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AVPN ISO 9308

2012
Edition : 01

ICS : 07.100.20

QUALITÉ DE L’EAU

Recherche et dénombrement des Escherichia coli


et des bactéries coliformes dans les eaux
de surface et résiduaires

Partie 3 : Méthode miniaturisée (nombre le plus


probable) pour ensemencement en milieu liquide

20 p

5, 7 Rue Abou Hamou Moussa- Alger


Tél : 021 64.19.08 Fax : 021 64.17.61
Site : http://www.ianor.org
AVANT PROPOS

La présente norme a été adoptée comme Norme Algérienne par les membres du comité
technique national n° 43 : « Hygiène alimentaire » conformément à la résolution du procès-
verbal de réunion n° 01 du 09/02/2012.

Le contenu technique de la présente norme est Identique à ISO 9308-2 : 1998 + Rectificatif
Technique : 2000.

La liste des membres ayant participé à l’adoption de la présente norme est la suivante :

NOM PRENOM ORGANISME STATUT - CTN

Présidente du comité

Secrétaire technique

Membre du comité

Membre du comité

Membre du comité

Membre du comité

Membre du comité

Membre du comité

Membre du comité

Membre du comité

Membre du comité

Membre du comité

Reproduction interdite
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Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

R
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.

O
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour

N
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités

IA
membres votants.

La Norme internationale ISO 9308-3 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-
e
comité SC 4, Méthodes microbiologiques.
v
si

L’ISO 9308 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité de l’eau — Recherche et
dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes dans les eaux de surface et résiduaires :
u
cl

— Partie 1: Méthode par filtration sur membrane


ex

— Partie 2: Méthode par enrichissement en milieu liquide


— Partie 3: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) par ensemencement en milieu liquide
rié

Les annexes E et F font partie intégrante de la présente partie de l’ISO 9308. Les annexes A à D sont données
uniquement à titre d’information.
op
Pr

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Sommaire Page

1 Domaine d’application ................................................................................................................................ 1

2 Références normatives ............................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ................................................................................................................................... 2

4 Principe ....................................................................................................................................................... 2

R
5 Appareillage ................................................................................................................................................ 2

O
6 Échantillonnage .......................................................................................................................................... 3

N
7 Milieu de culture et diluant .......................................................................................................................... 3

8
IA
Mode opératoire .......................................................................................................................................... 4
e
9 Expression des résultats ............................................................................................................................ 6
v
si

10 Rapport d’essai ........................................................................................................................................... 7


u

11 Données de performance ........................................................................................................................... 7


cl

Annexe A (informative) Exemple de logiciel pour une analyse statistique des NPP .......................................... 8
ex

Annexe B (informative) Exemple de logiciel en BASIC pour le calcul des NPP ................................................. 12

Annexe C (informative) Sel de mer synthétique ................................................................................................. 14


rié

Annexe D (informative) Caractéristiques de performance de la méthode .......................................................... 16

Annexe E (normative) Critères de qualité pour la fabrication du milieu en microplaques .................................. 17


op

Annexe F (normative) Procédure de préparation de microplaques d’étalonnage .............................................. 18


Pr

Bibliographie ..................................................................................................................................................... 21

© ISO 1998
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l'éditeur.
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Imprimé en Suisse

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NORME INTERNATIONALE © ISO ISO 9308-3:1998(F)

Qualité de l’eau — Recherche et dénombrement des


Escherichia coli et des bactéries coliformes dans les eaux
de surface et résiduaires —

Partie 3:
Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour ensemencement

R
en milieu liquide

O
N
1 Domaine d’application
IA
e
La présente partie de l’ISO 9308 spécifie une méthode miniaturisée pour la recherche et le dénombrement
v
d’Escherichia coli (E. coli ) dans les eaux de surface et résiduaires par ensemencement en milieu liquide. La
si

présente méthode est applicable à tous les types d’eaux de surface et résiduaires, plus particulièrement celles
u

riches en matières en suspension.


cl

La présente méthode n’est pas applicable à l’eau potable ou tout autre type d’eau dont la valeur guide est inférieure
ex

à 15 pour 100 ml.

La présente méthode ne convient pas à la recherche et au dénombrement de bactéries coliformes autres que les

E. coli.
rié

2 Références normatives
op

Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente partie de l’ISO 9308. Pour les références datées, les
Pr

amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente partie de l’ISO 9308 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l’ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.

ISO 3951, Règles et tables d’échantillonnage pour les contrôles par mesures des pourcentages de non conformes.

ISO 5667-1, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 1: Guide général pour l’établissement des programmes
d’échantillonnage.

ISO 5667-2, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques d’échantillonnage.

ISO 5667-3, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 3: Guide général pour la conservation et la manipulation
des échantillons.

ISO 8199, Qualité de l’eau — Guide général pour le dénombrement des micro-organismes sur milieu de culture.

ISO/CEI Guide 2, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général.

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3 Termes et définitions

Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 9308, les termes et définitions donnés dans le Guide 2 ISO/CEI ainsi
que le terme et la définition suivants s’appliquent.

3.1
Escherichia coli
E. coli
micro-organisme qui est b-D-glucuronidase positif à une température d’incubation de 44 °C dans le milieu liquide
spécifié contenant du 4-méthylumbelliféryl-b-D-glucuronide (MUG)

4 Principe

L’échantillon dilué est ensemencé dans une série de puits d’une microplaque contenant le milieu de culture
déshydraté.

Les microplaques sont examinées sous rayonnement ultraviolet à 366 nm dans l’obscurité après une période

R
d’incubation de 36 h minimum et 72 h maximum à 44 °C ñ 0,5 °C. La présence d’E. coli est indiquée par une

O
fluorescence bleue résultant de l’hydrolyse du MUG. Les résultats sont donnés en nombre le plus probable (NPP)
par 100 ml.

N
5 Appareillage
IA
e
À l’exclusion du matériel livré stérile, la verrerie doit être stérilisée conformément aux instructions données dans
v
l’ISO 8199.
u si

Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.


cl

5.1 Appareillage pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave).
ex

5.2 Étuve thermostatée, réglée à 44 °C ñ 0,5 °C.



rié

5.3 Tunnel de séchage ou hotte à flux laminaire vertical (de préférence de classe II).
op

5.4 Chambre d’observation UV (lampe de Wood, 366 nm).


Pr

AVERTISSEMENT — La lumière UV cause une irritation des yeux et de la peau. Utiliser des lunettes et
gants de protection.

5.5 Réfractomètre portable (optionnel).

5.6 pH-mètre, ayant une précision de ñ 0,1.

5.7 Tubes à essai, de dimensions 16 mm ¥ 160 mm et 20 mm ¥ 200 mm, ou fioles de capacités similaires.

5.8 Multipipette à 8 canaux, réglable ou préréglée, ou tout système convenable pour mesurer et distribuer 200 µl
par puits.

5.9 Cônes stériles pour multipipette.

2
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5.10 Matériel pour filtration sur membrane, conformément à l’ISO 8199, y compris filtres à membrane ayant
une porosité nominale de 0,2 µm, pour la stérilisation de liquides.

5.11 Microplaques steriles, à 96 puits de 350 µl, à fond plat, non fluorescentes.

5.12 Bandes adhésives stériles pour la fermeture des microplaques.

5.13 Boîtes de Petri stériles, de diamètre 90 mm.

6 Échantillonnage

Prélever les échantillons et les livrer au laboratoire conformément à l’ISO 8199 ainsi qu’à l’ISO 5667-1, l’ISO 5667-2
et l’ISO 5667-3.

R
7 Milieu de culture et diluant

O
7.1 Prescriptions générales

N
IA
Pour garantir des résultats reproductibles, préparer le milieu de culture et les diluants à l’aide soit de constituants de
qualité uniforme et de produits chimiques de qualité analytique reconnue, soit d’un diluant déshydraté ou d’un milieu
complet déshydraté, préparés conformément aux instructions du fabricant. Les préparer avec de l’eau déminé-
e
ralisée ou distillée exempte de substances pouvant inhiber la croissance dans les conditions de l’essai. Si les
v
milieux ne sont pas utilisés immédiatement, les conserver dans l’obscurité à (5 ñ 3) °C pour une période inférieure à
si

1 mois et dans des conditions évitant toute modification de leur composition.


u

NOTE L’utilisation de produits chimiques d’autres qualités est permise, sous réserve de démontrer qu’ils ont une
cl

performance équivalente pour l’essai.


ex

7.2 Diluants

7.2.1 Diluant Spécial (DS)


rié

Sel marin synthétique1) 22,5 g


op

Solution de bleu de bromophénol (optionnel) 10 ml


Pr

Eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) 1 000 ml

Stériliser à l’autoclave (5.1) à 121 °C ñ 3 °C pendant 15 min à 20 min.

La solution de bleu de bromophénol est préparée en ajoutant 0,04 g dans 100 ml d’éthanol à 50 %. Elle est utilisée
pour colorer le DS en bleu et éviter de le confondre avec l’eau déminéralisée ou distillée.

7.2.2 Eau déminéralisée ou distillée, exempte de substances inhibant la croissance dans les conditions de
l’essai.

Stériliser à l’autoclave (5.1) à 121 °C ñ 3 °C pendant 20 min.

1) Une analyse type d’un sel de mer synthétique convenable et disponible dans le commerce est donnée dans l’annexe C.
D’autres diluants, tels que l’eau distillée, peuvent être utilisés pour le dénombrement d’E. coli, sauf si des entérocoques
intestinaux doivent être dénombrés à partir des mêmes tubes de dilution.

3
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7.3 Milieu de culture: milieu MUG/EC

Composition:

Tryptone 40 g
Salicine 1g
Triton X 100‚ 1g
MUG (4-méthylumbelliféryl-b-D-glucuronide) 100 mg
Eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) 1 000 ml

Ajouter à 1 litre d’eau successivement la tryptone, la salicine et le Triton 2), tout en maintenant un chauffage doux et
une agitation magnétique, puis porter à ébullition jusqu’à dissolution complète. Laisser refroidir et ajouter la solution
de MUG, dissous dans 2 ml de N,N-diméthylformamide.

AVERTISSEMENT — Le N,N-diméthylformamide est toxique et peut provoquer le cancer. Il est dangereux


de l’inhaler, de le mettre en contact avec la peau, de l’avaler. Utiliser impérativement sous une hotte
d’aspiration de vapeurs chimiques.

R
O
Ajuster le pH à 6,9 ñ 0,2.

N
Stériliser par filtration sur membrane de porosité moyenne de 0,2 µm (5.10).

IA
Répartir en microplaques de 96 puits (5.11) à raison de 100 µl de milieu par puits (capacité minimale de 350 µl) et
déshydrater immédiatement sous tunnel de séchage ou hotte à flux laminaire (5.3).
v e
La fabrication du milieu doit respecter les critères de qualité donnés à l’annexe E.
u si
cl

8 Mode opératoire
ex

8.1 Choix des dilutions


Le nombre de dilutions à ensemencer varie en fonction du niveau de contamination présumé de l’eau à analyser.
Le Tableau 1 montre quelques exemples.
rié
op

Tableau 1
Pr

Origine de Nombre de Plage de mesure,


Nombre de dilutions
l’échantillon puits/dilution bactéries par 100 ml
Eaux de baignade 2 64 puits au 1/2
15 à 3,5 ¥ 104
32 puits au 1/20
Eaux douces 4 24 puits au 1/2
superficielles 24 puits au 1/20
40 à 3,2 ¥ 106
24 puits au 1/200
24 puits au 1/2 000
Eaux résiduaires 6 16 puits au 1/2 jusqu’à
60 à 6,7 ¥ 108
et stations d’épuration 16 puits au 1/200 000

2) Le Triton X 100 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs de la présente partie de l’ISO 9308 et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.

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8.2 Préparation des dilutions

NOTE Il est recommandé d’utiliser ces modes opératoires dans un poste de sécurité biologique, la dilution et le pipettage
pouvant produire des aérosols.

8.2.1 Eaux douces et eaux saumâtres (usées) [salinité , 30 g/kg, mesurée à l’aide d’un réfractomètre (5.5) ou
de méthodes équivalentes]

Préparer, sur un portoir, le nombre de tubes stériles (5.7) correspondant au nombre de dilutions choisies. Introduire
dans chacun d’eux 9 ml de diluant spécial (7.2.1).

Agiter vigoureusement l’échantillon (voir l’article 6) afin d’obtenir une répartition homogène des micro-organismes et
transférer immédiatement, à l’aide d’une pipette stérile, 9 ml de cet échantillon homogénéisé dans le premier des
tubes contenant 9 ml de diluant (dilution 1/2).

Avec une nouvelle pipette, transférer 1 ml de cette dilution (homogénéisée) dans le deuxième tube (dilution 1/20).

À partir du deuxième tube (dilution 1/20 soigneusement homogénéisée), procéder, si nécessaire, à une autre

R
dilution à 1/10 afin d’obtenir la dilution suivante (1/200).

O
Continuer ainsi jusqu’à ce que toutes les dilutions aient été préparées.

N
8.2.2 Eaux de mer (salinité > 30 g/kg)

IA
Préparer, sur un portoir, le nombre de tubes stériles (5.7) correspondant au nombre de dilutions choisies. Introduire
e
dans le premier tube 9 ml d’eau déminéralisée ou distillée (7.2.2) et dans les suivants 9 ml de diluant spécial (7.2.1).
v
si

Agiter vigoureusement l’échantillon (voir l’article 6) afin d’obtenir une répartition homogène des micro-organismes et
transférer immédiatement, à l’aide d’une pipette stérile, 9 ml de cet échantillon homogénéisé dans le premier des
u

tubes contenant 9 ml de diluant (7.2.2) (dilution 1/2).


cl

Avec une nouvelle pipette stérile, transférer 1 ml de cette dilution (homogénéisée) dans le deuxième tube (dilution
ex

1/20).

À partir du deuxième tube (dilution 1/20 soigneusement homogénéisée), procéder, si nécessaire, à une autre
dilution à 1/10 afin d’obtenir la dilution suivante (1/200).
rié

Continuer ainsi jusqu’à ce que toutes les dilutions aient été préparées.
op

8.3 Ensemencement et incubation des microplaques


Pr

8.3.1 Ensemencement

Transférer le contenu du premier tube de dilution dans une boîte de Petri vide, stérile, de diamètre 90 mm.

À l’aide de la pipette multicanaux (5.8) munie de huit cônes stériles (5.9), répartir 200 µl dans chacun des puits de
la microplaque (5.11) correspondant à cette première dilution.

Pour chacune des dilutions suivantes (1/20, 1/200, etc.), opérer de manière identique en changeant la boîte de Petri
et la rangée de huit cônes stériles entre chaque dilution.

De façon équivalente, tout autre système convenable (5.8) peut être utilisé pour répartir 200 µl de chaque dilution
par puits, selon le Tableau 1.

ATTENTION — Éviter les contaminations par débordement d’un puits à l’autre.

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8.3.2 Incubation

Une fois la microplaque ensemencée, la recouvrir d’une bande adhésive stérile (5.12) à usage unique, prévue à cet
effet.

Incuber la microplaque à l’étuve (5.2) à 44 °C ñ 0,5 °C pendant au minimum 36 h et au maximum 72 h.

NOTE Il convient de manipuler les microplaques avec précaution, sans les pencher.

8.4 Lecture des résultats

Placer chaque microplaque, recouverte d’une bande adhésive, dans la chambre d’observation UV (5.4).

Considérer comme positifs les puits dans lesquels on observe une fluorescence bleue.

NOTE La fluorescence n’évoluant pas avec le temps, la lecture peut être effectuée à tout moment après 36 h.

R
9 Expression des résultats

O
9.1 Détermination du nombre caractéristique

N
IA
Pour chacune des dilutions choisies, noter le nombre de puits positifs (+).

Lorsque trois dilutions ou plus ont été ensemencées, un nombre caractéristique de 3 chiffres, le dernier étant 0 si
e
possible, doit être consigné conformément à l’ISO 8199.
v
si

EXEMPLE 1: Eau de baignade


u

1/2 32 (+) sur 64


cl

1/20 5 (+) sur 32


ex

Consigner 32/5 comme étant le nombre caractéristique.


EXEMPLE 2: Eau superficielle

1/2 24 (+) sur 24


rié

1/20 18 (+) sur 24


op

1/200 5 (+) sur 24

1/2 000 1 (+) sur 24


Pr

Consigner 18/5/1 comme étant le nombre caractéristique.

EXEMPLE 3: Eau résiduaire

1/2 16 (+) sur 16

1/20 16 (+) sur 16

1/200 12 (+) sur 16

1/2 000 5 (+) sur 16

1/20 000 0 (+) sur 16

1/200 000 0 (+) sur 16

Consigner 12/5/0 comme étant le nombre caractéristique.

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9.2 Calcul du NPP et de son intervalle de confiance

Le NPP est une estimation statistique de la densité des micro-organismes, supposée répondre à une distribution de
Poisson dans les volumes ensemencés. Des intervalles de confiance sont attachés à ce NPP.

Les logiciels présentés à l’annexe A et à l’annexe B permettent pour chaque configuration d’ensemencement de
calculer le NPP d’E. coli par millilitre d’eau et l’intervalle de confiance à 95 %.

Pour les exemples qui suivent, NC est le nombre caractéristique, LI est la limite inférieure, et LS est la limite
supérieure.

EXEMPLE 1:

Si NC = 32/5, le logiciel à l’annexe A donne 7,56 E. coli par millilitre


(LI = 5,42; LS = 10,54)

Soit 756/100 ml (542 à 1 054).

R
O
EXEMPLE 2:

N
Si NC = 18/5/1, le logiciel à l’annexe A donne 159,08 E. coli par millilitre
(LI = 101,99; LS = 248,11)

EXEMPLE 3: IA
v e
Si NC = 12/5/0, le logiciel à l’annexe A donne 1 724,61 E. coli par millilitre
si

(LI = 1 003,98; LS = 2 962,50)


u
cl

Si aucun puits n’est positif, exprimer le résultat sous la forme suivante:


ex

< n/100 ml

où n est le NPP pour 1 puits positif dans les conditions de dilution utilisées.
rié
op

10 Rapport d’essai
Pr

Le rapport d’essai doit donner toutes les indications nécessaires à l’identification complète de l’échantillon, la
référence à la méthode utilisée et les résultats.

Le rapport d’essai doit en outre mentionner les phénomènes particuliers observés au cours de l’analyse et les
opérations non spécifiées dans la méthode, ou considérées comme facultatives, ayant pu modifier les résultats.

11 Données de performance

Des informations sur la répétabilité et la reproductibilité de la procédure, obtenues à partir d’essais interlaboratoires,
sont données à l’annexe D.

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Annexe A
(informative)

Exemple de logiciel pour une analyse statistique des NPP

10 REM **********************************************************************************
20 REM PROGRAMME GENERAL POUR LE CALCUL DU NPP ET SON INTERVALLE
30 REM DE CONFIANCE
40 REM **********************************************************************************
50 REM
60 DIM A(10,6),X2(3,9)
70 REM SET PROGRAM LIMITS
80 D9=10
90 U9=50

R
100 L9=0
110 A1=.0005

O
120 E1=85

N
130 REM SET CHI-SQUARED SIGNIFICANCE LEVELS
140 GOSUB 1000

IA
150 REM READ IN RESULTS OF A DILUTION SERIES
160 GOSUB 2000
e
170 REM CALC AND PRINT THE MPN
v
180 GOSUB 3000
si

190 REM CALC AND PRINT S.E. OF LOG10(MPN)


200 GOSUB 4000
u

210 REM CALC AND PRINT 95 PERCENT C.I. FOR MPN


cl

220 GOSUB 5000


ex

230 REM CALC AND PRINT DEVIANCE


240 GOSUB 6000
250 STOP

1000 REM SET CHI-SQUARED SIGNIFICANCE LEVELS


1010 FOR I=1 TO 3
rié

1020 FOR J=1 TO 9


1030 READ X2(I,J)
op

1040 NEXT J
1050 NEXT I
Pr

1060 REM 5 PERCENT LEVELS DF=1...9


1070 DATA 3.84, 5.99, 7.81, 9.49, 11.07
1080 DATA 12.59, 14.07, 15.51, 16.92
1090 REM 1 PERCENT LEVELS
1100 DATA 6.63, 9.21, 11.34, 13.28, 15.09
1110 DATA 16.81, 18.48, 20.09, 21.67
1120 REM.1 PERCENT LEVELS
1130 DATA 10.83, 13.81, 16.27, 18.47, 20.52
1140 DATA 22.46, 24.32, 26.12, 27.88
1150 RETURN
2000 REM READ IN RESULTS OF A DILUTION SERIES
2010 PRINT "MPN GENERAL PURPOSE PROGRAM"
2020 PRINT "**************************************"
2030 PRINT " "
2040 PRINT "M.A. HURLEY AND M.E. ROSCOE"
2050 PRINT " "
2060 PRINT "NUMBER OF DILUTION LEVELS......K=";
2070 INPUT N

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2080 IF N<1 THEN GOTO 2060


2090 IF N<=D9 THEN GOTO 2120
2100 PRINT "ERROR *** LEVELS EXCEED MAXIMUM"
2110 STOP
2120 S1=0
2130 FOR I=1 TO N
2140 PRINT " "
2150 PRINT "LEVEL NUMBER......................................I=";I
2160 PRINT "DILUTION FACTOR.................................D=";
2170 INPUT A(I,2)
2180 PRINT "SUBSAMPLE VOLUME...........................V=";
2190 INPUT A(I,1)
2200 PRINT "NUMBER OF SUBSAMPLES...................N=";
2210 INPUT A(I,3)
2220 PRINT "NUMBER OF POSITIVE SUBSAMPLES..P=";
2230 INPUT A(I,4)
2240 PRINT "IS THE DATA CORRECT FOR LEVEL ";I;"(Y OR N) ";
2250 INPUT R$

R
2260 IF R$="Y" THEN 2280
2270 GOTO 2140

O
2280 A(I,5)=A(I,1)*A(I,2)

N
2290 A(I,6)=A(I,5)*A(I,4)
2300 S1=S1+A(I,5)*A(I,3)

IA
2310 NEXT I
2320 RETURN
e
3000 REM CALCULATES AND PRINTS MPN
v
3010 B1=0
si

3020 S3=0
3030 FOR J=1 TO N
u

3040 E2=A(J,5)*U9
cl

3050 IF E2<E1 GOTO 3080


ex

3060 E2=0
3070 GOTO 3090
3080 E2=EXP(-E2)

3090 S3=S3+A(J,6)/(1-E2)
3100 NEXT J
rié

3110 IF S3-S1>=0 THEN 3130


3120 GOTO 3200
op

3130 FOR I=1 TO N


3140 A(I,5)=A(I,5)*2
Pr

3150 A(I,6)=A(I,6)*2
3160 NEXT I
3170 S1=S1*2
3180 B1=B1+1
3190 GOTO 3020
3200 X3=L9
3210 X4=U9
3220 X=(X3+X4)/2
3230 S=0
3240 FOR I=1 TO N
3250 E2=A(I,5)*X
3260 IF E2<E1 GOTO 3290
3270 E2=0
3280 GOTO 3300
3290 E2=EXP(-E2)
3300 S=S+A(I,6)/(1-E2)
3310 NEXT I
3320 IF ABS(S-S1)<A1 THEN 3380

9
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3330 IF S-S1>0 THEN 3360


3340 X4=X
3350 GOTO 3220
3360 X3=X
3370 GOTO 3220
3380 X5=X*(2^B1)
3390 PRINT " "
3400 PRINT "MPN=";X5
3410 PRINT "FOR A SAMPLE WITH DILUTION FACTOR 1"
3420 PRINT " AND VOLUME 1"
3430 RETURN
4000 REM CALCS AND PRINTS S.E. OF LOG10 (MPN)
4010 S2=0
4020 FOR I=1 TO N
4030 X3=A(I,5)
4040 E2=X3*X
4050 IF E2<E1 GOTO 4080
4060 X4=0

R
4070 GOTO 4090
4080 X4=EXP(-E2)

O
4090 S3=X3*X3*A(I,3)*X4

N
4100 S3=S3/(1-X4)
4110 S2=S2+S3

IA
4120 NEXT I
4130 V=1/(X*X*S2)
e
4140 S1=SQR(V)/LOG(10)
v
4150 PRINT " "
si

4160 PRINT "S.E. OF LOG10 (MPN)=";S1


4170 RETURN
u

5000 REM CALCS 95 PERCENT C.I. FOR MPN


cl

5010 X3=LOG(X)+B1*LOG(2)
ex

5020 S2=SQR(V)
5030 U=EXP(X3+1.96*S2)
5040 L=EXP(X3-1.96*S2)

5050 PRINT " "


5060 PRINT "95 PERCENT C.I. =";L;"TO";U
rié

5070 RETURN
6000 REM CALCS. AND PRINTS DEVIANCE
op

6010 S3=0
6020 FOR I=1 TO N
Pr

6030 S4=0
6040 IF A(I,4)<=0 GOTO 6110
6050 E2=A(I,5)*X
6060 IF E2<E1 GOTO 6090
6070 E2=0
6080 GOTO 6100
6090 E2=EXP(-E2)
6100 S4=A(I,4)*LOG(A(I,4)/(A(I,3)*(1-E2)))
6110 S3=S3+S4
6120 S4=0
6130 IF A(I,4)>=A(I,3) GOTO 6160
6140 S4=A(I,3)-A(I,4)
6150 S4=S4*(LOG(S4/A(I,3))+A(I,5)*X)
6160 S3=S3+S4
6170 NEXT I
6180 D=2*S3
6190 REM CHI-SQUARED TEST OF DEVIANCE
6200 V=N-1

10
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6210 PRINT " "


6220 PRINT "DEFIANCE =";D;"ON";V;" D.F."
6230 PRINT " "
6240 PRINT "CHI-SQUARED SIGNIFICANCE LEVELS FOR";V;" D.F."
6250 PRINT " 5 PERCENT ";X2(1,V)
6260 PRINT " 1 PERCENT ";X2(2,V)
6270 PRINT " .1 PERCENT ";X2(3,V)
6280 RETURN
7000 END

R
O
N
IA
v e
si
u
cl
ex

rié
op
Pr

11
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Annexe B
(informative)

Exemple de logiciel en BASIC pour le calcul des NPP

10 DIM T (20)
20 DIM M (20)
30 DIM P (20)
40 L = 0
45 CLS: L = L + 1
50 PRINT "CALCUL DU ";L;"EME NPP"
60 PRINT "........................................."
70 A = 1
80 PRINT

R
90 INPUT "NB DE DILUTIONS";DI: PRINT: PRINT
110 PRINT

O
120 P = 0: S =: U = 0

N
130 FOR I = 1 TO DI
140 PRINT ‘’DILUTION’’; I

IA
150 INPUT ‘’NB DE PUITS POSITIFS..’’; P(I)
155 INPUT ‘’NB DE PUITS....................’’;T(I)
e
160 INPUT ‘’VOLUME D’EAU/PUITS (ML)...’’;M(I): PRINT
v
170 P = P(I) + P
si

180 S = ((T(I) - P(I))*M(I)) + S


190 U = (M(I) * TI)) + U
u

200 NEXT I
cl

280 K = 1
ex

290 NP = (P/U) * 2 ^ (K + K / 2 + K / 4 + K / 8 + K / 16 + K / 32 + K / 64 + K / 128 + K / 256 + K / 512)


300 PM = 0
310 FOR I = 1 TO DI

320 PM = PM + ((P(I) * M (I) * EXP ( - M(I) * NP)) / (1 - EXP (- M(I) * NP )))


330 NEXT I
rié

340 IF PM < S THEN 370


350 K = K+A
op

360 GOTO 290


370 DT = S - PM
Pr

380 IF ABS (DT) < =.000005 GOTO 702


390 K = K-A
400 A = A / 10
410 GOTO 290
702 FOR I = 1 TO DI:ES = ES + P(I):NEXT I
710 FOR I = 1 TO DI
720 K (I) = (T(I) * (M(I)^2))
730 NEXT I
740 FOR I = 1 TO DI
745 IF (NP * M(I) > 88 THEN E(I) = 1.65E38:GOTO 760
750 E(I) = (EXP (M(I) * NP) - 1)
760 NEXT I
770 LL = 0
780 FOR I = 1 TO DI
790 LL = LL + (K (I) / E (I))
800 NEXT I
810 CL = (LOG (NP) - (1.96 * (1 / (NP * SQR (LL)))))
817 CU = (LOG (NP) + (1.96 * (1 / (NP * SQR (LL)))))

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840 NP = INT (NP * 100 +.5) / 100


850 PRINT: PRINT " NPP = ";NP;" / ML"
860 PRINT: PRINT
870 PRINT "LIMITE INFERIEURE=";INT ( EXP (CL)* 100 +.5) / 100;" / ML SUPERIEURE=";INT (EXP (CU) * 100
+.5) / 100;" / ML"
880 PRINT: PRINT: INPUT "DESIREZ VOUS UN AUTRE NPP (O/N)?";RE$
890 IF RE$ = "N" THEN END
900 GOTO 45

Commentaire

Après affichage du numéro de calcul (L, ligne 50):

— entrer le nombre de dilutions (ligne 90).

Pour chaque dilution:

— afficher le rang de la dilution (ligne 140);

R
— entrer le nombre de puits ou de tubes positifs (ligne 150);

O
N
— entrer le nombre de puits ensemencés avec cette dilution (ligne 155);

IA
— entrer le volume d’eau ensemencé par puits, en millilitres (ligne 160).

Calcul des NPP selon De Man [2] (lignes 280-410).


v e
Calcul des limites haute et basse de l’intervalle de confiance selon De Man [2] (lignes 770-817).
si
u

Affichage:
cl

— du NPP (par millilitre) (ligne 850);


ex

— de la limite inférieure (par millilitre) (ligne 870);


— de la limite supérieure (par millilitre) (ligne 870).


rié

Question: «Un autre calcul?»


op

Si non: FIN
Pr

13
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Annexe C
(informative)

Sel de mer synthétique

C.1 Composition en ions majoritaires d’un sel de mer synthétique

Concentration
ionique
Ion majoritaire % de la masse totale
pour une salinité
de 34 g/kg
(mg/l)

R
Chlorure (Cl–) 47,470 18 740

O
(Na+)

N
Sodium 26,280 10 454

IA
Sulfate (SO4–2) 6,602 2 631

Magnésium (Mg+2) 3,230 1 256


ve
Calcium (Ca+2) 1,013 400
si

Potassium (K+) 1,015 401


u

(HCO3–)
cl

Bicarbonate 0,491 194


ex

Borate (B) 0,015 6,0

Strontium (Sr+2) 0,001 7,5



rié

TOTAL DES SOLIDES 86,11 34 089,50

Eau (H2O) 13,88


op

TOTAL 99,99
Pr

C.2 Exemple pour une préparation avec des constituants définis

Trois solutions de base sont préparées comme suit:

a) Solution A

CaCl2,2H2O 83,6 g

KCl 43,5 g

SrCl2,6H2O 0,07 g

Eau distillée, pour obtenir un volume de 1 000 ml

14
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b) Solution B

NaHCO3 15,15 g

Na2B4O7 3,0 g

Eau distillée, pour obtenir un volume de 1 000 ml

c) Solution C

MgSO4,7H2O 190,0 g

MgCl2,6H2O 147,0 g

Eau distillée, pour obtenir un volume de 1 000 ml

Le diluant est préparé en ajoutant à 960 ml d’eau distillée 10 ml de solution A, 10 ml de solution B, 20 ml de solution
C, et puis 14,9 g de chlorure de sodium, à mélanger jusqu’à complète dissolution, et en ajustant le pH à 7,5 ± 0,2.

R
Enfin il est réparti en récipients de volume désiré et stérilisé à l’autoclave à (121 ± 3) °C pendant 15 minutes.

O
N
IA
v e
si
u
cl
ex

rié
op
Pr

15
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Annexe D
(informative)

Caractéristiques de performance de la méthode

Les performances de répétabilité (r) et reproductibilité (R) calculées conformément à l’ISO 5725-2 au cours d’essais
interlaboratoires ont montré:

a) Sur des eaux de baignade


(échantillons dopés, avec 100 laboratoires français, en trois occasions en 1995 et 1996) (1 eau de mer et deux
eaux douces, sans différence significative):

R
i) au niveau 100 E. coli / 100 ml: r ÷ 3,6

O
R ÷ 4,3

N
ii) au niveau 2 000 E. coli / 100 ml: r ÷ 1,7

IA
R ÷ 2,3
e
En outre, à titre indicatif, lors d’essais (en 1993 et 1994) limités à neuf laboratoires et quatre échantillons
v
contaminés naturellement:
u si

b) Sur des eaux de rivière


÷ 1,9
cl

contenant entre 1,2 ¥ 104 et 5,7 ¥ 104 E. coli / 100 ml: r


R ÷ 2,0
ex

c) Sur des eaux usées


contenant entre 1,2 ¥ 105 et 1,9 ¥ 107 E. coli / 100 ml: r ÷ 2,1

R ÷ 2,8
rié
op
Pr

16
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Annexe E
(normative)

Critères de qualité pour la fabrication du milieu en microplaques

E.1 Généralités

Pour chacun des critères qui suivent, un contrôle de qualité doit être effectué sur chaque lot de microplaques. Les
microplaques à tester sont prises de manière aléatoire ou systématique pour constituer un échantillon conformé-
ment à l’ISO 3951, en respectant le niveau général de prélèvement n° II du contrôle normal.

Le seuil de positivité d'une microplaque est défini comme étant le niveau de fluorescence conduisant à une lecture

R
positive sans ambiguïté, à l'œil nu, sous lampe de Wood (366 nm). Il doit être mesuré dans les conditions indiquées

O
à l’annexe F.

N
Les critères de qualité à respecter sont donnés en E.2 à E.4. Le lot est rejeté si l'un des critères n'est pas respecté.

IA
La souche à tester est E. coli WR1 (peut être obtenu auprès du RIVM, Bilthoven, Pays-Bas) et l'incubation est de
48 h à 44 °C.
v e
si

E.2 Bruit de fond


u

Vérifier l’absence de puits positif dans chaque microplaque de l'échantillon, après ensemencement avec du diluant
cl

spécial stérile et incubation pendant 48 h à (44 ± 0,5) °C. Le niveau de bruit de fond moyen de l'échantillon doit être
ex

inférieur à 25 % du seuil de positivité défini ci-dessus et le coefficient de variation doit être inférieur à 10 %.

E.3 Niveau moyen de fluorescence


rié

Le niveau moyen de fluorescence est la moyenne géométrique du signal obtenu à partir des 96 puits d’une
microplaque ensemencée uniformément avec 200 µl par puits d’une suspension de E. coli WR1 contenant
op

500 micro-organismes par millilitre de diluant spécial (7.2.1) et incubée pendant 48 h à (44 ± 0,5) °C. Le signal
moyen ainsi obtenu doit être au moins le double du seuil de positivité, et le coefficient de variation doit être inférieur
Pr

à 10 %.

E.4 Fertilité

La fertilité est le rapport entre le nombre de micro-organismes observés avec le lot de microplaques testé, au
nombre de micro-organismes observés avec un matériau de référence stable (valeur cible). Le niveau de
concentration à mettre en œuvre doit se situer autour du maximum de précision de la méthode, soit environ
1 micro-organisme par puits (500/100 ml). La stabilité et l'homogénéité (valeur cible et intervalles de confiance) du
matériau de référence sont mesurées avec un (des) lot(s) de microplaques déjà accepté(s). Le seuil d'acceptation
du lot de microplaques en essai est de 0,66 à 1,5 fois la valeur cible. Le coefficient de variation doit être inférieur à
10 %.

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Annexe F
(normative)

Procédure de préparation de microplaques d’étalonnage

F.1 Matériel et réactifs

Matériel courant de laboratoire (balance de précision, pH-mètre, verrerie) ainsi que:

F.1.1 4-Méthylumbelliférone.

R
F.1.2 Alcool éthylique absolu.

O
F.1.3 Solution de chlorure de sodium à 0,8 %.

N
IA
F.1.4 Glycine.

F.1.5 Hydroxyde de sodium.


v e
F.1.6 Microplaque à 96 puits.
u si

F.2 Préparation de la solution mère


cl
ex

Préparer une solution mère de 4-méthylumbelliférone (F.1.1) dans l'alcool éthylique (F.1.2) en mélangeant

4-Méthylumbelliférone 0,044 g

Alcool éthylique 10 ml
rié
op

F.3 Préparation de la solution tampon


Pr

F.3.1 Préparer les solutions suivantes:

a) Solution de glycine

Dissoudre 7,507 g de glycine et 5,84 g de chlorure de sodium dans 1 000 ml d'eau distillée.

b) Solution d'hydroxyde de sodium

Dissoudre 4 g d'hydroxyde de sodium dans 1 000 ml d'eau distillée.

F.3.2 Dans un bécher muni d’un agitateur, introduire 56,5 ml de la solution de glycine [F.3.1a)] et 43,5 ml de la
solution d'hydroxyde de sodium [F.3.1b)]. Vérifier au pH-mètre que la valeur du pH est bien de 10,3.

18
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F.4 Préparation de la plaque d’étalonnage

Toutes les opérations suivantes ont lieu à température ambiante.

Toutes les dilutions se font dans une solution de chlorure de sodium à 0,8 % (F.1.3).

Préparer une solution intermédiaire au 1/100 de la solution mère (F.2). À partir de la solution ainsi obtenue,
préparer quotidiennement les solutions suivantes:

ST 1 = 100 µl de la solution intermédiaire + 0,9 ml de NaCl à 0,8 %


ST 2 = 0,5 ml de ST 1 + 0,5 ml de NaCl à 0,8 %

ST 3 = 0,5 ml de ST 2 + 0,5 ml de NaCl à 0,8 %


ST 4 = 0,5 ml de ST 3 + 0,5 ml de NaCl à 0,8 %

ST 5 = 0,5 ml de ST 4 + 0,5 ml de NaCl à 0,8 %

R
Répartir les différentes solutions dans les colonnes impaires de la microplaque (F.1.6) selon le schéma montré à la

O
Figure F.1 (les colonnes paires ne sont pas utilisées).

N
IA
v e
u si
cl
ex

rié
op
Pr

Figure F.1

19
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Ajouter dans chaque puits 100 µl de la solution tampon pH 10,3 (F.3.2). On obtient ainsi une gamme étalon linéaire
allant de 0 pg à environ 1 500 pg de 4-méthylumbelliférone par microlitre.

NOTE Expérimentalement il a été observé que le seuil de positivité avec de la 4-méthylumbelliférone SIGMA (lot n° M-1381)
et des microplaques transparentes à fond plat NUNC (réf. 1352) est de 367 pg/µl en remplissant la microplaque comme décrit
dans la présente annexe avec la solution ST 3.

R
O
N
IA
v e
u si
cl
ex

rié
op
Pr

20
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CTN 43
INTERNATIONAL STANDARD ISO 9308-3:1998
TECHNICAL CORRIGENDUM 1

Published 2000-05-01

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION · МЕЖДУНАРОДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ · ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION

Water quality — Detection and enumeration of Escherichia coli and


coliform bacteria in surface and waste water —
Part 3:

R
Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid

O
medium

N
IA
TECHNICAL CORRIGENDUM 1 e
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes dans les eaux
v
de surface et résiduaires —
si

Partie 3: Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) pour ensemencement en milieu liquide
u
cl

RECTIFICATIF TECHNIQUE 1
ex

Technical Corrigendum 1 to International Standard ISO 9308-3:1998 was prepared by Technical Committee
rié

ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4, Microbiological methods.


op
Pr

Cover, page iii and page 1:

In the second element of the title of this part of ISO 9308, delete the words “in surface and waste water” and change
the third element to give the following new title:

“ Water quality — Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria —
Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) for the detection and enumeration
of E. coli in surface and waste water ”

ICS 07.100.20 Ref. No. ISO 9308-3:1998/Cor.1:2000(E)

© ISO 2000 – All rights reserved

Printed in Switzerland

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