p3320 Analyse Des Glucides Et Des Glycoprotéines

Analyse des glucides
et des glycoprotéines
par Jean MONTREUIL

Professeur émérite ; docteur ès sciences
et André VERBERT
Professeur ; docteur ès sciences
Laboratoire de chimie biologique
Unité mixte de recherche no 111 CNRS, Université des sciences et technologies de Lille
1. Monosaccharides ...................................................................................... PE 3320 - 2

1.1 Formules, isoméries et structures des monosaccharides......................... — 2
1.2 Propriétés physico-chimiques des monosaccharides ............................... — 4
2. Glycosides................................................................................................... — 4
2.1 Holosides....................................................................................................... — 4
2.2 Hétérosides. L’exemple des glycoconjugués ............................................. — 5
3. Procédés d’isolement des glucides libres et conjugués................ — 8
3.1 Isolement des glycoprotéines et des glycopeptides ................................. — 8
3.2 Procédés de libération des glycannes ........................................................ — 11
3.3 Procédés d’isolement des oligosaccharides libres ou libérés .................. — 15
4. Méthodes de dosage des glucides ....................................................... — 17
4.1 Détermination de la composition centésimale en monosaccharides
par méthodes colorimétriques .................................................................... — 17
4.2 Détermination de la composition molaire en monosaccharides ............. — 21
5. Détermination de la structure primaire ............................................. — 22
5.1 Procédés chimiques ..................................................................................... — 23
5.2 Procédés physiques ..................................................................................... — 24
5.3 Procédés enzymatiques ............................................................................... — 27
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. PE 3320
L es glucides, encore appelés sucres ou hydrates de carbone, représentent,

avec les protéines, les lipides et les acides nucléiques, l’une des quatre gran-
des classes de constituants de la matière vivante. De tout temps, ils ont fait
l’objet de recherches actives, principalement en raison de leur importance éco-
nomique et, à cet égard, l’industrie des hauts glycopolymères comme l’amidon,
la cellulose, les gommes et les pectines s’est développée dès le XIXe siècle.
Mais, à cet intérêt économique, s’est rapidement ajouté un intérêt biologique
dû, par exemple, au fait que le glucose et le glycogène sont, pour l’Homme,
source d’énergie pour le premier et réserve d’énergie pour le second. Très tôt,
une glycopathologie est née liée aux troubles de la régulation du métabolisme
glucidique, comme dans le cas du diabète. Enfin, et plus récemment, la décou-
verte que certains glucides complexes - ceux qui, en particulier, entrent dans la
constitution des membranes cellulaires - sont porteurs de messages et jouent
un rôle essentiel dans la vie sociale des cellules, a introduit les glucides dans le
domaine de la biologie moléculaire. Ainsi est né au fil des ans le terme de glyco-
technologie qui concerne l’ensemble des techniques susceptibles de produire
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des glucides d’intérêt économique dans les domaines de la santé et de l’agroali-
mentaire, en particulier.
Les glucides sont classés en glucides simples : les monosaccharides, et en pro-
duits de condensation de ces derniers : les glycosides.
Quelques définitions
MONOSACCHARIDES OU OSES Sucres simples possédant un squelette de 3 à 9 atomes de
carbone et comportant à la fois plusieurs fonctions alcooli-
ques et une fonction carbonylée réductrice, soit aldéhydi-
que (aldoses), soit cétonique (cétoses)
GLYCOSIDES Substances dont l’hydrolyse acide libère un ou plusieurs
oses
OLIGOSACCHARIDES Glucides constitués d’un nombre restreint de monosaccha-
rides (2 à 20 environ)
POLYSACCHARIDES Hauts polymères glucidiques de masse moléculaire variant
de 5 000 à plusieurs millions de daltons (1 dalton =
1 gramme par mole de substance)
HOMOOLIGO- ET Oligo- et polysaccharides constitués d’un seul type de
POLYSACCHARIDES monosaccharides
HÉTÉROOLIGO- ET HÉTÉRO- Oligo- et polysaccharides constitués de plusieurs mono-
POLYSACCHARIDES saccharides différents
HOLOSIDES Glycosides dont l’hydrolyse acide ne fournit que des oses
HÉTÉROSIDES Glycosides dont l’hydrolyse acide fournit des oses et des
substances non-glucidiques appelées aglycones
GLYCOCONJUGUÉS Hétérosides qui résultent de l’association de glucides
appelés glycannes avec un lipide (glycolipides) ou une pro-
téine (glycoprotéines)
1. Monosaccharides l’isomérie D-L qui s’exprime en orientant conventionnellement

l’avant-dernier hydroxyle vers la droite pour la série D, vers la gau-
che pour la série L (exemple du L-galactose dans la figure 1 a).
Les monosaccharides (ou oses) sont des molécules multifonction- La grande majorité des monosaccharides naturels appartiennent
nelles qui comportent plusieurs fonctions alcooliques et une fonc- à la série D, à l’exception de l’arabinose, du fucose et du rhamnose
tion carbonyle réductrice, soit aldéhydique dans le cas des aldoses, qui sont de la série L. Dans le cas particulier des cétoses (exemple
soit cétonique dans celui des cétoses. Leur classification repose, en du fructose) et des 6-désoxyhexoses (exemple du L-fucose), oses
outre, sur le nombre d’atomes de carbone qui les constitue et va des dont la fonction alcoolique primaire est remplacée par un groupe-
trioses aux nonoses. ment méthyle, les formules linéaires s’écrivent conformément à la
figure 1 b.
Enfin, la figure 1 c précise les formules de monosaccharides azo-
tés (les hexosamines), acides (les acides uroniques) et multifonc-
1.1 Formules, isoméries et structures tionnels (les acides sialiques).
des monosaccharides
1.1.2 Formules cycliques des oses
1.1.1 Formule linéaire des monosaccharides
Sur la base de leurs propriétés physico-chimiques, la démonstra-
La présence de carbones asymétriques entraîne de nombreuses tion a été apportée que les monosaccharides en solution dans l’eau
isoméries qui seront illustrées à propos des hexoses. La formule existent sous trois formes en équilibre : aldéhyde, hydrate d’aldé-
brute, C6H12O6, de ces sucres conduit à 8 aldoses isomères qui sont hyde et cyclique semi-acétalique, dans le cas des aldoses.
dits isomères de position. Ils résultent des orientations respectives La formulation de ces trois structures est donnée dans la figure 2.
des 4 fonctions alcooliques secondaires qu’ils possèdent. L’écriture La forme cyclique résulte d’une réaction de déshydratation entre
linéaire de 3 de ces 8 isomères est donnée dans la figure 1 (D-glu- l’un des hydroxyles de l’hydrate d’aldéhyde et l’hydroxyle des
cose, D-mannose, D-galactose). Toutefois, les mêmes formules carbones 5 (forme pyrannique) ou 4 (forme furannique) conduisant
auraient pu être écrites comme leur image dans un miroir : ainsi naît à deux isomères de position du second hydroxyle semi-aldéhydi-
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que, dits anomères a et b. En solution, la forme pyrannique du glu- Il convient enfin de signaler que le cycle pyrannique n’est pas plan
cose est thermodynamiquement la plus stable. et adopte une configuration bateau ou chaise, cette dernière étant
Sous leur forme conjuguée de glycosides, naturelle ou synthéti- plus stable.
que, les oses réagissent toujours sous leur formule cyclique, pyran-
nosique pour les uns, furannosique pour les autres (le fructose, par Abréviations
exemple).
Ara L-arabinose
AS acide sialique
Asn L-asparagine
Cer céramide
Con A concanavaline A
Da Dalton (gramme par mole)
DBA lectine de Dolichos biflorus
FAB-MS Fast Atom Bombardment-Mass
Spectrometry
Fuc L-fucose
Gal D-galactose
GalNAc N-acétyl-D-galactosamine
Glc D-glucose
GLC Gas Liquid Chromatography
GlcNAc N-acétyl-D-glucosamine
GlcA/GlcUA acide D-glucuronique
HLy hydroxylysine
HPAE High pH Anion Exchange Chromatography
HPCE High Performance Capillary Electrophoresis
HPLC High Pressure Liquid Chromatography
HPr hydroxyproline
LCA lectine de Lens culinaris
MAA lectine de Maackia amurensis
Man D-mannose
MS Mass Spectrometry
NeuAc acide N-acétylneuraminique
PAD détection ampérométrique pulsée
RCA lectine de Ricinus communis
RMN résonance magnétique nucléaire
Ser L-sérine
SM spectrométrie de masse
SNA lectine de Sambucus nigra
SO 3Ð groupement sulfuryle
Thr L-thréonine
TLC Thin Layer Chromatography
TMS groupement triméthylsilyle
UEA-I lectine d’Ulex europeus
Xyl D-xylose
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
1.2 Propriétés physico-chimiques 2. Glycosides

des monosaccharides
Les glycosides résultent de la création de liaisons glycosidiques
Les principales propriétés physico-chimiques des monosacchari- qui proviennent de la condensation de la fonction a - ou b - semia-
des peuvent se résumer de la manière suivante : cétalique de monosaccharides conduisant ainsi aux a - ou aux b -
1 le fait de posséder plusieurs carbones asymétriques leur con- glycosides. Selon que la fonction alcoolique est portée par un autre
fère un pouvoir rotatoire dextrogyre pour les uns, lévogyre pour les monosaccharide ou par une substance de nature non-glucidique
autres qui s’exprime par les signes + ou - : D(+)glucose (dextrose) appelée aglycone, on distingue, respectivement, les holosides et les
ou D(-)fructose (lévulose), par exemple ; hétérosides.
2 par leur fonction carbonyle, ils sont réducteurs ;
3 par leurs fonctions alcooliques, ils sont estérifiables et
alkylables ; 2.1 Holosides
4 par leur fonction semi-acétalique, ils réagissent avec les
alcools pour former les acétals que sont les glycosides.
Sur la base des formules cycliques données dans la figure 2, on
voit que l’union de deux molécules de D-glucose conduit à
9 structures disaccharidiques, selon que la fonction semiacétalique
réagit sous sa configuration anomérique a ou b avec les hydroxyles
CHO CHO CHO CHO
du second monosaccharide, y compris l’hydroxyle semi-aldéhydi-
H C OH HO C H H C OH HO C H que. On obtient ainsi 8 disaccharides réducteurs : a-1 ® 2, 3, 4 et 6 ;
b-1 ® 2, 3, 4 et 6, et trois disaccharides non-réducteurs : a-1 « a-1,
HO C H HO C H HO C H H C OH a-1 « b-1 et b-1 « b-1. Cet exemple permet de souligner dès à pré-
sent l’extraordinaire complexité de la chimie des sucres liée à leur
H C OH H C OH HO C H H C OH caractère de composés multifonctionnels car, si avec 2 acides ami-
H C OH H C OH H C OH HO C H nés différents on peut construire 2 dipeptides seulement, avec
2 monosaccharides différents on donnera naissance à
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH 120 disaccharides !
D - glucose D - mannose D - galactose L - galactose Suivant leur masse moléculaire, on distingue les oligosaccharides
(jusqu’à 5 000 daltons environ) et les polysaccharides (jusqu’à plu-
a sieurs millions de daltons).
CH2OH CHO CHO

2.1.1 Oligosaccharides
C O HO C H H C NH COCH3
HO C H H C OH HO C OH Parmi les oligosaccharides réducteurs, nous citerons le maltose

qui est un produit intermédiaire de l’hydrolyse enzymatique de poly-
H C OH H C OH H C OH saccharides comme l’amidon et le glycogène. Il résulte de l’union de
2 molécules de D-glucose par une liaison a-1,4-glucosidique, et
H C OH HO C H H C OH répond à la formule Glc (a 1-4) Glc. Il est hydrolysé en glucose par
les maltases.
CH2OH CH3 CH2OH
Le lactose, présent dans le lait de tous les mammifères, est un b-
D - fructose L - fucose N - acétyl-D-glucosamine galactosido-1,4-glucose et s’écrit Gal (b 1-4) Glc. Il est hydrolysé par
b la lactase intestinale.
COOH
Le représentant le plus connu des disaccharides non-réducteurs
C O est le saccharose dont l’importance industrielle et économique n’est
plus à démontrer et dont la structure est celle d’un a-glucosido-b-
CH2 fructoside, le fructose étant sous sa forme furannique (précisée par
CHO
la lettre f), et s’écrit Glc (a-1, b-2) fFru.
CHOH
H C OH CH3CO HN C H
2.1.2 Polysaccharides
HO C H HO C H
H C OH H C OH Les polysaccharides sont formés par condensation d’un grand

nombre de molécules d’oses, soit toutes identiques dans le cas des
H C OH H C OH homopolysaccharides comme l’amidon, le glycogène, la cellulose et
la chitine, soit de nature différente dans le cas des hétéropolysac-
COOH CH2OH charides comme les gommes, les hémicelluloses et les mucilages.
acide D-glucuronique acide N-acétyl-D-neuraminique
■ L’amidon est l’une des substances de réserve énergétique chez
c les végétaux où on le trouve sous forme de grains d’amidon. Il est
constitué de deux types très différents de hauts polymères : l’amy-
Figure 1 – Formules linéaires des oses lose, polysaccharide de structure linéaire formé de résidus de D-glu-
cose conjugués par des liaisons a-1,4, d’une masse moléculaire
variant entre 150 000 et 600 000 Da, et l’iso-amylose ou amylopec-
tine dont la masse moléculaire atteint plusieurs millions et qui pos-
sède une structure ramifiée résultant de la conjugaison sur des
chaînes d’amylose, par des liaisons a-1,6-glucosidiques, de chaînes
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H OH
C CH2OH
H
1 H O
H C OH H
2 OH H
HO C H O OH
CHO HO OH OH
3
H C OH H OH
H C OH H C
4
H C
HO C H H C OH 5
CH2OH
H C OH HO C H 6
alpha-glucose
H C OH H C OH
CH2OH H C OH
HO H
forme aldéhyde CH2OH C
forme hydrate 1 CH2OH
H C OH OH
d'aldéhyde O
2 H
HO C H O H
3 OH H
H C OH OH
H
4
H C H OH
5
CH2OH
6
béta-glucose
Formules cycliques Formules cycliques Figure 2 – Passage du D-glucose de la forme

dites de Tollens dites de Haworth
linéaire à la forme cyclique pyrannosique
latérales comportant 20 à 25 résidus de glucose associés par des plupart d’entre eux, indéterminée : les gommes de structure rami-
liaisons a-1,4-glucosidiques (figure 3). fiée contenant D-galactose, L-arabinose, L-rhamnose et acide D-
glucuronique ; les hémicelluloses composées de D-glucose, D-
■ Le glycogène, forme hépatique et musculaire de stockage du glu- xylose, L-arabinose et acide D-glucuronique ; les mucilages renfer-
cose chez l’animal, possède une structure analogue à celle de l’amy- mant du D-mannose et du D-galactose estérifiés par l’acide sulfuri-
lopectine mais en diffère par un nombre plus élevé de points de que.
ramification en a-1,6 et par des chaînes latérales plus courtes (10 à
15 résidus de glucose). Sa masse moléculaire atteint plusieurs dizai-
nes de millions de daltons.
■ La cellulose est une substance de soutien présente dans les
2.2 Hétérosides. L’exemple
parois des cellules végétales. Elle est constituée de longues chaînes des glycoconjugués
formées de résidus de glucose conjugués en b-1,4 (figure 4) solide-
ment associées les unes aux autres par des liaisons ponts hydro-
gène, formant ainsi des structures fibreuses et compactes qui sont à La classe des hétérosides qui résultent de l’association par une
la base de l’utilisation de la cellulose dans les industries papetières liaison glycosidique d’un glucide avec une substance de nature non-
et textiles. glucidique appelée aglycone comporte, parmi les plus importantes,
deux catégories de composés.
■ Dans le groupe des hétéropolysaccharides, on trouve des compo-
sés d’un grand intérêt industriel mais dont la structure reste, pour la
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH

O O O O O
OH OH OH OH OH
...O O O ...O O
OH OH OH OH OH
O O
CH2OH CH2OH CH2 CH2OH CH2OH CH2OH CH2 CH2OH

O O O O O O O O
OH OH OH OH OH OH OH OH
...O O O O O ... O O O O ...
OH OH OH OH OH OH OH OH
Nota : la structure résultant de l'élimination des ramifications en a-1,6 est celle de l'amylose
Figure 3 – Structure de l’amylopectine
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les cellules cancéreuses avec deux conséquences : la diffusion

CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH métastatique et le déclenchement de la réaction de défense immuni-
O O O O taire de l’organisme.
O O O O O Enfin, depuis quelques années, les glycoprotéines représentent
OH OH OH OH
un fabuleux enjeu économique avec la mise sur le marché de glyco-
OH OH OH OH protéines recombinantes produites par génie génétique et utilisées
dans le traitement de nombreuses maladies.
CH2OH CH2OH CH2OH
O O O
O O O O 2.2.2 Glycoprotéines
OH OH OH
OH OH OH
2.2.2.1 Types de liaison glycanne-protéine
Suivant que la liaison glycanne-protéine est de type O- ou N-gly-
Figure 4 – Structure de la molécule élémentaire de cellulose. cosidique, on distingue deux familles de glycoprotéines : les O- et
L’association par des liaisons ponts hydrogène d’un nombre élevé les N-glycosylprotéines. Les liaisons O-glycosidiques les plus cou-
de cette molécule conduit à la fibre de cellulose elle-même rantes sont les suivantes : GalNAc (a 1-0) Ser/Thr, Xyl (b 1-0) Ser,
GlcNAc (b 1-0) Ser, L-Ara (b 1-0) HPr, Gal (b 1-0) HLy. Quant aux N-
glycosylprotéines, la liaison est réalisée par le chaînon GlcNAc (b 1-
■ Les premiers sont des glycosides physiologiquement actifs utili- N) Asn et elle est de type glycosylamine CCOCNHC . Il convient
sés en thérapeutique. Ce sont, par exemple, les glycosides cardioto- de signaler que la même protéine peut être à la fois O- et N-glycosy-
niques, parmi lesquels la digitaline qui résulte de l’association de lée, comme dans le cas de la glycophorine (figure 5).
glucides particuliers comme le digitoxose avec un aglycone stéroli-
que comme la digitoxygénine. Ce sont aussi des antimitotiques uti- 2.2.2.2 Notion de « noyau »
lisés en chimiothérapie anticancéreuse, comme des nucléosides.
Tous les glycannes dérivent de la substitution de structures oligo-
■ Les seconds, auxquels nous nous attacherons plus particulière- saccharidiques communes aux glycannes d’une famille donnée. Ces
ment, sont les glycoconjugués qui résultent de l’association, par une structures invariantes constituent leur partie la plus interne associée
liaison glycosidique, d’un glucide (mono-, oligo-ou polysaccharide) à la chaîne peptidique et appelée « noyau » (inner-core pour les
qui prend le nom de glycanne, avec des lipides pour donner des gly- anglophones) (figure 6). À ces structures se conjuguent les séquen-
colipides ou avec des protéines pour conduire aux glycoprotéines. ces oligosaccharidiques qui portent la spécificité biologique des gly-
La liste des monosaccharides constituant les glycannes est donnée cannes et appelées antennes.
dans le tableau 1.
2.2.1 Importance biologique des glycoconjugués
Ils ont été longtemps négligés ou ignorés, en raison même de la

complexité de leur structure qui allie les problèmes que posent les
lipides et plus encore les protéines à ceux qui relèvent de la chimie
des glucides, la plus difficile qui soit en raison de la nature polyfonc-
tionnelle de ces derniers. Toutefois, à partir des années 70, l’intérêt
des biochimistes et des cliniciens s’est éveillé pour cette classe de
constituants qui sont universellement répandus, des virus aux ani-
maux supérieurs, en passant par les bactéries et les végétaux et qui
sont des constituants des membranes des cellules. En outre, une
série d’observations ont montré que les glycannes sont doués d’une
certaine intelligence biologique et qu’ils sont, en particulier, des
signaux de reconnaissance pour des protéines spécifiques appelées
lectines, celles-ci étant présentes dans les membranes de toutes les
cellules. On reconnaît actuellement aux glycannes les rôles
suivants :
1 Ils maintiennent les protéines dans une structure tridimension-
nelle biologiquement active et les protègent de la protéolyse.
2 Ils masquent les épitopes peptidiques et réduisent ainsi
l’immunogénicité des protéines.
3 Ils contrôlent la perméabilité des membranes cellulaires.
4 Ils sont des signaux de reconnaissance pour diverses molécu-
les et pour des micro-organismes, bactéries ou virus.
5 Ils contrôlent la durée de vie des glycoprotéines et des cellules
circulantes.
6 Ils sont des signaux de reconnaissance et d’association pour
des cellules et interviennent ainsi dans la vie sociale de ces derniè-
res.
7 Ils sont les supports d’activité de groupes tissulaires, de grou-
pes sanguins en particulier.
8 Ils sont des marqueurs de différenciation cellulaire et de cancé-
risation. Leur structure est, en effet, profondément modifiée dans
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Tableau 1 – Sigles désignant les monosaccharides les plus courants (1), (2)
Neutres Osamines Acides uroniques Acides sialiques
Ara : L-arabinose GalNAc : N-acétyl-D-galactosamine Idu : L-iduronate Neu : Neuraminate
Fru : D-fructose GlcNAc : N-acétyl-D-glucosamine GalA : D-galacturonate NeuAc : N-acétylneuraminate
Fuc : L-fructose ManNAc : N-acétyl-D-mannosamine GlcA : D-glucuronate NeuGc : N-glycolylneuraminate
Glc : D-glucose
Man : D-mannose
Rha : L-rhamnose
Xyl : D-xylose
(1) Nomenclature internationale
(2) Les formes furanniques et pyranniques des oses sont désignées par les lettres f et p (exemples : f Fru, pGlc).
2.2.2.3 Structure des O-glycannes

2 4 10 12 14 22 26 37 44 50
Les figures 7 et 8 donnent deux exemples de structures de gly-
1 cannes liés O-glycosidiquement, celles dites de type mucine et de
NH2 71 92 type protéoglycanne.
131
COOH
2.2.2.4 Structure des N-glycannes
Tous les N-glycannes dérivent de la substitution du noyau penta-
3 11 13 15 25 47
saccharidique C de la figure 6 pour donner naissance à trois types
Milieu extérieur Bicouche Cytoplasme de glycannes de N-glycosylprotéines :
lipidique
1 le type oligomannosidique dont un exemple est illustré par la
Figure 5 – Représentation schématique de la glycophorine, figure 9 ;
glycoprotéine membranaire des hématies. La glycophorine comporte 2 le type N-acétyllactosaminique qui résulte de la substitution
15 glycannes liés O-glycosidiquement ( ) et 1 glycanne par un nombre variable de résidus de N-acétyllactosamine
lié N-glycosidiquement ( ). Les nombres précisent la position Gal(b 1-4)GlcNAc et dont 4 structures de base sont décrites dans la
des acides aminés figure 10. Chacune de ces structures peut être substituée par un
nombre variable de molécules d’acide N-acétylneuraminique et/ou
de fucose. L’une d’elles est donnée dans la figure 11. La combinai-
son des différents types de substitution conduit à un nombre consi-
Gal(b1-3) GalNAc(a1-3) Ser / Thr A dérable de structures glycanniques possibles, justifiant ainsi
l’opinion de nombreux auteurs qui considèrent que les structures de
Gal(b1-3) Gal(b1- 4) Xyl(b1-3) Ser B
Man(a1-6) type N-acétyllactosaminique jouent un rôle de signaux de recon-
naissance. Il est intéressant, à cet égard, de souligner le fait que les
Man(b1- 4) GlcNAc(b1-4) GlcNAc(b1-N) Asn C
modifications des glycannes des glycoprotéines des membranes
Man(a1-3) des cellules cancéreuses touchent principalement les glycannes de
type N-acétyllactosaminique qui voient augmenter la proportion de
Figure 6 – Exemple de noyau (inner-core) de glycoprotéines.
structures tétra-antennées accompagnée d’une hypersialylation.
Le noyau A est présent dans les glycannes dits de type mucine,
Ces néo-glycannes deviennent ainsi des signaux d’antireconnais-
le noyau B dans les glycannes dits de type protéoglycanne
sance qui pourraient expliquer la « fuite » des cellules cancéreuses
et le noyau C dans toutes les N-glycosylprotéines
de la tumeur initiale, première étape de la diffusion métastatique ;
3 le type hybride illustré par la figure 12 qui résulte de l’associa-
tion sur le même glycanne d’une structure de type oligomannosidi-
NeuAc(a2-6) GalNAc(a1-3) Ser / Thr A que et d’une structure de type N-acétyllactosaminique.
Gal(b1-3) GalNAc(a1-3) Ser / Thr B

2.2.3 Glycolipides
NeuAc(a2-6) Gal(b1-3) Les glycolipides naissent de la conjugaison d’un glycanne et
GalNAc(a1-3) Ser / Thr C d’une céramide, celle-ci résultant de l’association par une liaison
NeuAc(a2-3) amide d’un acide gras à longue chaîne avec un alcool particulier, la
sphingosine (figure 13). Les glycosphingolipides dérivent de la gly-
Fuc(a1-2) Gal(b1-3) cosylation de la fonction alcoolique primaire de la céramide avec
D
GalNAc(a1-3) Ser / Thr cette particularité, partagée avec les glycoprotéines, que ces glycan-
nes possèdent un noyau commun, le lactose Gal(b 1-4)Glc.
Figure 7 – Exemples de structures de glycannes de type mucine.
La figure 14 décrit quelques structures de glycosphingolipides à
A : mucine salivaire ; B : glycanne de la glycoprotéine « antigel »
propos desquels il convient de souligner le fait que, plus encore que
du sang des poissons des mers froides ; C : glycanne
les glycannes des glycoprotéines, ceux des glycolipides sont des
de la glycophorine ; D : glycanne de groupe sanguin O
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Figure 8 – Exemple de structure d’un glycanne

[GalNAc(b1-4) GlcUA(b1-3)]n GalNAc (b1-4) GlcUA(b1-3) Gal(b1-3) Gal(b1-4) Xyl(b1-3) Ser
de type protéo-glycanne : l’acide chondroitine
4 4
SO3- SO3- sulfurique A des cartilages. GlcUA : acide
glucuronique
Man(a1-2) Man(a1-6)
Man(a1-6)
Man(a1-2) Man(a1-3) Man(b1-4) GlcNAc(b1-4) GlcNAc(b1-N) Asn
Man(a1-2) Man(a1-2) Man(a1-3)
Figure 9 – Exemple de structure d’un N-glycanne de type

oligomannosidique présent dans de nombreuses glycoprotéines
comme la thyroglobuline de la glande thyroïde, l’hémocyanine
du scorpion, les levures et la lactotransferrine du lait de vache
(D) Gal(b1-4) GlcNAc(b1-6)

Man(a1-6)
(A) Gal(b1-4) GlcNAc(b1-2) Figure 10 – Structure de base des glycannes
Man(b1-4) GlcNAc(b1-4) GlcNAc(b1-N) Asn de type N-acétyllactosaminique. L’association
(B) Gal(b1-4) GlcNAc(b1-2) des antennes A et B, A, B et C, A, B et D et A,
Man(a1-3) B, C et D conduisent aux structures dites
bi-antennées, tri-antennées, tri’-antennées
(C) Gal(b1-4) GlcNAc(b1-4)
et tétra-antennées, respectivement
Figure 11 – Exemples de glycannes

7' 6' 5' 4' bi-antennés. Sans GlcNAc(b1-4) ni Fuc(a1-6) :
NeuAc(a2-6) Gal(b1-4) GlcNAc(b1-2) Man(a1-6)
3 2 1 glycanne de la sérotransferrine humaine ;
[GlcNAc(b1-4)]0-1 Man(b1-4) GlcNAc(b1-4) GlcNAc(b1-N) Asn sans GlcNAc(b1-4) et avec Fuc(a1-6) : glycanne
(a1-6) de la lactotransferrine du lait de femme ;
NeuAc(a2-6) Gal(b1-4) GlcNAc(b1-2) Man(a1-3) [Fuc]0-1 avec GlcNAc(b1-4) et Fuc(a1-6) : glycanne
7 6 5 4
d’immunoglobulines IgG humaines
Man(a1-6)
Man(a1-6)
Man(a1-3) Man(b1-4) GlcNAc(b1-4) GlcNAc(b1-N) Asn
– Figure 12 – Glycanne de type hybride
SO3 (4)GalNAc(b1-4) GlcNAc(b1-2) Man(a1-3)
d’une hormone glycoprotéique hypophysaire
marqueurs parfois spécifiques de la cancérisation et qu’ils sont, à tera leur libération préalable par coupure de la liaison glycanne -
cet égard, utilisés dans l’immunodiagnostic et dans l’immunothéra- protéine ou glycanne - peptide.
pie de certains cancers. Se pose donc, en préalable, la question de l’isolement des glyco-
protéines et des glycopeptides.
3. Procédés d’isolement 3.1 Isolement des glycoprotéines

des glucides libres et des glycopeptides
et conjugués
3.1.1 Isolement des glycoprotéines
Le « glyco-analyste » peut être confronté à deux cas de figures :
Les procédés généraux de fractionnement et de purification des
1 ou bien les glucides sont libres dans leur milieu naturel et, dans
protéines sont parfaitement applicables aux glycoprotéines. Les
le cas particulier d’oligosaccharides, leur isolement sera réalisé en
mécanismes d’action des différents agents de fractionnement utili-
appliquant les procédés décrits dans le paragraphe 3.3 ;
sés sont toutefois dominés par l’influence des glycannes très hydro-
2 ou bien ils sont conjugués et, dans le cas particulier des glyco- philes par leurs fonctions hydroxylées et, plus encore, par leurs
protéines, le seul auquel nous nous attacherons, leur étude nécessi- groupements ionisables des résidus sialylés, phosphorylés et sulfu-
rylés qui solvatent la protéine.
______________________________________________________________________________________________________________________________________
glycoprotéine recherchée est désorbée par des solutions salines à

HOH2C CH CHOH CH CH (CH2)12 CH3 des concentrations et pH appropriés.
NH CO R Bien évidemment, l’application de la chromatographie d’immuno-
affinité nécessite l’obtention d’anticorps qui sont fournis soit par la
Figure 13 – Structure générale d’une céramide (R : acide gras technique complexe des anticorps monoclonaux fournis par des cul-
à longue chaîne) tures cellulaires, soit par des animaux auxquels a été injectée la
(glyco)protéine pure. Celle-ci aura donc été préalablement isolée et
purifiée, généralement à grand peine. L’intérêt de la chromatogra-
phie d’immuno-affinité est donc, par la suite, d’isoler rapidement et
Gal(a1-4) Gal(b1-4) Glc(b1-1) Cer A en grande quantité une (glyco)protéine.
R-Gal(b1-4) GlcNAc(b1-3) Gal(b1-4) Glc(b1-1) Cer B

(a1-2) La chromatographie d’immuno-affinité peut également être
Fuc appliquée aux glycoprotéines en utilisant des anticorps spécifi-
ques d’une structure glycannique portée par la glycoprotéine.
Figure 14 – Structure de glycolipides. A : antigène de groupe La figure 15 vaut donc pour les deux types d’anticorps : antiépi-
tissulaire PK et marqueur de cancérisation ; B : antigènes de groupes tope peptidique et anti-épitope glucidique.
sanguins : groupe O : R = H, groupe B : R = Gal(a1-3) ;
groupe A : R = GalNac(a1-3). Cer : céramide
La description détaillée des très nombreuses et très diverses

méthodes qui sont utilisées est impossible à réaliser dans le cadre
du présent article et nous nous limiterons à exposer le principe de Fixation
quelques-unes d’entre elles, certaines (les méthodes de relargage), + lavage Désorption
fondées sur les propriétés conjointes des glycannes et des protéi-
nes, d’autres (les méthodes de chromatographie d’immunoaffinité),
sur celles des protéines elles-mêmes ou sur celles des glycannes
eux-mêmes qui conduisent à la chromatographie d’affinité sur
colonnes de lectines immobilisées (voir § 3.1.3.2).
3.1.1.1 Méthodes de relargage

Les méthodes le plus couramment utilisées sont fondées sur des Figure 15 – Principe de l’isolement de (glyco)protéines
précipitations fractionnées en appliquant aux solutions de par chromatographie d’immuno-affinité. c : épitope peptidique
(glyco)protéines : ou glucidique reconnu par l’anticorps
— soit des gradients de concentration en éthanol à des tempéra-
tures inférieures à 0 °C afin d’éviter la dénaturation des protéines
par l’alcool. Ainsi peuvent être fractionnées les protéines du plasma 3.1.2 Isolement de glycopeptides
sanguin ;
— soit des gradients de concentration en sels neutres - le sulfate
Dans certains cas, des techniques analytiques ne sont applicables
d’ammonium étant le plus couramment utilisé - associés à des gra-
qu’à des glycopeptides, de même que l’emploi de certaines lectines
dients de pH. On fractionne, par exemple, le plasma sanguin en uti-
qui interagissent d’une manière non-spécifique avec la chaîne pep-
lisant 3 concentrations : 33, 50 et 100 p. cent de la saturation et, pour
tidique et nullement avec les glycannes libres. Enfin, l’étude des gly-
chaque étape, 3 pH différents : 7, 5 et 3. On obtient ainsi 9 précipités
cannes des glycoprotéines membranaires passe par l’obtention des
qui, après dialyse, sont soumis à des sous-fractionnements par
glycopeptides correspondants après attaque protéolytique ména-
diverses méthodes de chromatographie (tamisage moléculaire,
gée des membranes.
échange d’ions, affinité sur lectines ou anticorps immobilisés) ou
d’électrophorèses préparatives.
3.1.2.1 Préparation de glycopeptides à partir
Dans le cas particulier des glycoprotéines possédant plus de de glycoprotéines isolées
20 p. 100 de glucides, on tire parti de la protection que jouent les
glycannes vis-à-vis de la dénaturation de la protéine et de leur pou- Glycopeptides et glyco-aminoacides peuvent être obtenus par
voir solvateur pour appliquer à des milieux biologiques des procé- l’action de diverses protéases, la plus efficace étant la Pronase de
dés très drastiques de fractionnement. Streptomyces griseus. Le protocole expérimental est décrit dans le
tableau 2.
Il est possible d’obtenir en une étape l’ovomucoïde du blanc d’œuf
de poule (25 p. 100 de glucides) et l’orosomucoïde du plasma sanguin
(40 p. 100 de glucides) soit par ébullition, soit par défécation par l’acide
trichloracétique à la concentration de 10 p. 100. Il suffit ensuite de pré-
cipiter les filtrats par l’éthanol pour obtenir les deux composés.
3.1.1.2 Méthodes de chromatographie d’immuno-affinité

Ces procédés sont fondés sur l’emploi d’anticorps immobilisés
sur des supports chromatographiques les plus divers. On peut ainsi
obtenir en deux temps (figure 15) des (glyco)protéines pures puis-
que les anticorps ont une spécificité très étroite vis-à-vis des déter-
minants antigéniques peptidiques : après fixation de la
(glyco)protéine sur son support par simple passage de la solution
complexe de (glyco)protéines et lavage soigneux de la colonne, la
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
ture de ces derniers, qu’ils soient libres ou intégrés dans les systè-
mes cellulaires.
Tableau 2 – Préparation des glycopeptides Les lectines sont universellement répandues et sont présentes
aussi bien chez les micro-organismes que chez les végétaux et chez
Protéolyse : les animaux. Elles existent sous deux formes : en solution dans les
liquides biologiques et intégrées dans les membranes de toutes les
1. A 100 mg de glycoprotéine en solution dans 10 ml de tampon, cellules, y compris dans les enveloppes des virus et dans les appen-
0,04 M en Tris et 0,02 M en acétate de calcium, ajouter 2 mg de
Pronase E (Merck). dices des parois bactériennes. Les lectines membranaires, encore
appelées lectines endogènes, sont les capteurs des signaux de
2. Maintenir à 40 °C pendant 24 h au total. reconnaissance de nature glucidique portés :
3. Répéter cette addition à 4, 8 et 20 heures. — soit par des glycoprotéines en solution dans les liquides biolo-
giques et qui, grâce à elles, atteignent spécifiquement leurs cellules
4. Ajuster à pH 4,5 avec de l’acide acétique et concentrer à 1 ml.
cibles,
5. Ajouter 10 vol. d’éthanol absolu à - 10 °C et maintenir pendant — soit par d’autres cellules homologues qui ainsi se reconnais-
2 h à température ambiante. sent et s’associent.
6. Puis, pendant 18 h à 2 °C : Les lectines utilisées pour isoler des glucides libres ou conjugués
7. Centrifuger et éliminer le précipité. et pour explorer leur structure sont d’origines diverses, générale-
ment végétale et, plus rarement, animale. Elles sont dites lectines
Purification des glycopeptides : exogènes.
1. Par chromatographie d’échange d’ions. Ajouter au surnageant La classification des lectines est fondée sur la nature du mono-
un volume égal d’acide trichloacétique à 10 p. 100 (p/v). saccharide dont la présence est indispensable pour établir leur spé-
Centrifuger et dessaler le surnageant par passage sur des colon- cificité et qui est dit « lectino-dominant ».
nes couplées de Dowex 50 x 8 (25-50 mesh, forme H+) et de Dowex
1 x 8 (25-50 mesh, forme formiate). Laver les colonnes à l’eau dis- On a longtemps cru que l’action de lectines s’exerçait vis-à-vis de
tillée et concentrer sous vide l’éluat. monosaccharides en position terminale non-réductrice exclusive-
ment. On sait, à présent, que cette action se porte sur des structures
2. Par tamisage moléculaire sur colonne de Sephadex G-25 ou de oligosaccharidiques possédant notamment le monosaccharide
Bio-Gel P2 (élution par l’eau ou par l’acide acétique à 5 p. 100, v/v). « lectino-dominant ». Des exemples de séquences oligosaccharidi-
ques spécifiques de quelques lectines sont donnés dans la
figure 16. Toutefois, certaines lectines réagissent avec des mono-
Les glycopeptides sont ensuite fractionnés soit par chromatogra- saccharides en position terminale non-réductrice comme la GNA
phie de tamisage moléculaire, d’échange d’ions, HPLC, d’échange (résidus a-mannosyl terminaux ; voir figure 9), la SNA (résidus a-
d’ions sur Micropak AX-10 ou en phase reverse sur C18 Bondapak, 2,6-sialyl) et la MAA (résidus a-2,3-sialyl).
soit par chromatographie d’affinité sur lectines immobilisées ou par Nous nous limiterons à l’exposé des techniques d’isolement des
électrophorèse préparative à haut voltage (papier Whatman n° 1 ; glucides libres ou conjugués par chromatographie d’affinité sur
tampon acétate de pyridine pH 6,4 ; 2 h à 4 000 V) ou à bas voltage colonnes de lectines immobilisées.
(papier Whatman n° 3 ; tampon acétate de pyridine pH 3,9 : pyridine
/acide acétique/eau, 15 : 50 : 1935 en volumes). 3.1.3.2 Immobilisation des lectines
3.1.2.2 Préparation de glycopeptides membranaires De nombreuses lectines immobilisées sur agarose (Sepharose 4B
ou Ultrogel) sont actuellement commercialisées par plusieurs fir-
Les glycoprotéines membranaires extraites des membranes cellu- mes comme Pharmacia, Miles, EY-Laboratories et IBF. Elles peuvent
laires sont insolubles dans l’eau et ne se prêtent pas à l’application néanmoins être aisément préparées au laboratoire à des concentra-
des méthodes de fractionnement des protéines. Leur préparation tions atteignant 2 à 10 mg de lectine par ml de gel en les couplant à
exige, en outre, l’isolement préalable des membranes cellulaires. de l’agarose préalablement activé par le bromure de cyanogène
L’étude de la structure des glycannes glycoprotéiniques peut s’effec- CNBr. La condensation dont les détails techniques sont précisés
tuer plus simplement sur les glycopeptides obtenus par attaque pro- dans le tableau 3 s’effectue en deux étapes :
téolytique ménagée des cellules entières en vérifiant constamment 1 Fixation par le mécanisme suivant :
que celle-ci ne conduit pas à la lyse des cellules.
Dans le cas des glycoprotéines membranaires, le rendement de OH O
leur protéolyse est très faible et les quantités obtenues sont, pour Sepharose + CNBr Sepharose C NH
l’instant, incompatibles avec l’application de la RMN et de la spec- OH O
trométrie de masse. Actuellement, la méthode la plus courante
repose sur le fractionnement sur lectines des glycopeptides préala-
blement marqués métaboliquement par un précurseur glucidique 2 Conjugaison de la lectine conformément à la réaction
radio-actif approprié. suivante :
O
3.1.3 Utilisation des lectines Sepharose C NH + NH2 lectine
O OH
3.1.3.1 Définition et propriétés des lectines Sepharose
O C NH lectine
Les lectines sont des protéines ou des glycoprotéines oligoméri-
ques qui portent au moins deux sites peptidiques capables de NH
reconnaître spécifiquement des structures glucidiques et de s’y
associer, que ces structures soient libres ou conjuguées, en solution
ou intégrées dans des membranes cellulaires. Les lectines possè- 3.1.3.3 Chromatographie d’affinité des glucides libres
dent la propriété de précipiter les glycoconjugués et d’agglutiner les et conjugués
cellules. Elles sont donc des outils précieux pour isoler des glucides Le comportement chromatographique des oligosaccharides, des
et des glycoconjugués et pour obtenir des informations sur la struc- glycopeptides et des glycoprotéines sur des lectines immobilisées
______________________________________________________________________________________________________________________________________
est grandement imprévisible. En effet, si certaines lectines comme 3.2 Procédés de libération des glycannes
la Concanavaline A (Con A), fixent indifféremment les glucides
libres et conjugués, d’autres, au contraire, comme la LCA, ne s’asso-
cient qu’aux glycopeptides et glycoprotéines. En conséquence, La libération des glycannes des glycoprotéines est un préalable
seuls des essais préalables définiront les types de structures, libres incontournable, dès l’instant où la chaîne peptidique est susceptible
et/ou conjuguées, susceptibles de relever de la chromatographie d’interférer soit dans l’application d’une méthode physique comme
d’affinité sur lectines immobilisées. la RMN soit dans celle d’un procédé chimique comme la perméthy-
La figure 17 illustre un schéma de fractionnement par chromato- lation. Dans certains cas particuliers, une protéolyse poussée
graphie d’affinité sur lectines d’un mélange de N-glycosylpeptides jusqu’au stade de glyco-amino acides ou de glyco-oligopeptides est
de type oligomannosidique et de type bi-, tri- et tétra-antenné envisageable.
obtenu en appliquant le protocole expérimental décrit dans le La libération des glycannes par coupure des liaisons O- et N-gly-
tableau 4. Le sous-fractionnement des fractions obtenues par chro- cosidiques peut être réalisée par l’application de méthodes chimi-
matographie d’affinité sur une première lectine peut être réalisé en ques ou enzymatiques.
soumettant chacune des fractions à une chromatographie sur une
colonne de seconde lectine montée en tandem à la suite de la pre-
mière.
MAA
NeuAc(a2-3) Gal(b1-4) GlcNAc(b1-2) Man(a1-6)

GalNAc(a1-3) Gal(b1-3 ou 4) GlcNAc(b1-)
Man(b1-4) GlcNAc(b1-4) GlcNAc (b1-N) Asn DBA ou
(a1-2)
NeuAc(a2-6) Gal(b1-4) GlcNAc(b1-2) Man(a1-3) (a1-6) Gal(a1-3)
Fuc UEA – I
Fuc
A
SNA B
RCA
Con A
LCA
Figure 16 – Motifs glucidiques pour lesquels l’affinité des lectines SNA, MAA, RCA, Con A, LCA, DBA, UEA I est maximale. A : cas d’un glycanne
bi-antenné. B : les oligosaccharides reconnus par DBA et UEA I sont les épitopes glucidiques des groupes sanguins A ou B et O, respectivement
Tableau 3 – Préparation de colonnes de lectines immobilisées

ACTIVATION DU SEPHAROSE 4B Placer dans un bécher refroidi dans la glace 50 ml de Sepharose 4B préalablement lavé sur filtre
Büchner avec 1 litre d’eau glacée.
Ajouter sous agitation 100 ml de K2CO3 2M froid puis 6,25 ml d’une solution de CNBr dans l’acétoni-
trile (2 g/ml). Maintenir à 0 °C pendant 2 min. Laver sur filtre avec 3 l d’eau distillée glacée.
COUPLAGE DE LECTINE Transférer le Sepharose activé dans un bécher de 200 ml et ajouter la solution refroidie à 0 °C de la
lectine (0,25 g de lectine en solution dans NaCl 0,5 M - NaHCO3 0,2 M ; glucide « hapténique » 0,2 M
pH 8,5) (*). Maintenir à 4 °C pendant 24 h sous agitation. Filtrer sur Büchner et laver à 0 °C avec de
l’eau puis du NaCHO3 0,1 M et enfin de l’eau. Bloquer les groupes imidocarbonate non-substitués
(cf. § 3.1.3.2, étape 1) avec 100 ml d’une solution 1 M de glycine pendant 3 h à température du labo-
ratoire, laver à l’eau distillée refroidie, puis avec le tampon d’équilibre contenant 0,02 % d’azide de
sodium. Stocker à 4 °C dans le tampon d’équilibrage.
(*) Le glucide hapténique est le monosaccharide « lectino-dominant » qui, en saturant le site lectinique de reconnaissance-association, évite que ce dernier perde
son activité par empêchement stérique lié à la condensation.
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
Tableau 4 – Chromatographie d’affinité

sur Con A immobilisée d’un mélange
de glycopeptides d’origine membranaire
1. Équilibrer la colonne (1 cm x 10 cm) de Con A Sepharose à l’aide
d’un tampon d’acétate de sodium 5 mM de pH 5,2 contenant NaCl
0,1 M, CaCl2 1 mM, MnCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, azide de sodium
0,02 % (température du laboratoire, débit 9 ml/h) (*).
2. Passer sur la colonne la solution de glycopeptides dissous dans
le tampon d’équilibrage.
3. Éluer les glycopeptides en 3 étapes par passages successifs du
tampon d’équilibrage (5 vol. de colonne), d’a-méthylglucoside
0,01 M (3 vol. de colonne) puis 0,3 M (5 vol. de colonne). On
obtient ainsi trois fractions : glycopeptides non-réactifs passant au
volume mort, faiblement réactifs et fortement réactifs.
4. Dessaler les fractions par chromatographie de tamisage molécu-
laire sur des colonnes (2 cm x 50 cm) de Bio-Gel P2 et lyophiliser.
(*) La présence de cations bivalents dans la solution est rendue nécessaire
par la nature métalloprotéique de la plupart des lectines.
Le même protocole expérimental est applicable aux oligosaccharides libérés
par coupure chimique ou enzymatiques, radiomarqués ou non.
3.2.1 Méthodes chimiques
3.2.1.1 Hydrazinolyse
La méthode de libération des glycannes par hydrazinolyse
concerne essentiellement les N-glycosylprotéines. Elle dérive de la
méthode d’Akobori d’identification des acides aminés terminaux
libérés d’une protéine, tous les autres acides aminés étant libérés
sous forme d’hydrazides. En effet, l’action de l’hydrazine porte sur
les liaisons CCOCNHC que celles-ci soient de nature peptidique
ou de type glycosylamine, comme dans le cas des N-glycosylprotéi-
nes. Il s’ensuit que les liaisons acétamido des résidus de N-acétyl-
glucosamine et d’acides sialiques sont, elles aussi, coupées et que
l’hydrazinolyse devra être suivie de la N-réacétylation des monosac-
charides aminés. Le procédé comprend donc 3 étapes : hydrazino-
lyse, ré-N-acétylation et réduction du monosaccharide en position
terminale afin de stabiliser les molécules de glycannes.
Le protocole expérimental est décrit dans le tableau 5.
3.2.1.2 Coupure alcaline

L’attaque alcaline de la liaison glycanne-protéine ne concerne que
les glycannes conjugués N- et O-glycosidiquement à condition tou-
tefois que, pour ces derniers, seuls les b-hydroxy-amino acides,
sérine et thréonine, soient impliqués dans la liaison. Dans le premier
cas, il s’agit d’une réaction d’hydrolyse et, dans le deuxième cas,
d’un mécanisme complexe dit de b-élimination.
a) Dans le cas des O-glycosylprotéines
L’attaque par la soude ou la potasse s’effectue dans des condi-
tions douces (pH 10 ; 40-45 °C pendant 0,5 à 6 jours) et en présence
d’un agent réducteur destiné à stabiliser la molécule par transforma-
tion en alditol du monosaccharide en position terminale réductrice
pour éviter une dégradation récurrente (peeling).
Le protocole expérimental est décrit dans le tableau 6.
b) Dans le cas des N-glycosylprotéines
La coupure alcaline de la liaison N-glycosidique nécessite des
conditions plus drastiques que dans le cas des O-glycosylprotéines
(NaOH 1 M, 100 °C pendant 6 à 12 h). Comme dans le cas de la b-éli-
mination, la réaction est effectuée en milieu réducteur et nécessite la
ré-N-acétylation des résidus de glucosamine et d’acide sialique (voir
tableau 7).
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Mélange de N-glycosylpeptides
Con A-Sepharose
FNR FFR FR
Structures de type
oligomannosidique
Asn Asn
Asn
Asn
Asn
LCA-Sepharose
FNR FR FNR FR FNR
Asn
Asn Asn
Asn Asn
Structures de type
oligomannosidique
Asn
Asn
Asn
: NeuAc : Gal : Man : GlcNAc : Fuc
Figure 17 – Schéma de fractionnement séquentiel de glycopeptides par chromatographie d’affinité sur colonnes montées en tandem de ConA
et de LCA immobilisées. FNR : fraction non-retenue ; FFR : fraction faiblement retenue ; FR : fraction retenue
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
Tableau 5 – Exemple d’hydrazinolyse d’une N-glycosylprotéine

■ HYDRAZINOLYSE Dans un tube hermétiquement clos, couvrir la glycoprotéine anhydre d’hydrazine anhydre.
Chauffer à 100 °C pendant 12 à 15 heures.
Éliminer l’hydrazine en excès par évaporation sous un courant d’azote en présence d’un volume
de toluène, puis en exsiccateur en présence d’acide sulfurique.
Purifier les composés par passage sur une colonne de Bio-Gel P2 et lyophiliser.
■ RE-N-ACÉTYLATION Dissoudre le résidu sec dans une solution saturée de NaHCO3(1 mg/ml de glycanne).
Ajouter à 5 min d’intervalle 5 fractions de 10 ml d’anhydride acétique.
Dessaler sur une colonne (1 cm x 5 cm) de Dowex 50 x 8 (mesh 25-50 ; forme H+). Lyophiliser
l’effluent.
■ RÉDUCTION Dissoudre le résidu dans NaOH 0,05 M (1 mg/ml) et réduire par NaBH4 (5 mg/ml) pendant 16 h à
20 °C. Arrêter la réaction par addition de Dowex 50 x 8 (mesh 25-50 ; forme H+). Filtrer et concen-
trer sous vide.
Éliminer l’acide borique par des co-distillations répétées effectuées sous vide en présence de
méthanol. Purifier par passage sur colonne de Bio-Gel P-2 (2 cm x 25 cm).
Les oligosaccharide-alditols sont ensuite fractionnés par HPLC ou par chromatographie sur lecti-
nes immobilisées.
Nota : les oligosaccharide-alditols obtenus en faible quantité, comme ceux qui sont issus des N-glycosylprotéines membranaires, peuvent être radiomarqués soit
par ré-N-acétylation en présence de [14C]anhydride acétique, soit par réduction à l’aide de borohydrure tritié. Ce procédé est applicable aux N-glycannes.
2 chromatographie de tamisage moléculaire sur colonne de Bio-

Gel P2 pour séparer les oligosaccharide-alditols des N-glycosylpep-
Tableau 6 – Clivage réducteur tides, suivie de la libération des N-oligosaccharide-alditols soit par
des liaisons O-glycosidiques impliquant la sérine hydrolyse alcaline, soit par hydrazinolyse.
et le thréonine (b-élimination)
1. Ajuster la solution de glycoprotéine (10-20 mg/ml) à pH 10 par 3.2.2 Méthodes enzymatiques
addition de soude diluée, puis ajouter un volume égal d’une solu-
tion refroidie à 0 °C de soude 0,1 M et de borohydrure de sodium 2 Parmi les hydrolases, la famille des glycosidases possède la pro-
M.
priété de couper les liaisons glycosidiques de deux manières : soit
2. Maintenir à reflux à 45 °C pendant 16 h en moyenne. en s’attaquant au monosaccharide en position terminale non-réduc-
3. Ajuster à pH 6 par addition d’acide acétique à 50 % puis purifier trice, et il s’agit alors des exoglycosidases, soit en coupant à l’inté-
sur une colonne (2 cm x 75 cm) de Sephadex G-50 ou de Bio-Gel rieur même de la molécule de glycanne, dans le cas des
P4. endoglycosidases. C’est cette seconde catégorie d’enzymes qui est
utilisée pour libérer tout ou partie des glycannes : le glycanne com-
Les oligosaccharide-alditols sont ensuite fractionnés par HPLC ou plet dans le cas des endoglycosidases de la classe I : peptide-N-gly-
par chromatographie sur lectines immobilisées. cosidase ou N-glycanase F de Flabobacterium meningosepticum et
Nota N-glycopeptidase A de l’émulsine d’amande et le glycanne amputé
1. Dans les conditions décrites ci-dessus, ni les liaisons N-glycosidiques ni du résidu terminal de N-acétylglucosamine dans le cas des endogly-
les liaisons O-glycosidiques, de l’hydroxyproline et de la tyrosine ne sont
rompues. cosidases de la classe II : « l’endo-B » spécifique des structures de
2. La réduction des glycannes peut s’effectuer en présence de borohydrure type N-acétyllactosaminique bi-antennées désialylées et de
tritié et conduire ainsi à des oligosaccharide-alditols radiomarqués. « l’endo-H » spécifique des structures oligomannosidiques.
3.2.2.1 Coupure par les peptide-N-glycosidases

Ces endoglycosidases hydrolysent les liaisons GlcNAc-Asn aussi
bien des glycoasparagines que des glycopeptides et des glycopro-
Tableau 7 – Clivage réducteur des liaisons téines à condition toutefois que ces dernières soient préalablement
N-glycosidiques dénaturées par la chaleur. Bien que leurs paramètres optimaux
d’activité soient différents (pH 6,5 à 9,5 et 25 °C pour la glycanase F ;
1. Dissoudre la N-glycosylprotéine (50 mg/ml) dans une solution
de NaOH 1 M - NaBH4 1 M. pH 4 à 6 et 37 °C pour la N-glycopeptidase A), leurs spécificités sont
identiques et très larges puisque les deux enzymes sont actifs sur
2. Chauffer à reflux à 100 °C pendant 6 h. Amener à pH 6 à 0 °C par les glycannes de types oligomannosidique, hybride, N-acétyllacto-
l’addition d’acide acétique à 50 %. saminique bi-, tri- et tétra-antennés, même si le résidu terminal de
3. Purifier sur colonne (2 cm x 40 cm) de Bio-Gel P2. Lyophiliser. N-acétylglucosamine est fucosylé en position C-6.
Le tableau 8 donne un exemple d’utilisation des peptide-N-glyca-
4. Ré-N-acétyler (cf. tableau 5).
nases.
5. Fractionner les oligosaccharide-alditols par HPLC ou par chro-
matographie sur lectines immobilisées. 3.2.2.2 Coupure par les endo-N-acétyl-b
c) Dans le cas des O,N-glycosylprotéines -D-glucosaminidases
La libération des glycannes liés N- et O-glycosidiquement à la Ces enzymes constituent une famille très homogène
même protéine s’effectue en deux temps : d’endoglycosidases puisque toutes possèdent la propriété de rom-
pre la liaison b -1,4-N- acétylglucosaminique des résidus de N,N’-
1 clivage spécifique des liaisons O-séryl ou thréonyl par b-élimi- diacétylchitobiose présents dans tous les noyaux pentasaccharidi-
nation dans les conditions décrites en a) ci-dessus. ques des N-glycosylprotéines.
______________________________________________________________________________________________________________________________________
— chromatographie en phase réverse,

— chromatographie d’échange d’anions à pH élevé.
Tableau 8 – Protocole d’action
des peptide-N-glycanases sur les glycoprotéines
Tableau 9 – Protocole d’action
1. Dénaturer la glycoprotéine en solution (20 à 50 mg / 20 à 50 ml de
tampon Tris 50 mM - HCl pH 8,5) par chauffage (100 °C ; 10 min). de l’endo-N-acétyl-b -D-glucosaminidase H
2. Ajouter 50 mU d’enzyme. Incuber à 37 °C pendant 15 h et arrêter 1. Dénaturer la glycoprotéine en solution dans un tampon phos-
l’action de l’enzyme par chauffage à 100 °C pendant 3 min. Centri- phate 0,01 M-citrate 0,01 M de pH 5,5 (1 mg/ml) par chauffage à
fuger. 100 °C pendant 10 min.
3. Analyser (GLC, RMN, SM) ou fractionner le surnageant par High 2. Ajouter à 2-5 nmoles de glycoprotéine dénaturée 5 mU d’endo-
pH Anion Exchange Chromatography (HPAE), à détection ampéro- H en solution dans le tampon précédent de pH 5,5.
métrique pulsée (PAD), par High Pressure Liquid Chromatography
(HPLC) ou par High Performance Capillary Electrophoresis (HPCE). 3. Incuber de 2 à 24 h à 37 °C sous agitation constante et en pré-
sence de quelques gouttes de toluène pour inhiber la prolifération
Nota : dans le cas des glycopeptides, la dénaturation n’est pas indispensa- des micro-organismes.
ble.
4. Centrifuger et séparer les oligosaccharides libérés de la glyco-
protéine résiduelle par chromatographie sur colonne (2 cm x
40 cm) de Bio-Gel P2.
Toutefois, elles présenteront des spécificités différentes liées aux 5. Analyser la fraction oligomannosidique par HPAE-PAD, HPCE,
structures oligosaccharidiques substituant le noyau. À cet égard, HPLC ou TLC (thin layer chromatography).
elles sont réparties en deux groupes principaux :
— le groupe I avec l’endo-H de Streptomyces plicatus et l’endo-F1
de Flavobacterium meningosepticum actives sur les glycannes de
type oligomannosidique et hybride,
— le groupe II avec l’endo-B de Sporotrichum dimorphosporum
et les endo-F2 et F3 de Flavobacterium meningosepticum actives sur
Tableau 10 – Chromatographie de type HPLC
les glycannes de type oligomannosidique.
d’oligosaccharides neutres
Dans le tableau 9 est décrit, à titre d’exemple, le protocole appli- sur colonne de silice-alkylamine
qué dans le cas de l’endo-H.
L’enzyme est actif sur les glycoasparagines, sur les glycopeptides 1. Colonne (0,4 x 25 cm) de 5 mm Supelcosyl LC-NH2 (Supelco).
et sur les glycoprotéines, de préférence dénaturées. Dans le cas où 2. Appareil de HPLC automatisé Spectra Physics (modèle 8.700)
des glycannes de type oligomannosidique et de type N-acétyllacto- équipé d’un détecteur (modèle 8.400) connecté à un ordinateur
saminique coexistent dans la même protéine, les oligosaccharides intégrateur (modèle 4.100) - Détection : UV 206 nm.
libérés par l’endo-H peuvent être séparés par chromatographie de
3. Dissoudre 1 mg d’oligosaccharide dans 50 ml d’eau et déposer
tamisage moléculaire (colonne de Bio-Gel P2) de la glycoprotéine sur la colonne préalablement équilibrée avec le solvant initial
résiduelle dont les glycannes de type N-acétyllactosaminique peu- acétonitrile : eau, 70 : 30 v/v. Après l’injection, maintenir pendant
vent être détachés soit par coupure chimique, soit par hydrolyse 15 min les conditions isocratiques avec le même solvant.
enzymatique à l’aide d’une peptide-N-glycosidase.
4. Éluer avec un gradient linéaire d’acétonitrile - eau dans le rap-
port 60 : 40 pendant 60 min pour séparer les oligosaccharides pos-
sédant de 2 à 5 résidus de mannose, puis dans le rapport 50 : 50
pour obtenir des oligosaccharides de 5 à 9 résidus de mannose.
3.3 Procédés d’isolement
des oligosaccharides libres ou libérés
3.3.1 Chromatographie de partage de type HPLC
Les techniques que nous décrivons ne s’appliquent qu’aux oligo- d’oligosaccharides neutres sur colonnes
saccharides libres dans un milieu biologique ou libérés soit par cou- de silice-alkylamine
pure chimique, soit par coupure enzymatique. En outre, nous
prendrons à titre d’exemple celui des glycannes des glycoprotéines,
À titre d’exemple, nous décrivons dans le tableau 10 le protocole
en soulignant toutefois que les procédés que nous présentons sont
appliqué à la séparation d’oligosaccharides obtenus par action de
applicables à tous les oligosaccharides quels que soient leur origine
l’endo-H sur des N-glycannes de type oligomannosidique.
et leur mode de préparation.
Les oligosaccharides peuvent être fractionnés par la méthode
classique de chromatographie préparative sur papier, méthode 3.3.2 Chromatographie de type HPLC d’échange
ancienne, certes, mais qui garde toute son efficacité dans l’isole- d’anions de sialyloligosaccharides
ment, en quantités élevées, de l’ordre de quelques centaines de mil-
ligrammes, d’oligosaccharides contenant une dizaine de résidus
Le tableau 11 donne un exemple de chromatographie préparative
monosaccharidiques. En raison des longs délais de plusieurs jours
de sialoglycannes obtenus par hydrazinolyse d’une N-glycosylpro-
nécessaires pour obtenir de bonnes séparations, la plupart des
téine contenant des glycannes différemment sialylés.
auteurs ont abandonné ce procédé au profit de la chromatographie
liquide à haute pression (HPLC, pour High Pressure Liquid Chroma-
tography) et la chromatographie d’affinité sur colonnes de lectines
immobilisées.
3.3.3 Chromatographie de type HPLC en phase
reverse d’oligosaccharides neutres
Une grande diversité de procédés ont été décrits, dont nous ne
décrirons que ceux qui sont le plus généralement utilisés :
— chromatographie de partage sur colonnes de silice-alkylamine,
— échange d’anions sur colonnes de silice-amines quaternaires,
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
Le tableau 12 donne le protocole à suivre pour une telle chroma- paratifs ou « finger-printings ») et préparative des glycannes des N-
tographie dont le grand pouvoir séparateur permet de dévoiler et O-glycosylprotéines.
l’hétérogénéité des glycannes portés par une même glycoprotéine. Le tableau 13 donne un exemple de protocole expérimental limité
à la séparation des glycannes neutres, bien que la méthode soit par-
faitement applicable aux sialyloligosaccharides.
Tableau 11 – Chromatographie de type HPLC
préparative d’échange d’ions de sialoglycannes
Tableau 13 – Chromatographie de glycannes
1. Colonne (0,8 x 50 cm) de 10 mm Micropak AX-10 (Varian)
connectée à un chromatographe Spectra-Physics. neutres par Dionex-HPAE
2. Déposer sur la colonne une solution de 20 mg d’oligosacchari- Matériel : Système DIONEX LC (Dionex Sunny Vale, CA, USA)
des dans 60 ml d’eau distillée. connecté à un détecteur PAD à électrode d’or. Détection des
oligosaccharides : E1 : 0,05 V/300 ms ; E2 : 0,6 V/120 ms ;
3. Effectuer la chromatographie avec un gradient de KH2PO4 0,5 M E3 : 0,6 V/60 ms à 300 nA ;
de pH 4,0 dans les conditions suivantes (débit 2 ml/min) :
Colonne (4,6 x 250 mm) de Carbo Pac PA-1
4. eau distillée pendant 5 min ; Élution (1 ml/min à température ambiante) par des solutions de
5. gradient linéaire jusqu’à 2,5 p. 100 (v/v) de KH2PO4 0,5 M pen- NaOH de concentrations variables et de forces ioniques croissan-
dant 15 min ; tes par addition d’acétate de sodium.
6. élution isocratique pendant 25 min ;
7. gradient linéaire jusqu’à 5 p. 100 (v/v) de KH2PO4 0,5 M pendant
35 min ; 3.3.5 Amélioration de la sensibilité
par pyridylamination des oligosaccharides
8. élution isocratique pendant 45 min.
9. Les oligosaccharides sont détectés à 206 nm. Plusieurs méthodes de condensation d’oligosaccharides avec des
10. Purifier chaque fraction (4 ml) par chromatographie de tami- chromophores fluorescents ou absorbant fortement l’UV ont été
sage moléculaire sur une colonne (1,9 x 30 cm) de Bio-Gel P2 (200- décrites en vue de sensibiliser la détection des composés et leur
400 mesh), l’élution étant réalisée avec de l’eau distillée (débit : analyse en spectrométrie de masse FAB-MS (Fast Atom Bombard-
12ml/h). ment-Mass Spectrometry).
11. Détecter les glucides présents dans chaque fraction en utilisant
un réactif à l’orcinol sulfurique : chauffage à 100 °C de plaques
chromatographiques de Silica-Gel (precoated Silica Gel 60 Merck)
sur lesquelles est déposée une goutte prélevée dans chacun des N
tubes d’élution. CHO CH N
CHOH CHOH
CHOH CHOH
+ NH2
R O C H N R O C H
Tableau 12 – Chromatographie préparative de type CHOH CHOH
HPLC en phase reverse d’oligosaccharides neutres
CH2OH Réduction CH2OH
1. Colonne de 3 mm C18 (4,6 x 10 cm ; Brownlee Labs, Santa Clara, N Base de Schiff
CA, USA) connectée sur un chromatographe Spectra-Physics (voir CH NH
tableau 10).
CHOH
2. Injecter sur la colonne 1 mg d’oligosaccharides dissous dans
10 ml d’eau distillée. CHOH
3. Éluer successivement par de l’eau distillée (15 min), R O C H
4. par un gradient linéaire eau/acétonitrile (90 : 10 ; v/v) pendant
25 min, CHOH
5. puis par un gradient isocratique du même solvant (20 min). CH2OH

6. Débit 1 ml/min. Amine secondaire
7. Détecter les oligosaccharides à 206 nm. Figure 18 – Mécanisme de la pyridylamination des oligosaccharides
3.3.4 Chromatographie sur Dionex-HPAE Nous utilisons couramment au laboratoire la pyridylamination

(High pH Anion Exchange Chromatography) des oligosaccharides dont le principe de la méthode est illustré par
des oligosaccharides la figure 18 et dont le protocole d’application est décrit dans le
tableau 14. Les pyridylaminodérivés sont ensuite séparés par chro-
matographie.
L’introduction récente en chromatographie de type HPLC sur rési-
nes pelliculaires d’échange d’ions à pH élevé, associée à la détection ■ Mode opératoire
ampérométrique pulsée (Pulsed Amperometric Detector ou PAD), a La séparation des oligosaccharides neutres est réalisée par
considérablement amélioré la séparation et l’analyse des mono- et l’application du gradient discontinu suivant :
oligosaccharides. Elle a été utilisée avec succès dans la chromato-
graphie analytique (obtention de profils chromatographiques com-
______________________________________________________________________________________________________________________________________
4.1 Détermination de la composition

centésimale en monosaccharides
Temps NaOH 0,1 M Acétate de sodium 0,15 M
(min) p. cent dans la soude 0,1 M par méthodes colorimétriques
0 100 0
10 100 0 ■ Règles générales
1. Température et temps de chauffage ont une grande importance
60 40 60 dans le développement des colorations et devront être très exacte-
65 40 60 ment fixés.
125 100 0 2. Tous les tubes à essais utilisés devront posséder le même dia-
mètre et être rigoureusement propres.
3. Avant d’être placés au bain-marie, les milieux réactionnels
seront soigneusement homogénéisés par une agitation prolongée à
l’aide de tiges de verre aplaties à une extrémité.
4. Les réactifs se conservent généralement pendant plusieurs
Tableau 14 – Pyridylamination des oligosaccharides semaines à 4 °C.
Pyridylamination : 5. Les réactions sont sensibles à la présence de métaux, de sels de
fer en particulier. En conséquence, les réactifs seront conservés
1. À 100 nmoles d’oligosaccharides lyophilisés, ajouter 10 ml de dans des flacons en verre Pyrex blanc.
l’agent de couplage obtenu en dissolvant 10 mg de 2-aminopyri-
dine dans 50 ml d’acide acétique et 60 ml de méthanol. 6. Les colorations n’étant pas reproductibles d’une expérience à
l’autre, on ne peut se référer à des courbes étalons et il est néces-
2. Chauffer à 90 °C pendant 15 min sous agitation constante et éli- saire d’introduire dans chaque série de dosages des témoins inter-
miner l’excès de réactif par évaporation sous courant d’azote. nes constitués par des solutions titrées de monosaccharides
3. Ajouter 10 ml de réactif réducteur (6 mg de borane-diméthyla- préalablement déshydratés sous vide en présence d’anhydride
mine dissous dans 100 ml d’acide acétique). Chauffer à 90 °C pen- phosphorique ou de soude.
dant 30 min et évaporer sous courant d’azote en présence de 7. Les solutions titrées sont préparées par dilution de solutions
méthanol et de toluène.
mères conservées à - 20 °C après avoir été additionnées de quel-
4. Dissoudre le résidu sec dans l’eau et soumettre à une ques gouttes d’acide chlorhydrique pour stabiliser les sucres et de
chromatographie en phase reverse sur des colonnes de C18 ou de chloroforme pour inhiber le développement de micro-organismes.
silice alkylamine. Les solutions titrées ne sont conservées que 2 à 3 semaines.
8. Les absorbances données, à quantités égales, par les monosac-
charides d’une même famille varient d’un sucre à l’autre. Il est donc
■ Commentaire : le rendement de la réaction ne dépasse jamais nécessaire, après avoir pris connaissance des rapports molaires de
90 % et les pyridylamino-oligosaccharides doivent être isolés de la chacun des monosaccharides, déterminés en appliquant les métho-
manière suivante : dissoudre dans l’eau le résidu sec obtenu et ajou- des décrites en 4.2, de corriger les valeurs initialement obtenues
ter un volume égal d’une solution saturée de bicarbonate de avec un témoin interne constitué d’un seul monosaccharide en répé-
sodium ; éliminer l’excès d’amino-pyridine par 7 extractions succes- tant les déterminations avec l’introduction d’un « témoin corrigé »
sives par 2 ml de benzène ; chromatographier sur Sephadex G-15 en dans lequel les monosaccharides sont à la même concentration
utilisant une solution aqueuse d’acide acétique 10 mM comme molaire que celle du composé naturel à étudier.
éluant. 9. Parfois, une réaction colorée donnée n’est pas spécifique et est
développée par des monosaccharides appartenant à des classes dif-
férentes, oses neutres et acides uroniques, par exemple. Une for-
mule de correction doit alors être appliquée.
4. Méthodes de dosage 10. Les courbes d’absorbance fournies par un chromophore sont
des glucides spécifiques d’un monosaccharide ou d’une classe de monosacchari-
des donnés. Leur tracé peut donc permettre de déceler l’interférence
d’autres glucides dans la réaction colorée.
Le premier problème qui se pose dans l’étude d’un oligo- ou d’un 11. Tous les protocoles que nous décrirons peuvent faire l’objet
polysaccharide libre ou conjugué concerne sa composition en d’une « miniaturisation» en réduisant dans les mêmes proportions
monosaccharides. Il soulève deux questions : tous les poids et volumes annoncés.
1) Quelle est la composition centésimale du composé en mono-
saccharides neutres, en osamines, en acides uroniques et en acides 4.1.1 Dosage des monosaccharides neutres
sialiques ?
2) Quelle est sa composition molaire en monosaccharides répartis ■ Principe : le principe des méthodes de dosage colorimétrique des
dans les quatre familles précédentes ? monosaccharides neutres varie suivant qu’il s’agit d’hexoses, de 6-
désoxyhexoses ou de pentoses. Cependant, tous les procédés tirent
parti de la formation de produits de dégradation des sucres sous
l’action des acides forts. Ces chromogènes qui sont, la plupart du
temps, des dérivés du furfural (figure 19) sont ensuite condensés
avec diverses substances, généralement des phénols, pour fournir
des chromophores.
■ Mode opératoire : dans les tableaux 15 et 16 sont décrits les
modes opératoires des dosages à l’orcinol et au phénol qui sont le
plus couramment utilisés.
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
CHOH CHOH CHOH CHOH
R C H CHOH CHO R C H C CHOH

Aldose
Tableau 16 – Dosage des oses neutres
OH OH OH par la méthode au phénol sulfurique
(forme aldéhyde) Forme énol Réactifs : Solution aqueuse de phénol contenant 5 p. 100 (p/v)
d’acide sulfurique concentré.
CHOH CHOH CHOH CHOH
H Mode opératoire : Introduire dans des tubes à essais :
R C H C CHOH R C H C 1. 1 ml de solution à doser (ou une quantité de substance accom-
O O CHO pagnée de 1 ml d’eau distillée) renfermant au maximum 200 mg
d’oses totaux.
CH CH
2. 2 ml de réactif au phénol.
R C C CHO
3. 5 ml d’acide sulfurique ajoutés en 5 secondes à l’aide d’une
O burette dont le jet tombe brutalement à la surface du liquide. La
température atteint alors 110 °C.
Figure 19 – Mécanisme de la formation de furfural dans le cas des
pentoses (R = H), d’hydroxyméthylfurfural dans le cas des hexoses 4. Mélanger soigneusement à l’aide d’un agitateur aplati à une
(R = CH2OH) et d’acide 5-formylfuroïque dans le cas des acides extrémité et maintenir les tubes pendant 5 min au bain-marie à
uroniques (R = COOH) 100 °C. Refroidir les tubes sous un courant d’eau et les maintenir à
l’obscurité pendant 30 min.
5. L’absorbance des solutions est déterminée à 492 nm. La colora-
tion est stable pendant 3 h.
6. Introduire les solutions titrées témoins comme dans le cas du
dosage par l’orcinol sulfurique.
Tableau 15 – Dosage des oses neutres totaux
par la méthode à l’orcinol sulfurique 7. Sensibilité : 5 à 200 mg d’oses neutres dans un volume total de
7 ml.
Réactifs : Solution d’orcinol à 1,5 g d’orcinol p. 100 ml d’acide sul-
furique à 30 p. 100 (v/v). Conserver à 0 °C dans des flacons Pyrex
blanc.
Solution aqueuse d’acide sulfurique à 60 p. 100 (v/v). ■ Commentaires
Solutions titrées (200 mg/ml) de monosaccharides neutres et 1. Osamines, N-acétylosamines et acides sialiques ne réagissent
d’acide glucuronique. pas.
Mode opératoire : Introduire dans des tubes à essais : 2. Au contraire, les acides uroniques donnent une coloration avec
1. 1 ml de solution à doser (ou une quantité de substance accom- les deux réactifs et leur présence nécessite donc l’introduction d’un
pagnée de 1 ml d’eau distillée) renfermant au maximum 200 mg terme de correction ainsi que la présence, dans les séries de dosa-
d’oses totaux.
ges, d’un témoin interne constitué d’une solution titrée d’acide glu-
2. 2 ml de réactif à l’orcinol. curonique. Ce terme de correction tient compte du dosage
3. 15 ml d’acide sulfurique à 60 p. 100. colorimétrique des acides uroniques par le carbazol (cf. 4.12) et se
formule de la manière suivante :
4. Mélanger soigneusement à l’aide d’un agitateur aplati à une
extrémité et maintenir les tubes pendant 20 min au bain-marie à 4 xc Ð yb
80 °C ± 2 °C. ---------------------------- ¸ 1 000 = Q (mg/ml)
Refroidir les tubes sous un courant d’eau et les maintenir à l’obs- 4 ac db
----------- Ð ----------
curité pendant 45 min. 200 200
5. L’absorbance des solutions est déterminée à 510 nm. La colora- x = absorbance de 1 ml de la solution à doser par l’orcinol ou le
tion est stable 24 h à l’obscurité et à 4 °C. phénol sulfurique
6. Dans chaque série de dosages sont introduits des témoins inter- c = absorbance de 50 mg d’acide uronique dosé par la méthode au
nes constitués par des solutions titrées d’oses neutres et, éventuel- carbazol sulfurique
lement, d’acide glucuronique. En cas de coexistence d’oses
neutres et d’acides uroniques, appliquer la formule de correction y = absorbance de 1 ml de la solution à doser donnée par le carba-
donnée dans le texte. zol sulfurique
b = absorbance de 200 mg d’acide uronique donnée par l’orcinol
7. Sensibilité : 5 à 200 mg d’oses neutres dans un volume total de
18 ml. ou le phénol sulfurique
a = absorbance de 200 mg d’oses neutres donnée par l’orcinol ou
le phénol sulfurique
d = absorbance de 200 mg d’oses neutres donnée par le carbazol
sulfurique
3. Les protéines interfèrent dans les dosages, mais cette cause
d’erreur est éliminée en mesurant les absorbances à 510 nm dans le
cas de l’orcinol sulfurique et à 492 nm dans le cas du phénol sulfuri-
que.
4. Pour des quantités égales de monosaccharides neutres, les
absorbances varient dans de larges proportions. Le dosage des oses
neutres, pour être exact, doit donc s’effectuer en deux temps :
d’abord avec une solution titrée de glucose comme référence, puis
avec une solution titrée constituée des mêmes oses que ceux qui
______________________________________________________________________________________________________________________________________
entrent dans la composition du saccharide et dans les mêmes rap- c = absorbance de 50 mg d’acide uronique donnée par le carbazol
ports molaires. sulfurique
5. Les sels interfèrent dans le dosage colorimétrique des oses b = absorbance de 200 mg d’acide uronique donnée par l’orcinol
neutres. Il sera donc parfois nécessaire de procéder à un dessalage sulfurique.
des solutions de glucides à doser par un passage sur des colonnes 3. Les protéines n’interfèrent pas en deçà de 200 mg p.ml.
couplées d’échangeur de cations, comme la Dowex 50, ou d’échan-
geur d’anions, comme la Dowex 1, ou par chromatographie de tami- 4. Comme dans le cas des oses neutres, à quantités égales, les dif-
sage moléculaire dans le cas de polysaccharides ou de férents acides uroniques ne donnent pas la même absorbance et le
glycoprotéines de masse moléculaire élévée. commentaire no 4 du paragraphe précédent leur est applicable.
4.1.2 Dosage des acides uroniques 4.1.3 Dosage des osamines
■ Principe : la méthode au carbazol sulfurique de Dische est la plus ■ Principe : contrairement aux méthodes précédentes qui sont
couramment utilisée. Son principe est fondé sur le développement directement applicables aux oligo- et polysaccharides et aux gluci-
d’un chromophore violet par condensation de l’acide formylfuroï- des conjugués, les différentes méthodes de dosage colorimétrique
que formé à chaud par l’acide sulfurique et le carbazol ou diben- des osamines et N-acétylosamines conjuguées nécessitent leur libé-
zopyrrole. ration préalable par une hydrolyse acide. La coloration est ensuite
développée sur l’osamine libre ou préalablement ré-N-acétylée sous
■ Mode opératoire : voir tableau 17. forme de N-acétylosamine.
■ Commentaires La méthode d’Elson et Morgan de dosage des osamines libres est
la plus couramment utilisée et son principe est décrit dans la
1. Osamines, N-acétylosamines et acides sialiques n’interfèrent figure 20.
pas dans la réaction.
2. Au contraire, les oses neutres donnent une coloration qui ■ Mode opératoire : voir tableau 18.
nécessite l’introduction d’un terme de correction tenant compte du ■ Commentaires
dosage colorimétrique des oses neutres par l’orcinol ou le phénol
sulfurique et qui se formule de la manière suivante : 1. Oses neutres, acides uroniques, acides aminés et peptides
n’interfèrent pas dans la réaction. Toutefois, certains auteurs préco-
xa Ð yd nisent d’extraire la coloration par l’alcool isoamylique.
--------------------- ¸ 1 000 = Q (mg/ml)
ca bd 2. Les liaisons glycosidiques des osamines sont très stables et les
------ Ð ------- conditions classiques de leur rupture sont très drastiques : HCl 4 N à
50 50
100 °C pendant 4 heures. Toutefois, la stabilité de ces liaisons varie
x = absorbance de 1 ml de la solution à doser avec le carbazol avec la structure même des saccharides, si bien qu’il est nécessaire
a = absorbance de 200 mg d’oses neutres donnée par l’orcinol sul- de rechercher les conditions optimales d’hydrolyse en utilisant des
furique solutions d’acide chlorhydrique variant de 2 à 6 N pendant des
temps allant de 2 à 10 h.
Tableau 17 – Dosage des acides uroniques

par la méthode au carbazol sulfurique CHO CH3 HO C C CO CH3
Réactifs : Solution de carbazol (0,1 g pour 100 ml d’éthanol H C NH2 C O C C CH3

NH
absolu), conservée à 4 °C et renouvelée tous les mois.
Solutions titrées d’acide glucuronique (50 mg p. ml) et de monosac- HO C H CH2 HO C H
charides neutres (200 mg p. ml). +
H C OH C O H C OH
Mode opératoire : Introduire dans des tubes à essais :
1. 1 ml de la solution à doser (ou une quantité de substance H C OH CH3 H C OH
accompagnée de 1 ml d’eau distillée) renfermant au maximum
100 m d’acide uronique. CH2OH CH2OH
2. Placer dans la glace et ajouter très lentement et sous agitation Glucosamine Acétylacétone 3-acétyl-2-méthyl
constante à l’aide d’un agitateur 6 ml d’acide sulfurique concentré. 5-tétrahydroxybutyl-pyrrole
Maintenir 20 min au bain-marie bouillant.
3. Refroidir rapidement et ajouter 0,2 ml de solution au carbazol.
H C C H
4. Après un séjour de 3 h à l’obscurité, les absorbances sont mesu-
rées à 530 nm. La coloration est stable 7 h. H C C CH3
NH
5. Introduire les solutions titrées témoins constituées par des solu- 2-méthyl-pyrrole
tions d’acide glucuronique et, éventuellement, d’oses neutres.
Figure 20 – Mécanisme de la réaction d’Elson-Morgan
6. Sensibilité : 2 à 10 mg d’acides uroniques dans un volume final
de 7,2 ml.
3. Comme dans le cas des oses neutres et des acides uroniques,

les absorbances varient avec la nature de l’osamine et le commen-
y = absorbance de 1 ml de la solution à doser donnée par l’orcinol taire no 4 du paragraphe 4.1.1 s’applique à ces composés.
sulfurique
d = absorbance de 200 mg d’oses neutres donnée par le carbazol
sulfurique
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
4.1.4 Dosage des acides sialiques présente est son manque de spécificité. La réaction, en effet, touche
non seulement les acides sialiques, mais aussi les acides désoxyri-
Le dosage colorimétrique des acides sialiques peut être effectué bonucléiques, le fructose, les acides uroniques et les oses neutres.
par deux types différents de procédés : le premier (méthode de Niazi Toutefois, dans le cas de ces deux derniers types de glucides, la sen-
et State) est applicable aux sialoconjugués natifs, tandis que le sibilité est très faible puisqu’elle est 50 fois inférieure à celle des aci-
second (méthode de Warren) nécessite l’hydrolyse préalable des des sialiques. En ce qui concerne le désoxyribose et le fructose, leur
liaisons sialosyl soit par voie chimique, soit par voie enzymatique. présence peut être détectée en traçant les courbes d’absorbance. En
effet, les longueurs d’onde d’absorption maximale sont de 610 nm
a) Dosage des acides sialiques conjugués pour le désoxyribose et de 530 nm et 640 nm pour le fructose et de
■ Principe : la méthode de Niazi et State est fondée sur l’emploi du 530 nm pour l’acide N-acétylneuraminique. Toutefois, la coexistence
réactif de Dische à la diphénylamine destinée à l’origine à doser les du fructose et des acides sialiques dans des saccharides est raris-
acides désoxyribonucléiques. Le mécanisme de la réaction passe sime.
par la formation d’un chromophore qui a été identifié au 2-désoxy- 2. Les protéines, les méthylpentoses et les hexosamines n’inter-
4-amino-octose et qui, se condensant avec la diphénylamine, déve- fèrent pas dans la coloration.
loppe une coloration bleu-violacée. 3. Les différents acides sialiques ne donnent pas, à quantités éga-
■ Mode opératoire : voir tableau 19. les, la même absorbance (absorbance molaire de l’acide N-
acétylneuraminique : 4040, de l’acide N-glycolylneuraminique :
■ Commentaires 3340) et le commentaire no 4 du paragraphe 4.11 s’applique à ces
1. Ce protocole, d’application simple et rapide, présente l’avan- composés.
tage de doser les acides sialiques totaux quelle que soit leur nature
N-acétylée, N-glycolylée et O-acétylée. L’inconvénient majeur qu’il
Tableau 18 – Dosage des osamines par la méthode d’Elson et Morgan

Réactifs : Acide chlorhydrique.
Solution préparée extemporanément d’acétylacétone (2 ml) dans une solution aqueuse de carbonate de sodium anhydre 0,625 M
(48 ml).
Solution à 1,6 g de p-diméthylaminobenzaldéhyde pour 30 ml d’HCl pur concentré (Réactif d’Ehrlich).
Solution titrée de glucosamine à 50 mg p.ml.
Mode opératoire
— Hydrolyse chlorhydrique. La glucosamine est libérée par chauffage à 100 °C pendant 4 h du composé en solution dans HCl 4N. Celui-ci est
éliminé par évaporation en exsiccateur pendant plusieurs jours et en présence de soude ou par neutralisation avec une solution de soude.
— Développement de la coloration. Introduire dans des tubes à essais :
1. 1 ml de solution à doser renfermant au maximum 50 mg de glucosamine ;
2. 1 ml de solution d’acétylacétone et 2 ml d’eau distillée.
3. Maintenir les tubes obturés par une bille de verre à 100 °C pendant 10 min. Refroidir, ajouter 5 ml d’éthanol et maintenir à 75 °C ± 2 °C pen-
dant 5 min.
4. Ajouter lentement 1 ml de réactif d’Ehrlich et porter à 75 °C pendant 30 min.
5. Refroidir. Ajouter 5 ml d’éthanol absolu et, après un séjour de 30 min à l’obscurité, mesurer les absorbances à 520 nm. La coloration est sta-
ble pendant 24 h à l’obscurité.
6. Sensibilité : 2 à 50 mg dans un volume final de 15 ml.
Tableau 19 – Dosage des acides sialiques conjugués totaux par la méthode à la diphénylamine
Réactifs :
— Solution de 1 g de diphénylamine pour 100 ml d’un mélange d’acide sulfurique et d’acide acétique (10 : 90, v/v) (réactif de Dische). Conser-
ver à 4 °C, à l’obscurité.
Avant usage, dissoudre les cristaux par un chauffage à 40 °C.
— Solution d’acide trichloracétique à 7,5 g p. 100 ml d’eau distillée.
— Solution titrée d’acide N-acétylneuraminique (100 mg p.ml).
Mode opératoire :
1. À 1 ml d’une solution d’oligosaccharides ou de glycoconjugués correspondant à 1-20 mg d’acide sialique, ajouter 2 ml d’acide trichloracéti-
que à 7,5 p. 100 et 6 ml de réactif de Dische.
2. Maintenir au bain-marie bouillant pendant 30 min.
3. Refroidir les tubes sous eau courante et mesurer l’absorbance à 530 nm après un séjour de 30 min à l’obscurité. La coloration est stable pen-
dant 6 heures.
4. Sensibilité : 1 à 20 mg pour un volume final de 9 ml.
Note : la diphénylamine est cancérigène !
______________________________________________________________________________________________________________________________________
b) Dosage des acides sialiques libres

■ Principe : le dosage des acides sialiques libres par la méthode de
Warren s’effectue en deux étapes : Tableau 20 – Dosage des acides sialiques libres
1) libération des acides sialiques soit par hydrolyse acide douce, par la méthode de Warren
en raison de la fragilité des liaisons cétosyl des acides sialiques et de
ces composés eux-mêmes, soit par hydrolyse enzymatique réalisée Réactifs :
A : dissoudre 4,278 g de métaperiodate de sodium dans 4 ml d’eau
avec des neuraminidases, distillée, ajouter 58 ml d’acide phosphorique concentré et complé-
2) formation d’un chromogène, l’acide formylpyruvique par oxy- ter à 100 ml avec de l’eau distillée.
dation périodique, puis d’un chromophore de coloration rose B : solution contenant 10 g d’arsénite de sodium et 7,1 g de sulfate
( lmax = 555 nm) par condensation avec l’acide 2-thiobarbiturique. de sodium pour 10 ml d’acide sulfurique 0,1 N.
C : solution contenant 0,6 g d’acide thiobarbiturique et 7,1 g de sul-
■ Mode opératoire : voir tableau 20. fate de sodium pour 100 ml d’eau distillée.
Le réactif est stable pendant 1 mois à 4 °C et à l’obscurité.
■ Commentaires D : cyclohexanone redistillée.
1. Les absorbances molaires varient avec la nature des acides sia- Mode opératoire :
liques.
Hydrolyse des liaisons sialosyl : L’hydrolyse des liaisons sialosyl
2. L’interférence principale est due au 2-désoxyribose dont l’oxy- est réalisée soit par l’acide formique, soit par l’acide trifluoroacéti-
dation périodique fournit du malonaldéhyde qui réagit avec l’acide que à pH 1,5 et à 80 °C pendant 30 à 60 min dans les deux cas.
thiobarbiturique. Le tracé des courbes d’absorption permet de déce- Après évaporation ou lyophilisation, le résidu sec est dissous dans
ler l’interférence : lmax = 532 nm pour le 2-désoxyribose et 555 nm une quantité déterminée d’eau distillée.
pour l’acide N-acétylneuraminique. Développement de la coloration : Introduire dans des tubes à
3. En raison de la grande labilité des acides sialiques vis-à-vis de essais :
l’acide chlorhydrique, l’hydrolyse chimique doit être effectuée par 1. 0,2 ml de la solution contenant 1 à 10 mg d’acide sialique et
des acides sulfurique, formique ou acétique. 0,1 ml du réactif A.
4. Il est recommandé de purifier les acides sialiques libérés par
2. Maintenir à la température de la pièce pendant 20 min.
une chromatographie préalable sur une résine échangeuse d’anions
conformément au protocole suivant : l’hydrolysat (5 ml contenant 5 3. Éliminer l’excès de periodate en ajoutant 1 ml de réactif B.
à 25 mg d’acide sialique) est passé sur une colonne (0,7 x 6 cm) de
4. Après 5 min de repos à température ambiante, ajouter 3 ml de
Dowex 2 x 8 (200-400 mesh, forme acétate). Après lavage avec 5 ml réactif C et placer les tubes obturés avec une bille de verre pendant
d’eau distillée, les acides sialiques sont déplacés avec 8 à 10 ml 15 min au bain-marie bouillant.
d’une solution d’acétate de sodium 1 M et d’acide acétique 1 M ajus-
tée à pH 4,6. L’éluat est complété à 10 ml et les acides sialiques sont 5. Refroidir et extraire la coloration par agitation vigoureuse en
dosés conformément au protocole décrit dans le tableau 20. présence de 3 ml de réactif D.
5. L’hydrolyse enzymatique doit être utilisée avec la plus grande 6. La phase colorée est séparée par centrifugation et les mesures
prudence. En effet, les neuraminidases sont généralement peu acti- d’absorbance sont effectuées à 549 nm. La coloration est stable
pendant plusieurs heures à l’obscurité.
ves sur les acides sialiques N-glycolylés et inactives sur les acides
sialiques O-acétylés. 7. Sensibilité : 0,5 à 25 mg d’acide sialique pour un volume final de
3 ml de cyclohexanone.
4.2 Détermination de la composition

molaire en monosaccharides
La composition molaire d’un oligo- ou d’un polysaccharide néces-

site la coupure préalable des liaisons glycosidiques en vue de libérer
quantitativement les monosaccharides sans les détruire. Or, les
méthodes d’hydrolyse par les acides dilués autrefois utilisées ne
permettaient pas de remplir ces conditions en raison des différences
très importantes de stabilité des liaisons glycosidiques vis-à-vis des
acides et qui varient avec la nature des monosaccharides. Le
tableau 22 est, à cet égard, démonstratif. C’est pourquoi, les auteurs
se sont tournés vers la méthanolyse qui, en un temps, libère quanti-
tativement les monosaccharides, y compris les acides sialiques et
les acides uroniques et sous la forme stable d’a et/ou de b-méthyl-
glycosides. Ceux-ci sont, dans un second temps, triméthylsilylés en
vue, à la fois, de les stabiliser et de les rendre plus volatils. Les tri-
méthylsilylméthylglycosides sont ensuite identifiés par chromato-
graphie en phase gazeuse éventuellement couplée à la
spectrométrie de masse et dosés. La figure 21 illustre les différentes
étapes de ce mode opératoire et le tableau 21 en précise le proto-
cole.
■ Commentaires
1. La méthanolyse doit être effectuée dans des conditions anhy-
dres totales sous peine de réaliser une hydrolyse destructrice. Ces
conditions touchent non seulement le méthanol - chlorhydrique
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
(attention aux pipettes de prélèvement humides) mais aussi les

échantillons analysés.
CH2OH CH2OH
O
O O
O
O
OH OH OH OH
Méthanolyse
CH2OH CH2OH
O O
O OCH3 + OCH3
OH
OH OH OH OH
Triméthylsilylation
CH2OTMS CH2OTMS
O O
OCH3 + OCH3
SMTO SMTO
OTMS OTMS OTMS OTMS
GLC ou GLC-MS
TMS : groupement triméthylsilyl
Figure 21 – Méthanolyse des oligosaccharides et triméthylsilylation

des méthylglycosides
2. Les N-acétylhexosamines sont libérées sous la forme N-désacé-

tylée de méthylhexosamines.
3. Dans les conditions de méthanolyse utilisées, la liaison GlcNAc-
Asn des N-glycosylprotéines, très résistante, n’est coupée que dans
une faible proportion (10 p. 100 environ). En outre, la glucosamine
est libérée sous forme de glucosamine libre et non de méthylgluco-
saminide.
4. Un témoin interne de référence (méso-inositol et/ou mannitol)
est introduit dans le milieu réactionnel.
5. Détermination
de la structure primaire
Quand la composition molaire en oses des oligo- et polysacchari-
des est obtenue, se posent les questions suivantes :
1. Dans quel ordre les différents monosaccharides vont-ils se
conjuguer ?
2. Pour un ose donné, quelle est la nature a ou b de la liaison gly-
cosidique qui l’associe à son partenaire monosaccharidique ?
3. En quelle(s) position(s) est substitué son squelette carboné par
un ou plusieurs monosaccharides ?
La réponse à ces questions est apportée par l’application de pro-
cédés chimiques, physiques ou enzymatiques, utilisés seuls ou en
association. Rappelons, en outre, que les lectines peuvent apporter
des renseignements précieux sur la structure primaire des glycosi-
des (voir 3.1.3), sans toutefois être capables, à elles seules, de préci-
ser la structure primaire complète d’un oligosaccharide.
______________________________________________________________________________________________________________________________________
Tableau 21 – Protocole de méthanolyse des oligo- et polysaccharides

Préparation des réactifs
A : Méthanol chlorhydrique. Ébullition à reflux de méthanol (500 ml) pendant 1 heure en présence de copeaux de magnésium (2,5 g) et d’iode
(0,1 g). Distiller et conserver à l’abri de l’eau. Faire passer bulle à bulle dans le méthanol anhydre de l’acide chlorhydrique gazeux déshydraté
par passage dans de l’acide sulfurique concentré. L’acide chlorhydrique est produit en faisant tomber goutte à goutte 500 ml d’acide sulfurique
sur 250 g de NaCl. Titrer le méthanol chlorhydrique avec de la soude 0,1 M en présence de phénolphtaléine et l’amener par dilution avec du
méthanol anhydre pour obtenir une concentration en HCl de 0,5 M.
B : Réactif de triméthylsilylation. Le réactif de triméthylsilylation est le BSTFA - 1 % TMCS (N,O-bis (triméthylsilyl) trifluoroacétamide - 1 % tri-
méthylchlorosilane) obtenu de la Société Merck.
Protocole :
1. Des quantités de substances correspondant à environ 1 à 5 mg de glucides totaux, placées dans des tubes à réaction à capuchon en Teflon,
sont additionnées de 2 mg de méso-inositol et/ou de mannitol (solutions stock à 100 mg/ml). Les solutions sont ensuite soigneusement lyophi-
lisées.
2. L’hydrolyse acide est réalisée par addition de 200 ml de méthanol chlorhydrique 0,5 M suivie d’un chauffage à 80 °C durant 24 h.
3. Dans le cas d’échantillons glycoprotéiniques, les acides aminés sont éliminés par 3 extractions successives de la phase méthanolique par
500 ml d’heptane redistillé.
4. Après extraction, le méthanol chlorhydrique est neutralisé par addition d’une pointe de spatule de nitrate d’argent.
5. Ajouter 50 ml d’anhydride acétique. La N-réacétylation est effectuée toute la nuit à température ambiante et à l’obscurité.
6. Après centrifugation, le surnageant est transféré dans un micro-tube réalisé à partir d’une pipette Pasteur scellée à son extrémité ; ce micro-
tube est placé dans un tube à réaction comme précédemment et le méthanol est évaporé sous courant d’azote.
7. Le résidu sec est repris par 20 ml de pyridine anhydre et par 20 ml de réactif de silylation.
8. La silylation est réalisée à température ambiante durant une nuit.
Chromatographie en phase gazeuse :
1. L’analyse en phase gazeuse est effectuée sur des volumes de 10 ml de la solution précédente dans les conditions suivantes :
2. colonne capillaire (25 m x 0,33 mm de Æ int., film de 0,5 mm de phase de type OV-101 méthyl silicone, marque SGE, BP1),
3. injecteur type Ross (injecteur évaporateur à aiguille),
4. chromatographe Varian model 3400 équipé d’un détecteur par ionisation de flamme,
5. gaz vecteur : hélium (pression 10 psi),
6. température du four programmée de 120 à 240 °C (2 °C/min),
7. température de l’injecteur : 245 °C et du détecteur : 245 °C.
5.1 Procédés chimiques lequel les glucides sont labiles, la fonction terminale réductrice des
oligosaccharides libres doit être préalablement réduite pour con-
duire à un oligosaccharide-alditols. Au contraire, les N-glycopepti-
5.1.1 Coupures partielles des, stables en milieu alcalin, peuvent être directement méthylés ;
— méthanolyse des glucides perméthylés destinée à libérer sous
forme de méthylglycosides les monosaccharides partiellement
Il est parfois nécessaire de fragmenter préalablement un oligo- ou méthylés. Tous les monosaccharides, y compris les acides sialiques
un polysaccharide en effectuant d’une manière ménagée des coupu- qui sont cependant particulièrement fragiles, sont quantitativement
res plus ou moins sélectives de quelques liaisons glycosidiques. On libérés par la méthanolyse ;
obtient ainsi des mélanges d’oligosaccharides de faible masse — identification et dosage des O-méthyl méthylglycosides par
moléculaire dont la détermination plus aisée de la structure primaire chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de
permet ensuite de reconstituer le puzzle. masse.
Certaines méthodes réalisent des coupures préférentielles, mais
non-spécifiques, de liaisons glycosidiques particulières : les liaisons 5.1.2.2 Mode opératoire
des résidus N-acétylglucosaminyles sont coupées par hydrolyse sul-
furique ménagée (H2SO4 0,5 N, 100 °C, pendant 15 à 60 min) et les a) Perméthylation
liaisons 1,6-glycosidiques sont coupées par acétolyse (anhydride Les méthodes originelles de Purdie et Irvine (iodure de méthyl-
acétique/acide acétique/H2SO4 10 : 10 : 1 v/v/v ; 40 °C pendant 16 h). oxyde d’argent) et de Hayworth (sulfate de méthyl-soude) ont été
Au contraire, l’hydrazinolyse suivie de la désamination nitreuse des remplacées au fil du temps par des procédés dits « aux carbanions »
groupements NH2 de la glucosamine coupe spécifiquement les à la fois plus doux et plus efficaces dans leur attaque nucléophile :
liaisons glycosidiques de cette dernière. diméthylsulfoxyde (DMSO) - hydrure de sodium, tert-butoxyde de
potassium ou plus simplement DMSO - NaOH.
Nous nous limiterons à la description de ce dernier procédé
5.1.2 Méthode de perméthylation des glycosides (tableau 23).
5.1.2.1 Principe
La méthode comprend 3 étapes :
— perméthylation destinée à transformer toutes les fonctions
alcooliques libres en groupements méthoxy ( COCH 3 ) très stables.
La réaction de perméthylation s’effectuant en milieu basique dans
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
Tableau 22 – Conditions d’hydrolyse quantitative des liaisons glycosidiques des monosaccharides (1)
Conditions d’hydrolyse Nature des monosaccharides
Monosaccharides neutres
Cétoses (2) Aldoses Hexosamines Acides uroniques
H2SO4 0,01 N ; 100 °C ; 1 h Q P N N
H2SO4 2 N ; 100 °C ; 2 h D Q P Q
ATFA (3) 4 M ; 100 °C ; 4 h D Q Q P
HCl 4N ; 100 °C ; 4 h D D Q D
(1) Q : hydrolyse quantitative, P : partielle ; N : nulle ; D : destruction des monosaccharides
(2) incluant les acides sialiques
(3) ATFA : acide trifluoroacétique
Tableau 23 – Perméthylation des oligo- et polysaccharides par la méthode à la soude dans le diméthylsulfoxyde
1. La soude est conservée sous atmosphère d’argon dans un dessicateur à P2O5 afin d’éviter toute trace d’humidité. D’une manière générale,
toutes les étapes de la réaction seront réalisées sous atmosphère d’argon.
2. Dissoudre 10 à 100 mg d’oligosaccharide réduit dans 300 ml de diméthylsulfoxyde distillé. L’échantillon est placé dans un petit tube de verre
(6 x 80 mm), lui-même placé au fond d’un tube réactionnel à capuchon en Teflon.
3. La solubilisation est facilitée par ultrasonage à 20 °C pendant 1/2 h.
4. 20 mg de soude, préalablement pulvérisée au mortier, et 100 ml d’iodure de méthyle sont alors ajoutés. Le tube est saturé d’argon et placé
2 h au bain ultrasonique à température ambiante.
5. La méthylation est stoppée par addition de 0,5 ml d’H2O contenant 5 mg de thiosulfate de sodium (pour éliminer l’iode en excès).
6. L’oligosaccharide méthylé est extrait par addition répétée (3 fois) de chloroforme (0,5 ml). Les solutions chloroformiques sont rassemblées.
7. La solution chloroformique est lavée 5 fois avec 1 ml d’eau, séchée par addition de sulfate anhydre de sodium (1 pointe de spatule), filtrée
et évaporée sous courant d’azote.
Les oligosaccharide-alditols perméthylés sont caractérisés par

leur temps de rétention en chromatographie en phase gazeuse. Le
couplage à la spectrométrie de masse permet leur identification.
Tableau 24 – Méthanolyse
des oligosaccharide-alditols perméthylés
1. Dissoudre 1 à 10 mg de dérivés perméthylés dans 150 ml de 5.2 Procédés physiques
méthanol chlorhydrique 0,5 M et maintenir à 80 °C pendant 24 h
dans un tube en verre (6 x 80 mm) placé dans un tube
(13 x 100 mm) tapissé de Teflon et obturé par un bouchon à vis en
Teflon. 5.2.1 Spectrométrie de masse
2. Éliminer le méthanol chlorhydrique sous courant d’azote.
La spectrométrie de masse qui a révélé son efficacité dans l’ana-
3. O-acétyler dans le même tube les méthylglycosides perméthylés lyse des monosaccharides substitués, O-méthylés en particulier, est
avec 40 ml de pyridine/anhydride acétique (1 : 1, v/v) à 37 °C pen- devenue un outil indispensable pour explorer la structure primaire
dant 24 h. des oligosaccharides grâce aux perfectionnements qu’elle a connus
4. Éliminer le réactif sous courant d’azote. et à l’apparition de la méthode de bombardement par atomes rapi-
des (Fast Atom Bombardment-Mass Spectrometry ou FAB-MS).
5. Dissoudre les perméthyl-glycosides O-acétylés dans du métha-
nol et analyser par chromatographie en phase gazeuse associée à Plus récemment, deux nouveaux modes d’ionisation ont été
la spectrométrie de masse. introduits : la technique d’ionisation par désorption laser associée
au « temps de vol » (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation -
Time of Flight Mass Spectrometry ou MALDI-TF-MS) et l’électros-
pray (ES) qui permettent la mesure de masses moléculaires très éle-
b) Méthanolyse des oligosaccharide-alditols perméthylés vées sur des composés de polarité très variée.
Le protocole expérimental est décrit dans le tableau 24. On notera
que la méthanolyse est suivie de l’O-acétylation des fonctions alcoo- 5.2.1.1 FAB-MS
liques libres afin d’augmenter le pouvoir de résolution de la chroma-
tographie en phase gazeuse et de la spectrométrie de masse. ■ Principe : La FAB-MS est fondée sur le bombardement d’oligosac-
charides natifs ou substitués par O-méthylation ou O-acétylation, en
c) Analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectromé- solution dans une matrice visqueuse, par un faisceau d’atomes
trie de masse des méthylglycosides des monosaccharides méthylés d’argon ou de xénon. Les spectres de masse présentent des ions
et acétylés
______________________________________________________________________________________________________________________________________
pseudomoléculaires formés par différentes voies : [M - H]- par Le protocole expérimental que nous décrivons ci-dessous ne con-
perte de proton ; [M + H]+ par conjugaison de proton ; [M + Cl]- par cerne que les oligosaccharides d’une masse moléculaire inférieure à
conjugaison d’un anion ; [M + Na]+ ou [M + NH4]+ par conjugaison 5 000 Da préalablement O-méthylés par l’application du procédé de
d’un cation. perméthylation décrit en 5.122 a.
624 828 1 247

402 1 229
812 1 016 1 435 1 640
1 482 652
1 496 858
235
Gal O GlcNAc O Gal O GlcNAc O Gal O Glc ol
1 686 1 686 1 686
Fuc O Fuc O Fuc O
189 189 189
+ +
R O Gal O GlcNAc R O Gal O GlcNAc
Fuc O OH
812 624
m/z m/z
1 435 1 247
Relat. int. (%)

100 x 16
157
624
80 812
189
60 798
828
40 402
235 652
858
20 1 016
0
180 360 540 720 900 1 080
m/z
Relat. int. (%)
100 x 48
80
1 247 1 891
1 435
60 1 229 1 640
1 421 1 482
40
1 686
20
0
1 080 1 260 1 440 1 620 1 800 1 980 Figure 22 – Spectre de FAB-MS
d’un hexasaccharide alditol fucosylé isolé
m/z
du lait de femme
■ Choix de la matrice : le meilleur support d’échantillons est le thio- divers incréments de masse permettent d’accéder à la connaissance
glycérol ou le mélange thioglycérol/glycérol (1 : 1) quand il s’agit de la structure primaire de l’oligosaccharide.
d’accumuler ou d’obtenir des spectres MS/MS (Spectrométrie de
masse en tandem). 5.2.1.2 Électrospray
■ Préparation de l’échantillon : après avoir déposé sur la cible 1 à Dans cette technique, la production d’ions multichargés rend pos-
2 ml de la matrice choisie, déposer sur celle-ci 0,5 à 1 ml de la solution sible l’analyse de composés de masses moléculaires élevées (plus
méthanolique de O-méthyl-oligosaccharide à la concentration de 1 à de 100 000 Da) par abaissement « artificiel» du rapport m/z (masse/
5 mg par ml qui convient parfaitement pour des masses moléculaires charge). Ces ions multichargés sont produits par la désorption
variant de 500 à 3 000 Da. d’ions à partir d’une phase liquide. Au cours de ce processus, des
ions sont émis directement dans la phase gazeuse à partir de gout-
■ Résultats : la figure 22 donne un exemple de spectre obtenu avec
telettes électriquement très chargées.
un oligosaccharide fucosylé du lait de femme préalablement réduit,
puis méthylé. La présence de fragments caractéristiques et les
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
5.2.1.3 MALDI-TF-MS
La technique de spectrométrie de masse par ionisation par
désorption laser associée à la méthode dite du « temps de vol » est 16 T3 T3 T3 T3
décrite en détails dans la revue générale de Hillenkamp et Karas 15
(Methods in Enzymology, V. Ginsburg. ed, 193, p. 280-295, Acade- 14
mic Press, 1990), à laquelle nous renvoyons le lecteur. Sa grande T3
13 T3
sensibilité et sa rapidité, associées au fait qu’elle est applicable à des
mélanges d’oligosaccharides, font que la MALDI-TF-MS prendra 12
une place de plus en plus importante dans la détermination de la T3
11
séquence des oligosaccharides, associée à la FAB-MS. Un exemple
10 T3
de spectre obtenu par cette méthodologie est donné dans la
figure 23. 9 T3
8
■ Principe : l’énergie pour désorber les échantillons de la matrice
est apportée par un rayonnement laser. Le calcul de la masse molé- 7 T3
T3
culaire est obtenu par la conversion du temps de vol en rapport m/z 6
après calibration de l’appareil par une substance de référence. 5
■ Les avantages de cette méthode reposent notamment sur sa 4
gamme de masse (analysable jusqu’à plus de 200 000 Da) et sa
grande sensibilité, de l’ordre de la picomole et moins. 2 000 3 000 4 000 5 000
Masse (m /z )
5.2.2 RMN (résonance magnétique nucléaire) En abcisses : (m /z ) masse / charge
La méthode de détermination de la structure primaire des oligo- En ordonnées : intensités relatives des pics obtenus
saccharides par RMN du proton a été mise au point en 1977 grâce à
une collaboration établie entre notre laboratoire et celui du profes- La spectrométrie de masse ne fournit aucune information concernant les
seur J.F.G. Vliegenthart à Utrecht. Elle permet de déterminer la anoméries a et b des liaisons glycosidiques. Celles-ci ne peuvent être
structure primaire complète, incluant la définition des anoméries a précisées qu'en utilisant des a– et b– glycosidases ou la RMN.
et b des liaisons glycosidiques, libérant ainsi l’expérimentateur de la
servitude de l’utilisation des glycosidases et de l’application de la Figure 23 – Analyse par MALDI-TF-MS de glycopeptides désialylés
méthode de perméthylation. En outre, l’analyse en RMN n’est pas obtenus par protéolyse d’une glycoprotéine contenant 11 glycannes
destructrice et les échantillons sont récupérables. différents : ■ N-acétylglucosamine, ● : mannose ; ▼ : galactose ;
✩ : fucose. T3 : tripeptide
Toutefois, la méthode présente les inconvénients suivants qui en
limitent l’application :
— la sensibilité est faible et des quantités appréciables de maté-
riel glucidique, 1 à 5 micromoles, sont nécessaires ; de simplifier les spectres par remplacement des protons des fonc-
— la comparaison des spectres fournis par un glucide avec ceux tions OH et NH par du deutérium.
qui sont décrits dans la littérature ou dans des banques de données Les résultats sont exprimés en ppm par rapport à l’acétone utili-
ne permet d’identifier une molécule nouvelle que dans la mesure où sée comme témoin interne et dont le glissement chimique d est de
elle s’apparente à une famille homologue de structures déjà déter- 2,225 ppm.
minées. Dans le cas contraire, la nouvelle structure devra être déter- Les appareils de RMN doivent atteindre des champs magnétiques
minée par l’application de tout ou partie des procédés décrits dans intenses à des fréquences radio de 300 MHz au moins.
le présent article, y inclus la spectrométrie de masse.
Nous nous limiterons à l’étude des glycannes de N-glycosylpro- ■ Mode opératoire
téines pris comme exemple. Les oligosaccharides ou les glycannes libérés en oligosacchari-
dealditols, sont dissous dans une petite quantité (0,5 à 1 ml) d’eau
■ Principe de la méthode lourde et la solution est maintenue à température ambiante pendant
L’analyse des structures glucidiques consiste à étudier les dépla- 6 à 8 h avant d’être lyophilisée. Ce traitement est répété 2 à 3 fois. Le
cements chimiques de quelques signaux bien individualisés sur les résidu sec est dissous dans 0,5 ml de D2O et la solution, éventuelle-
spectres appelés, dans la terminologie anglaise « structural-reporter ment filtrée et centrifugée, est transférée dans un tube RMN de
groups ». Ils sont distincts de la majorité des protons du squelette 5 mm, après addition de 1 à 10 ml d’acétone et vérification du pH qui
carboné des monosaccharides qui résonnent entre d = 3,5 et doit se situer entre 6 et 8.
3,9 ppm et qui font partie de la région appelée « bulk-region ». Les spectres sont enregistrés à l’aide de spectromètres de RMN
Les « structural-reporter groups » les plus importants sont les de 300 à 600 MHz.
suivants :
■ Résultats
— protons anomériques,
— groupes méthyle, acétyle, glycolyle, Un exemple de spectre, celui d’un sialo-décasaccharide prove-
— protons des carbones 2, 3, 4 et 5 du N-acétylgalactosaminitol, nant de l’urine d’un patient atteint de sialidose, maladie génétique
— proton du carbone 3 des acides sialiques, due à un déficit en neuraminidase, est donné dans la figure 24. Il
— proton du carbone 2 du mannose, montre qu’il est possible de discriminer et de localiser les deux
— proton du carbone 4 du galactose, types de liaisons a-2,3 et a-2,6 de l’acide N-acétylneuraminique, ce
— protons des carbones 5 et 6 du fucose, que ne pourraient réaliser les neuraminidases actives sur les deux
— protons des carbones de la « bulk region » sous l’influence types de liaisons.
d’une liaison glycosidique ou d’une substitution par des groupe- L’analyse du spectre permet de distinguer 5 zones : celles des pro-
ments acylés, sulfurylés ou phosphorylés. tons anomériques de tous les monosaccharides (de 4,4 à 5,2), des
Pour éviter l’interférence des protons de l’eau, les échantillons protons H-2 et H-3 des résidus de mannose (4,1 à 4,3), des protons
sont dissous dans de l’eau lourde D2O qui offre, en outre, l’avantage H-3 équatoriaux des résidus d’acide N-acétylneuraminique (2,65 à
______________________________________________________________________________________________________________________________________
2,8), des protons des groupements acétamido des résidus de N-acé- 5.3 Procédés enzymatiques
tylglucosamine et d’acide N-acétylneuraminique (2 à 2,1), et des
protons H-3 axiaux des résidus d’acide N-acétylneuraminique.
Nous avons défini en 3.2.2 les glycosidases et distingué deux
catégories de ces enzymes suivant qu’ils libèrent des monosaccha-
rides en s’attaquant à l’extrémité non-réductrice des chaînes glyco-
Tableau 25 – Procédé général d’hydrolyse sidiques (exoglycosidases) ou en coupant des liaisons
récurrente des oligo- et polysaccharides glycosidiques intramoléculaires et libérant ainsi des oligosacchari-
par des exoglycosidases des (endoglycosidases). Les modalités diverses de l’action de ces
dernières ont été définies et leur emploi permet de libérer des frag-
1. Dissoudre 1 à 20 nM de saccharide dans 50 ml d’un tampon ments oligosaccharidiques dont la structure primaire peut être
approprié et ajouter la glycosidase choisie pour sa spécificité. déterminée dans un second temps. Ces enzymes n’apportent toute-
Ajouter une trace de toluène pour inhiber la croissance des fois que des informations très limitées sur la structure primaire des
microorganismes.
oligo- et polysaccharides, contrairement aux exoglycosidases qui,
2. Incuber à 37 °C pendant 20 h. en réalisant une dégradation récurrente des chaînes glycosidiques,
permettent, non seulement, de déterminer si l’hydrolyse des oligo-
3. Arrêter l’action de l’enzyme par chauffage au bain-marie
bouillant pendant 1 min. Dessaler par passage sur des microcolon- saccharides est totale et de définir la structure primaire de ces der-
nes (0,5 x 5 cm) montées en tandem d’un échangeur de cations niers, mais aussi de définir les anoméries a et b de la liaison de
(Dowex 50 x 8,25-50 mesh, forme H+) puis d’anions (Dowex chaque monosaccharide conjugué.
1 x 8,25-50 mesh, forme COO-).
4. Évaporer l’effluent à siccité sous vide et identifier les monosac-
charides par chromatographie en phase gazeuse.
a-NeuAc-(2-6)-b-Gal-(1-4)-b-GlcNAc-(1-2)-a-Man-(1-3)
6 5 4
b-Man-(1-4)-GlcNAc
3 2
a-NeuAc-(2-3)-b-Gal-(1-4)-b-GlcNAc-(1-2)-a-Man-(1-6) Man H-2 atome
6' 5' 4'
H-3
Protons anomériques 6'
6'
2a 5 5' 6
4'a 3a
4 4'b
2b 3a 4
3b
3b
HOD
4'
5,2 ppm 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2
NAc - CH3 protons

NeuAc
H – 3e
5 atome
H – 3e N6
atome
N3
N3 N6
2a 5'a
2b 5'
2,8 2,6 2,2 2,0 1,8
Figure 24 – Spectre RMN des protons d’un sialodécasaccharide montrant qu’il est possible de distinguer et de localiser sur les antennes les
résidus d’acide sialique liés en a-2,3 ou en a-2,6. Les chiffres se rapportent à la numérotation des monosaccharides constituant le saccharide.
HOD : eau deutériée N3, N6 : résidus d’acide sialique conjugués en a-2,3 et en a-2,6, respectivement sur les résidus terminaux de b-galactose
_____________________________________________________________________________________________________________________________________
5.3.1 Hydrolyse séquentielle d’oligosaccharides

par des exoglycosidases
Le tableau 25 décrit un procédé général d’hydrolyse de glycosi-

des par des exoglycosidases.
5.3.2 Identification des monosaccharides libérés

et du saccharide résiduel
La masse moléculaire de l’oligosaccharide résiduel diminuant

d’une unité monosaccharidique, la libération séquentielle des
sucres est suivie par chromatographie de tamisage moléculaire.
P
O
U
Analyse des glucides R
et des glycoprotéines
E
N
par Jean MONTREUIL
et
Professeur émérite ; docteur ès Sciences
André VERBERT
S
Professeur ; docteur ès Sciences
Laboratoire de chimie biologique
A
Unité mixte de recherche no 111 CNRS. Université des sciences et technologies de Lille
V
O
Bibliographie I
CHAPLIN (M.F.) et KENNEDY (J.F.). – Carbohydrate
Analysis. A practical approach, IRL Press,
HOUNSELL (E.). – Glycoprotein analysis in Biome-
dicine. In J. Walker (ed), Methods in molecular
VERBERT (A.). – Methods on Glycoconjugates. A
Laboratory manual, Harwood Academic, Chur
R
Oxford, 1994. biology, Humana Press, Totowa (N.J.), 1993. (CH), 1995.
DUMITRIU (S.). – Polysaccharides in Medicinal MONTREUIL (J.), VLIEGENTHART (J.F.G.) et WIEGANDT (H.). – Glycolipids. In A. Neuberger and
Applications, Marcel Dekker, New York, 1996. SCHACHTER (H.). – Glycoproteins, Comprehen- L.L.M. van Deenen, Comprehensive Biochemis-
sive Biochemistry, vol. 29a (1995) and vol. 29b
(1997), Elsevier, Amsterdam.
try, vol. 10, pp. 1-188, Elsevier, Amsterdam,
1985. P
L
U
S
Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie

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Analyse des glucides

par Jean MONTREUIL

1. Monosaccharides ...................................................................................... PE 3320 - 2

L es glucides, encore appelés sucres ou hydrates de carbone, représentent,

1. Monosaccharides l’isomérie D-L qui s’exprime en orientant conventionnellement

1.2 Propriétés physico-chimiques 2. Glycosides

CH2OH CHO CHO

HO C H H C OH HO C OH Parmi les oligosaccharides réducteurs, nous citerons le maltose

H C OH H C OH Les polysaccharides sont formés par condensation d’un grand

Formules cycliques Formules cycliques Figure 2 – Passage du D-glucose de la forme

CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH

CH2OH CH2OH CH2 CH2OH CH2OH CH2OH CH2 CH2OH

Figure 3 – Structure de l’amylopectine

les cellules cancéreuses avec deux conséquences : la diffusion

2.2.1 Importance biologique des glycoconjugués

Ils ont été longtemps négligés ou ignorés, en raison même de la

2.2.2.3 Structure des O-glycannes

Gal(b1-3) GalNAc(a1-3) Ser / Thr B

Figure 8 – Exemple de structure d’un glycanne

Figure 9 – Exemple de structure d’un N-glycanne de type

(D) Gal(b1-4) GlcNAc(b1-6)

Figure 11 – Exemples de glycannes

3. Procédés d’isolement 3.1 Isolement des glycoprotéines

glycoprotéine recherchée est désorbée par des solutions salines à

R-Gal(b1-4) GlcNAc(b1-3) Gal(b1-4) Glc(b1-1) Cer B

La description détaillée des très nombreuses et très diverses

3.1.1.1 Méthodes de relargage

3.1.1.2 Méthodes de chromatographie d’immuno-affinité

NeuAc(a2-3) Gal(b1-4) GlcNAc(b1-2) Man(a1-6)

Tableau 3 – Préparation de colonnes de lectines immobilisées

Tableau 4 – Chromatographie d’affinité

3.2.1 Méthodes chimiques

3.2.1.2 Coupure alcaline

FNR FR FNR FR FNR

: NeuAc : Gal : Man : GlcNAc : Fuc

Tableau 5 – Exemple d’hydrazinolyse d’une N-glycosylprotéine

2 chromatographie de tamisage moléculaire sur colonne de Bio-

3.2.2.1 Coupure par les peptide-N-glycosidases

— chromatographie en phase réverse,

5. puis par un gradient isocratique du même solvant (20 min). CH2OH

3.3.4 Chromatographie sur Dionex-HPAE Nous utilisons couramment au laboratoire la pyridylamination

4.1 Détermination de la composition

CHOH CHOH CHOH CHOH

R C H CHOH CHO R C H C CHOH

4.1.2 Dosage des acides uroniques 4.1.3 Dosage des osamines

Tableau 17 – Dosage des acides uroniques

Réactifs : Solution de carbazol (0,1 g pour 100 ml d’éthanol H C NH2 C O C C CH3

3. Comme dans le cas des oses neutres et des acides uroniques,

Tableau 18 – Dosage des osamines par la méthode d’Elson et Morgan

b) Dosage des acides sialiques libres

4.2 Détermination de la composition

La composition molaire d’un oligo- ou d’un polysaccharide néces-

(attention aux pipettes de prélèvement humides) mais aussi les

TMS : groupement triméthylsilyl

Figure 21 – Méthanolyse des oligosaccharides et triméthylsilylation

2. Les N-acétylhexosamines sont libérées sous la forme N-désacé-

Tableau 21 – Protocole de méthanolyse des oligo- et polysaccharides

Les oligosaccharide-alditols perméthylés sont caractérisés par

624 828 1 247

Relat. int. (%)

5.2.2 RMN (résonance magnétique nucléaire) En abcisses : (m /z ) masse / charge

5,2 ppm 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2

NAc - CH3 protons

2,8 2,6 2,2 2,0 1,8