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Analyse des corps gras

par Michel OLLÉ


Direction générale de la concurrence, de la consommation
et de la répression des fraudes
Laboratoire interrégional de Montpellier

1. Extraction de la matière grasse ........................................................... P 3 325 - 2


2. Détermination des caractères physiques.......................................... — 2
3. Détermination des constituants majeurs ......................................... — 4
4. Détermination des constituants mineurs ......................................... — 11
5. Mesure de l’altération............................................................................. — 13
6. Mise en évidence des adultérations ................................................... — 15
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 3 325

i l’on s’en réfère à la définition donnée par le Comité français d’accréditation


S (COFRAC) du terme corps gras, il s’agit « d’une substance naturelle ou éla-
borée, d’origine animale ou végétale, contenant principalement des
triglycérides ».
Les corps gras sont des mélanges complexes constitués en masse de :
— 97 à 99 % de triglycérides ou acylglycérols ;
— 1 à 2 % d’acides gras libres, de phospholipides, mono et diglycérides ;
— 0,5 à 1 % de composés mineurs : colorants, hydrocarbures, stérols, vitami-
nes, alcools.
Souvent définis par leur solubilité dans les solvants organiques, les corps gras
constituent le groupe des lipides.
Les lipides constituent un groupe plus hétérogène que les glucides et les pro-
téines et sont classés généralement en :
— lipides simples, constitués de C, H, O ;
— lipides complexes, constitués de C, H, O, S, P, N.
Les lipides peuvent de plus s’associer à certains autres constituants tels que
les protéines ou les glucides.
Les lipides ont un dénominateur commun : l’existence d’une ou plusieurs
molécules d’acides gras estérifiant un alcool, le glycérol, pour former les trigly-
cérides ou acylglycérols.
Les corps gras sont sur le plan nutritionnel les éléments ayant la valeur
énergétique la plus élevée :
1 g de corps gras = 9 kcal = 37,6 kJ
Il n’existe pas de corps gras à l’état naturel.
Le premier stade de l’analyse consistera à extraire le corps gras de son sup-
port, végétal ou animal, ou bien encore d’un produit alimentaire (chocolat,
pâtisserie, fromage) ou bien d’un produit d’entretien ou cosmétique.

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ANALYSE DES CORPS GRAS ______________________________________________________________________________________________________________

1. Extraction de la matière Le type d’extraction est fonction de la matrice utilisée.


Exemples
grasse Lait
— NF V 04-215 : hydrolyse par HCl 12 N à 80 ˚C, puis extraction
(Soxlhet, BBS) par oxyde diéthylique ;
L’extraction des corps gras a le plus souvent un double objectif : — NF EN ISO 1211 : hydrolyse NH4OH-éthanol (Rose-Gottlieb) puis
extraction par éther de pétrole.
— le dosage de la matière grasse ;
Viande
— l’analyse de la matière grasse extraite. — NF V 04-402 (matière grasse totale) : hydrolyse par HCl 4 N à
100 ˚C puis extraction par hexane ou éther de pétrole ;
Elle doit donc être totale et ne pas modifier la nature de la matière
— NF V 04-403 (matière grasse libre) : séchage sur Na2SO4 anhydre
grasse.
puis extraction par éther de pétrole ;
Il existe de nombreuses méthodes de dosage de la matière — méthode générale NF V 03-030 : extraction hexane-isopropanol
grasse : 3-2 v/v puis purification de l’extrait sur colonne de celite 545. Méthode
n’altérant pas la matière grasse.
— méthodes gravimétriques :
• extraction par un solvant sans traitement préalable,
• extraction par un solvant après traitement chimique préalable 1.3 Méthodes physiques
(acide ou alcalin) ;
— dosage direct par spectrométrie RMN (résonance magnétique
nucléaire) ou IR (infrarouge) ; ■ Résonance magnétique nucléaire RMN basse résolution. Basée
sur la mesure, par spectrométrie de résonance magnétique
— dosage par différence à 100 après dosage des autres consti- nucléaire à basse résolution et à onde pulsée, de la teneur en com-
tuants (beurre). posés liquides contenant de l’hydrogène. Méthode rapide et non
destructrice, la RMN nécessite de connaître la nature de la matière
grasse, car l’appareil doit être étalonné avec un corps gras identique
à celui que l’on veut doser. Elle ne peut s’appliquer à des composés
1.1 Extraction directe par solvant contenant des corps gras inconnus présents dans les graines oléagi-
neuses, préalablement séchées à 103 ± 2 ˚C.

■ Infrarouge
Quelquefois, il est nécessaire d’éliminer dans un premier temps la
phase aqueuse, soit par dessiccation à l’étuve (viandes), soit par C’est une méthode basée sur le principe que les différents consti-
séchage sur sulfate de sodium anhydre Na2SO4. tuants des produits alimentaires présentent des spectres d’absorp-
tion caractéristiques dans l’infrarouge, mais se chevauchant. Les
Les solvants les plus souvent utilisés sont l’oxyde diéthylique, auteurs ont démontré que, si l’on réalise les mesures à six lon-
l’hexane, les mélanges chloroforme-méthanol 2-1 v/v (réactif de gueurs d’onde différentes, par un système à trois équations, il est
Folch), chloroforme-isopropanol 3-2 v/v, dichlorométhane-méthanol possible de déterminer à la fois l’humidité, les protéines et les
2-1 v/v. Il est important de préciser la méthode utilisée car les diffé- matières grasses. Comme pour la RMN, il est nécessaire d’étalonner
rents solvants n’ont pas le même pouvoir extracteur (en particulier l’appareil afin de déterminer les constantes spécifiques de chaque
envers les phospholipides). Dans le cas de l’analyse quantitative, constituant pour chaque type de produit à analyser. Les appareils
l’extrait est ensuite purifié sur une colonne constituée d’un mélange présents sur le marché (Infralyser de Technicon, Grain Quality Ana-
sulfate de sodium anhydre – celite 545. lyser de Neotec, Infra-Red Milk Analyser de Grubb Parsons) donnent
Différentes méthodes, en fonction de la matrice, peuvent être uti- dans les différents domaines d’excellents résultats.
lisées.
Exemples
Tourteau (NF ISO 734-1, NF ISO 734-2, méthode rapide) : extraction
directe à l’hexane, puis distillation et pesée. 2. Détermination
Beurre (ISO/CD 17189.2) : extraction directe par épuisement à
l’éther de pétrole.
des caractères physiques
Nota : la notation chloroforme-méthanol 2-1 v/v signifie 2 volumes de chloroforme pour
1 volume de méthanol.
2.1 Masse volumique

1.2 Extraction après traitement chimique La détermination de la masse volumique est réalisée à l’aide d’un
pycnomètre selon des méthodes normalisées (NF ISO 6883 ou
UICPA 2-101). On peut exprimer la masse volumique absolue (dans
le vide) mais comme cette détermination est généralement utilisée
Le traitement chimique est le plus souvent une hydrolyse desti- pour transformer une masse d’huile en volume, on préfère utiliser le
née à détruire les lipoprotéines, modifier les structures des peptides poids du litre d’huile dans l’air. Les méthodes font référence à la
et glucides. Après hydrolyse, on extrait à l’aide d’un solvant qui est masse volumique de l’eau, masse volumique différente selon la
ensuite distillé. méthode ISO (International Organization for Standardization) ou la
méthode UICPA (Union internationale de chimie pure et appliquée).
Dans le cas du lait, la matière grasse est extraite par un mélange
éthéro-ammoniacal puis pesée. Dans tous les cas, les méthodes Il est possible aussi d’utiliser un densimètre électronique, dont le
avec traitement chimique ne permettent pas une étude correcte de fonctionnement est basé sur la variation de fréquence d’un oscilla-
la composition et de la qualité de la matière grasse obtenue. teur non amorti assimilable à un diapason rempli de liquide.

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La fréquence de vibration est liée à la densité. 2.5 Point de fumée – Point d’éclair
Exemples : masses volumiques à 20 ˚C (kg/m3)
Amande 911 à 917 Coton 917 à 925
Arachide (Afrique) 914 à 916 Maïs 919 à 923 Le point de fumée, dont la détermination est très imprécise,
Arachide (Amérique) 917 à 920 Noix 924 à 926 est la température à laquelle le corps gras, chauffé dans des con-
ditions précises, émet des fumées de façon continue.
Colza 914 à 917 Soja 921 à 924
Olive 910 à 916 Tournesol 920 à 925
Lin 927 à 936 Ricin 957 à 968
On utilise l’appareil de Cleveland pour réaliser cette mesure.
Baleine 916 à 927 Sardine 923 à 932
Hareng 918 à 923 Saindoux (40 ˚C) 900 à 903
Suif (40 ˚C) 900 à 903 Le point d’éclair est la température à laquelle se produit, en
présence d’une flamme, l’inflammation nette des vapeurs de
l’échantillon.

2.2 Indice de réfraction On utilise l’appareil de Pensky – Martens pour cette détermination
(NF ISO 15267).

L’indice de réfraction des huiles varie en fonction de leur insatura- Point de fumée et point d’éclair varient considérablement en fonc-
tion. Il est mesuré suivant la norme ISO 6320 à 20 ˚C pour les huiles tion de l’acidité libre de l’échantillon.
fluides et à 40 ˚C pour les graisses. L’indice de réfraction est mesuré Le point d’éclair est utilisé pour évaluer la teneur en hexane rési-
à l’aide de réfractomètres, de type Abbe, thermostatés. Il est lié à la duaire des corps gras, en particulier lors du transport (supérieur à
température (0,000 35 par degré au voisinage de 20 ˚C). 250 ˚C).
Exemples :
Huiles riches en acide oléique 1,468 à 1,472
Huiles riches en acide linoléique 1,471 à 1,477
Huiles riches en acide linolénique 1,480 à 1,523
2.6 Teneur en solide
Graisses animales (40 ˚C) 1,470 à 1,480
La teneur en solide d’une phase grasse constitue un élément
important pour la connaissance des propriétés rhéologiques d’une
graisse.
2.3 Couleur
Cette teneur en solide peut être approchée de différentes maniè-
res, aucune méthode ne donnant de résultat absolu :
Nombreuses sont les méthodes permettant de déterminer la cou- — par dilatométrie (UICPA 2-141) : détermination d’un volume de
leur des corps gras. Les méthodes les plus utilisées comparent poids connu de graisse à diverses températures en dessous de
visuellement la couleur de l’échantillon à des étalons 60 ˚C. Après fusion à 60 ˚C et mesure du volume, le corps gras est
conventionnels : porté à 0 ˚C pendant 90 min puis 30 min à 10 ˚C, le volume mesuré,
puis de 5 ˚C en 5 ˚C jusqu’à 60 ˚C. La dilatation est mesurée en
— méthode Lovibond (NF ISO 15-305 et NFT 60-224) qui consiste ml/kg ;
à comparer avec un jeu de verres colorés jaunes et rouges ;
— par calorimétrie : mesure de la quantité de chaleur qu’il faut
— méthode FAC qui consiste à « encadrer » la couleur entre 2 des fournir à chaque instant à un mélange de triglycérides pour élever
29 verres proposés ; sa température (de 0,5 à 2 ˚C par minute) ;
— méthode Gardner qui consiste à « encadrer » la couleur entre 2 — par résonance magnétique nucléaire à onde continue (UICPA
des 18 verres proposés. 2-150) ;
— par résonance magnétique nucléaire pulsée (NF EN ISO 8292) :
Il existe un appareil (spectromètre à filtres interférentiels commer- mesure des signaux de décroissance de l’aimantation émis par des
cialisé par la société Lovibond) permettant de déterminer la couleur protons de corps gras liquides et solides, suite à des impulsions à 10
avec une plus grande fiabilité. et 70 µs.
Ces méthodes par RMN nécessitent un traitement préalable de
l’échantillon dans des conditions parfaitement définies.
2.4 Viscosité D’autres méthodes peuvent permettre une approche de la teneur
en solide :
— la détermination du titre (NF ISO 935) : température observée,
Il n’existe pas de méthode particulière pour mesurer la viscosité lors du refroidissement sous agitation continue des acides gras
des corps gras. On utilise les méthodes par écoulement employées liquides, pour laquelle se produit un palier temporaire au cours de la
pour les produits pétroliers. chute de température, ou, s’il y a augmentation de température, la
température maximale atteinte ;
La viscosité diminue en fonction de l’insaturation ainsi qu’avec le
chauffage. Elle augmente avec l’oxydation. — la détermination du point de fusion en tube capillaire ouvert
(NF ISO 6321 et NF ISO 6321/A1) : mesure de la température à
Pour la plupart des corps gras, elle est comprise entre 50 et laquelle une colonne de corps gras, dans un tube capillaire immergé
80 mPa · s à 20 ˚C et décroît jusqu’à 6 à 8 mPa · s à 100 ˚C, exception dans l’eau, commence à se déplacer lorsqu’on augmente la tempé-
faite pour l’huile de ricin. rature.

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3. Détermination 3.1.3 Indice d’hydroxyle

des constituants majeurs C’est la quantité de potasse exprimée en milligrammes néces-


saire pour neutraliser l’acide acétique se combinant par acétyla-
tion à 1 g de corps gras.
3.1 Indices
Il est déterminé suivant la norme NF T 60-213.
3.1.1 Indice de saponification L’anhydride acétique dans la pyridine acétyle à chaud les fonc-
tions alcool libres. Après une heure, l’excès d’anhydride acétique est
transformé en acide acétique par addition d’eau.
C’est la quantité de potasse, exprimée en milligrammes, Cet acide acétique est ensuite dosé par de la potasse alcoolique.
nécessaire pour saponifier 1 g de corps gras.

Cet indice est déterminé suivant la norme NF ISO 3657. 3.2 Triglycérides
Il est nécessaire d’opérer :
— en phase homogène ;
Les triglycérides ou acylglycérols sont des esters d’acides gras et
— à température élevée en présence d’un excès d’une solution de glycérol (tableau 1). Ce sont les principaux constituants des
éthanolique de potasse. corps gras (97 à 99 %). De ce fait, de très nombreux auteurs se sont
Cet excès est ensuite dosé par retour, ce qui permet de déterminer penchés sur l’analyse des triglycérides.
la quantité de potasse consommée. (0)
L’indice de saponification rend compte de la longueur des chaînes
hydrocarbonées des acides gras.
Tableau 1 – Acides gras usuels
Exemples :
Coprah 255 à 260 Soja 188 à 195 Nombre
Palme 195 à 205 Colza 170 à 182 de carbone
Arachide 189 à 196 Saindoux 192 à 197 (indice :
Nom usuel Dénomination chimique
nombre de
Olive 185 à 196 Beurre 215 à 235
doubles
Tournesol 188 à 193 Sardine 185 à 195 liaisons)
Acides gras saturés
3.1.2 Indice d’iode 4 Acide butyrique Butanoïque
6 Acide caproïque Héxanoïque
C’est le nombre de grammes d’iode fixé par 100 g de corps 8 Acide caprylique Octanoïque
gras.
10 Acide caprique Décanoïque

Il est déterminé suivant la norme NF ISO 3961. 12 Acide laurique Dodécanoïque

En présence d’un large excès d’halogénure d’iode, l’iode est fixé 14 Acide myristique Tétradécanoïque
sur les doubles liaisons en une heure. 16 Acide palmitique Hexadécanoïque
L’iode non consommé est ensuite dosé par le thiosulfate. 18 Acide stéarique Octadécanoïque
Plusieurs méthodes sont proposées : 20 Acide arachidique Eicosanoïque
— méthode de Wijs en présence de trichlorure d’iode ;
22 Acide béhénique Docosanoïque
— méthode de Hanus en présence de monobromure d’iode ;
— méthode au brome. 24 Acide lignocérique Tétracosanoïque
La méthode de Wijs est certainement la plus utilisée (possibilité 26 Acide cérotique Hexacosanoïque
de trouver dans le commerce du réactif prêt à l’emploi). Acides gras mono-insaturés
Ces trois méthodes donnent des résultats équivalents mais il est 16 Acide palmitoléique Hexadécèn 9c oïque n-7
aussi possible d’obtenir le résultat par le calcul lorsque la composi-
tion en acides gras est bien connue, sachant que l’indice d’iode pour 18 Acide oléique Octadécèn 9c oïque n-9
l’acide oléique est de 90, 181 pour le linoléique et 274 pour le linolé- 18 Acide elaïdique Octadécèn 9t oïque n-9t
nique.
20 Acide gadoléique Eicosèn 9c oïque n-11
( 90 × % oléique ) + ( 181 × % linoléique ) + ( 274 × % linolénique )
Indice d′iode = ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 22 Acide erucique Docosèn 13c oïque n-9
100
24 Acide nervonique Tétracosèn 15c oïque n-9
Exemples :
Coprah 5à9 Soja 125 à 138 Acides gras polyinsaturés
Palme 45 à 58 Colza 97 à 106 18:2 Acide linoléique Octadécadièn 9c 12c oïque
Arachide 85 à 108 Saindoux 52 à 70 Octadécadiènoïque n-6,9
Olive 75 à 94 Beurre 33 à 45 18:3 Acide α linolénique Octadécatrièn 9c 12c 15c oïque
Tournesol 120 à 134 Sardine 160 à 190 Octadécatriènoïque n-3,6,9

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Si l’on utilise des colonnes de type WCOT (Wall Coated Open


Tableau 1 – Acides gras usuels (suite) Tubular) de 6 à 8 m de longueur, imprégnées de méthyl silicone ou
méthylphénylsilicone, les triglycérides seront regroupés par nom-
Nombre bre pair d’atomes de carbone, chaque pic correspondant à une
de carbone enveloppe réunissant un ensemble de composés ayant le même
(indice : nombre d’atomes de carbone, la présence de doubles liaisons
Nom usuel Dénomination chimique
nombre de n’ayant aucun effet.
doubles
liaisons) Exemple : C54 = SSS (tristéarine) ou OOO (trioléine) ou LLL (trilino-
léine) ou toutes les combinaisons entre les trois acides gras.
18:3 Acide γ linolénique Octadécatrièn 6c 9c 12c oïque
Octadécatriènoïque n-6,9,12
En augmentant la longueur des colonnes (20 m), on va pouvoir
18:4 Acide stéaridonique Octadécatétraèn 6c 9c 12c 15c séparer les différents composants de chaque enveloppe obtenue
oïque précédemment. L’élution est réalisée en programmation de tempé-
Octadécatétraènoïque
n-3,6,9,12 rature (340 à 370 ˚C). Grob a démontré que l’injecteur utilisé doit
être de préférence un injecteur du type « on column » permettant
20:4 Acide arachidonique Eicosatétraèn 5c 8c 11c 14c d’injecter à basse température (meilleure répétabilité, analyse quan-
oïque titative).
Eicosatétraènoïque n-6,9,12,15
20:5 EPA Eicosapentèn 5c 8c 11c 14c 17c Il est aussi possible de déterminer la concentration en mono et
oïque diglycérides par CPG suivant la norme UICPA 2-326.
Eicosapentènoique
n-3,6,9,12,15 Exemple : sur les figures 1 ou 2 sont données des CPG de triglycé-
rides classées par poid moléculaire suivant la norme UICPA 2-323.
22:6 DHA Docosahexèn 4c 7c 10c 13c 16c
19c oïque
Docosahexènoïque
n-3,6,9,12,15,18

Pendant très longtemps, l’analyse en fonction du degré d’insatu-


ration fut une méthode complexe et délicate. Grâce à l’apparition
des techniques chromatographiques vers 1950, les progrès dans
l’analyse ont été considérables.

3.2.1 Analyse par chromatographie couche mince


CCM

Il est possible, en utilisant des couches minces de gel de silice


imprégné de AgNO3 de séparer les triglycérides en fonction de leurs
insaturations.
Les couches sont obtenues par adjonction de nitrate d’argent à la C 50 C 52 C 54
silice (5 à 30 %) et conservées à l’obscurité.
Les solvants d’élution peuvent être le benzène, le chloroforme, ou
encore des mélanges benzène-chloroforme-oxyde diéthylique. La
révélation s’effectue à l’aide d’une solution hydroalcoolique de
dichloro-2,7-fluorescéine.
Cette méthode permet en outre de séparer les formes cis des for-
mes trans (pour une même double liaison, la forme cis a un rapport
frontal Rf inférieur à la forme trans).
Cette méthode reste cependant d’une interprétation très délicate,
de nombreux phénomènes intervenant au cours de la migration, et
ne peut s’appliquer qu’à un nombre limité de corps gras.

C 56
3.2.2 Analyse par chromatographie en phase
gazeuse CPG

Les triglycérides peuvent être analysés en CPG en utilisant des


colonnes courtes imprégnées de phases stationnaires apolaires ou Colonne capillaire : diamètre 0,25 mm, phase stationnaire SE 30,
peu polaires de type silicone. Pendant longtemps, les triglycérides longueur 10 m
Gaz vecteur : hydrogène 1,5 ml/min
ont été élués, regroupés par nombre pair d’atomes de carbone Température : 340 à 370 °C, 5 °C/min
(UICPA 2-323).
Les développements récents de la CPG sur colonne capillaire [1]
ont permis d’améliorer considérablement l’analyse des triglycéri-
des. Figure 1 – Triglycérides de beurre de cacao par CPG

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Les triglycérides sont élués selon leur nombre de partition NP (ou


C 38 nombre équivalent de carbone NEC) :
C 40
C 42 NP = NC − 2n
C 50 C 52 C 54

C 44 avec NC nombre de carbone de triglycérides,

n nombre de doubles liaisons.

C 46 Exemples :
C 48 SSS (tristéarine) : NP = 54
OOO (trioléine) : NP = 54 − (2 × 3) = 48
LLL (trilinoléine) : NP = 54 − (2 × 6) = 42

Les détecteurs principalement utilisés sont :

— le détecteur réfractométrique, en prenant soin de réguler les


températures solvant et colonne. Ce détecteur ne permet pas l’utili-
sation de gradient de solvant ;
C 56 — le détecteur à diffusion de lumière (Light Scattering Detector),
simple d’utilisation, mais pour lequel la réponse de chaque compo-
sant doit être soigneusement étudiée.
Colonne capillaire : diamètre 0,25 mm, phase stationnaire SE 30,
longueur 10 m Une des difficultés des méthodes par chromatographie liquide
Gaz vecteur : hydrogène 1,5 ml/min
Température : 320 à 370 °C, 5 °C/min
reste l’identification des différents composés élués due, d’une part à
leur grande diversité, d’autre part à la difficulté de se procurer des
Figure 2 – Triglycérides de beurre de cacao et de matières grasses substances étalon. Certains auteurs ont montré qu’il existe une rela-
laitières par CPG tion linéaire entre les nombres de doubles liaisons et les logarith-
mes des rétentions relatives α par rapport à la trioléine. Grâce à la
construction d’un tel diagramme (figure 4), il est possible d’identi-
3.2.3 Analyse par chromatographie liquide CL fier un certain nombre de composés.
Exemple : dans le tableau 2 sont donnés des compositions centé-
Grâce aux plus récents développements de la chromatographie simales triglycéridiques de quelques corps gras analysés par la
liquide et en particulier aux développements des supports greffés, méthode UICPA 2-324.
l’analyse des triglycérides a fait d’importants progrès.
Les phases utilisées sont essentiellement des phases constituées
de silice de granulométrie 5 µm greffées par des chaînes octadecyl
(C18). L’éluant utilisé est du type acétone-acétonitrile 50-50 v/v.
lg α
Exemples : l’analyse par chormatographie liquide des triglycérides StStSt
d’huile d’olive est donnée sur la figure 3. 0,5

0,25
OOO

PPP StStLn
StOL
0 OOO
POL
LOO

POO

PPLn
– 0,25 StLnLn
PoOO
PLO
OLnO

LLL
LLnO
LOL

PLnLn
– 0,5
LLL

PLL

SOO
POP

LnLnLn
– 0,75
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Nombre de liaisons doubles n
NEC42

NEC44

NEC46

NEC48

NEC50

Ln acide linolénique
St acide stéarique
P acide palmitique
Colonne : RP18, longueur 25 cm O acide oléique
Phase mobile : acétone-acétonitrile 55-45 v/v, 1 ml/min L acide linoléique
Détection réfractométrique

Figure 3 – Triglycérides d’huile d’olive par CLHP Figure 4 – Diagramme lg(α) = f{n)

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3.2.4 Acides gras en position 2 sur les triglycérides


(0)

Tableau 2 – Composition centésimale massique


triglycéridique Les méthodes par CPG ou par CLHP (chromatographie liquide
haute performance), si elles ont amélioré la connaissance des trigly-
Corps gras cérides en déterminant la structure globale, ne permettent pas de
connaître la position des acides gras sur les triglycérides. Seules

Beurre de cacao
certaines enzymes lipolytiques peuvent agir sur les liaisons esters
Triglycéride

Tournesol

de façon sélective.

Saindoux
Arachide

Palme

Colza
Olive
Soja

Suif
Exemple : ainsi la lipase pancréatique intervient sélectivement sur
les positions 1-3 ( α – α′ ) des triglycérides et permet d’obtenir un 2 (β)
monoglycéride qui est ensuite isolé par CCM, extrait puis analysé par
CPG après transformation en ester méthylique.
LLnLn 0,8 Les acides gras en position 2 sur les triglycérides sont analysés
par chromatographie en phase gazeuse des monoglycérides obte-
LLLn 7,5 0,8 nus après hydrolyse enzymatique (NF EN ISO 6800).
OLnLn 0,3 0,7
LLL 19,3 36,3 2,0 2,2
3.3 Acides gras
OLLn 5,0 4,7
PLLn 2,8 1
3.3.1 Préparation des esters méthyliques
OLL 20,4 29,1 18,3 3,6 0,5 9,1
OOLn 0,8 0,9 0,7 8,2 Les acides gras étant les constituants essentiels des triglycérides,
c’est par leur connaissance que l’analyste peut déterminer les carac-
PLL 13,1 11,3 5,1 1,5 1,0 0,5 2,0 téristiques d’identité des corps gras, selon :
— la présence ou non de certains acides gras ;
POLn 0,7 0,5 0,9 0,4 1,6
— les proportions des acides gras entre eux.
LLGa 0,4 Les acides gras peuvent être analysés sous forme libre, mais,
généralement les acides gras sont analysés après désactivation
OOL 7,6 6,5 19,4 16,7 1,0 1,7 0,9 0,2 22,9
sous forme ester.
SLL 4,2 7,5 1,4 1,3 1,6 Les méthodes d’estérification sont nombreuses. Le choix s’effec-
PoOO 1,1 tuera en fonction des acides gras à analyser : présence d’acides gras
libres, d’acides gras à chaîne courte, d’acides gras à fonction alcools
POL 7,8 4,0 12,9 10,9 7,7 6,5 2,7 2 6,7 ou acides...
PPL 1,5 0,5 2,9 1,4 7,0 2 La plupart des méthodes d’estérification se réalisent en présence
d’un excès d’alcool. Il est possible d’utiliser les alcools éthylique,
MyOO 1,0 0,5 3,2 3,8 propylique, isopropylique, ou encore butylique, de façon à former
PPoO des esters ayant des températures d’ébullition plus élevées.
MyOP 1,0 1,2 3,0 L’alcool le plus généralement utilisé étant le méthanol, on parle
d’analyse d’esters méthyliques d’acides gras.
OOO 1,9 0,6 11,8 31,3 3,4 5,7 4,4 2 26,1 Les techniques de préparation des esters méthyliques sont relati-
SOL 3,0 2,1 3,0 0,7 0,7 0,8 1,4 1 2,1 vement nombreuses. Nous n’avons cité que les plus utilisées.
Méthode au triméthylhydroxysulfonium TMSH S ( CH 3 ) 3+ OH – : en
POO 1,3 0,4 6,7 22,6 24,4 26,4 23,0 6,3
présence de TMSH, les triglycérides sont estérifiés au moment où ils
PSL 0,8 3,8 4,8 3 pénètrent dans l’injecteur du système chromatographique (250 ˚C).
Méthode générale au trifluorure de bore BF3 : le corps gras est
PoSO 1,0
dans un premier temps saponifié en présence de potasse méthano-
PPO 0,2 0,7 2,3 4,3 34,2 7,6 10,6 14/21 1,7 lique 0,5 N. L’estérification est ensuite réalisée en présence de BF3/
méthanol (réactif prêt à l’emploi dans le commerce). Après addition
PPP 0,5 d’eau, les esters sont récupérés à l’aide d’un solvant.
SOO 0,7 1,5 2,7 9,2 5,3 11,5 2,1 Méthode applicable aux corps gras neutres (ou ayant une faible
acidité) : la réaction s’effectue à chaud en présence de potasse
PSO 2,2 0,7 5,3 21,1 14,5 32/41 méthanolique environ N, les esters étant récupérés par un solvant
PPS 0,8 2,4 3,3 (pentane, hexane) après addition d’eau.
Méthode à froid (corps gras à chaînes courtes) : dans le cas des
SSO 0,3 1,9 4,0 20/30 corps gras possédant des chaînes courtes (acide butyrique), il est
PSS 3,1 3,1 0,2/1 nécessaire d’opérer à froid. Dans un tube ou une ampoule fermé, on
solubilise les triglycérides dans le pentane, puis on les estérifie par
SSS 0,5 1,6 0,1/0,5 de la potasse méthanolique environ 2N par agitation.
NI 0,5 10 2,6 4,6 6 Estérification en milieu acide : il est possible d’obtenir des esters
en milieu H2SO4/alcool, en ampoule scellée, à chaud (bain-marie).
P ; Acide palmitique Po : Acide palmitoléique Ln : Acide linolénique Méthodes applicables aux corps gras acides et acides gras :
S : Acide stéarique My : Acide myristique Ga : Acide gadoléique
— méthode au méthanol/acide sulfurique : dans un ballon ou en
O : Acide oléique L : Acide linoléique NI : non identifié
ampoule scellée pendant 25 min ;

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— méthanolyse au méthylate de sodium, réaction en deux Ils peuvent être identifiés selon leur longueur de chaîne équiva-
étapes : saponification en présence d’une solution méthanolique de lente (LCE), caractéristique pour une même famille.
méthylate de sodium suivie d’une méthanolyse en milieu acide
(méthanol chlorhydrique) après séparation à l’eau, extraction des Il est aussi possible d’utiliser des composés connus soit des corps
esters au solvant (hexane, heptane) ; gras dont la composition est bien connue, soit des matériaux de
référence (certifiés) permettant de faire à la fois les analyses qualita-
— méthode au trifluorure de bore BF3 qui peut être réalisée sur
tives et quantitatives.
les acides gras sans saponification.
L’analyse quantitative est réalisée selon :
Il existe aussi des microméthodes (méthode de Christopherson à
froid) permettant de préparer très rapidement des esters — la méthode de normalisation interne corrigée (les coefficients
méthyliques sur des quantités très faibles. de réponse sont calculés par rapport à la réponse de l’acide palmiti-
À ces méthodes, il convient d’ajouter les méthodes permettant de que C16:0) et les différents acides gras sont exprimés en pourcen-
modifier certaines fonctions dans le cas d’acides gras à fonctions tage de mélange ;
secondaires (tels que l’acide ricinoléique à fonction alcool) : — la méthode d’étalonnage interne (utilisation d’un étalon) si l’on
— par acétylation en présence d’anhydride acétique, fluoroacéti- désire des valeurs pondérales.
que, fluorobutyrique ; L’analyse par CPG des esters méthyliques d’acides gras est réa-
— par formation d’éthers : formation de triméthylsilyléthers en lisée suivant la méthode NF EN ISO 5508.
présence de dérivés silylants.
Il est possible d’analyser les acides gras sans dérivatisation en uti-
Les méthodes de préparation des esters méthyliques d’acides lisant une colonne de type FFAP (Free Fathy Acid Phtalate), méthode
gras sont regroupées dans la norme NF EN ISO 5509. essentiellement utilisée pour doser les acides gras courts (C4 à C6).

3.3.2 Analyse des acides gras et esters d’acides Le détecteur principalement utilisé pour l’analyse des acides gras
est le détecteur à ionisation de flamme (FID).
gras par CPG
Les conditions chromatographiques sont propres à chaque type
Les progrès réalisés en CPG au cours des vingt dernières années de colonne. On peut travailler en température isotherme ou bien en
ont très nettement amélioré l’analyse des corps gras. programmation.
Chromatographie sur colonne remplie : colonnes en verre de 3 m
de longueur remplie de support de granulométrie 80 à 100 mesh
Cas particulier : pour le dosage de l’acide butyrique, on utilise
imprégné à 5 à 10 % de polyesters :
la méthode par étalonnage interne (acide valérique) et chroma-
— diéthylène glycol succinate (DEGS) ; tographie gazeuse sur colonne FFAP (UICPA 2-310).
— butane diol succinate (BDS) ;
— éthylène glycol adipate (EGA) ;
— copolymère (EGSSX). Les compositions en acides gras des corps gras sont assez bien
Peu de laboratoires utilisent encore les colonnes remplies. connues, malgré les variations d’espèces ou géographiques. Il suffit
de se reporter à quelques ouvrages spécialisés pour obtenir plus de
Chromatographie sur colonne capillaire : de très nombreux tra- détails ([2] [3], Pharmacopée). Certains corps gras peuvent présen-
vaux sur l’analyse des corps gras en colonne capillaire ont été ter une grande diversité de composition, mais avec toujours cer-
publiés. Les colonnes les plus utilisées sont constituées de tubes de tains éléments caractéristiques, cas des huiles de poisson dans
silice de 0,25 à 0,53 mm de diamètre, de longueur comprise entre 25 lesquels la matière grasse varie avec l’espèce et l’époque de
et 50 m, sur lesquels est greffée une phase stationnaire moyenne- l’année, mais toujours caractérisés par la présence des acides gras
ment polaire ou polaire : polyéthylène glycol (Carbowax 20 M), EPA (C20:5) et DHA (C22:6) [2].
polysiloxane substitués (CP Wax – Innowax – FFAP) avec jusqu’à
environ 80 % de groupements cyano (polyproxylcyanosilicone de Exemple : les résultats obtenus pour les esters méthyliques d’huile
type CP Sil 88 ou BPX 70 ou encore SP 2330). de colza et de poisson sont donnés sur les figures 5 et 6.
Les différents constituants sont retenus en fonction : Les compositions centésimales en acides gras de quelques corps
gras sont données dans le tableau 3.
— du nombre d’atomes de carbone ;
— dans une même famille, des insaturations de chaîne : les dou-
bles liaisons polaires étant retenues. Ainsi, pour la famille C18, les
différents composés seront élués dans l’ordre :

16:0

18:1
18:2
18:3
∆9 (acide oléique) – C18 ∆9-12 (acide
C18:0 (acide stéarique) – C18 :1 :2
∆9-12-15 (acide linolénique)
linoléique) – C18 :3
∆9 signifie qu’il y a 18 atomes de carbone, 1 double liaison en ∆9 (∆ étant le
Nota : C18 :1
carbone de la fonction acide).
Il est possible pour un même composé de séparer de nombreux
isomères : isomères de position des doubles liaisons :
∆9 ∆11

18:0
C18 :1 C18 :1

20:1
ou bien isomères de configuration (formes cis et trans).
La principale difficulté de l’analyse par CPG réside dans l’identifi-

20:0
17:0 16:1

cation des composés élués.


14:0

22:0
22:1
17:1

Les différents acides gras sont élués selon la loi de Kovats :

20:2

24:0
lg dr = an + b
avec dr distance de rétention,
Colonne capillaire : 25 m polyéthylèneglycol
n nombre de carbone de la chaîne, Température : 170 °C
b ordonnée à l’origine, Gaz vecteur : hydrogène 1 ml/min

a pente. Figure 5 – Esters méthyliques d’acides gras d’huile de colza par CPG

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Tableau 3 – Composition centésimale massique en acides gras

Acides gras

Palmitoléique

Lignocérique
Arachidique
Linolénique

Gadoléique
Caprylique

Myristique

Palmitique

Behenique
Linoléique
Caproïque
Butyrique

Stéarique
Caprique

Laurique

Erucique
Oléique

DHA
EPA
Corps gras

Nombre de
carbone et 161 181 182 183 201 205 221 226
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
de doubles
liaisons

Coprah 0,3 à 1 6 à 9 5 à 7 45 17 à 20 7 à 10 2à3 7à9 1à3


à 48

Palmiste <1 2à4 3à4 44 15 à 17 8 à 10 2à3 14 2à3


à 47 à 19
Palme 0à 0,5 à 41 4à6 35 9 à 12 0,1 0,2 0,1
0,2 1,5 à 45 à 41 à 0,5 à 0,5 à 0,2

Beurre 24 33 34 2à3 0,1 0,5 0 à 0,2


Cacao à 27 à 36 à 35 à 0,5 à 1,0

Arachide 7 à 11 0 à 0,5 3 à 4 55 14 0 à 0,1 1,5 à 2 1 à 1,5 2 à 3,5 1


(Afrique) à 68 à 25 à 2,5
Arachide 10 0 à 0,5 3 à 4 30 35 0 à 0,3 1,5 à 2 1 à 1,5 3à4 1à2
(Amérique) à 12 à 42 à 42

Olive 9 à 15 0,5 2à4 62 5 à 17 0,4 0,2 0,2


à 1,5 à 79 à 0,9 à 0,5 à 0,4
Tournesol 5à7 3à5 19 65 0 à 0,5 0,1 0,1 0,5 à 1 0
à 22 à 69 à 0,5 à 0,5 à 0,2

Soja 9 à 11 0 à 0,2 3 à 5 21 52 6à9 0,1 0,1


à 24 à 57 à 0,5 à 0,5

Maïs 11 0,1 1,5 24 45 0,5 0,1 0,1 0,5 à 1


à 14 à 0,4 à3 à 30 à 55 à 1,2 à 0,5 à 0,5
Noix 7à9 4à5 15 53 10 0,1
à 20 à 59 à 14 à 0,5
Lin 6 à 7 0 à 0,3 3 à 5 18 13 50 0,1 0,1 0,1
à 22 à 18 à 55 à 0,5 à 0,5 à 0,3
Colza 3à5 0,1 1à2 55 17 7 à 11 0,1 0,5 0,5 à 1 0
à 0,4 à 63 à 22 à 0,5 à 1,2 à 0,5
Colza 2à4 0,1 1à2 11 11 8 à 12 0,5 à 1 7 à 10 0,5 45
Erucique à 0,4 à 15 à 15 à 10 à 50

Saindoux 0 à 0,2 0 1à2 23 2à4 12 38 6 à 10 0,2 à 1 0,1 0,6 à 1


à 0,2 à 27 à 18 à 44 à 0,6
Suif 0 2,5 24 2à4 16 35 2,5 0,4 à 1 0,3 0,1
à 0,1 à 3,5 à 28 à 25 à 45 à4 à 0,5 à 0,4

Poisson 6à9 16 7 à 10 3 à 5 10 1 à 3 0,2 à 1 0,2 1à4 9 à 15 6


à 25 à 15 à 0,8 à 12

Matière 2,8 1,1 1 à 2 2,5 2,6 9 à 14 22 1,5 à 3 8 à 12 16 1,2 0,3 à 1


grasse à4 à 2,4 à 3,5 à4 à 35 à 34 à3
laitière

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L’utilisation des colonnes capillaires à polarité élevée (CP SIL 88, 3.4 Phospholipides
BPX 70) a permis de mettre au point plus particulièrement le dosage
des acides gras trans (présents essentiellement dans les corps gras
hydrogénés). Ces acides gras sont analysés sous forme esters Les phospholipides forment des mélanges complexes présents
méthyliques, dans les mêmes conditions que celles des acides gras dans la plupart des matières grasses végétales ou animales. Les
(NF ISO 15304). teneurs sont très variables (de quelques milligrammes par kg à des
grammes par kg).

Il existe aussi pour doser les acides gras trans une méthode
pas spectrométrie infrarouge (NF ISO 13884, UICPA 2-207). 3.4.1 Dosage par le phosphore
Après transformation en esters méthyliques, on mesure
l’absorbance à 970 cm−1 (10,3 nm), absorbance due aux vibra-
En se basant sur un poids moléculaire moyen, la quantité de
tions de la déformation des liaisons C  H des doubles liaisons.
phospholipides se déduit de la teneur en phosphore mesurée.
Les valeurs sont comparées à une gamme étalon obtenue avec
des solutions de trans-octadénoate de méthyle (élaïdate de Phospholipides = Phosphore × 26,5
méthyle).
1 mg de phosphore correspondant en général à 26,5 mg de phos-
pholipides.
Différentes méthodes permettent de doser le phosphore.
3.3.3 Analyse des acides gras par CLHP
Méthodes colorimétriques : après formation des cendres puis
solubilisation dans un acide fort, deux méthodes permettent le
dosage :
Les lipides peuvent être analysés en CLHP sous différentes
— méthode au molybdate d’ammonium. Colorimétrie bleue du
formes :
complexe molybdate/phosphate utilisée pour les faibles teneurs
(huiles raffinées) ;
— sous forme d’acides gras, après saponification puis acidifica-
— méthode au phosphovanadomolybdate. Colorimétrie jaune du
tion et extraction ; complexe phosphovanadomolybdate utilisée pour les fortes
teneurs (huiles brutes).
— sous forme dérivée : esters méthyliques ou esters phénylacéti-
ques. Méthode par spectrométrie d’absorption atomique : méthode
permettant une grande sensibilité (jusqu’à 1 mg/kg) par l’utilisation
L’analyse peut être réalisée soit par chromatographie d’adsorp- d’un spectromètre d’absorption atomique équipé d’un four graphite
prétraité au tantale.
tion sur colonne de silice traitée au nitrate d’argent (5 à 20 %), la
phase mobile pouvant être le benzène, ou bien un mélange acétone- Il est actuellement possible de déterminer la quantité de phos-
acétonitrile, soit par chromatographie de partage en phases phore par utilisation d’appareils d’émission atomique équipés d’une
inverses : les colonnes les plus utilisées sont de type octadécyl, les source à plasma (ICP Induction Coupled Plasma).
éluants du type acétonitrile-eau 70-30 v/v ou méthanol-eau 95-5 v/v.

3.4.2 Dosage des phospholipides

Dans les échantillons à teneur élevée en phospholipides, il est


possible de déterminer la teneur directement par précipitation à
l’acétone, lavage, puis gravimétrie.

DHA 3.4.3 Phospholipides individuels


EPA

Cette analyse peut se faire :


— par chromatographie couche mince sur gel de silice :
• chromatographie unique avec solvant chloroforme-méthanol-
eau 62-25-4 v/v/v ;
• chromatographie bidimensionnelle avec chloroforme-métha-
nol-ammoniaque 65-30-4 v/v/v puis chloroforme-méthanol-acide
acétique-eau 170-25-25-6 v/v/v/v.
La révélation est réalisée par pulvérisation d’une solution éthano-
lique à 10 % d’acide phosphomolybdique puis chauffage à 110 ˚C.
L’analyse quantitative est ensuite réalisée par grattage de chaque
tache et minidosage du phosphore dans chacune d’elles.
Mêmes conditions que figure 5 — par chromatographie liquide haute pression : la phase mobile
est constituée par un mélange CH3CN/CH3OH/H2O 65-21-14 v/v/v. La
colonne est une colonne de silice. La détection est réalisée par un
spectromètre à 210 nm. Après extraction de la matière grasse, celle-
Figure 6 – Esters méthyliques d’acides gras d’huile de poisson ci est purifiée par passage sur microcolonne de silice Sep-pak puis
par CPG analysée en CLHP.

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4. Détermination 4.2 Fraction stérolique


des constituants mineurs
Les stérols sont analysés par CPG sous forme dérivée :

— de triméthylsilyléther (TMS) obtenus à l’aide de réactifs sily-


La fraction insaponifiable ne représente généralement que 0,5 à lants anhydres ;
2 % des corps gras. Alors que la fraction saponifiable ne contient
que des triglycérides, la fraction insaponifiable est composée de dif- • mélange pyridine-hexaméthylsilasane-triméthylchlorosilane
férents groupes, chaque groupe ayant un nombre plus ou moins (2-1,8-1,2 v / v / v),
important de constituants.
• bisilyltrifluoroacétamide – triméthylchlorosilane (90-10 v/v) ;
La première étape de toute analyse sera le fractionnement de — d’acétates obtenus par microacétylation par le mélange pyri-
l’insaponifiable, afin de pouvoir isoler chaque famille. dine – anhydride acétique (50-50 v/v).

La colonne capillaire utilisée a une longueur de 25 m et est impré-


gnée de méthylpolysiloxanes (OV 1 – SE 30 ou équivalent) ou de
méthylphénylpolysiloxanes (SE 52 – OV 17). La température du four
4.1 Fractionnement de l’insaponifiable est de l’ordre de 250 ˚C à 260 ˚C. La détection s’effectue par ionisa-
tion de flamme.

Après saponification du corps gras, la fraction insaponifiable peut Les différents stérols sont identifiés par le temps de rétention rela-
tif exprimé par rapport au β sitostérol, composé généralement
être extraite (à l’aide d’hexane ou d’oxyde diéthylique) puis pesée
majeur dans les huiles et graisses végétales, les graisses animales
après séchage.
contenant essentiellement du cholestérol.
Le fractionnement s’effectue généralement par CCM sur plaque Exemple : sur OV 17 (figure 8) (NF ISO 6799) :
de silice, de nombreux systèmes éluants pouvant être utilisés : chlo- cholestérol 0,63
roforme-oxyde diéthylique 80-20 v/v, hexane-oxyde diéthylique 70- cholestanol 0,64
30 v/v, hexane-acétate d’éthyle 80-20 v/v. L’élution est réalisée par
brassicastérol 0,71
polarité décroissante, Rf hydrocarbures : 0,97, Rf stérols 0,25. La
révélation est effectuée par pulvérisation de dichloro-2,7-difluores- campestérol 0,81
céine ou de rhodamine B. stigmastérol 0,87
∆7 campestérol 0,92
L’échantillon ayant été déposé sous forme d’une bande occupant βsitostérol 1,00
toute la largeur de la plaque, on pourra, par grattage, récupérer les
∆5 avenastérol 1,03
bandes correspondant aux différents groupes (figure 7) :
∆7 stigmastérol 1,12
Les différents constituants sont ensuite extraits de la silice par ∆7 avenastérol 1,16
solubilisation à chaud dans un solvant (chloroforme, oxyde diéthyli-
que, dichlorométhane) puis filtration et séchage.

Une méthode récente permet, particulièrement en vue de l’ana-


lyse des stérols, de fractionner l’insaponifiable par CLHP sur βsitostérol

∆7 stigmastérol
colonne de silice, éluant hexane-isopropanol 99-1 v/v, détecteur
Stigmastérol

réfractométrique. Les composés élués sont récupérés à l’aide d’un


collecteur de fractions.
Campestérol

∆7 avenastérol
Campestanol

∆5 avenastérol

Front du solvant
∆7 campestérol

Hydrocarbures
Brassicastérol
Cholestanol
Cholestérol

Tocophérols

Alcools triterpéniques
4 méthylstérols
Stérols
Diols
2 cm
Dépôt d'échantillon Colonne capillaire : longueur 25 m diamètre 0,25 mm,
2 cm phase stationnaire OV 1701
Gaz vecteur : hydrogène 1,5 ml/min
Température : 260 °C

Figure 7 – Fractionnement des composés insaponifiables par CCM Figure 8 – Stérols d’huile de tournesol par CPG

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Tableau 4 – Teneur et composition centésimale massique stérolique

Stérols

Teneur en stérols
∆7 stigmastérol
∆7 campestérol

∆5 avenastérol

∆7 avenastérol
Brassicasétrol

Stigmastérol
Campestérol
Cholestérol

(mg/100 g)
βsitostérol

totaux
Corps gras

Coprah 1 6à9 18 à 19 55 à 70 6 à 16 2à8 60


Palme 1à4 14 à 22 8 à 13 62 à 74 0à2 0à1 50
Olive 0 à 0,3 1à4 0à2 80 à 95 3 à 15 0à4 150
Arachide 0 à 0,3 13 à 18 8 à 10 72 à 74 7à9 1à3 250
Tournesol 0à1 8 à 12 8 à 12 0à2 60 à 66 2à5 10 à 15 2à5 350
Maïs 0 à 0,3 18 à 23 5à8 60 à 70 4à8 0à1 0à4 500
Sésame 0 à 0,5 17 à 21 6à9 60 à 65 7 à 12 1à2 500
Soja 0 à 0,5 18 à 23 15 à 22 50 à 65 0,5 à 3 2à3 0,5 à 1,5 350
Colza 0à2 8 à 13 25 à 37 0à2 50 à 58 2à4 0à5 650
Saindoux 100 100
Matière grasse laitière 100 300
Poisson 100 400

La teneur en stérols totaux peut être déterminée en CPG avec pré- vent présenter des teneurs en hydrocarbures importantes : squa-
cision par la méthode d’étalonnage interne suivant les normes lène dans les huiles de poisson, karitène dans le karité.
NF EN ISO 12228 et NF T 60-249 (étalon : solution de bétulinol ou Les longueurs de chaîne sont généralement comprises entre 8 et
αcholestanol introduite avant l’étape de saponification) ou encore 36 atomes de carbone, la majeure partie étant comprise entre 20 et
par méthode enzymatique : oxydation enzymatique des stérols à 30. La quantification peut s’effectuer par étalonnage interne.
l’aide d’une cholestérol oxydase, puis d’une catalase, formant un
formaldéhyde. Le formaldéhyde réagit avec le pentane – 2,4-dione
pour former de la luditine dosée par spectrométrie à 405 nm
(NF T 60-243). 4.5 Tocophérols

Exemple : les compositions centésimales stérolique de quelques Les tocophérols sont des composés possédant à la fois une acti-
acides gras sont données dans le tableau 4 et l’analyse des stérols vité vitaminique et une activité antioxydante. Alors que l’activité
d’huile de tournesol sur la figure 8. vitaminique décroît de l’αtocophérol au δtocophérol, l’activité
antioxydante croît de l’αtocophérol au δtocophérol.
Les tocophérols peuvent être obtenus après fractionnement de
4.3 Alcools triterpéniques l’insaponifiable, mais, du fait de leur oxydabilité, il est nécessaire de
les protéger : saponification à froid, ou à chaud, mais de courte
durée et en présence de pyrogallol.
Les alcools triterpéniques, les méthylstérols, sont séparés par Le fractionnement peut être effectué en CCM, comme pour les
CCM lors du fractionnement de l’insaponifiable (Rf légèrement autres fractions, mais la révélation au réactif d’Emmerie-Engel
supérieur à celui des stérols). Après grattage de la bande, extraction (solution éthanolique de chlorure ferrique et α-α′ dipyridile) est
des constituants, ceux-ci sont dérivés en triméthylsilyléthers, ou destructrice (nécessité de révéler seulement les bords de la plaque
acétates, puis analysés en CPG dans les conditions voisines de cel- où ont migré les témoins). Après grattage de la bande correspon-
les de l’analyse des stérols. dante, extraction des composés puis dérivatisation en triméthylsily-
Certains alcools (erythrodiol et uvaol) peuvent présenter un grand léthers, l’analyse est effectuée en CPG sur colonne capillaire de
intérêt dans la caractérisation de certaines huiles alimentaires (gri- méthylpolysiloxane ou méthylphénylpolysiloxane, dans les condi-
gnon d’olive, pépins de raisin). tions analogues à l’analyse des stérols.
La méthode la plus utilisée est la méthode par CLHP (celles de
UICPA 2-432). Le corps gras est mis en solution dans l’hexane. La
séparation s’effectue sur colonne de silice, la phase mobile étant un
4.4 Hydrocarbures mélange hexane-isopropanol 99-1 v/v. La détection s’effectue par
fluorescence (exitation : 290 nm ; émission : 330 nm (figure 9). La
méthode peut aussi être utilisée pour les esters de tocophérol (acé-
Séparés lors du fractionnement, les hydrocarbures sont analysés tate d’αtocophérol) simplement en modifiant légèrement les lon-
par CPG sur colonne capillaire apolaire. Quelques corps gras peu- gueurs d’onde (exitation : 290 nm ; émission : 308 nm).

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— temps d’apparition d’un trouble au cours du refroidissement

δ tocophérol
(Cold Test) qui renseigne sur la teneur présumée en cires ;
α tocophérol — dosage des cires ; fractionnement par chromatographie
liquide sur colonne de gel de silice à 2 % d’eau (élution par 140 ml
de mélange hexane-oxyde diéthylique 99-1 v/v), récupération de la
fraction contenant les cires, évaporation, analyse par CPG capillaire
sur colonne apolaire et quantification par étalonnage interne (ara-
β tocophérol

chidate laurique).

4.7 Colorants

Les colorants naturels des corps gras sont essentiellement des


caroténoïdes et des chlorophylles.
Les caroténoïdes sont analysés à partir de la fraction insaponifia-
ble en CLHP à polarité de phase inversée (éluant méthanol-chloro-
forme 90-10 v/v) avec détecteur UV/visible à barrette de diodes.
Les chlorophylles sont aussi caractérisées par CLHP sur colonne
de silice avec éluant hexane-isopropanol (98,5-1,5 v/v) par la
γ tocophérol

méthode officielle FOSFA (Federation of Oils, Seeds and Fats Asso-


ciations).

4.8 Vitamines

La détermination de la teneur en vitamine A s’effectue par CLHP


de la même manière que pour le carotène.

Colonne capillaire : phase stationnaire silice 5 µm, longueur 25 m Pour les vitamines D, après saponification à froid et extraction de
Phase mobile : hescane-isopropanol 99-1 v/v la fraction insaponifiable, le dosage est réalisé par double chroma-
Détection fluorescence : 290-330 nm tographie liquide : une première chromatographie sur une colonne
de silice, récupération de la fraction contenant les vitamines, puis
Figure 9 – Tocophérols par CLHP une deuxième chromatographie de cette fraction sur une colonne
octadécyl et quantification par étalonnage externe.

Dans certains corps gras (palme-maïs), les tocophérols sont asso-


ciés aux tocotriénols, que l’on analyse conjointement, que ce soit en
CPG ou en CLHP. 5. Mesure de l’altération
Les tocophérols, comme les autres constituants de l’insaponifia-
ble, présentent un profil caractéristique pour chaque corps gras.
Il existe aussi une méthode par CPG après extraction de l’insapo- Les corps gras sont des composés altérables. La présence d’eau
nifiable et CCM (NF T 60-239). (dans la graine, dans le milieu) peut entraîner des phénomènes
d’hydrolyse. Au cours de l’obtention, le chauffage ainsi que certains
métaux (en particulier le fer et le cuivre) peuvent entraîner des phé-
nomènes d’oxydation. Enfin, les rayonnements lumineux vont eux
4.6 Cires aussi créer des altérations.

Les cires ne sont pas considérées comme des corps gras. Cepen-
dant, certains corps gras peuvent contenir des quantités non 5.1 Acides gras libres
négligeables de cires considérées alors comme constituant mineur.
Les cires sont des composés complexes. Elles peuvent se trouver
naturellement en l’état (cire d’abeille, cires végétales) ou comme L’hydrolyse des corps gras, qu’elle soit d’origine chimique (pré-
constituants mineurs de certains corps gras (tournesol). L’analyse sence d’eau) ou enzymatique par les enzymes lipolytiques (palme,
doit donc être réalisée à deux niveaux : karité, olive) entraîne la formation d’acides gras libres.
— détermination de la composition des cires :
• teneur en insaponifiable (environ 50 %) après saponification L’acidité est le pourcentage d’acides gras libres exprimé con-
10 h en milieu alcalin 2N ; ventionnellement en acide laurique pour le coprah et le pal-
• composition de l’insaponifiable : alcools gras transformés en miste, acide palmitique pour le palme, acide oléique pour la
esters éthyliques, puis analyse par CPG ; majeure partie des corps gras.
• composition des acides gras après récupération de la partie
saponifiée ; L’acidité peut aussi s’exprimer sous la forme d’indice d’acide
— détermination de la teneur en cires dans les corps gras qui est le nombre de milligrammes de potasse nécessaire pour
(règlement CEE no 2568/91 annexe IV) : neutraliser 1 g de corps gras.

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Le rapport entre l’acidité exprimée en acide oléique et l’indice 5.4 Spectrométrie ultraviolette
d’acide est très voisin de 2.
Indice d’acide = Acidité oléique × 2 Au cours de l’oxydation, particulièrement à des températures éle-
vées, il peut y avoir un phénomène de conjugaison des doubles
L’acidité (NF EN ISO 660) est déterminée par :
liaisons. Dans le cas des corps gras polyinsaturés, les diènes conju-
— méthode titrimétrique soit à froid en milieu éthanol-oxyde dié- gués absorbent à 232 nm, alors que certains produits secondaires
thylique 50-50 v/v, soit à chaud (éthanol) en utilisant dans les deux (cétones, αdicétones) absorbent au voisinage de 268 nm. La mesure
cas une solution d’hydroxyde de potassium 0,1 N éthanolique pour peut s’effectuer selon les normes UICPA 2.505 et NF ISO 3656. Les
la méthode à froid, aqueuse pour la méthode à chaud ; densités optiques sont mesurées après mise en solution dans
— méthode potentiométrique : par détermination du point l’isooctane ou le cyclohexane et exprimées pour 1 g de corps gras.
d’équivalence après mise en solution du corps gras dans de l’étha-
nol chaud. Cette méthode est surtout utilisée dans le cas de corps
gras très colorés.
5.5 Composés polaires

5.2 Indice de peroxyde (IP) Lorsque l’on chauffe des corps gras à des températures élevées
(friture), les phénomènes d’oxydation et de dégradation des corps
gras sont amplifiés. Cette oxydation importante peut être appréciée
Les premiers composés formés au cours de l’oxydation sont les par :
peroxydes ou les hydroperoxydes. — l’accroissement de l’acidité libre ;
Ceux-ci vont ensuite évoluer vers des composés plus stables : — l’accroissement de la viscosité ;
aldéhydes, cétones, acides. — l’accroissement de l’indice de réfraction.
L’indice de peroxyde représente l’état d’oxydation au moment du La détermination de la teneur en composés polaires
dosage. (NF EN ISO 8420) est une méthode simple à réaliser ne demandant
pas un appareillage sophistiqué : l’échantillon après mise en solu-
tion est élué par un mélange éther de pétrole-oxyde diéthylique 87-
L’indice de peroxyde est le nombre de microgrammes d’oxy- 13 v/v au travers d’une colonne de silice hydratée à 5 %. Les compo-
gène actif contenus dans un gramme de corps gras et suscepti- sés plus polaires que les triglycérides sont adsorbés sur la silice.
bles d’oxyder l’iodure de potassium. L’éluant est évaporé, puis pesé. La teneur en composés polaires est
représentée par la différence entre la quantité éluée et la quantité
introduite.
Il est exprimé en microgrammes par gramme ou plus souvent en
milliéquivalent d’oxygène actif par kilogramme.
IP (µg/g) = 16 IP (mol/kg) = 8 IP meq d’O2/kg 5.6 Polymères de triglycérides
Le dosage peut être réalisé selon les normes NF T 60-220 et
ISO 3960. La méthode de dosage des composés polaires peut conduire
Après mise en solution du corps gras dans du solvant (chloro- quelquefois à des surévaluations : huiles acides, corps gras riches
forme-acide acétique 10-15 v/v ou isooctane-acide acétique), on en glycérides partiels, dosés avec les composés polaires. Par
ajoute l’iodure de potassium en solution saturée. Après un temps de ailleurs, cette méthode est relativement longue à réaliser (environ
repos, on dose l’iode libéré par une solution de thiosulfate de 3 h).
sodium en présence d’empois d’amidon. Les polymères de triglycérides peuvent être dosés en quelques
minutes par chromatographie liquide d’exclusion (NF T 60-247), les
grosses molécules, non retenues par les pores, migrent plus rapide-
ment que les petites. L’éluant utilisé est du tétrahydrofuranne, la
5.3 Indice de para-anisidine colonne de 300 mm est remplie d’un gel de type styrène-divinylben-
zène avec des pores de 10 nm (100 Å). Le détecteur est un détecteur
réfractométrique.
L’indice de para-anisidine (IpA) permet la quantification des com-
posés aldéhydiques, souvent caractéristiques de l’odeur de rance.
5.7 Mesure de la résistance à l’oxydation
L’indice de para-anisidine est 100 fois l’augmentation d’absor-
bance d’une solution d’essai, mesurée à une largeur d’onde de
350 nm dans une cuve de 10 mm d’épaisseur, après réaction Si l’on sait bien déterminer l’oxydation d’un corps gras, à un
avec la para-anisidine dans les conditions de l’essai. moment donné, il est beaucoup plus difficile de déterminer sa résis-
C’est un indice sans unité. tance à l’oxydation, donc sa durée de vie.
Test de Swift modifié (NF T 60-219) : on fait barboter un courant
d’air dans le corps gras. Cet air vient ensuite barboter dans une solu-
En solution acétique, les composés aldéhydiques réagissent avec tion contenant un indicateur coloré (rouge de crésol). Les composés
la para-anisidine pour donner un complexe coloré jaune absorbant d’oxydation volatils entraînés modifient le pH de la solution colorée
à 350 nm. qui passe du violet au pourpre, puis au jaune, ce qui correspond à
Le dosage peut être réalisé selon les normes UICPA 2-504 et un indice de peroxyde d’environ 20 meq d’O2/kg. Le résultat est
ISO 6885. exprimé en heures.
La connaissance des indices de peroxyde IP et de para-anisidine Rancimat (NF ISO 6886) : version automatique du test de Swift
permet de déterminer la valeur TOTOX (TOtal OXydation Value) : modifié ; c’est la mesure, à l’aide d’une cellule de conductivité dou-
ble en platine, de la variation de conductivité de l’eau distillée utili-
TOTOX = 2 IP + IpA sée dans le piège.

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6. Mise en évidence 6.3 Composition triglycéridique


des adultérations
Les progrès de la CLHP ont permis de réaliser des tables de com-
position triglycéridique. Un composé tel que la trilinoléine peut très
bien être utilisé pour caractériser la présence d’huile de tournesol
Les adultérations des matières grasses peuvent avoir deux
ou de pépins de raisins dans des huiles qui présentent habituelle-
origines :
ment une faible teneur en trilinoléine comme l’arachide ou l’olive.
— l’intérêt financier : mélange d’huiles de faible coût à des pro- La composition triglycéridique par CPG est aujourd’hui la seule
duits à forte valeur ajoutée (huile d’olive, de noix) ; méthode permettant de mettre en évidence la présence de matières
— l’accident ou incident de fabrication : mélanges accidentels ou grasses étrangères dans le beurre de cacao (étude en rapport C54/
pollutions dues aux installations. C50).
Les techniques modernes d’analyse, en particulier les chromato-
graphies, permettent aux analystes de mettre en évidence une adul-
tération ou une pollution, la « chimie des indices » étant 6.4 Tocophérols, alcools
pratiquement abandonnée.

Comme pour les stérols, les tocophérols peuvent être caractéristi-


ques d’une huile et donc être utilisés comme marqueurs. Ainsi, le
6.1 Acides gras δ tocophérol est caractéristique des huiles de soja.
La présence de tocotriénol indiquera l’addition d’huile de palme.
La détermination de la composition en acides gras est un moyen Erythrodiol et uvaol, diols terpéniques, sont caractéristiques des
relativement simple pour contrôler la pureté d’un corps gras. Il suffit huiles de pépins de raisins et de grignon d’olive.
dans un premier temps de comparer les valeurs obtenues soit à cel-
les de la littérature (nombreux sont les ouvrages incluant des tables
de composition des corps gras habituels), soit aux valeurs obtenues
à partir d’échantillons d’origine sûre. 6.5 Mise en œuvre
Certains acides gras peuvent être considérés comme marqueurs.
Dans tous les cas, recherche d’une adultération de façon
Exemple : ainsi si une huile d’arachide ou de tournesol présente
méthodologique : acides gras, stérols, triglycérides et tocophérols.
une teneur en acide linolénique (C 18:3) supérieure à 0,4 %, il y a lieu
Cependant, les technologies modernes, telles que l’hydrogénation,
de soupçonner une adultération par du colza ou du soja.
la transestérification ou interestérification, dans le cas de matières
De même l’acide érucique (C 22:1) fut pendant longtemps un excel- grasses solides, modifient considérablement certaines composi-
lent marqueur de l’huile de colza. tions.
La quantification des mélanges s’effectue simplement par la Exemples : si l’on prend le cas d’une huile utilisée pour la con-
moyenne arithmétique des acides gras mis en œuvre. servation des sardines, il est nécessaire de compléter systématique-
ment l’analyse des acides gras par celle de la fraction stérolique. Le
Cependant, selon la nature des corps gras, la composition en aci- phénomène d’osmose de l’huile de poisson se mélangeant à l’huile de
des gras peut être insuffisante pour caractériser un mélange. couverture ne permet pas de déterminer la nature de l’huile utilisée.
Dans le cas de pâtisseries au beurre, quelques pourcents de
matière grasse végétale (margarine) ne pourront être mis en évidence
par l’analyse des acides gras, mais à coup sûr par la composition de la
6.2 Fraction stérolique fraction stérolique (cholestérol + phytostérol).

Certains stérols peuvent être considérés comme d’excellents mar-


queurs d’espèces : 6.6 Cas de l’huile d’olive
— le brassicastérol caractérise les crucifères (colza, moutarde).
La présence de brassicastérol (même en faible quantité) sera carac-
L’huile d’olive est un corps gras parfaitement réglementé, tant
téristique d’une adultération ;
pour sa définition que pour sa composition.
— le ∆7 stigmastérol caractérise les huiles de tournesol et de
Le législateur européen a défini les différents types d’huile d’olive
carthame ; ainsi si l’on ajoute du tournesol à une huile d’arachide
(vierge, raffinée, grignons) ainsi que toutes les méthodes afférentes
d’origine africaine, on obtiendra une huile dont la composition en
à la composition (règlement CEE 2568-91 modifié), afin d’éviter tout
acides gras sera voisine d’une huile d’arachide d’origine
risque d’adultération. L’analyste va ainsi déterminer la qualité de
américaine ; l’analyse des stérols indiquera à coup sûr la présence
l’huile d’olive (acidité, indice de peroxyde). Il va rechercher la pré-
de ∆7 stigmastérol, donc de l’adultération de l’arachide ;
sence d’huiles étrangères par l’analyse des acides gras, des stérols,
— le cholestérol en quantité notable est caractéristique des grais- des triglycérides par CLHP. Ensuite, il va rechercher l’addition d’huile
ses animales. Certaines huiles végétales peuvent présenter des d’olive raffinée ou de grignons par la détermination de la teneur en
teneurs en cholestérol non négligeables (palme, huile de pépins de cires, de la teneur en stérènes (stigmasta-3,5-diène), en érythrodiol,
tomate). Dans de nombreux cas, il est impératif de compléter l’ana- et par l’analyse spectrophotométrique. Enfin, il va s’assurer de
lyse des acides gras par l’analyse de la fraction stérolique (olive, l’absence de solvants chlorés par l’analyse des résidus chlorés, tou-
noix, noisette, arachide d’origine américaine) pour la recherche tes ces valeurs analytiques étant définies par le législateur.
d’adultération.
Mais si l’huile d’olive est un produit parfaitement protégé, il n’est
Pour quantifier les mélanges à l’aide des stérols, il est nécessaire pas toujours nécessaire de réaliser des analyses aussi poussées afin
de connaître la teneur en stérols totaux des corps gras utilisés. de déterminer l’adultération d’un corps gras.

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