Bioquímica I

2010/2011

Separação das Proteínas do Soro de Coelho

por Electroforese em Acetato de Celulose

Alunas:

Andreia Sousa
n.º 40261
Alexandra Salvado
n.º 40267

29 de Março de 2011
1.º Ano - 2.º Semestre
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em Acetato de Celulose

1. Apresentação, Tratamento e
Discussão de Resultados

Tira de acetato de celulose obtido na electroforese

1 – Albumina
2 – Globulinas 1
3 – Globulinas 2
4 – Globulinas 
5 – Globulinas 
6 – Ponto de aplicação
Imagem 1 Tira de acetato de celulose obtida na electroforese (após a transparentização).

Interpretação do electroforama obtido

A electroforese envolve o movimento de espécies carregadas em

solução sob a acção de um campo eléctrico. As macromoléculas, neste caso,
proteínas, vão se movimentar no sentido oposto à sua carga (num determinado
valor de pH). Quando as proteínas têm carga global negativa – pH superior ao
pI da proteína –,
movimentam-se para o
eléctrodo com carga positiva
(ânodo), quando têm carga
global positiva – pH inferior
ao pI da proteína –,
movimentam-se para o

Imagem 2 Esquema de uma electroforese. eléctrodo com carga

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negativa (cátodo). A mobilidade electroforética (µ) de um composto é definida

como sendo igual à sua velocidade de migração (v) por unidade de intensidade
de campo eléctrico aplicado (E). Esta grandeza é inversamente proporcional à
carga, q, e inversamente proporcional ao tamanho da molécula e à viscosidade
do meio (ɳ) em que se processa a electroforese. No caso de a molécula ser
esférica, com um raio r, é válida a relação:

A carga das proteínas, que lhes confere a mobilidade numa

electroforese, depende do valor de pH da solução tampão em que se
encontram. Se o pH da solução for superior ao pI (ponto isoeléctrico), a
proteína ficará com carga global negativa (logo irá mover-se para o ânodo). Se
o pH da solução for superior ao pI, a proteína ficará com carga global positiva
(logo irá mover-se para o cátodo). Se o pH for igual ao pI, a proteína ficará no
ponto de aplicação, já que a sua carga global será nula – logo não migrará para
nenhum eléctrodo.

No soro de coelho normal estão presentes 15 proteínas que influenciam

o modelo electroforético. No entanto, como apresentam mobilidades
semelhantes geralmente apresentam apenas 5 bandas distintas:

 Albumina;
 Globulinas 1;
 Globulinas 2;
 Globulinas ;
 Globulinas .

Como todas as proteínas ficam com carga global negativa quando em

solução tampão a pH 8,6 todas migram para o ânodo, logo a amostra foi
aplicada perto do cátodo pois assim seria mais fácil observar a diferença entre
as bandas.

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Na tira de acetato de celulose apresentada acima (Imagem 1) é possível

observar 5 bandas distintas. Quanto maior a diferença entre o pH e o pI e
menor a massa relativa da proteína mais esta migra. No entanto, quando as
cargas das proteínas são semelhantes, o factor de diferenciação das moléculas
na tira vai ser a massa molecular relativa. Assim, como a que tem menor
massa relativa é a albumina e é nesta que a diferença entre o pH e o pI é
maior, é a albumina a proteína que mais migra, sendo seguida pelas globulinas
1, 2, ,  (esta última é a que apresenta uma diferença entre o pH e o pI
menor e a que tem maior massa). Pode-se também verificar que as
intensidades das cores são diferentes, devido às concentrações em que estão
presentes no plasma. Verifica-se, então, que a banda correspondente à
albumina é a de cor mais intensa – pois está presente no plasma em maiores
concentrações – e as menos intensas são as globulinas α, β e  - as suas
concentrações no plasma são menores.

Quadro 1 Quadro com a massa relativa de cada proteína, o seu nível no plasma e o seu pI.

Proteínas Nível no plasma Mr pI

aproximado
(g dm-3)

Albumina 40,0 66 000 4,9

Globulinas 1 4,5 40 000 – 60 000 -

Globulinas 2 6,5 100 000 – 400 000 4,9 – 6,3

Globulinas  8,5 110 000 – 120 000 -

Globulinas  11,0 150 000 – 400 000 6,3 – 7,6

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Justificação do aumento da intensidade de corrente ao longo da

electroforese

Quadro 2 Medição da amperagem, registada pelos diferentes grupos, a tempos de exposição à

intensidade de corrente diferentes.

Tira nº Tempo(min) I (mA)

0 9
1 45 13
2 50 14
3 60 15
4 70 -
5 90 6
6 100 3

No inicio da electroforese, os dois compartimentos (que continham

solução tampão) tinham a mesma carga, logo as proteínas não migravam. Para
que elas começassem a migrar era necessário criar uma diferença de potencial
entre eles (um tinha de ficar com carga positiva – ânodo – e outro com carga
negativa – cátodo), logo ligou-se os eléctrodos da tina à fonte de alimentação e
regulou-se a diferença de potencial para 200V. Como consequência, ao
ligarmos os dois compartimentos através da tira de acetato de celulose houve
uma corrente eléctrica no sentido do cátodo para o ânodo.

Esta corrente só existe enquanto houver diferença de potencial entre os

compartimentos – para que continue a existir corrente eléctrica é necessário
manter ligada a fonte de alimentação.

Durante a realização da electroforese verificou-se um aumento da

intensidade de corrente, 6 mA, como se pode observar no quadro 2. O
aumento da intensidade de corrente deve-se não só ao número de tiras, pois a
área por onde passa a corrente eléctrica é maior (pela equação , onde
é a corrente eléctrica, é a área, é a velocidade de impulso e é a carga)
como também ao aumento da temperatura (devido a energia dissipada) que

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tem como consequência uma diminuição da viscosidade da solução tampão, o

que se traduz numa diminuição da resistência, pela lei de Ohm ( , sendo
que corresponde ao potencial eléctrico, à resistência e à intensidade da
corrente) para uma diferença de potencial constante e uma diminuição da
resistência, aumenta a intensidade da corrente e, portanto, o aumento da
mobilidade dos iões na solução.

Quando se retirou a terceira tira (no total de seis) é possível observar

que a intensidade de corrente começou a baixar, isto deve-se ao facto de haver
menos tiras a ligar os dois compartimentos (a área por onde passa a corrente
eléctrica é menor).

Função do Ponceau S

Imagem 3 Fórmula estrutural da solução de Ponceau S.

Quando se retirou as tiras de acetato de celulose, no final da

electroforese, estas foram mergulhadas em solução de Ponceau S. Este
reagente permite corar as proteínas, pois liga-se aos grupos amina (carregados
positivamente) e às regiões apolares da proteína. Desta forma, numa tira de
acetato de celulose é possível observar bandas vermelhas (que são as
proteínas coradas) num fundo transparente.

A coloração das proteínas tornou possível visualizar com maior

facilidade as cinco bandas referidas acima, bem como determinar a que estava
em maior ou menor concentração – a com cor mais intensa é que existia em
maior concentração.

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Comparação dos resultados obtidos pelos diferentes grupos

Quadro 3 Resultados obtidos pelos diferentes grupos.

Tiras Resultado
1

(45 minutos)

(50 minutos)

(60 minutos)

(70 minutos)

(90 minutos)

(100 minutos)

A electroforese realizada na aula prática foi deixada a decorrer durante

tempos diferentes para os diferentes grupos, de modo a podermos comparar os
resultados da eficiência de uma electroforese.

O tempo pré-definido fora os 45 minutos – tempo ao qual foi retirada a

primeira tira. A partir daí as tiras foram retiradas de 10 em 10 minutos,
aproximadamente.

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O primeiro grupo foi aquele cujos resultados foram menos visíveis – a

tira deste grupo esteve exposta a uma corrente eléctrica durante um curto
tempo, quando comparada com as restantes tiras. As bandas das proteínas
não são claramente visíveis e são difíceis de distinguir (pouca migração das 5
proteínas) por esse mesmo motivo (fraca exposição à corrente eléctrica)

Após 50 minutos do início da electroforese, foi retirada a segunda tira.

Aqui a intensidade de corrente era praticamente idêntica à que se verificava
quando se retirou a primeira tira, pelo que a corrente eléctrica a que esta tira foi
exposta também foi fraca o que, somando ao pouco tempo da sua exposição,
resulta numa fraca distinção das bandas, assim como uma fraca migração das
5 proteínas.

Dez minutos depois foi retirada a terceira tira. Esta tira ainda se
apresentava na condição atrás mencionada: pouco tempo de exposição á
corrente eléctrica. Por esse motivo, nesta tira também não foi possível
distinguir com facilidade as 5 bandas das diferentes proteínas do soro de
coelho e não se observou uma boa migração por parte das mesmas.

Aos 70 minutos foi retirada a quarta tira. Nesta tira podemos assumir que
a corrente eléctrica foi mais fraca, uma vez que havia menos tiras na tina de
electroforese. No entanto, devido ao maior tempo de exposição, podemos
afirmar e observar que se conseguiu distinguir mais facilmente as 5 bandas
distintas de proteínas e a migração das mesmas também foi mais eficaz.

Após 90 minutos desde que se retirou a primeira tira, retirou-se a quinta

tira. Esta tira apresenta uma intensidade de corrente eléctrica semelhante à
registada quando se retirou a quarta tira, pelo que o factor determinante na
distinção das 5 bandas e a sua migração foi o tempo. Como esta tira esteve
mais tempo exposta a uma passagem de corrente eléctrica, foi possível
distinguir-se com alguma facilidade as diferentes bandas de proteínas assim
como o diferente nível das suas migrações.

Aos 100 minutos, foi retirada a sexta e a última tira. Esta tira, em
semelhança às últimas duas, também esteve exposta a uma menor intensidade

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de corrente eléctrica e, mais uma vez, o factor determinante na distinção das 5

bandas e a sua migração foi o tempo. Como esta tira esteve ainda mais tempo
exposta a uma passagem de corrente eléctrica, foi possível distinguir-se com
mais facilidade as diferentes bandas de proteínas assim como o diferente nível
das suas migrações.

Em conclusão, podemos dizer que quanto mais tempo estiver exposta e

mais forte for a passagem de corrente eléctrica, mais fácil se torna a distinção
das bandas assim como o diferente grau das suas migrações.

2. Bibliografia
 Quintas, A., Halpern, M.J., Freire, A.P. Eds., “Bioquímica –
Organização Molecular da Vida”, Lidel, Lisboa, 2008
 http://www.angelfire.com/clone2/fouad/techniques/ponceau_S_sol
ution.pdf (2 de Abril de 2011, às 15:04 h)

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3. Questões a desenvolver
As instruções para a realização de uma electroforese em papel indicam
que a amostra deve ser aplicada numa tira de papel 10x10cm,
previamente impregnada de uma solução tampão de fosfato de sódio (pH
6,5) 1mM, e sujeita depois a 10mA durante 1h a 0ºC. Preveja as
consequências das seguintes acções, justificando:

 Por engano, usou-se um tampão de fosfatos de sódio (pH 6,5)

100mM na separação;

Ao usar um tampão com maior concentração aumenta-se a força iónica

da solução. Ao aumentar a força iónica da solução provoca-se uma super
condutividade eléctrica que gera calor (energia dissipada). Este calor tem como
consequência uma diminuição da viscosidade da solução tampão, o que se
traduz numa diminuição da resistência, pela lei de Ohm ( , sendo que
corresponde ao potencial eléctrico, à resistência e à intensidade da
corrente) para uma diferença de potencial constante e uma diminuição da
resistência, aumenta a intensidade da corrente e, portanto, o aumento da
mobilidade dos iões na solução. Desta forma, a electroforese decorreria mais
rapidamente, o que iria provocar que as proteínas mergulhassem na solução
tampão.

 Por engano, não se ligou o sistema de refrigeração do aparelho;

Ao não se ligar o sistema de refrigeração do aparelho a temperatura

aumentaria logo, a viscosidade da solução tampão diminuiria bem como a sua
resistência. Ao diminuir a resistência de acordo com a lei de Ohm ( ,
sendo que V corresponde ao potencial eléctrico, R à resistência e I à
intensidade da corrente), para uma diferença de potencial constante e uma
diminuição da resistência, aumenta a intensidade da corrente o que leva a que

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as proteínas da amostra possam atravessar totalmente a tira de acetato de

celulose mergulhando na solução.

 Um compartimento do aparelho de electroforese tinha um volume

maior de solução tampão do que o outro.

Se num dos compartimentos houvesse um volume maior de solução

tampão, haveria a tendência para que esta se deslocasse no sentido de
equilibrar os volumes. A diferença entre os volumes levaria a uma maior
pressão na extremidade da tira de acetato de celulose em relação à outra
extremidade. Esta diferença de pressão conduziria a um movimento de iões da
solução da zona de maior pressão para a de menor pressão, até que a pressão
nas duas extremidades da tira se igualassem, situação que corresponde a
equilíbrio.
Este facto iria afectar os resultados da electroforese pois:
1. Se o sentido da migração das proteínas e o sentido do
deslocamento do volume fossem iguais: as proteínas migrariam
mais rapidamente, podendo mergulhar na solução.
2. Se o sentido da migração das proteínas e o sentido do
deslocamento do volume fossem opostos: as proteínas migrariam
no sentido contrário ao que deveriam (sentido da sua carga) e por
isso o resultado obtido seria errado.

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