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Agents antimicrobiens Chemother.

 mars 2004 ; 48(3) : 838-842.


doi:  10.1128/AAC.48.3.838-842.2004
PMCID : PMC353070
PMID : 14982773

Isolement et caractérisation des bactéries contenant


des intégrons sans sélection d'antibiotiques
Robert S. Barlow , 1, 2 John M. Pemberton , 2 Patricia M. Desmarchelier , 1 et Kari S.
Gobius 1, *

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ABSTRAIT
Les bactéries sont capables d'hériter de gènes de résistance aux antibiotiques pour
fournir une protection contre la plupart des antibiotiques. La dissémination de gènes
de résistance aux antibiotiques par transfert horizontal de gènes a conduit à
l'émergence rapide d'une résistance aux antibiotiques parmi les bactéries ( 13 ). Des
études approfondies ont montré que les éléments génétiques mobiles tels que les
plasmides et les transposons sont capables de faciliter la propagation du matériel
génétique entre les espèces ou les genres de bactéries. Dans les années 1980, des
éléments génétiques appelés intégrons ont été identifiés sur ces éléments mobiles
( 20 ). Les intégrons sont des systèmes de capture et d'expression de gènes
caractérisés par la présence d'un gène intI codant pour une intégrase, un site de
recombinaison ( attI ) et un promoteur ( 13)). Les intégrons sont capables de
capturer des cassettes de gènes de l'environnement et de les incorporer en utilisant
une recombinaison spécifique au site. A ce jour, au moins huit classes d'intégrons
ont été décrites ( 10 ). Chaque classe se distingue par des différences dans les
séquences des gènes de l'intégrase. Les classes d'intégron 1 et 2 contiennent des
cassettes de gènes de résistance aux antibiotiques et ont fait l'objet de nombreuses
et larges études ( 5 , 7 , 12 ). Les intégrons de classe 4 ont été appelés
superintégrons et se trouvent sur le petit chromosome de Vibrio cholerae . Les
superintégrons abritent des centaines de cassettes de gènes qui codent pour des
adaptations allant au-delà de la résistance aux antibiotiques et de la pathogénicité
( 14). Les autres classes d'intégrons peuvent également contenir des cassettes de
gènes de résistance aux antibiotiques, mais leur prévalence mondiale reste faible
( 2 , 10 ). Les intégrons jouent un rôle majeur dans la dissémination des gènes de
résistance aux antibiotiques chez les bactéries gram-négatives et sont couramment
associés aux membres de la famille des entérobactéries ( 4 ).
L'utilisation d'antibiotiques en milieu clinique et non clinique joue un rôle
important dans le développement de bactéries résistantes aux antibiotiques dans le
monde ( 3 ). L'utilisation d'antibiotiques comme prophylactiques et promoteurs de
croissance chez les animaux producteurs d'aliments et son effet sur le
développement de bactéries résistantes aux antibiotiques est un domaine qui est
devenu d'actualité ces derniers temps. La possibilité que des bactéries résistantes
aux antibiotiques ou les gènes de résistance aux antibiotiques portés par ces souches
entrent dans la chaîne alimentaire et, par conséquent, soient transmis à l'homme
( 19) est particulièrement préoccupant.). L'évaluation des intégrons contenant des
gènes de résistance aux antibiotiques fournit un moyen d'évaluer rapidement le
réservoir potentiel d'une forme de résistance aux antibiotiques qui peut être présente
dans les populations bactériennes associées aux animaux de production de
viande. Des méthodes capables de détecter, d'isoler et de caractériser les bactéries
résistantes aux antibiotiques contenant des intégrons peuvent permettre l'évaluation
de cette forme de transfert de gènes de résistance aux antibiotiques entre les hôtes
bactériens.
L'isolement de bactéries exprimant une résistance aux antibiotiques a
traditionnellement reposé sur la sélection de bactéries capables de croître en milieu
liquide ou solide contenant des antibiotiques spécifiques ( 22). Si le milieu choisi
est spécifique à la croissance d'un groupe limité de bactéries ou d'un genre bactérien
spécifique, la sélection d'isolats résistants aux antibiotiques peut être relativement
routinière. Cependant, si le milieu supporte la croissance d'une large gamme de
bactéries, on peut prévoir qu'une large gamme correspondante de bactéries qui
expriment apparemment une résistance aux antibiotiques sera également
propagée. Étant donné que différents genres et espèces bactériens présentent divers
niveaux de résistance intrinsèque aux antibiotiques, il est probable que certains
isolats bactériens exprimeront une véritable résistance aux antibiotiques, conférée
par un mécanisme actif de résistance aux antibiotiques, tandis que d'autres
montreront une résistance inhérente due à des facteurs tels qu'une absorption
réduite de antibiotiques particuliers. Dans ces cas, des efforts substantiels seront
nécessaires pour faire la distinction entre les isolats qui présentent une résistance
inhérente et ceux qui ont des mécanismes de résistance actifs acquis grâce à des
gènes de résistance aux antibiotiques. Le développement de méthodes pouvant
faciliter l'identification des bactéries résistantes aux antibiotiques, indépendamment
de leur sélection sur des milieux supplémentés d'un ou de plusieurs antibiotique(s),
accélérera grandement à la fois l'efficacité de l'isolement et l'évaluation de la
gamme des gènes de résistance aux antibiotiques portés par les antibiotiques. isolats
résistants.
À ce jour, aucun protocole permettant d'isoler des bactéries résistantes aux
antibiotiques contenant des intégrons à partir de populations mixtes n'a été
décrit. L'étude de la résistance aux antibiotiques transmise par les intégrons chez les
membres de la famille des entérobactéries a été dominée par la recherche clinique
et s'est centrée sur le dépistage phénotypique et génotypique de bactéries isolées de
patients symptomatiques ( 8 , 18 , 23). Bien que cette approche soit utile pour
surveiller le développement de la résistance aux antibiotiques au sein des bactéries
cliniquement importantes, elle sous-estime presque certainement la variété de gènes
de résistance aux antibiotiques associés aux intégrons qui existent et donc le
développement de bactéries résistantes aux antibiotiques. Dans la présente étude,
nous décrivons un protocole que nous avons développé. Le protocole est capable
d'identifier, d'isoler et de caractériser les bactéries résistantes aux antibiotiques
contenant des intégrons à partir de matières fécales animales, mais ne dépend pas
de leur expression de gènes de résistance aux antibiotiques.

MATÉRIELS ET MÉTHODES
Souches bactériennes
Trois souches de contrôle d' Escherichia coli portant intégron de classe 1 contenant
les plasmides R388 et R46 et de classe 2 intégron contenant du transposon Tn 7 ,
respectivement, ont été gracieusement fournis par Hatch Stokes (Macquarie
University). Le plasmide R388 porte un intégron de classe 1 avec deux cassettes de
gènes, dfrB 2 (qui code pour la résistance au triméthoprime) et orfA . Le plasmide
R46 porte également un intégron de classe 1 avec quatre cassettes de gènes. R46 a
deux copies identiques d' oxa2 (qui code pour la résistance à l'ampicilline) et une
copie chacune de aadA1 (qui code pour la résistance à la spectinomycine et à la
streptomycine) et orfD . Transposon Tn 7porte un intégron de classe 2 avec trois
cassettes de gènes, drfA1 (qui code pour la résistance au triméthoprime), sat (qui
code pour la résistance à la streptothricine) et aadA1 (qui code pour la
spectinomycine et la résistance à la streptomycine). Les souches témoins ont été
maintenues sur gélose Luria-Bertani contenant de l'ampicilline ou de la
streptomycine à 100 µg/ml.
Collecte et traitement des échantillons
Cinq échantillons fécaux ont été prélevés dans chacun des 10 troupeaux de bovins
sur une période d'un mois. Tous les échantillons de matières fécales ont été prélevés
sur des bovins qui avaient passé la nuit dans un abattoir local. Chaque troupeau de
bovins provenait d'emplacements géographiques indépendants séparés d'au moins
50 km. Une quantité de 10 g de matières fécales a été placée dans 90 ml d'eau
peptonée tamponnée (BPW ; Oxoid, Basingstoke, Angleterre), traitée avec un
stomiseur pendant 1 min, puis enrichie pendant 6 h à 37°C sans agitation. Un
aliquot de 100 µl d'enrichissement a été ré-enrichi dans 100 ml de BPW pendant 18
h supplémentaires à 37°C. Des matrices d'ADN ont été préparées à partir des
enrichissements résultants par lyse cellulaire bouillie. Brièvement, 1 ml
d'enrichissement pendant une nuit a été sédimenté par centrifugation, remis en
suspension dans 200 pi d'eau distillée stérile et bouilli pendant 10 min. Les
suspensions cellulaires bouillies ont été centrifugées,
Détection PCR des gènes de l'intégrase
Des lysats de cellules bouillies ont été testés par PCR pour la présence des gènes
d'intégrase intI1 et intI2 en utilisant des amorces spécifiques conçues pour amplifier
les régions conservées des gènes respectifs (tableau(Tableau 1).1). Les amorces HS
463a et HS 464 ont été utilisées pour détecter les échantillons intI1 positifs. Les
amorces RB 201 et RB 202 ont été utilisées pour détecter
les échantillons intI2 positifs. Les PCR ont été réalisées dans des mélanges
réactionnels de 25 µl contenant 2 µl d'ADN, 1,0 µM de chaque amorce
oligonucléotidique, 200 µM de désoxynucléoside triphosphates (Roche
Diagnostics, Mannheim, Allemagne), 10 mM de Tris-HCl, 1,5 mM de MgCl 2 , 50
mM de KCl ( Roche Diagnostics) et 1 U de Taq polymérase (Roche
Diagnostics). La PCR a été réalisée pendant 30 cycles de dénaturation à 94°C
pendant 30 s, hybridation à 65°C ( intI1 ) et 62°C ( intI2 ) pendant 30 s, et
extension à 72°C pendant 45 s. Les produits de PCR ont été visualisés par
coloration au bromure d'éthidium après électrophorèse sur gel d'agarose.
TABLEAU 1.
Amorces utilisées pour la détection par PCR des intégrases de classe 1 et de classe
2 et des régions de cassettes génétiques associées

a
 Nucleotides 11918 à 11937 de intI2 ( numéro d' accès GenBank AP002527 ).
b
 Complément des nucléotides 12292 à 12311 de intI2 ( numéro d' accès GenBank AP002527 ).
c
 Nucléotides 2250 à 2268 de intI1 ( numéro d' accession GenBank M95287 ).
d
 complément des nucléotides 5538-5559 de qacE Δ 1 (numéro d' accès GenBank no. M95287 ).
Isolement des bactéries contenant des intégrons
Les enrichissements positifs pour intI1 et/ou intI2 ont été dilués en série à 10 -
5,5
 dans 0,1% de peptone-1% de Tween 80. Un millilitre de la dilution a été filtré à
travers un filtre à membrane hydrophobe (HGMF) en utilisant un filtre étalé
(Filtaflex, Almonte , Ontario, Canada) et un collecteur à vide. Les HGMF ont été
placés sur de la gélose modifiée pour colite hémorragique (mHC) ( 21 ), qui
ne contenait pas de méthylumbelliferyl glucuronide, et ont été incubés pendant une
nuit à 37°C. Les colonies cultivées pendant la nuit ont été répliquées sur un HGMF
frais en utilisant un système réplicateur-inoculateur HGMF (Filtaflex) et incubées
comme décrit ci-dessus. Les colonies bactériennes sur le HGMF original ont été
lysées par la méthode de Nizetic et al. ( 11) après mouillage des membranes avec
une solution de prétraitement pendant 30 min ( 24 ). L'ADN a été réticulé au
HGMF par exposition à la lumière UV pendant 5 min.
Des membranes contenant de l'ADN réticulé ont été hybridées avec des sondes
marquées à la digoxigénine (DIG) capables de détecter intI1 ou intI2 générées avec
les amorces HS 463a et HS 464 ( sonde intI1 spécifique) et les amorces RB 210 et
RB 202 ( sonde intI2 le kit de marquage PCR DIG (Roche Diagnostics) selon les
instructions du fabricant. L'hybridation a été réalisée à 68°C par les méthodes
décrites dans le Guide de l'utilisateur du système DIG pour l'hybridation de filtres
(Roche Diagnostics). Présomptif intI1 - et intI2 colonies -positifs ont été cueillies
à partir HGMFs répliqués et striées sur des plaques de gélose nutritive (Oxoid).
Confirmation et caractérisation préliminaire des intégrons
Les isolats présumés positifs pour l'intégrase ont été confirmés comme étant positifs
pour l'intégrase par PCR. Tous les isolats contenant intI1 ont été testés pour la
présence d' intI2 , et de même, tous les isolats positifs pour intI2 ont été testés pour
la présence d' intI1 . Des amorces capables d'amplifier les régions de cassette de
gènes insérées des intégrons de classe 1 et de classe 2 ont été utilisées pour
déterminer les tailles des régions de cassette insérées. Les amorces RB 317 et RB
320 ont été utilisées pour amplifier la région de la cassette du gène de l'intégron de
classe 1 (Tableau(Tableau 1).1). Les conditions de cycle de PCR pour la région de
cassette de gène d'intégron de classe 1 PCR étaient 30 cycles de dénaturation à
94°C pendant 30 s, annelage à 59°C pendant 30 s et extension à 72°C pendant 3
min. La PCR de White et al. ( 23 ) a été utilisé pour amplifier la région de la
cassette du gène de l'intégron de classe 2.
La purification des produits de PCR a été réalisée par précipitation à
l'isopropanol. Brièvement, 45 µl de chaque mélange PCR ont été ajoutés à 180 µl
d'isopropanol à 75 %. Les échantillons ont été incubés à température ambiante
pendant 15 min pour permettre la précipitation des produits de PCR. Les
échantillons ont ensuite été placés dans une microcentrifugeuse et centrifugés à 17
000 × g pendant 20 min. Le surnageant résultant a été soigneusement aspiré, puis
250 l d'isopropanol à 75 % ont été ajoutés et les échantillons ont été centrifugés à
17 000 × gpendant 5 minutes. Après centrifugation, les surnageants ont été
soigneusement aspirés et les culots d'ADN résultants ont été séchés à 90°C pendant
1 min. Les culots ont finalement été remis en suspension dans 60 µl de tampon TE
(Tris-EDTA) (pH 8,0). La quantification de la concentration d'ADN de chaque
échantillon a été réalisée en utilisant une électrophorèse sur gel et des standards de
quantification d'ADN de bactériophage non digéré de 2, 4, 6, 8, 10 et 20 ng/μl
(Gibco BRL, Rockville, Maryland).
Les réactions de séquençage ont été réalisées en utilisant la chimie du terminateur
BigDye (version 2.0 ; Applied Biosystems) et un thermocycleur 9700 (Perkin-
Elmer, Norwalk, Connecticut). Chaque mélange réactionnel contenait 8 ul du
mélange réactionnel prêt pour le terminateur BigDye (version 2.0) et 3,2 pmol
d'amorce dans un mélange réactionnel de 20 ul. Les amorces utilisées pour le
séquençage étaient les mêmes que celles utilisées pour générer l'amplicon PCR. Le
programme PCR pour toutes les réactions de séquençage comprenait une
dénaturation initiale à 94°C pendant 5 min, suivie de 25 cycles de dénaturation
pendant 10 s à 96°C, un annelage de l'amorce pendant 5 s à 50°C et une extension
pendant 4 min à 60°C. C. Les produits de séquençage ont été purifiés par le
protocole de précipitation à l'isopropanol décrit ci-dessus et ont été transportés sur
de la glace jusqu'à l'Australian Genome Research Facility (Université du
Queensland, Brisbane, Australie) pour le séquençage.1 ). Les séquences ont été
alignées et comparées aux séquences de la base de données GenBank en utilisant le
composant ContigExpress de la suite Vector NTI (version 5.5 ; InforMax, Inc.,
Frederick, Md.).
Identification des isolats et tests de sensibilité aux antibiotiques
L'identification des organismes contenant des intégrons et les CMI des antibiotiques
pour les organismes ont été déterminées en utilisant le système VITEK Junior
(BioMérieux, Hazelwood, Mo.). Les cartes VITEK d'identification (cartes GNI) et
de test de sensibilité aux antibiotiques (cartes GNS-424) ont été ensemencées et
incubées selon les recommandations du fabricant. Les antibiotiques suivants ont été
testés : amikacine, amoxicilline-acide clavulanique, ampicilline, céfotaxime,
ceftazidime, céphalothine, ciprofloxacine, gentamicine, imipénem, méropénème,
nitrofurantoïne, norfloxacine, ticarcilline-acide clavulanique, tobramycine,
triméthoprim-s, et triméthoprime-sulfaméthazole. Un test de détection des β-
lactamases à spectre étendu (BLSE) a également été réalisé, et l'interprétation des
résultats était basée sur la comparaison de la réduction de la croissance causée par
le céfotaxime-clavulanate et le ceftazidime-clavulanate et celle causée par les
céphalosporines seules. Le résultat du test était soit BLSE positif, soit BLSE
négatif, tel que déterminé par l'appareil VITEK Junior.E. coli ATCC 25922 a été
utilisé comme organisme témoin.
RÉSULTATS
Prévalence des bactéries contenant des intégrons dans les matières
fécales bovines
Au total, 50 échantillons de matières fécales bovines provenant de 10 troupeaux de
bovins géographiquement indépendants ont été testés pour la présence d'intégrases
de classe 1 et de classe 2. Dans l'ensemble, 43 des 50 (86 %) échantillons ont été
testés positifs pour l'intégrase de classe 1 et 47 des 50 (94 %) étaient positifs pour
l'intégrase de classe 2. L'analyse de chaque troupeau pour la présence de l'intégrase
de classe 1 a identifié six troupeaux pour lesquels cinq échantillons sur cinq étaient
positifs, deux troupeaux pour lesquels quatre échantillons sur cinq étaient positifs et
un troupeau chacun pour lequel trois échantillons sur cinq et deux échantillons sur
cinq étaient positif. L'analyse de chaque troupeau pour la présence de l'intégrase de
classe 2 a également identifié huit troupeaux pour lesquels cinq échantillons sur
cinq étaient positifs, un troupeau pour lequel quatre échantillons sur cinq étaient
positifs et un autre troupeau pour lequel trois échantillons sur cinq étaient positifs.
Des isolats contenant des intégrons de classe 1 ont été isolés de 25 des 50 (50 %)
échantillons, et des isolats contenant des intégrons de classe 2 ont été isolés de 14
des 50 (28 %) échantillons. Neuf échantillons contenaient à la fois un organisme
contenant des intégrons de classe 1 et un organisme contenant des intégrons de
classe 2, et cinq échantillons contenaient plus d'un organisme contenant des
intégrons de classe 1. Aucun isolat contenant à la fois des intégrons de classe 1 et
de classe 2 n'a été trouvé.
Identification des isolats et tests de sensibilité aux antibiotiques
Tous les isolats confirmés porteurs d'un intégron de classe 1 ou de classe 2 ont été
identifiés au niveau de l'espèce avec le système VITEK Junior. Des intégrons de
classe 1 ont été trouvés dans Aeromonas caviae , Aeromonas veronii biovar sobria
et E. coli . Des intégrons de classe 2 ont été trouvés dans des isolats positifs à l'urée
de Providentia stuartii , E. coli , Proteus vulgaris , Proteus mirabilis , Shewanella
putrefaciens et Morganella morganii. Chaque isolat a reçu un numéro
d'identification Abr, et les sensibilités aux antibiotiques des isolats contenant des
intégrons ont été déterminées à l'aide des cartes GNS-424, qui déterminent les
sensibilités des bactéries gram-négatives. Les résistances aux antibiotiques des
souches testées sont présentées dans le tableauTableau 22.
TABLEAU 2.
Profils de résistance aux antimicrobiens des bactéries contenant des intégrons
a
 Abréviations des antibiotiques : AMP, ampicilline ; AMC, amoxicilline-acide clavulanique; CF,
céphalothine; FD, nitrofurantoïne; IMI, imipénem; SXT, triméthoprime-sulfaméthoxazole ; IMPT,
céfotaxime; TAZ, ceftazidime; TCC, ticarcilline-acide clavulanique; TMP, triméthoprime; TOB,
tobramycine.
b Les
 parenthèses indiquent une résistance intermédiaire.
c
 ND, non déterminé. Des cassettes de gènes putatifs ont été identifiées par séquençage partiel de
nucléotides et comparaison avec les séquences de la base de données GenBank en utilisant le
service BLAST ( 1 ).

Caractérisation des régions de cassettes génétiques insérées des


intégrons de classe 1 et de classe 2
Pour valider le succès de notre approche de détection d'isolats bactériens porteurs
d'intégrons codant pour la résistance aux antibiotiques, une caractérisation
préliminaire des régions de cassettes de gènes insérées a été réalisée. Les régions de
cassettes de gènes insérées des intégrons de classe 1 et de classe 2 ont été
amplifiées par PCR avec les amorces RB 317 et RB 320 pour les organismes
contenant des intégrons de classe 1 et les amorces Hep 74 et Hep 51 pour les
organismes contenant des intégrons de classe 2 (tableau(Tableau 1).1). Les
amplicons PCR produits par les amorces RB 317 et RB 320 avaient une taille de
900 à 2,1 kb et comprenaient des régions variables ayant la capacité de coder pour
entre une et trois cassettes de gènes insérées. Quelques isolats n'ont pas produit
d'amplicon lorsqu'ils ont été testés pour la présence d'une région de cassette de gène
insérée. Ceci était probablement dû à l'absence d'un segment conservé en 3' dans
ces organismes. Les amplicons PCR produits par les amorces Hep 74 et Hep 51
étaient de 2,2 kb et avaient la même taille que l'amplicon produit à partir de
la souche témoin Tn 7 . Les isolats de P. stuartii positifs à l'urée qui
étaient intI2 positifs n'ont pas réussi à produire un amplicon de toute taille lorsqu'ils
ont été testés.
Un séquençage direct partiel des régions de cassettes de gènes de 15 intégrons de
classe 1 sélectionnés au hasard a été effectué pour valider les preuves préliminaires
de la présence de cassettes de gènes de résistance aux antibiotiques. Cette approche
a déterminé la présence de cadres de lecture ouverts avec des identités de gènes
codant pour les dihydrofolate réductases ( dfr2D , dfrA1 , dfrXII et dfrV ), les
aminosides adényltransférases ( aadA1 et aadA2 ) et la chloramphénicol
acétyltransférase ( catB8 ( et catB3 )(Tableau 2).2). Le séquençage partiel des
intégrons de classe 2 a indiqué la présence de séquences orthologues au trio de
gènes de résistance aux antibiotiques ( drfA1 , sat et aadA1 ) associés à
Tn 7 (tableau(Tableau 22).

DISCUSSION
Le protocole de détection des intégrons développé dans cette étude a été validé avec
50 échantillons de matières fécales bovines prélevés dans les abattoirs locaux. Les
tests PCR ont indiqué la présence d' intI1 (86 %) ou d' intI2 (94 %) dans les
échantillons fécaux, tandis que des bactéries contenant des intégrons de classe 1 ou
2 ont été isolées dans 50 et 28 % des échantillons, respectivement. Les raisons des
taux d'isolement réduits n'étaient pas claires; cependant, ils peuvent être dus en
partie à l'utilisation de gélose mHC comme milieu de croissance pour les
HGMF. La gélose mHC est conçue pour favoriser la croissance des membres de la
famille des entérobactéries et inhiber la croissance des bactéries non entériques
( 21). Il est possible qu'un sous-ensemble des échantillons testés positifs par PCR
pour l'intégrase de classe 1 ou 2 contienne des bactéries contenant des intégrons qui
ne se développent pas sur la gélose semi-sélective. L'utilisation de milieux
favorables à la croissance d'un plus large éventail de bactéries peut entraîner un
meilleur taux d'isolement.
Des phénotypes de résistance multiple ont été observés parmi les isolats contenant
des intégrons de classe 1 et de classe 2. Une forte corrélation entre la présence
d'intégrons portant la dihydrofolate réductase et l'expression phénotypique de la
résistance au triméthoprime a été observée. De nombreux isolats présentaient
également une résistance aux antibiotiques mais ne possédaient pas les cassettes de
gènes de résistance aux antibiotiques correspondantes dans les intégrons
caractérisés à partir de ces isolats. Il est probable que de telles résistances soient
codées par des éléments non intégrés.
Le séquençage partiel des cassettes de résistance aux antibiotiques associées aux
intégrons a identifié des cadres de lecture ouverts avec des identités de gènes qui
codent pour la résistance au triméthoprime, à la streptomycine et à la
spectinomycine, à la streptothricine et au chloramphénicol. Des séquences
orthologues du gène de la dihydrofolate réductase et de l'aminoglycoside
adényltransférase ont été trouvées dans la majorité des organismes contenant des
intégrons de classe 1. Les isolats d' Aeromonas qui portaient des intégrons de classe
1 étaient les plus susceptibles de porter un orthologue du gène de la dihydrofolate
réductase et un orthologue du gène de l'aminoglycoside adényltransférase en
aval. La même observation a été faite pour des aéromonades mobiles isolées
d'élevages danois de truites arc-en-ciel et d'échantillons cliniques du Royaume-Uni
( 9 , 17). L' orthologue du gène de la chloramphénicol acétyltransférase ( catB8 ),
détecté dans un isolat d' A. caviae portant un intégron de classe 1, a déjà été associé
à des intégrons de classe 1 chez Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas
aeruginosa (numéros d'accès GenBank AF227506 et AF418284 ,
respectivement) . Les régions de cassettes de gènes insérées des intégrons de classe
2 détectées dans cette étude ont été partiellement séquencées et comparées à
l'intégron de classe 2 porté sur Tn 7 ( 6 ). Toutes ces séquences de E. coli , M.
morganii et P. vulgarisétaient identiques aux séquences des gènes portés sur Tn 7 ,
et il est donc hautement probable que ces isolats contiennent également Tn 7 ou des
transposons apparentés.
Les régions de cassette de gènes d'un certain nombre d'organismes contenant des
intégrons de classe 1 et 2 n'ont pas pu être amplifiées par PCR. Ces résultats
peuvent être dus au fait que les régions de cassettes de gènes insérées étaient trop
grandes pour être amplifiées par des techniques PCR conventionnelles ou que de
tels intégrons peuvent manquer du segment conservé 3' généralement associé à
cette classe d'intégron. L'incapacité de la PCR spécifique à la cassette du gène de
l'intégron de classe 2 à amplifier un produit à partir de l'un des isolats de P.
stuartii positifs à l'urée peut être due à la présence d'un intégron de classe 2 qui
contient le segment conservé 3' des intégrons de classe 1 similaire à celui trouvé
dans un isolat d' Acinetobacter baumannii ( 12 ). Un autre intérêt était le fait que
l'urée-positive contenant de l'intégrase de classe 2Les isolats de P. stuartii n'ont pas
montré de résistance au triméthoprime, alors que tous les intégrons de classe 2
précédemment décrits ont codé la résistance au triméthoprime. Dans l'ensemble,
l'absence de résistance au triméthoprime dans les isolats de P. stuartii positifs à
l'urée et l'absence d'amplicons de la PCR spécifique à la cassette du gène de
l'intégron de classe 2 suggèrent que les gènes de l'intégrase de classe 2 des isolats
de P. stuartii positifs à l'urée ne font pas partie de Tn 7 ou d'éléments génétiques
apparentés. Une caractérisation ultérieure peut déterminer si les gènes P. stuartii
intI2 positifs à l'urée sont associés à des cassettes de résistance aux antibiotiques ou,
en variante, font partie d'une nouvelle structure de superintégron, proposée comme
le progéniteur des intégrons de résistance aux antibiotiques (15 , 16 ).
Le but de cette étude était de développer et de valider un protocole qui pourrait être
utilisé pour identifier, isoler et caractériser les bactéries contenant des intégrons de
classe 1 et de classe 2 à partir d'échantillons environnementaux. Les procédés
actuels pour l'isolement de bactéries résistantes aux antibiotiques dépendent de la
sélection de tels isolats sur des milieux contenant des antibiotiques. Un avantage
significatif du protocole développé dans ce travail est que les bactéries portant des
cassettes de gènes de résistance aux antibiotiques associées aux intégrons pourront
désormais être isolées sans sélection préalable des bactéries sur des milieux de
culture contenant des antibiotiques. Cela permettra d'examiner les gènes de
résistance aux antibiotiques qui n'ont pas été détectés sur la base de leur expression
sélective et peut faciliter l'identification des gènes de résistance aux antibiotiques
qui sont portés silencieusement par la bactérie hôte. Alors que les gènes de
résistance aux antibiotiques portés silencieusement peuvent ne fournir aucun
avantage dans leur hôte bactérien immédiat, le transfert vers un autre hôte peut
alors être suivi d'une expression. L'identification, l'isolement et la caractérisation
rapides et efficaces des intégrons de résistance aux antibiotiques sont possibles
grâce à ce protocole. Ce protocole peut maintenant être appliqué pour faciliter une
meilleure compréhension des facteurs qui contribuent à la présence et au transfert
de gènes de résistance aux antibiotiques associés aux intégrons dans des isolats
bactériens provenant de diverses sources environnementales et animales.

REMERCIEMENTS
Ce travail a été soutenu par Meat and Livestock Australia et CSIRO.
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Les articles sur les agents antimicrobiens et la chimiothérapie sont fournis ici avec l'aimable autorisation de l' American
Society for Microbiology (ASM)

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