LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2010, Volume 5, N°20

Article original

Validation de la méthode du dosage de l’histamine dans les produits de la

pêche par HPLC

Validation Method of the Determination of Histamine Quantification in Seafood Using HPLC

Abderrazzak Rachidi 1, Dina Baghdadi Mazini 2, Said Barrijal 2, Guillaume Duflos 3, Philippe Caillaud 4

1 : ONSSA - Laboratoire Régional d’Analyses et de Recherches – Casablanca; 2: Faculté des Sciences et

Techniques - Tanger; 3 : AFSSA – Laboratoire d’études et de Recherches sur les produits de la pêche – Boulogne
sur mer; 4 : AFNOR - EURL – Œnologues de France

RESUME :
L’objectif de cette étude est de valider la méthode
HPLC pour le dosage des amines biogènes,
l’histamine en particulier dans les produits de la
pêche. Ce travail va nous permettre de quantifier
de manière exacte nos échantillons et pouvoir
assurer la qualité et la salubrité des produits
alimentaires. Pour valider cette méthode, nous
avons appliqué les exigences de la norme NF
V03-110, Mai 2010 [1], basés sur le profil
d’exactitude et de la fidélité et ceux de la norme
NF T 90-210 [2], basés sur l’étude de la fonction
étalonnage. Les résultats obtenus déclarent la
méthode valide et fiable pour son usage comme
méthode de routine.
MOTS CLÉS : Validation interne, HPLC,
Histamine, Amines biogènes, Exactitude.
ABSTRACT:
The aim of this study is to validate HPLC method
for proportioning of the biogenic amines;
particularly histamine in seafood. This work will
help us to quantify in an exact way our samples
and to be able to ensure the quality and the
healthiness of the food products. To validate this
method, we applied the requirements of standard
NF V03-110 of May 2010 [1], based on the
exactitude and fidelity, and the requirements of
standard NF T 90-210 [2] based on the survey of
the standardization .The results obtained declare
the method valid and reliable for the use as
method in routine.
KEYWORDS : interne validation, HPLC,
Histamine, Biogenic amines, Exactitude.

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INTRODUCTION :
Selon la norme ISO 17025 [3] ; la validation
est une exigence technique qui permet
l’évaluation des compétences des laboratoires
d’étalonnage, d’essais et d’analyses.
Les principaux éléments pour la validation d’une
méthode d’analyse sont (NF T 90-210) [3]:

L’étude de la fonction d’étalonnage;

La limite de quantification et de détection;

L’étude des rendements;

L’exactitude.
Ce travail a été élaboré dans le but de valider le
protocole expérimental de la méthode HPLC
développée au Laboratoire Régional d’Analyses
et de Recherches de Casablanca pour l’analyse
des amines biogènes dans les produits de la
pêche.
1. Domaine d’application :
Ce mode opératoire décrit principalement la
méthode du dosage de l’histamine (0 à 250
mg/kg) par HPLC dans les poissons frais,
surgelés et en conserves.
2. Principe :
Cette méthode permet de séparer et de
quantifier les amines biogènes (putrescine,
cadavérine, spermine, spermidine, tyramine,
tryptamine et histamine) présents dans les
matrices biologiques.
L’extraction des amines se fait après une étape de
déprotéinisation par l’acide perchlorique 0,2M
elles sont marquées avec le chlorure de dansyl.
Après marquage, la proline est ajoutée pour
neutraliser l’excès de chlorure de dansyl. Les
amines sont séparées sur une colonne C18 utilisant
un gradient d’élution eau/acétonitrile. La durée de
séparation chromatographique est de 30 minutes.
L’analyse du chromatogramme permet
d’identifier les différents pics et leurs surfaces
correspondantes par une mesure à 254 nm.
3. Matériel et Méthodes :
3.1 Réactifs :
• Acétone, qualité HPLC Sharlau
• Acétonitrile qualité HPLC Sharlau;
• Toluène qualité HPLC Merck
5
• Acide perchlorique à 70 % p.a;
• 1,3 diaminopropane;Aldrich
• Carbonate de sodium pour analyse ;
• Chlorure de Dansyl ; Sigma,
• L-Proline. Sigma,
• Histamine dihydrochloride, Fluka,
PM = 184.07 g
3.2 Appareillage :

Centrifugeuse réfrigérée, vortex ;

Bain marie, Balance;

Broyeur, pipette et tube;

Evaporateur sous flux d’azote, seringue;

Congélateur, Vial, flacons, filtres;

Chaîne HPLC Shimadzu LC-20A
Prominence.

Injecteur automatique Shimadzu SIL 20
AC réfrigéré à 4°C ;

Détecteur à barrettes diodes Shimadzu SPD
M 20 A.
3.3 Standards de validation :
Deux répétitions (n=2) ont été préparées pour
chaque niveau de concentration (m=5).l’ensemble
de l’étape de préparation a été répétée pendant
cinq jours (p=5).Ces standards de validation (SV)
ont été préparés de manière indépendante dans la
matrice en vue de simuler le plus possible la
procédure analytique pour la détermination des
impuretés. Pour cela, un lot d’échantillon
(contrôle inter laboratoire CIL-2009) a été utilisé
comme matrice de contrôle.
3.4 Conditions chromatographiques :
 Colonne Wacosil C18 RS 5µm, 100 Å (25
cm X 4.6 mm)
 Phase Mobile (A : Eau /B : Acétonitrile).
Suivant un gradient développé par Duflos
et al [4] et obtenu par 2 pompes
Shimadzu LC-20 AD.
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Tableau 1 : Gradient d’élution. en comparant les biais relatifs observés à des

Temps (min) Eau Acétonitrile Ecarts Maximum Acceptables (EMA). Notre plan
0 40% 60% est formé de Cinq niveaux de concentrations
6 25% 75% (étalons indépendants) préparés pendant 5 jours :
8 25% 75% p =5 et n= 5 avec deux répétitions par niveau et
13 5% 95% jour, ce qui fait un total de 5×5× 2 = 50 essais.
20 5% 95%
20.01 40% 60% Tableau 2 : Rapport des aires obtenues sur des
30 40% 60% étalons à des jours différents d’évaluation d’une
fonction linéaire de type y = a0 + a1x
Ce gradient permet de séparer les amines niv1 niv2 niv3 niv4 niv5
biogènes avec un débit de 1ml/min.
Séries 0 25 50 100 250

L’identification des pics s’effectue à l’aide 11-Mars
d’un chromatogramme de référence [4]. Une (J1) 0,2326 2,0527 4,0863 8,0739 20,3395
vérification du temps de rétention est 12-Mars
effectuée à l’aide de la gamme d’étalonnage. (J2) 0,2584 2,1954 4,2608 8,1203 19,9378
15-Mars
(J3) 0,2719 2,1345 4,0757 8,1185 19,2768
16-Mars
(J4) 0,2527 2,1833 4,0410 8,0158 20,6128
17-Mars
(J5) 0,2409 2,1679 4,0547 8,1451 19,4291

y = a0 + a1 x CV
a0 a1 résiduel
Séries
11-Mars (J1) 0,0899 0,0808 1,6%
12-Mars (J2) 0,2648 0,0787 0,6%
15-Mars (J3) 0,3012 0,0762 2,0%
16-Mars (J4) 0,0760 0,0817 2,8%
17-Mars (J5) 0,2754 0,0768 1,8%

L’ordonnée à l’origine a0 et la pente a1 sont

estimées lors de chaque jour d’étalonnage et
Figure 1 : Chromatogramme de référence permettent de calculer les grandeurs retrouvées de
(Duflos et al 1999). chaque étalon.
4. Outils statistiques : Tableau 3 : Quantités d’histamine retrouvées en
Macro Excel développés par Mr Caillaud mg/kg
Philippe (membre de la commission générale niv1 niv2 niv3 niv4 niv5
méthodes analyse agroalimentaire de l’AFNOR,
EURL – Œnologues de France). Séries 0 25 50 100 250

11-mars 2,91 25,66 51,08 100,92 254,24

5. Résultats et discussions :
12-mars 3,23 27,44 53,26 101,50 249,22
5.1. Étude de la fonction d’étalonnage : plan
d’expériences de type A (NF T 90-210) 15-mars 3,40 26,68 50,95 101,48 240,96
Le plan d'expériences de type A permet 16-mars 3,16 27,29 50,51 100,20 257,66
d’évaluer une fonction d’étalonnage dans un
domaine d’étalonnage par un test d’adéquation ou 17-mars 3,01 27,10 50,68 101,81 242,86

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Biais en ٪
Quantité retrouvée

Quantité théorique
Quantité théorique

Figure 3 : Répartition des biais en % en fonction

Figure 2 : Quantités retrouvées par rapport aux des niveaux par rapport des EMA étalonnage définis
quantités théoriques en mg/kg et à la par le laboratoire.
)
droite X = X .
La fonction d’étalonnage est considérée
Approche par vérification individuelle par acceptable dans le domaine étudié [0-250ppm]
rapport à un EMA (écart maximal accepté) : Les avec l’approche EMA utilisé car les biais relatifs
biais absolus et relatifs entre chaque grandeur mesurés sont inférieurs à l’EMA fixé par le
théorique et chaque grandeur retrouvée doivent laboratoire.
être calculés.
Les biais observés sur chaque étalon analysé 5.2. Étude des rendements : plan C
sont acceptable (± inférieurs) par rapport aux L’étalonnage est réalisé à partir de solutions
EMA fixés. standard ayant subies toutes les étapes du
protocole analytique d’extraction. La
Tableau 4 : Biais relatifs par rapport aux valeurs concentration de chaque amine biogène est
théoriques calculée par rapport à un standard interne (1-3
niv1 niv2 niv3 niv4 niv5
Diaminopropane) Il n’y a donc pas lieu de
réaliser une étude de rendement.
Séries 0 25 50 100 250

11-mars ---- -2,8% -1,1% -1,2% 0,3% 5.3. Etude de l’exactitude (NF T 90-210)
L’exactitude de la méthode est étudiée sur des
12-mars ---- -1,9% 1,5% -0,2% 0,0%
échantillons de valeur de référence par ajouts
15-mars ---- -3,7% -0,9% 2,6% -0,3% dosés à 0,5 mg/kg, 50 mg/Kg, 100 mg/Kg et 200
16-mars ---- 3,2% -2,9% -2,8% 0,5% mg/Kg. Les valeurs expérimentales utilisées pour
17-mars ---- -1,5% -1,6% 2,4% -0,3%
l'étude de l'exactitude (plan D) à quatre niveaux
de concentrations.
EMA% fixé 10% 10% 10% 10% 10%
Les résultats sont interprétés pour la
Conclusion Vérifié vérification de la justesse et de l’exactitude de la
méthode par rapport à un écart maximal
Le choix des EMA dépend de la simulation acceptable autour de chaque valeur de référence
du défaut accepté dans le domaine d’étalonnage fixé par le laboratoire.
ainsi qu’une corrélation supérieure à 0,999. 5.3.1. Exactitude au Niveau 1 (0,5 mg / kg) ou
Notre modèle d’étalonnage est appliqué avec limite de quantification présupposée : plan B
un niveau ± 10%. Cinq échantillons ne contenant pas
d’histamine sont préparés à une valeur de la

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limite de quantification présupposée à 0,5 mg/Kg mLQ + 2× sLQ < LQ + 60 % × LQ.

puis sont analysés dans des conditions de fidélité
intermédiaire. Chaque analyse est répétée deux 5.3.2. Exactitude au Niveau 2 (50 mg / kg)
fois dans des conditions de répétabilité. Tableau 7 : Tableau des résultats pour un ajout
dosé à 50 mg/Kg
Tableau 5 : Etude de la limite quantification Variance
Résultats en mg/kg Moyenne
Variance des séries
Résultats en mg/kg Moyenne Séries
des séries
Séries
Répétition Répétition 2 Répétition Répétition zi 2
1 2 zi Si
1 2
Si
22-mars
0,5032 0,4991 0,5012 0,00001 22-mars (J1) 52,321 52,109 52,22 0,023
(J1)
23-mars 23-mars (J2) 50,143 49,801 49,97 0,058
0,5185 0,5201 0,5193 0,00000
(J2)
24-mars 24-mars (J3) 50,300 50,500 50,40 0,020
0,4907 0,5120 0,5014 0,00023
(J3) 25-mars (J4) 49,900 51,000 50,45 0,605
25-mars
0,5020 0,5155 0,5087 0,00009
(J4) 26-mars (J5) 51,600 50,196 50,90 0,986
26-mars
0,5160 0,5096 0,5128 0,00002
(J5)
5.3.3. Exactitude au Niveau 3 (100 mg / kg)
Tableau 6 : Paramètres d’exactitude de la limite de Tableau 8: Tableau des résultats pour un ajout
quantification à 0,5 mg/kg dosé à 100 mg/Kg
Nombre de séries n 5 Variance
Résultats en mg/kg Moyenne
des séries
Nombre de répétitions par série r 2
Séries
Moyenne générale mLQ 0,50868 Répétition Répétition zi 2
Si
1 2
Ecart-type de fidélité intermédiaire : sFI 0,00974
CV de fidélité intermédiaire CVFI en % 1,9 % 22-mars (J1) 100,56 100,11 100,33 0,102
Variance de répétabilité : srépét2 0,00007 23-mars (J2) 102,97 103,18 103,07 0,023
Variance des moyennes : 0,00006
24-mars (J3) 100,15 99,60 99,88 0,154
Variance inter-séries : sB2 0,00003
25-mars (J4) 99,50 102,05 100,77 3,239
Variance de fidélité intermédiaire sFI2 0,00009
Ecart-type de répétabilité : srépét 0,00834 26-mars (J5) 100,40 101,72 101,06 0,869

CV de répétabilité CVrépét en % 1,6 %

5.3.4. Exactitude au Niveau 4 (200 mg / kg)
Interprétation de l'exactitude (T90-210) Tableau 9 : Tableau des résultats pour un ajout
Référence en mg/kg 0,5 dosé à 200 mg/Kg
EMA 0,3 Variance
Résultats en mg/kg Moyenne
des séries
LQ + 60 % × LQ 0,8 Séries
0,5282 Répétition Répétition 2
Z − 2× S FI 1 2 zi Si

+ 2× 0,4892
Z S FI 22-mars (J1) 202,98 202,02 202 ,50 0,466
LQ - 60 % × LQ 0,2
23-mars (J2) 201,12 199,50 200,31 1,317

La limite de quantification présupposée est 24-mars (J3) 200,41 199,70 200,06 0,255

exacte, elle est vérifiée par les deux 25-mars (J4) 201,29 200,44 200,87 0,359
inégalités suivantes :
mLQ − 2× sLQ > LQ – 60 % × LQ et 26-mars (J5) 199,42 201,16 200,39 1,522

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5.3.4. Bilan de l'étude de l'exactitude z ± kFI×sFI , la valeur kFI est calculée avec la loi
Tableau 10 : Bilan de l’étude de l’exactitude
de Student avec une proportion de 90%. Notre
pour la fidélité et la justesse
Niveau Niveau Niveau Niveau étude de la fidélité intermédiaire est réalisée selon
Niveaux 1 2 3 4 la norme V03-110.
Valeur de référence L’intervalle d’acceptabilité correspond à
0,5 50 100 200
mg /kg
l’intervalle autour de la valeur de référence par
EMA acceptable ou
λ en %
20 % 20 % 20 % 20 % rapport à l’écart maximal acceptable fixé par le
laboratoire pour valider sa méthode
FIDELITE d’analyse.
Ecart type de
0,008 0,582 0,937 0,885
répétabilité (Srépét)
Ecart type de
0,010 0,956 1,398 1,174
fidélité (SFI)
Coef. de variation
0,44
de répétabilité 1,64 % 1,15 % 0,93 %
%
(CVrépét)
Coef. de variation 0,58
1,91 % 1,88 % 1,38 %
de fidélité (CVFI) %
Incertitude relative
3,8 % 3,8 % 2,8 % 1,2 %
de fidélité, k = 2
kFI avec la norme
1,98 2,11 2,08 2,03 Figure 4 : Représentation de l'intervalle de
V03-110, π = 90 %
tolérance en % suivant la norme NF T90-210 et des
JUSTESSE EMA en %
Valeur moyenne 200,8
0,509 50,787 101,023
estimée 05
Biais en % 1,74 % 1,57 % 1,02 % 0,4 %

Tableau 11 : Bilan de l’étude de l’exactitude

avec la norme V03-110
Niveau Niveau Niveau Niveau
Niveaux
1 2 3 4
Probabilité π 90 % 90 % 90 % 90 %

Limite haute
0,80 60,00 120,00 240,00
d’acceptabilité

Limite haute de Figure 5 : Représentation de l'intervalle de

0,528 52,807 103,926 203,188
tolérance tolérance en % suivant la norme NF V03-10 et des
limites d'acceptabilité en %
Limite basse de
0,489 48,768 98,120 198,422
tolérance
Les profits d’exactitude ci-dessus montrent
Limite basse
0,20 40,00 80,00 160,00 les intervalles de tolérance à différents niveaux de
d’acceptabilité
concentration et qui ne dépassent pas les 20 %

L’intervalle de tolérance correspond à l’intervalle CONCLUSION :

où une proportion de futurs résultats devrait se La validation de notre méthode de mesure
situer dans cet intervalle sous la forme : s'appuie sur une étude intra laboratoire au travers
de caractéristiques quantifiées et vérifiées
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(fonction d’étalonnage et profil d’exactitude). 1. L’étude de la fonction étalonnage a montré

Ces caractéristiques ont démontré la performance
de la méthode et ainsi constituent la structure d'un
dossier de validation de la méthode dans le cadre
d'une démarche qualité. Ces informations sont
utilisées pour évaluer l'incertitude de mesure ou
d'autres paramètres qui résument le profil
d'exactitude.
L’acceptation de cette validation est vérifiée
sur la base des évaluations faites :
que le modèle de régression et le domaine de
linéarité sont valides avec un EMA fixé
à 10% comme le précise la norme T 90-210,
et qu’il existe une relation linéaire entre les
quantités retrouvées et leurs valeurs de
référence.
2. L’exactitude de la limite de quantification
présupposée a été vérifiée à 500 µg/Kg.
3. L’exactitude et la justesse ont été vérifiées
avec EMA de 20%. pour les quatre niveaux
de concentrations, 0,5, 50, 100 et 200 mg/kg.

REFERENCES
[1] NF V03-110, Analyses des laboratoires d'étalonnages et d'essais, [6] NF ISO 5725-2, Application de la
produits agricoles et alimentaires Deuxième édition 2005-05-15 ; statistique — Exactitude (justesse et
protocoles de caractérisation en vue Version corrigée 2005-11-01. fidélité) des résultats et méthodes de
de la validation d’une méthode mesure — Partie 2 : Méthode de base
[4] Duflos et al : Relevance of matrix
d’analyse quantitative par pour la détermination de la
effect in determination of biogenic
construction du profil d’exactitude, répétabilité et de la reproductibilité
amines in plaice (Pleuronectes
Mai 2010 d’une méthode de mesure normalisée
platessa) and whiting (Merlangus
(indice de classement : X 06-041-2).
[2] NF T 90-210, Qualité de l'eau merlangus). Journal AOAC
Protocole d'évaluation initiale des international, vol 82, n°5, 1097- [7] NF ISO 5725-3, Application de la
performances d'une méthode dans 1101,1999 statistique — Exactitude (justesse et
un laboratoire (ICS : 03.120.30 ; fidélité) des résultats et méthodes de
[5] NF ISO 5725-1, Application de la
13.060.50 ; 13.060.60/ ISSN 0335- mesure — Partie 3 : Mesures
statistique — Exactitude (justesse et
3931/ Mai 2009). intermédiaires de la fidélité d’une
fidélité) des résultats et méthodes de
méthode de mesure normalisée
[3] ISO/CEI 17025 Exigences mesure — Partie 1 : Principes
(indice de classement : X 06-041-3).
générales concernant la généraux et définitions (indice de
compétence des classement : X 06-041 1).

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