite no debe exceder de 24 horas.
Las muestras deben ser transportadas con refrigeración ( 4 a 10°C) y conservadas así
hasta el inicio del examen.

2. PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA DE FILTRACION CON MEMBRANA

DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES, TERMOTOLERANTES Y BACTERIAS
HETEROTROFICAS MESOFILAS VIABLES

1 Antes de iniciar el examen, desinfectar la mesa de trabajo, usando un desinfectante que

no deje residuos.

2 Disponer sobre la mesa de trabajo el material necesario para ejecutar el análisis:

a) Equipo de filtración, con los portafiltros previamente esterilizados.
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b) Placas Petri de 48mm x 8.5mm, conteniendo un medio “M - Endo Agar LES”, m-FC y
R2A , identificadas con el numero de muestra que deberá contener, el volumen a ser
filtrado es usado como dato.

c) Probetas graduadas estériles, con la abertura recubierta con papel aluminio,

identificadas con el numero de la muestra.

d) Agua de dilución estéril

e) Pipetas estériles de 10 y 1 ml

f) Frasco de boca ancha para colocar las pipetas que han sido utilizadas

g) Pinzas sumergidas en alcohol.

h) Membranas filtrantes estériles con 47mm de diámetro y una porosidad de 0,45 µm.

i) Mecheros de Bunsen, para mantener el ambiente aséptico y efectuar la desinfección de

las pinzas utilizadas.

3.0 Preparación del porta filtro:

a) Retirar la parte superior del porta filtro y con una pinza flameada y enfriada,
colocar una membrana filtrante estéril, con la cara cuadriculada volteada para
arriba, centrando sobre la parte superior del porta filtro.

b) Acoplar la parte superior del porta filtro, teniendo cuidado para no

dañar la membrana.

4.0 Preparación de la muestra para la filtración.

4.1 Volúmenes iguales o superiores a 20ml.

a) Homogenizar la muestra, agitar un número no menor a 25 veces,
inclinando el frasco y formando un ángulo de 45° entre el brazo y el
antebrazo.

b) Distribuir los volúmenes requeridos de muestra en probetas estériles y

proceder a la filtración.

4.2 Volúmenes inferiores a 20 ml.

a) Adicionar al porta filtro aproximadamente 20 ml de agua de dilución estéril
(no es necesario medir el volumen, pues este servirá de soporte para que
las bacterias existentes en la muestra se distribuyan uniformemente en la
superficie de la membrana, al ser efectuada la filtración).

b) Homogenizar la muestra (como en 4.4.4.1 a) con auxilio de una pipeta

estéril, retirar el volumen deseado y proceder a la filtración
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4.3 Volúmenes decimales (Dilución de muestras)

a) Efectuar las diluciones decimales de la muestra, de la siguiente forma:
· Proceder la marcación de cada frasco de agua de dilución estéril,
anotando el numero de muestra y la dilución que deberá contener.

· Homogenizar la muestra y , con una pipeta estéril de 10 ml,

obedeciendo los cuidados de asepsia, transferir 10 ml de muestra a un
frasco propiamente identificado y que contiene 90 + 2 ml de agua de
dilución estéril. Prepara la primero dilución decimal (10ˉ¹), sabiendo
que 1 ml de la misma corresponde a 0,1 ml de muestra

· Repetir la segunda la operación anterior, con un frasco conteniendo la

dilución hecha anteriormente (10ˉ¹), y de esta con una nueva pipeta
estéril de 10 ml transferir 10 ml para un nuevo frasco, previamente
identificado, conteniendo 90± 2 ml de agua de dilución esteril. Se
prepara asi la segunda dilución decimal (10ˉ²), sabiendo que un 1 ml
de la misma corresponde a un volumen de 0.01 ml de muestra.

· Proceder de esta manera, la

³, 10ˉ⁴,....).

b) Después de preparar las diluciones, preparar el porta filtro y después de

homogenizar las diluciones seleccionadas para la filtración , retirar el
volumen deseado con una pipeta estéril y proceder la filtración .

5.0 Filtración de volúmenes de muestra

a) Verter cuidadosamente en el porta filtro el volumen de muestra a ser
examinado, evitando que el agua sobrepase los bordes superiores.

b) Conectar a la bomba de vacío para proceder a la filtración.

c) Después de la filtración enjuagar el porta fltro 3 veces con porciones

de 20-30 ml de agua de dilución estéril, para evitar la retención
de alguna bacteria en las paredes internas del mismo.

d) Apagar la bomba de vacío al finalizar la operación. Evitar secar

excesivamente a la membrana filtrante.

6.0 Colocar la placa petri correspondiente, conteniendo “M-Endo Agar

LES”, frente al equipo de filtración y con el auxilio de una pinza entreabrir la placa.
Para determinar coliformes termotolerantes colocar la membrana sobre una placa de
Agar m-FC

7.0 Separar la parte superior del porta filtro y con una pinza cuyas extremidades serán
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flameadas, retirar la membrana con cuidado para que la pinza toque apenas la parte
periférica con cuidado de la misma, fuera del área de filtración. Acoplar nuevamente la
parte superior del porta filtro a la parte inferior.

8.0 Para cuidar la asepsia, colocar cuidadosamente la membrana, con la

superficie cuadriculada volteada hacia arriba, en la superficie del medio de cultivo
(M – ENDO Agar LES o m-FC o R2A), en la placa petri.

9.0 Verificar si se formaron bolsas de aire entre la membrana y el medio de cultivo. Si esto
ocurre levantar uno de los bordes de la membrana con una pinza estéril y haciendo
movimientos circulares, deslizar la membrana con la finalidad de eliminarlas, pues estas
bolsas impiden el contacto de las bacterias con el medio del cultivo, dificultando o
impidiendo su crecimiento.

10.0 Lavar nuevamente el filtro con agua de dilución estéril y proceder a la próxima
filtración.

11.0 Los porta filtros deben estar estériles en el inicio de cada serie de filtraciones y estas
series no deben ser usados para más de 30 muestras, si hubo un intervalo de 30 minutos
entre una filtración y otra los porta filtros deben ser esterilizados nuevamente, para evitar
contaminación accidental. Para el conteo total de bacterias el filtro debe ser
cuidadosamente lavado y esterilizado con luz UV después de cada filtración. La rápida
esterilización de los porta filtros puede ser efectuada por los siguientes procedimientos:
a) Exposición a radiación ultravioleta durante dos minutos.

b) Sumergir en agua, hirviendo por no más de 30 minutos.

12.0 Controlar la esterilidad de cada porta filtro usado para una serie de filtraciones, para lo
cual es necesario efectuar la filtración de una muestra de 100 ml de agua de dilución
esteril, antes de ser iniciada la filtración de las muestras en prueba, cada 10 muestras.
También intercalar la filtración de una muestra de agua de dilución esteril entre cada serie
de muestras filtradas en el mismo porta filtro. Cada 30 muestras.

13.0 Después de la filtración de las muestras y posterior transferencia de las membranas

filtrantes a las placas Petri, colocarlas en posición invertida en bandejas forradas con
toallas de papel-toalla humedecidas. Colocar las bandejas con las placas Petri con el
medio m-ENDO en la incubadora a 35 ± 0,5°C, durante 22 – 24 horas y los de m-FC a
44.5°C+0,2, durante 24 horas.
La determinación de Bacterias heterotróficas aerobias mesófilas viables, también se puede
efectuar por la técnica de fltración con membrana, para lo cual uno de los medios que se
emplea es el R2 A y se incuba a 35.5+05°, durante 72+4 horas.
Incubar :
Microorganismo Temperatura de incubación Tiempo de incubación
Coliformes totales 35°C+0,5 22-24 horas
Coliformes termotolerantes 44.5°C+0,2, 24 horas
Bacterias heterotróficas 35.5+05°C 72+4 horas
mesófilas
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14. Después de un periodo determinado de incubación, seleccionar para lectura los

volúmenes filtrados que presentan entre 20 y 80 colonias típicas de coliformes y un total de
bacterias (típicas y atípicas de coliformes) inferior a 200. En el “M-ENDO AGAR LES” las
colonias típicas de coliformes presentan coloración rosado a rojo oscuro con brillo metalico
verde dorado superficial, recubriendo toda la superficie de la colonia o parte de ella; las
colonias atípicas varían en apariencia presentándose desde incoloras hasta rojo oscuras,
observándose un brillo metálico en su superficie. En el m-FC las colonias típicas de
coniformes termotolerantes se presentan de color azul y las Bacterias heterotróficas aerobias
mesófilas viables de color blanco, en el medio R2A.

15. La densidad de coliformes totales, coliformes termotolerantes y bacterias heterotróficas

aerobias mesófilas viables, determinada a través de la técnica membrana filtrante, se
expresa, se expresa como numero de Unidades Formadoras de Colonias por 100 ml (UFC
/100 ml).