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Méthodes en immunologie

Des principes aux bonnes applications


Chez le même éditeur

Du même auteur :
Guides des analyses en immunologie : indications, critères de réalisation et limites, 284 pages, 2014.
Immunologie fondamentale et immunopathologie. Enseignements thématique et intégré - Tissu lym-
phoïde et sanguin/Immunopathologie et immuno-intervention, 280 pages, 2013.

Autres ouvrages :
Bactériologie médicale, 2è édition, par François Denis, Marie-Cécile Ploy, Christian Martin, Edouard
Bingen, Roland Quentin, 640 pages, 2011.
Gaz du sang facile, par Iain A M Hennessey, Alan G Japp, Éric Raynaud de Mauverger, 152 pages, 2010.
Le bilan biochimique facile, Jeremy Hughes, Ashley Jefferson, Éric Raynaud de Mauverger, 248 pages,
2009.
Guide thérapeutique 2014, 7è édition, par Léon Perlemuter et Gabriel Perlemuter, 2 368 pages, à paraître.
Dictionnaire médical, 6è édition, version électronique et atlas anatomique inclus, par Jacques
Quevauvilliers, 1 608 pages, 2009.
Méthodes en immunologie
Des principes aux bonnes applications

Collège des enseignants d'immunologie (Assim)


Coordinateurs de l'ouvrage :
Marie Christine Béné

Christian Drouet

Sylvain Fisson

Estelle Seillès
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© 2014 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés


ISBN : 978-2-294-74022-0
ISBN numérique : 978-2-294-74159-3
Dépôt légal : septembre 2014

Elsevier Masson SAS, 62, rue Camille-Desmoulins, 92442 Issy-les-Moulineaux cedex


www.elsevier-masson.fr
Liste des collaborateurs

Ce livre a été rédigé sous l'égide de l'ASSIM, Association Jean-Luc Aymeric, Université de Montpellier 2
des Collèges des Enseignants d'Immunologie. Faculté des Sciences.
L'ensemble de l'ouvrage a été coordonné par : Marie Christine Béné, l'UNAM Nantes Faculté
Marie Christine Béné, PU-PH en Hématologie, de Médecine et CHU de Nantes.
CHU de Nantes & Faculté de Médecine, Uni- Sandrine Billaud, l'UNAM Angers Faculté de
versité de Nantes. Pharmacie.
Christian Drouet, PU-PH en Immunologie,
Stéphane Birklé, l'UNAM Nantes Faculté de
Université Joseph-Fourier FRE CNRS 3405,
Faculté de Pharmacie & CHU de Grenoble.
Pharmacie.
Sylvain Fisson, Professeur des Universités en Philippe Bulet, Université Joseph-Fourier FRE
Immunologie, Faculté des Sciences Fonda- CNRS 3405, Grenoble.
mentales Appliquées, Université d'Évry Val Claude Capron, Université de Versailles St Quen-
d'Essonne (UEVE). tin en Yvelines Faculté de Médecine et Hôpital
Estelle Seillès, PU-PH en Immunologie, CHU Ambroise Paré, Boulogne-Billancourt.
de Besançon & Faculté de Médecine et de Phar-
Guislaine Carcelain, Université Pierre et Marie
macie, Université de Franche-Comté.
Curie Faculté de Médecine et Groupe Hospita-
La rédaction de chaque chapitre a été pilotée par lier Pitié Salpêtrière, Paris.
un ou plusieurs coordonnateurs et sa rédaction réa-
Alain Chevailler, l'UNAM Angers Faculté de
lisée par un groupe d'auteurs.
Médecine & CHU d'Angers.
Introduction générale Sylvie Chollet-Martin, Université Paris Sud
Marie Christine Béné, Christian Drouet, Sylvain Faculté de Pharmacie et Hôpital Bichat,
Fisson et Estelle Seillès. Paris.
Cécile Contin-Bordes, Université Bordeaux Sega-
Partie I – Techniques immunologiques
len Faculté de Médecine et CHU de Bordeaux.
Coordonnateurs : Sandrine Billaud, Stéphane Marie-Hélène Delfau-Larue, Université Paris-
Birklé, Sylvie Chollet-Martin, Cécile Contin- Est Créteil Faculté de Médecine et Hôpital
Bordes, Ludovic Freyburger, Brigitte Gubler, Henri Mondor, Créteil.
Gilles Thibault
Olivier Diaz, Université Claude Bernard Lyon 1
Auteurs : INSERM U1111.
Patricia Amé-Thomas, Université de Rennes  1 Christian Drouet, Université Joseph-Fourier
Faculté de Médecine et CHU de Rennes FRE CNRS 3405 Faculté de Pharmacie et
Pontchaillou. CHU de Grenoble.
Karim Arafah, Université Joseph-Fourier, Plate- Sylvain Dubucquoi, Université de Lille 2 Faculté
forme BioPark d'Archamps, Archamps. de Médecine et CHU de Lille.
Jacques Aubry, l'UNAM Nantes Faculté de Sylvie Chollet-Martin, Université Paris Sud
Pharmacie. Faculté de Pharmacie et Hôpital Bichat, Paris.
VI Liste des collaborateurs

Sylvain Fisson, Université d'Évry Val d'Essonne Ghislaine Sterkers, Université Denis Diderot
(UEVE), Faculté des Sciences Fondamentales Faculté de Médecine et Hôpital Robert Debré,
Appliquées. Paris.
Bertrand Favier, Université Joseph-Fourier Gre-
Gilles Thibault, Université François Rabelais
noble FRE CNRS 3405.
Faculté de Pharmacie et CHU Bretonneau,
Ludovic Freyburger, VetAgro Sup Campus vété- Tours.
rinaire de Lyon.
Jean-Pol Frippiat, Université de Lorraine Faculté Arlette Tridon, Université d'Auvergne Faculté
des sciences Nancy. de Pharmacie et CHU de Clermont-Ferrand.
Marie-Anne Gougerot-Pocidalo, Université Florence Velge-Roussel, Université François
Denis-Diderot Faculté de Médecine et Hôpital Rabelais Faculté de Pharmacie, Tours.
Bichat, Paris.
Brigitte Gubler, Université de Picardie Jules Joana Vitte, Université de la Méditerranée Aix-
Verne Faculté de Médecine et CHU d'Amiens. Marseille Faculté de Médecine et Hôpital de la
Conception, Marseille.
Christine Legrand-Frossi, Université de Lor-
raine Faculté des Sciences et technologies. Partie II – Exemples d'applications
Brigitte Le Mauff, Université de Caen Basse-­
Coordonnateurs : Patricia Amé-Thomas, Jacques
Normandie Faculté de Médecine et CHU de Caen. Bienvenu, Alain Chevailler, Marie-Agnès Dragon-
François Lemoine, Université Pierre et Marie Duret, Christian Drouet, Myriam Labalette,
Curie Faculté de Médecine et Groupe Hospita- Marie-Paule Lefranc, Brigitte Le Mauff, Jean-
lier Pitié Salpêtrière, Paris. Yves Muller, Estelle Seillès.
Damien Masson, l'UNAM Nantes Faculté de Auteurs :
Médecine et CHU de Nantes.
Eltaf Alamyar, Université de Montpellier 2
Jeanne Moreau, Université de Limoges, Faculté
Faculté des Sciences et Techniques.
de Pharmacie.
Patricia Amé-Thomas, Université de Rennes  1
Jean-François Nicolas, Université Claude Ber-
Faculté de Médecine et CHU de Rennes
nard Lyon 1 Faculté de Médecine et Hospices
Pontchaillou.
Civils de Lyon.
Jacques Bienvenu, Université Claude Bernard
Olivier Nüsse, Université Paris Sud.
Lyon 2 Faculté de Pharmacie et Hospices Civils
Franck Pagès, Université René Descartes Faculté de Lyon.
de Médecine et Hôpital Européen Georges
Marie-Laure Boulland, CHU de Rennes Pont-
Pompidou, Paris.
chaillou et Faculté de Médecine, Université de
Denise Ponard, Université Joseph-Fourier et Rennes 1.
CHU de Grenoble.
Delphine Charignon, Université Joseph-Fourier
Philippe Robert, Bioprojet Biotech. FRE CNRS 3405 et CHU de Grenoble.
Paul Rouzaire, Université d'Auvergne Faculté de Alain Chevailler, l'UNAM Faculté de Médecine
Pharmacie et CHU de Clermont-Ferrand. et CHU d'Angers.
Géraldine Schlecht-Louf, Jacques Chiaroni, Université de la Méditerra-
Université Paris Sud. née Aix-Marseille Faculté de Médecine et EFS
Nabila Seddiki, Université Paris-Est Créteil
Alpes-Méditerranée.
Faculté de Médecine et Hôpital Henri-Mondor, Federica Defendi, Université Joseph-Fourier
Créteil. FRE CNRS 3405 et CHU de Grenoble.
Liste des collaborateurs  VII

Marie-Agnès Dragon-Duret, Université René Jean-Yves Muller, l'UNAM Nantes Faculté de


Descartes Faculté de Médecine et Hôpital Médecine et CHU de Nantes.
Européen Georges Pompidou, Paris. Denise Ponard, Université Joseph-Fourier et
Christian Drouet, Université Joseph-Fourier CHU de Grenoble.
FRE CNRS 3405 Faculté de Pharmacie et Vanessa Ratié, Université de Franche-Comté
CHU de Grenoble. Faculté de Médecine et EFS Bourgogne
Patrice Duroux, Université de Montpellier 2 Franche-Comté, Besançon.
Faculté des Sciences et Techniques. Marie-Nathalie Sarda, Université Claude Ber-
Arije Ghannam, Université Joseph-Fourier FRE nard Lyon 2 Faculté de Médecine et Hospices
CNRS 3405 et EFS Rhône-Alpes. Civils de Lyon.
Véronique Giudicelli, Université de Montpellier Souphatta Sasorith, Université de Montpellier 2
2 Faculté des Sciences et Techniques. Faculté des Sciences et Techniques.
Myriam Labalette, Université Lille 2 Faculté de Estelle Seillès, Université de Franche-Comté
Médecine et CHU de Lille. Faculté de Médecine et de Pharmacie et CHU
Marie-Paule Lefranc, Université de Montpellier de Besançon.
2 Faculté des Sciences et Techniques. Jean-Luc Taupin, Université Bordeaux Segal
Brigitte Le Mauff, Université de Caen Basse-Nor- Faculté de Médecine et CHU de Bordeaux.
mandie Faculté de Médecine et CHU de Caen. Arlette Tridon, Université d'Auvergne Faculté
Charline Marotel, Université de Franche-Comté de Pharmacie et CHU de Clermont-Ferrand.
Faculté de Médecine et de Pharmacie et CHU
de Besançon.
Abréviations

ABC Avidin–Biotin Complex FLISA Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay


Ac Anticorps FPIA Fusion Proteins for Immune Applications
ADN Acide désoxyribonucléique FRO Formes réactives de l'oxygène
Ag Antigène FSC Forward scatter
APC Analyse en Composantes Principales FT-ICR 
Fourier Transform Ion Cyclotron
ARN Acide ribonucléique Resonance
ASO Allele Specific Oligonucleotides GEP Gene Expression Profile
ATG Autophagy related genes GFP Green Fluorescent Protein
BcR B cell Receptor HAT Hypoxanthine, Aminoptérine, Thymidine
BrdU Bromodéoxyuridine HGPRT Hypoxanthine–Guanine–Phosphoribosyl–
BSA Bovine Serum Albumin Transférase
CAM Complexe d'Attaque Membranaire HLA Human Leucocyte Antigens
CDC Complement Dependent Cytotoxicity HPLC High Performance Liquid Chromatography
CDR Complementarity Determining Regions HRP horseradish peroxidase
CFSE CarboxyFluorescéine Diacétate ICM ImmunoChromatographie sur Membrane
Succinimidyl IEF Isoélectrofocalisation
CFU Colony Forming Units IG Immunoglobuline
CGD Chronic Granulomatous Disease IMGT® international ImMunoGeneTics
CGH Comparative Genomic Hybridization information system®
CHO Chinese hamster ovary INN International Nonproprietary Name
CMF Cytométrie en flux IP Indice de Phagocytose
CMH Complexe Majeur d'Histocompatibilité KI Knock-In
CNV Copy Number Variation KO Knock-Out
CPA Cellule Présentatrice d'Antigènes LC Liquid Chromatography
CPCA  Composite Proteins for Clinical LCR Liquide Céphalo-Rachidien
Applications LDA Limit Dilution Assay
cpm Coups par minute LLC Leucémie Lymphoïde Chronique
Ct Cycle threshold MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/
CTL Cytotoxic T Lymphocytes Ionization
DCI Dénomination Commune Internationale MEVB Microscopie électronique à balayage
DGVB Dextrose Gelatin Veronal Buffer MET Microscopie électronique à transmission
DO Densité Optique MGUS  Monoclonal Gammapathy of Undetermined
EBV Epstein-Barr Virus Significance
ECL Enhanced chemiluminescence MH Major Histocompatibility
EDTA Acide éthylène diamine tétra-acétique MLR Mixed Lymphocyte Reaction
EIA Enzyme Immuno Assay MS Mass Spectrometry
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay MS/MS Tandem Mass Spectrometry
ELISpot Enzyme-Linked ImmunoSpot MSI Mass Spectrometry Imaging
ESI ElectroSpray Ionization NADPH Nicotinamide adénine dinucléotide
FACS Fluorescence Activated Cell Sorter phosphate
FISH Fluorescence In Situ Hybridization NBT NitroBleu de Tétrazolium
FITC Fluoresceine isothiocyanate NGS Next Generation Sequencing
X Abréviations

NHS N-hydroxysuccinimide SAGE Serial Analysis of Gene Expression


NK Natural Killer SBT Sequencing Based Typing
NOD Non-Obese Diabetic SCID Severe Combined ImmunoDeficiency
OMS Organisation Mondiale de la Santé SDS Sodium Dodécylsulfate
PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis SEM Scanning Electron Microscopy
PAL Phosphatase alcaline SFC Spot Forming Cells
PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells SMM Smoldering Multiple Myeloma
PBS Phosphate-Buffered Saline SNP Single Nucleotide Polymorphism
pb Paire de bases SPR Surface Plasmonic Resonance
PCA Principal Component Analysis SSC Side scatter
PCR Polymerase Chain Reaction SSO Sequence Specific Oligoprobes
PEG Polyéthylène glycol SSP Sequence Specific Primers
PMF Peptide Mass Fingerprinting STR Short Tandem Repeat
PMT Photomultiplicateur SVF Sérum de Veau Fœtal
PSM Poste de Sécurité Microbiologique TAP  Transporter Associated
PVDF Polyvinylidene difluorure with antigen Processing
qRT-PCR 
Quantitative Real Time-Polymerase TBS Tris-Buffered Saline
Chain Reaction TcR T cell Receptor
RAI Recherche des Agglutinines Irrégulières TR Récepteur T
Rf Mobilité relative RDA Test Direct à l'Antiglobuline
RFLP  Restriction Fragment Length TDR Test de Diagnostic Rapide
Polymorphism TEM Transmission Electron Microscopy
RIA Radio-Immuno-Assay TIA Test Indirect à l'Antiglobuline
RISC RNA-Induced Silencing Complex TLR Toll-Like Receptor
ROS Reactive Oxygen Species TMA Tissue MicroArray
RP Reversed-Phase TOF Time Of Flight
RPI Related Proteins of the Immune System TROD Test Rapide à Orientation
RT Reverse Transcription Diagnostique
RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain UV Ultraviolets
Reaction VIH Virus de l'Immunodéficience
RU Resonance Unit Humaine
Avant-propos

La connaissance du système immunitaire a de phagocytose, de bactéricidie ou de migration.


conduit à développer dans un contexte immuno­ À un niveau plus intégré, certaines techniques
logique des techniques d'analyse moléculaire et mettent en jeu tout ou partie des partenaires du
cellulaire. Les techniques moléculaires sont utili­ système immunitaire dans des tests in  vivo ou
sées pour l'analyse de la clonalité des réponses ex vivo.
immunitaires, pour l'étude des modifications Les principes et caractéristiques majeurs de ces
génomiques (ADN) ou transcriptomiques (ARN), méthodes sont décrits dans la première partie de
en mettant à profit les propriétés des protéines cet ouvrage, alors que la seconde partie exemplifie
intervenant dans l'immunité avec des dosages dans une série d'applications comment ces tech­
quantitatifs ou qualitatifs par les techniques d'im­ nologies peuvent être conjuguées pour des explo­
munochimie appliquées à de nombreux ligands. rations spécifiques.
Les techniques cellulaires permettent d'examiner L'objectif de cet ouvrage est d'apporter aux
et éventuellement de manipuler les capacités étudiants, personnels techniques, praticiens et
d'expression des gènes et des protéines des cel­ chercheurs, un référentiel méthodologique afin de
lules de l'immunité. Les propriétés spécifiques des guider les choix expérimentaux les plus pertinents
cellules du système immunitaire sont exploi­tées au regard des questions posées.
notamment dans des techniques d'immuno­ ­
phénotypage, de prolifération, de cytotoxicité, Les coordinateurs
Chapitre 1
L'antigène comme réactif :
définition et propriétés

Le terme d'antigène désigne une espèce molécu- le plus souvent des antigènes peptidiques, associés
laire biologique ou synthétique reconnue par un aux molécules du complexe majeur d'histocompa-
récepteur spécifique du système immunitaire tibilité (CMH) ou human leucocyte antigens
(e.g. immunoglobulines, récepteurs des lympho- (HLA) chez l'homme.
cytes B ou T). L'antigénicité désigne la capacité de Un épitope correspond à la structure minimale
la molécule à être reconnue spécifiquement par un d'un antigène reconnue par une partie limitée pour
récepteur. L'immunogénicité traduit la capacité le récepteur de l'antigène, appelée paratope. Un
d'un antigène à induire une réponse immunitaire. antigène peut être constitué d'une mosaïque d'épi-
Un antigène peut être tolérogène lorsque sa recon- topes. La structure d'un épitope dans l'espace (ou
naissance n'induit pas de réponse immunitaire. structure stéréochimique) peut être séquentielle
(ou linéaire) ou conformationnelle (structures
secondaire, tertiaire ou quaternaire). Des modifica-
Caractéristiques tions post-traductionnelles (e.g. glycosylation,
des antigènes phosphorylation, méthylation) peuvent changer la
structure des épitopes. La structure native d'une
Leur définition sous-entend une interaction spé- protéine est généralement conformationnelle et
cifique avec le système immunitaire adaptatif et comprend des modifications post-­traductionnelles.
plusieurs critères permettent de caractériser les Un antigène mimétique possède un épitope sté-
antigènes. réochimique (mimotope) dont la structure peut être
Les récepteurs pour l'antigène des lympho- proche de ou identique à celle d'un autre épitope
cytes B (BCR) peuvent reconnaître des molécules porté par une molécule différente. Ce type d'anti-
natives, en solution ou particulaires. La plupart gènes peut être à l'origine de réactions croisées.
des antigènes induisent une réponse lymphocy-
taire B faisant appel aux lymphocytes T auxiliaires
(ou helper) et sont appelés antigènes thymo-
dépendants. Certaines structures répétitives Nature chimique, origine
peuvent induire des réponses lymphocytaires B et localisation des antigènes
sans l'intervention (help) des lymphocytes T et
sont appelées antigènes thymo-indépendants Les antigènes peuvent être des protéines, des poly-
(e.g. antigènes polyosidiques). saccharides, des lipides, des acides nucléiques, des
Les récepteurs pour l'antigène des lymphocytes métaux, des molécules de synthèse ou des molé-
T (TCR) reconnaissent des fragments d'antigènes, cules complexes (e.g. glycolipides, glycoprotéines).
Méthodes en immunologie
© 2014 Elsevier Masson SAS. Tous droits reservés
10 Techniques immunologiques

Selon leur origine, on distingue les antigènes possède une constante proche de 10−4 L.mol−1 et
non immunogènes ou haptènes, les antigènes un anticorps de haute affinité, une Ka proche de
propres à une espèce différente ou xéno-antigènes, 10−12 L.mol−1. Une autre façon d'exprimer l'affi-
propres à des individus différents dans la même nité d'un complexe épitope/paratope est de défi-
espèce ou allo-antigènes, propres à un individu nir la concentration molaire permettant de saturer
donné ou auto-antigènes et les néo-antigènes, for- 50 % des récepteurs présents. On considère qu'une
més de novo par transformation de l'antigène origi- faible affinité est de l'ordre de 10−4 mM et une
nel ou issus de la combinaison de plusieurs forte affinité de l'ordre de 10−9 mM. Cette affinité
molécules. Les auto-antigènes peuvent être à l'ori- dépend de la complémentarité entre l'épitope et le
gine de maladies auto-immunes lorsqu'ils sont paratope.
associés à un signal de danger. Les immunoglobulines portent au minimum
Les antigènes et épitopes cryptiques ont pour parti- deux paratopes semblables, capables de r­ econnaître
cularité d'être inaccessibles aux récepteurs spécifiques les mêmes épitopes, si ceux-ci sont répétés au sein
du système immunitaire parce qu'ils sont enfouis au du même antigène ou présents sur deux antigènes
sein d'une molécule, d'une cellule ou d'un tissu. proches. La valence antigénique correspond au
Les super-antigènes présentent une structure nombre de molécules d'un épitope donné ­pouvant
moléculaire créant une liaison non spécifique être reconnues simultanément par des ­anticorps
entre des TCR (en dehors des régions de recon- qui lui sont spécifiques. L'accès des paratopes aux
naissance ou CDR) et les molécules du CMH. Ils épitopes est par ailleurs contraint par la notion
conduisent ainsi à une réponse immunitaire dis- d'encombrement stérique. La valence antigénique
proportionnée et secondairement à la mort des est ainsi toujours inférieure ou égale au nombre
cellules qui sont entrées en contact avec cette d'épitopes.
molécule. Ce sont souvent des toxines produites L'avidité représente la résultante des différentes
par des agents pathogènes qui sont considérées forces d'interaction engagées entre les anticorps et les
comme des facteurs de virulence. épitopes. La force d'interaction globale d'un anti-
Les allergènes sont des antigènes de l'environ- corps avec sa cible dépend alors du nombre de para-
nement qui ne déclenchent normalement pas de topes qu'il peut engager. Ainsi, une IgM,
réaction inflammatoire, sauf chez des sujets aller- pentamérique, qui peut engager ses dix paratopes lors
giques ou atopiques où ils sont à l'origine de de l'interaction avec un antigène, a une force d'inter­
manifestations cliniques. action (avidité) plus importante que celle d'une IgG
qui ne peut engager que deux paratopes identiques.

Thermodynamique de la
réaction antigène–anticorps
Qualité de l'antigène
Les caractéristiques physiques des réactions anti- et interactions
gène–anticorps sont très importantes à connaître antigène–récepteur
pour le développement de techniques qui les uti-
lisent car elles conditionnent de nombreux para- Une modification infime de l'épitope peut avoir
mètres de l'expérimentation souhaitée. des conséquences majeures sur la qualité des
Épitopes et paratopes engagent des interactions récepteurs engagés, avec des retentissements par-
non covalentes, instables et réversibles, de type liai- fois importants sur la qualité de la réponse immu-
sons de van der Waals, liaisons hydrophiles/hydro- nitaire qui en découle. Dans le cas des épitopes
phobes, liaisons électrostatiques et liaisons peptidiques, on peut ainsi définir des motifs :
hydrogène. La somme de ces liaisons définit la force • agonistes, qui présentent une structure proche
d'interaction entre l'antigène et son récepteur. ou dans lesquels le remplacement d'acides ami-
L'affinité de l'anticorps est évaluée par une nés n'affecte en rien la qualité de la reconnais-
constante d'affinité (Ka) qui s'exprime en L/mol sance par le récepteur et la réponse immunitaire
(L.mol−1). Ainsi, un anticorps de faible affinité qui en découle ;
Chapitre 1. L'antigène comme réactif : définition et propriétés 11

• agonistes partiels, au sein desquels le rempla- Propriétés


cement d'acides aminés affecte la reconnais- des antigènes influant
sance et surtout la quantité de signaux transduits
par le récepteur. La réponse immunitaire peut
sur les méthodes de dosage
être moins intense et/ou aboutir à un autre
profil cytokinique (e.g. Th1 versus Th2) ; L'ensemble des propriétés des antigènes peut
• super-agonistes, si le remplacement d'acides avoir un impact dans différents domaines de leur
aminés conduit à une réponse amplifiée compa- utilisation pratique, que ce soit dans le cadre de
rativement à celle obtenue avec la molécule la biologie médicale (e.g. dosages de protéines,
initiale ; d'anticorps), de la recherche (e.g. modèles expé-
• antagonistes, lorsque le remplacement d'acides rimentaux), de la vaccination ou de l'utilisation
aminés affecte la reconnaissance et conduit à la de molécules biologiquement actives (e.g. immu-
réponse inverse de celle obtenue avec la molé- nothérapies). Le tableau 1.1 collige les propriétés
cule initiale. d'un antigène influençant ces différents domaines

Tableau 1.1  Impacts des propriétés de l'antigène dans les réponses immunitaires et en immuno-analyse
Antigènes/propriétés Implications pratiques Conséquences en cas de non-respect de la propriété
Épitopes B
Natifs In vivo, les antigènes ont conservé leur – Dans le cas où les modifications post-traductionnelles sont
Par opposition à conformation structurale qui peut subir des essentielles à la reconnaissance par le récepteur, produire un
dénaturés ou dégradés modifications post-traductionnelles (glycosylation, épitope recombinant non modifié chez un procaryote peut
phosphorylation, méthylation, ubiquitinylation…). conduire à perturber la reconnaissance par les anticorps
Un antigène est donc natif s'il a conservé – La dénaturation ou la dégradation d'un antigène peut conduire
l'ensemble de ses propriétés, c'est-à-dire sa à une perte de reconnaissance par les récepteurs spécifiques. La
conformation et ses modifications dénaturation peut aussi conduire à la formation de néo-antigènes
Répétés (multivalents) Facilitent la formation de complexes immuns Impact sur les méthodes de dosage biologique :
Par opposition à – deux sites antigéniques sont nécessaires (au minimum) pour
monovalents les tests ELISA de type sandwich. Pour les méthodes
compétitives, un épitope monovalent peut être utilisé
– la multivalence est indispensable pour les méthodes
d'agglutination et de précipitation
Épitopes T
Doivent être présentés – Vaccins Inefficacité d'un vaccin si l'épitope sélectionné n'est pas
par les molécules CMH – Évaluation de la réponse lymphocytaire T in vitro présenté par le CMH de la population vaccinée
de l'individu
Épitopes B ou T
Spécificité Pour les immunodosages :
Accessibilité – manque de spécificité → faux positifs
Stabilité – manque d'accessibilité → faux négatifs
– manque de stabilité → faux négatifs
Réintroduction Impact en vaccination : rappels – Le tarissement de la source de présentation antigénique
conduit à faire disparaître la réponse immunitaire
– Perte de la protection vaccinale
Respect de la voie Impact en vaccination : vaccins systémiques ou – Inefficacité
d'introduction muqueux – Les antigènes vaccinaux administrés par voie muqueuse
doivent résister à la dégradation par les sucs digestifs, passer
les barrières de la flore, du mucus et des épithéliums
– Les propriétés des cellules présentatrices d'antigène peuvent
orienter la réponse immunitaire vers la tolérance, plutôt que
l'immunisation
Innocuité Vaccins, biothérapies Effets secondaires
Faciles à produire Coût, performances, reproductibilité interlots
12 Techniques immunologiques

d'application. Différentes méthodes de dosage nelles. Le tableau 1.2 illustre l'importance de la


des anticorps sont décrites, en phase liquide ou qualité des antigènes dans le choix de la tech-
en phase solide (sur un support). En phase solide, nique à mettre en œuvre. Le tableau 1.3 présente
il faut s'assurer que l'épitope n'est pas masqué ou certaines conditions réactionnelles pouvant
altéré par perte des structures conformation- influencer l'interprétation des résultats.

Tableau 1.2  Impact de la propriété des antigènes sur le choix des méthodes immunologiques
Technique Propriétés des Ag Remarques (avantages/contraintes)
Immunofluorescence indirecte (IFI) – Natifs – Les plus proches du vivant
– In situ – Structures parfois complexes
Immunoprécipitation ou immunodiffusion – Natifs – Les antigènes ont souvent conservé leurs
– Solubles propriétés originelles
– Les antigènes insolubles ne peuvent être utilisés
– La méthode de dosage est souvent spécifique
(peu de faux positifs), mais aussi, souvent peu
sensible (faux négatifs)
Immunodosages Radio-Immuno-Assay (RIA) – Natifs purifiés Utilisation réglementée des radio-isotopes
à réactifs marqués – Recombinants
Enzyme-Linked – Faciles à mettre en œuvre, automatisables,
– Synthétiques (peptides)
Immunosorbent Assay (ELISA) économiques
classique ou à traceurs – Quantitatifs
fluorescents (FLISA, FIA, FPIA) – Larges gammes de mesure
ou phosphorescents (MPIA)
Fluorimétrie en flux – Multiparamétrique
(multiplex) – Interférences possibles

Tableau 1.3  Influence des conditions réactionnelles sur la mise en œuvre d'un immunodosage
Contraintes Exemples Impact
Préservation de la L'épitope reconnu a-t-il :
structure stéréochimique – une structure linéaire (séquence peptidique) ?
– une structure secondaire, tertiaire (repliements dans La perte d'épitopes conformationnels altère la qualité
l'espace) ? de l'interaction antigène–anticorps
– une structure quaternaire (formée de la combinaison
de différentes molécules) ?
– subi des modifications post-traductionnelles ? Quand l'interaction antigène–anticorps fait appel à la
reconnaissance d'un motif additionnel (modifications
post-traductionnelles), l'utilisation d'antigènes
recombinants (issus d'un procaryote) peut être une
source de faux négatifs
L'utilisation de méthodes de dosage en phase Importance de la force ionique et de la température
solide apporte des contraintes supplémentaires : Un dosage adapté dans un milieu biologique (sérum)
– conformation de l'antigène (i.e. perte de la ne l'est pas nécessairement dans un autre (urine ou
conformation originelle au profit d'une autre) LCR, e.g.)
– « effet matrice » : l'environnement moléculaire est
important afin que l'anticorps lui-même conserve sa
conformation et, en conséquence, sa spécificité
Spécificité de la réaction Pureté de l'antigène :
Antigènes purifiés et recombinants (élimination de Risque de faux positifs. Il faut connaître les substances
toutes les protéines du vecteur) interférentes
Utilisation d'un agent de saturation L'objectif principal de l'agent de saturation est de
limiter les faux positifs. Il ne faut pas qu'il soit lui-
même une source d'interférences
Prélèvement adéquat : Interférences, imprécision
Sérum et non pas plasma hépariné par exemple
Facteurs rhumatoïdes, cryoglobulines, anticorps
Prise en compte des interférences : hétérophiles, immunoglobulines monoclonales
Chapitre 1. L'antigène comme réactif : définition et propriétés 13

Autres facteurs d'anticorps et même en évaluer les concentrations


conditionnant l'interaction dans les immunodosages. La formation de com-
plexes immuns nécessite que les antigènes pré-
antigène–récepteur sentent au moins deux épitopes accessibles aux
anticorps. Les anticorps de classe IgM, avec leurs
La qualité de l'interaction d'un antigène avec son dix sites d'interaction potentiels avec l'antigène,
récepteur influence la réaction immunitaire, pou- sont ainsi plus efficaces que les IgG (bivalentes)
vant conduire à un ensemble de réponses aussi pour la formation de ces complexes.
variées que la mort ou l'activation/différenciation La forme d'expression, soluble ou membranaire,
cellulaire. de l'antigène pèse également sur les possibilités
À la composante structurale des antigènes, qui d'interaction des anticorps (et des BCR) avec leur
pèse sur l'interaction fine avec le récepteur spéci- antigène cible. En effet, les régions transmembra-
fique, s'ajoute donc une autre composante essen- naires et intracytoplasmiques sont peu accessibles,
tielle : les concentrations de l'antigène et de ses mais leurs séquences d'acides aminés peuvent
récepteurs spécifiques disponibles. Ces concentra- constituer des épitopes libérés lors de lyses cellu-
tions respectives conditionnent la qualité de la laires. La forme d'expression membranaire peut
réaction immunitaire tant in vivo qu'in vitro ou, de également adopter une structure tertiaire ou qua-
façon plus ciblée, la capacité de certains immuno- ternaire, par association multimérique, qui dispa-
dosages à révéler l'interaction antigène–récepteur. raît dans la forme soluble du même antigène.
Pour déclencher une réaction de rejet immunitaire Enfin, la forme membranaire d'un antigène peut
vis-à-vis d'un antigène, ce dernier doit se trouver générer un environnement optimal, lié à un effet
à une concentration adéquate. En effet, les de concentration, conduisant à la réticulation de
concentrations antigéniques faibles ou très fortes récepteurs immunitaires spécifiques et favorisant la
aboutissent généralement à l'absence de réponse délivrance optimale de signaux d'activation.
immunitaire mesurable (c'est-à-dire à la tolérance, Outre sa structure intrinsèque, qui peut se résu-
l'anergie, ou l'apoptose des cellules qui expriment mer à la séquence peptidique d'un antigène,
un récepteur spécifique). Les variations rapides de d'autres éléments tels que les modifications post-
concentrations antigéniques peuvent également traductionnelles, la concentration ou le site d'ex-
conduire à la mise en place d'une réponse immu- pression conditionnent la qualité de la
nitaire de rejet. L'exposition chronique à l'anti- reconnaissance de l'antigène par un récepteur spé-
gène en l'absence de réponse inflammatoire locale cifique, et par conséquent, la qualité de la réponse
induit, à l'inverse, une tolérance. Ces notions ont immunitaire.
un impact en vaccinologie et peuvent conduire à
l'utilisation d'adjuvants (e.g. sels d'aluminium)
qui, outre la composante inflammatoire qu'ils Particularités des allergènes
génèrent, permettent de concentrer localement
l'antigène vaccinal sur une durée suffisante pour Les réactions d'hypersensibilité immédiate de
conduire à la stimulation optimale du système type  I sont caractérisées par la production d'IgE
immunitaire. dirigées contre des antigènes de l'environnement
En fonction des concentrations en antigènes et ou allergènes. La mise en évidence d'IgE circu-
en anticorps, des complexes immuns de taille lantes spécifiques d'un allergène repose sur la dis-
variable peuvent se former. Un défaut d'élimina- ponibilité de ce dernier. Depuis quelques années,
tion des complexes immuns peut conduire à leur des protéines purifiées de sources allergéniques
dépôt dans les vaisseaux, les articulations ou le naturelles ou recombinantes ont permis de définir
rein par exemple. le concept d'allergie moléculaire qui a amélioré le
Les propriétés d'agglutination ou de précipita- diagnostic des allergies. La composition des aller-
tion des complexes immuns peuvent être mises à gènes est cependant parfois très complexe
profit pour révéler la présence d'antigènes ou (tableau 1.4). Les différentes sources allergéniques
14 Techniques immunologiques

Tableau 1.4  Principales familles d'allergènes et leurs caractéristiques


Famille Caractéristiques Exemples
Protéines de transfert des lipides (LTP, pour – Stables à la cuisson et à la digestion Ara h 9, Pru p 3
Lipid Transfer Proteins) – Réactions systémiques et « syndrome oral » Cora h 8, Art v 3
Protéines de stockage – Stables à la chaleur Ara h 1, 2, 3, 6, 7
– Présentes dans les graines Gly m 5, 6
Protéines PR-10 (pour Pathogenesis Related – Détruites par la chaleur Bet v 1, Ara h 8
protein family 10) – « Syndrome oral » Gly m 4, Gly a 1
– Homologues de Bet v 1 Pru p 1, Api g 1.01, Mal d 1
Profilines (protéines liant l'actine) de grande – Allergènes mineurs des plantes Bet v 2, Pru p 4
homologie – Symptômes peu sévères la plupart du temps Hev b 8, Phl p 12
Déterminants carbohydratés à forte – Symptômes peu sévères la plupart du temps CCD ; MuxF3, Ana c 2
réactivité croisée (CCD pour Cross-Reactive
Carbohydrate Determinants)
Protéines liant le calcium – Présentes dans de nombreux pollens Bet v 4
– Fortes réactions croisées Phl p 7
Sérum-albumines – Présentes dans les liquides et solides Fel d 2, Can f 3, Bos d 6, Sus PSA, Equ c 3
biologiques (lait, œuf, viande…)
Parvalbumines – Présentes dans les poissons Cyp c 1
– Stables à la cuisson Gad c 1
Tropomyosines – Protéines liant l'actine dans les muscles Pen a 1
– Réactions croisées entre crustacés, Der p 10
nématodes, blattes et acariens Ani s 3
Lipocalines – Protéines animales assez stables Fel d 1, d 4
– Peu de réactions croisées entre espèces Can f 1, f 2, Mus m 1, Equ c 1

comprennent en effet de nombreux composants espèces animales ou végétales variées, donnant lieu
dont chaque épitope peut être à l'origine d'une à des réactions croisées. Enfin, la stabilité des aller-
réponse immunitaire. Plus encore, des protéines de gènes, en particulier à la chaleur ou à la digestion,
structure similaire sont souvent présentes dans des est à prendre en considération.
Chapitre 2
Les anticorps comme réactifs

Les anticorps sont devenus des outils indispen- par plusieurs clones de lymphocytes B, chacun
sables dans les activités de recherche, de diagnos- exprimant à sa surface une immunoglobuline dont
tic et de thérapie. En plus de leur capacité à le paratope est complémentaire d'un épitope
reconnaître très précisément une molécule, de s'y donné. L'ensemble des anticorps, sécrétés par les
fixer avec une affinité variable et de façon réver- différents plasmocytes issus de l'activation des
sible, les anticorps peuvent distinguer des diffé- clones B ayant chacun fixé l'antigène par une
rences subtiles entre les molécules d'antigène. Ces région précise, est déversé dans la circulation san-
propriétés en font de remarquables réactifs d'utili- guine pour rejoindre les antigènes restés libres, s'y
sation aisée. fixer puis entraîner leur élimination de l'orga-
nisme. Ces anticorps sont dits polyclonaux et
représentent une population hétérogène d'immu-
Rappels sur les anticorps noglobulines, leur spécificité épitopique et leur
affinité pour l'antigène étant différentes bien
Afin d'assurer la protection de l'organisme contre qu'elles soient toutes dirigées contre le même
toute substance étrangère potentiellement dange- antigène. À l'inverse, les anticorps monoclonaux
reuse, le système immunitaire est composé d'un sont issus de l'activation d'un seul clone cellu-
grand nombre de lymphocytes B. Chaque clone laire B exprimant le même récepteur pour l'anti-
cellulaire B exprime à sa surface de multiples gène et constituent une population homogène
copies d'un unique récepteur pour l'antigène d'immunoglobulines dont la spécificité épitopique
(BCR), qui est une glycoprotéine membranaire de et l'affinité sont rigoureusement identiques.
la famille des immunoglobulines appelée anti- Afin d'assurer d'une part, la reconnaissance
corps, dont l'extrémité N-terminale ou paratope spécifique d'antigènes et d'autre part, leur élimi-
définit la spécificité antigénique. La diversité des nation de l'organisme, les immunoglobulines ou
récepteurs pour l'antigène est assurée par une anticorps possèdent une dualité fonctionnelle
extrême variabilité de la séquence en acides ami- assurée par la structure particulière de ces molé-
nés de cette région de l'immunoglobuline. cules. En effet, ces glycoprotéines sont consti-
Lorsqu'un antigène se fixe par complémentarité tuées d'une région variable (fragment Fab,
spatiale entre une région précise de celui-ci, appe- antibody binding) en N-terminal portant le site de
lée épitope ou déterminant antigénique, et le reconnaissance et de fixation de l'antigène et
paratope de l'immunoglobuline membranaire d'une région constante (fragment Fc, cristalli-
d'un lymphocyte B donné, ce dernier est activé, se sable) en C-terminal, portant les fonctions effec-
multiplie et se différencie en plasmocytes. Les trices assurant l'élimination de l'antigène. Chaque
antigènes étant souvent constitués d'une mosaïque monomère d'immunoglobuline est constitué de
d'épitopes, un même antigène peut être reconnu deux chaînes légères identiques associées de façon

Méthodes en immunologie
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16 Techniques Immunologiques

covalente à deux chaînes lourdes identiques. B spécifiques de cet antigène. D'autres isotypes
Chacune de ces chaînes polypeptidiques com- sont ensuite produits par commutation de classe,
porte un domaine variable et un ou plusieurs conservant la spécificité de l'immunoglobuline.
domaines constants. La séquence peptidique des De plus, des hypermutations somatiques s'opèrent
domaines constants des chaînes lourdes définit au niveau des gènes codant les parties variables des
l'isotype de l'immunoglobuline. Chez les mammi- chaînes lourdes et légères des immunoglobulines,
fères, il y a cinq classes d'immunoglobulines (Ig) : qui améliorent l'affinité du paratope pour l'épi-
IgG, IgA, IgM, IgD et IgE. Certaines classes sont tope de l'antigène. Ces mécanismes ont pour but
divisées en sous-classes (e.g. IgG1 à IgG4) d'adapter la réponse de l'organisme à la nature de
(fig. 2.1). Chacune de ces classes et sous-classes l'antigène afin d'améliorer l'efficacité de la réponse
possède des propriétés différentes. Ces propriétés immunitaire. De plus, des lymphocytes B mémoire
sont importantes à prendre en considération pour persistent dans l'organisme et répondent plus effi-
l'utilisation des anticorps en tant que réactifs ; en cacement à une seconde rencontre avec le même
effet, elles peuvent être avantageuses ou au antigène. Cette maturation de la réponse humo-
contraire constituer des handicaps majeurs à leur rale est particulièrement intéressante pour la pro-
utilisation. duction d'anticorps performants en tant que
Lors du premier contact avec un antigène, ce réactifs.
sont d'abord des IgM qui sont sécrétées par les En résumé, la spécificité et l'affinité des anti-
plasmocytes issus de l'activation des lymphocytes corps pour leur antigène sont les deux propriétés

IgG1 IgG2 IgG3 IgG4

IgD IgM
IgE

IgA1 IgA2

Fig. 2.1  Structure comparative des classes et sous-classes d'immunoglobulines humaines.


D'après Assim. Immunologie fondamentale et immunopathologie. Issy-les-Moulineaux : Elsevier Masson ; 2013.
Chapitre 2. Les anticorps comme réactifs 17

essentielles qui en font d'excellents outils pour espèces de taille intermédiaire, comme le lapin,
leur utilisation en tant que réactifs in  vitro. Ils sont souvent employées. Il est également impor-
peuvent ainsi contribuer à déceler toute une tant de choisir une espèce animale qui soit phylogé-
palette d'agents pathogènes ainsi que la présence nétiquement la plus éloignée possible de la source
de substances d'origine virologique, bactériolo- de l'antigène avec lequel l'immunisation sera effec-
gique, fongique ou parasitaire, de drogues et tuée. En effet, un antigène est d'autant plus immu-
d'autres molécules inhabituelles ou anormales nogène qu'il diffère de structures normalement
dans l'organisme. Leur simplicité d'utilisation présentes dans l'espèce à immuniser. Ainsi, pour
ne se limite pas au diagnostic en santé humaine préparer des anticorps contre l'albumine de souris,
et animale. Ils sont également utilisés pour la il est préférable d'immuniser une chèvre plutôt que
purification, la détection et l'analyse de molé- des rats. Enfin, il faut également tenir compte des
cules et, depuis quelques années, comme outils propriétés des chaînes lourdes recherchées qui dif-
thérapeutiques. fèrent suivant les espèces, par exemple les IgG des
rats sont plus faciles à purifier que celles des souris.
Enfin, l'activation du complément, parfois recher-
Préparation d'anticorps chée dans les tests ultérieurs, varie en fonction de
polyclonaux l'espèce ayant produit les anticorps.
La deuxième décision concerne la taille et le
Les premiers types d'anticorps qui ont été pro- degré de pureté de l'antigène nécessaire. Ce choix
duits en tant qu'outils sont les anticorps polyclo- dépend de l'utilisation future des anticorps. Les
naux. La méthode la plus simple pour obtenir des antigènes peuvent se présenter sous la forme de
anticorps spécifiques d'un antigène consiste à micro-organismes inactivés (e.g. bactéries, virus,
injecter cet antigène à un animal à plusieurs levures) qui sont d'excellents immunogènes en
reprises, puis à recueillir le sérum contenant les raison de leur caractère particulaire. Il peut s'agir
anticorps après prélèvement sanguin. Les anti- également de protéines en solution, lyophilisées
corps spécifiques de l'antigène présents dans cet ou encore intégrées dans un gel de polyacryla-
immunsérum peuvent être ensuite purifiés en mide. Les protéines peuvent être artificiellement
fonction de leur isotype et/ou de leur spécificité converties en antigènes particulaires en les cou-
antigénique. De manière générale, les IgG étant plant à des substrats solides comme des billes
les plus affines, elles représentent la classe d'anti- d'agarose. Les antigènes peuvent enfin se présen-
corps la plus utilisée dans les méthodes de dosage ter sous forme de petites molécules ou haptènes
immunologiques. (e.g. molécules chimiques, peptides, acides
L'objectif est ici d'administrer l'antigène à l'ani- nucléiques). Ces derniers sont très peu immuno-
mal sous une forme qui induit la réponse la plus gènes et il est nécessaire de les conjuguer à des
forte et la plus appropriée en termes d'isotype, molécules protéiques de grande taille comme la
garantissant la production d'immunsérum forte- sérum-albumine bovine ou l'hémocyanine de
ment concentré en anticorps spécifiques. limule pour induire la production d'anticorps. Ce
La première décision concerne le choix de l'es- couplage chimique est effectué à l'aide de réactifs
pèce animale. Si l'on souhaite produire de grandes bifonctionnels. Ce complexe, une fois injecté chez
quantités d'antisérum, il convient de retenir un ani- l'animal, induit la formation d'anticorps contre
mal de grande taille (cheval, âne, chèvre ou mou- l'haptène et contre la protéine porteuse, qu'il faut
ton). Cependant, ces espèces sont plus coûteuses à ensuite purifier pour disposer d'un réactif spéci-
l'achat et à l'entretien et sont moins faciles à mani- fique de l'haptène. C'est de cette façon que sont
puler que des animaux de plus petite taille comme obtenus des anticorps contre des hormones, des
les rongeurs qui nécessitent des installations moins médicaments ou encore contre des peptides syn-
coûteuses. Cependant, le volume des prélèvements thétiques ou issus de protéines. Ils permettent
sanguins est plus limité chez ces derniers. Des aussi la production d'anticorps spécifiques ayant
18 Techniques Immunologiques

des applications directes dans des études fonction- La voie sous-cutanée est la plus facile d'accès,
nelles (e.g. neutralisation, agonistes). Toutefois, quelle que soit l'espèce animale choisie. La voie
l'inconvénient majeur, parfois rencontré lors de la intramusculaire permet une libération lente de
préparation de tels anticorps dirigés contre des l'antigène mais n'est pas adaptée aux petits ani-
épitopes linéaires, est leur incapacité à reconnaître maux et est plus douloureuse. La voie intrader-
la protéine sous forme native. La séquence et la mique est la plus immunogène mais limite le
longueur du peptide, la méthode de couplage et le volume à injecter qui doit être faible. Elle n'est
choix de la protéine porteuse sont à prendre en mise en pratique que chez les animaux de grande
considération pour la mise en place du schéma taille. Les injections par voie intraveineuse et
d'immunisation. Néanmoins, ceci reste une straté- intrapéritonéale ne sont employées que dans des
gie de choix pour des protéines difficiles à purifier cas particuliers. La voie intraveineuse permet,
ou à synthétiser. par une exposition rapide de l'antigène aux
L'immunisation peut se dérouler de plusieurs cellules immunocompétentes, d'induire une
­
façons. La dose, la nature de l'antigène, l'utilisa- réponse rapide et forte en minimisant la quantité
tion d'adjuvants, la voie d'administration, le d'antigène à injecter. Toutefois elle demeure
nombre d'injections et l'intervalle entre ces der- délicate et dangereuse car elle peut être à l'ori-
nières sont autant de paramètres qui influencent gine d'effets secondaires graves comme l'induc-
la qualité de la réponse anticorps. Il n'existe pas tion d'un choc anaphylactique. Elle ne peut pas
de règle générale. Le protocole doit être testé être utilisée pour des antigènes particulaires. La
empiriquement de manière à s'assurer que la voie intrapéritonéale est réservée aux petits ani-
réponse anticorps produite est de bonne qualité. maux. Enfin, l'injection de l'antigène directe-
La dose d'antigène à administrer pour induire ment au sein des organes lymphoïdes est possible
une réponse anticorps de qualité dépend large- et minimise grandement la quantité d'antigène à
ment de la nature même de l'antigène et de l'es- injecter, mais requiert une grande expertise du
pèce animale choisie. L'utilisation d'adjuvants manipulateur.
retardant la libération de l'antigène qui est alors Plusieurs injections séparées d'environ 1  mois
sous forme d'une émulsion huile–eau est néces- sont classiquement pratiquées. L'objectif de cette
saire dans le cas d'antigènes solubles afin d'induire hyperimmunisation est d'induire la production
une forte réponse anticorps. Le plus connu est d'anticorps de haute affinité et de l'isotype le plus
l'adjuvant incomplet de Freund, qui est une émul- approprié, IgG le plus fréquemment. L'affinité
sion de la solution d'antigène dans de l'huile des anticorps conditionne la sensibilité des tech-
minérale. Son utilisation ralentit la libération de niques immunologiques. Des prélèvements de
l'antigène et son élimination, tout en le concen- sang sont réalisés avant chaque immunisation et
trant au niveau du site de l'injection. L'adjuvant environ 8 jours après. Il n'existe pas de méthode
complet de Freund contient en plus des extraits de universelle pour analyser la production d'anti-
mycobactéries tuées. Celles-ci stimulent la réponse corps spécifiques. Toutefois, le test utilisé doit
immunitaire innée en induisant une réponse être facile à réaliser et d'interprétation aussi évi-
inflammatoire locale au site de l'injection, qui sti- dente que possible, il doit permettre d'évaluer la
mule les cellules prenant en charge l'antigène. quantité (titration) et l'affinité des anticorps pro-
Cependant, l'injection de ce dernier est doulou- duits ainsi que leur spécificité. Les animaux ayant
reuse et déconseillée par les comités d'éthique de produit les meilleurs anticorps sont ensuite
protection des animaux. D'autres produits sont sélectionnés.
plus rarement employés comme des sels d'alumi- La ponction de sang en vue de la préparation des
nium ou des squalènes. L'utilisation d'adjuvants lots d'anticorps est généralement effectuée sous
est réservée aux voies d'injection intradermique, anesthésie locale, selon les recommandations des
sous-cutanée et intramusculaire. Elle n'est pas comités d'éthique d'expérimentation animale, de
nécessaire en cas d'antigènes particulaires comme façon stérile à l'animalerie. Le sang est recueilli sans
les micro-organismes. anticoagulant pour obtenir du sérum. Le volume
Chapitre 2. Les anticorps comme réactifs 19

prélevé dépend du poids et des données hématolo- de réaction croisée avec d'autres molécules pré-
giques de l'animal. Le traitement du matériel se sentes dans les échantillons à analyser. De plus,
poursuit au laboratoire par centrifugation du sang du fait de la variabilité de la réponse immunitaire
coagulé. Les protéines sériques sont dosées et une de chaque individu, la qualité des sérums varie
électrophorèse permet de déterminer la masse d'un lot à l'autre, ce qui nécessite des ajuste-
d'immunoglobulines afin de la normaliser. ments et des calibrations avant l'utilisation d'un
Le sérum recueilli contient de nombreuses pro- nouveau lot.
téines pouvant interférer dans les immuno-analyses
prévues, notamment des immunoglobulines non
spécifiques de l'antigène produites avant l'immu- Préparation d'anticorps
nisation de l'animal. Il est donc très souvent néces- monoclonaux
saire de purifier les anticorps polyclonaux. La
stratégie choisie dépend de l'isotype ainsi que du En 1975, Georges Köhler et Cesar Milstein (prix
degré de pureté désiré. Plusieurs techniques Nobel 1984) ont mis au point une technique qui
peuvent être utilisées. La première étape de purifi- permet d'isoler in vitro des clones plasmocytaires
cation consiste à séparer les immunoglobulines des produits à l'issue de l'hyperimmunisation d'un
autres protéines du sérum soit par précipitation par animal. L'avantage majeur de cette technique est
des sels d'ammonium ou de l'éthanol, soit par de pouvoir caractériser précisément chacun des
chromatographie d'affinité sur protéine A ou pro- anticorps monoclonaux produits in vitro, pour ne
téine G, ou bien encore par chromatographie conserver que ceux dont les propriétés (spécificité,
échangeuse d'anions. La protéine A est un compo- affinité et isotype) sont les plus adaptées aux appli-
sant de la paroi cellulaire de Staphylococcus aureus cations prévues. De plus, les anticorps monoclo-
et la protéine G est une protéine de la paroi bacté- naux retenus peuvent être produits de façon
rienne des streptocoques du groupe B. Elles se constante, en quantité indéfinie, reproductible et
lient toutes les deux à la région Fc des IgG. de façon illimitée dans le temps. Toutes les immu-
Toutefois, cette interaction varie selon les espèces, noglobulines issues du clone ont les mêmes carac-
et même au sein d'une espèce en fonction de la téristiques physico-chimiques et biologiques, ce
sous-classe d'IgG. Les IgM sont généralement qui permet de standardiser les analyses. Les clones
purifiées par une combinaison de techniques, du producteurs d'anticorps monoclonaux peuvent
fait de leur taille et de leur point isoélectrique être cultivés in  vitro et stockés sous forme
élevé, y compris précipitation au sulfate d'ammo- congelée.
nium suivie d'une filtration sur gel, chromatogra- Le principe général repose sur la fusion d'un
phie échangeuse d'anions, électrophorèse de zone lymphocyte B ou d'un plasmocyte avec des cel-
ou électrofocalisation. lules de myélome conférant à l'hybridome ainsi
Il est parfois nécessaire de purifier uniquement les formé une capacité proliférative illimitée. Seules
immunoglobulines spécifiques de l'antigène, afin les cellules hybrides sécrétrices d'un anticorps spé-
d'éliminer les interférences dues aux autres immuno- cifique de l'antigène sont sélectionnées, puis iso-
globulines. Ceci est réalisé soit par immunoprécipi- lées les unes des autres afin de cultiver séparément
tation, soit par chromatographie d'immuno-affinité. chacun des clones producteurs d'un anticorps
La phase solide est alors constituée de l'antigène monoclonal. Une fois les propriétés de chaque
cible couplé à une résine. Le passage de l'immunsé- anticorps monoclonal définies, seuls les hybrido-
rum dans la colonne permet la liaison des anticorps mes d'intérêt sont conservés en vue d'une produc-
et leur élution différentielle. Cette technique garan- tion en masse. Cette technique d'obtention
tit la spécificité du réactif. d'hybridomes se déroule en trois étapes sur envi-
Cependant, même si les anticorps polyclonaux ron 6 mois :
sont purifiés, ces réactifs restent hétérogènes, • immunisation ;
chaque anticorps étant dirigé contre un épitope • fusion cellulaire ;
donné de l'antigène, ce qui augmente les risques • sélection et séparation des clones.
20 Techniques Immunologiques

Ces étapes sont suivies de la production des tir de la rate, mais parfois elles peuvent provenir
anticorps monoclonaux (fig. 2.2). de ganglions lymphatiques ou de plaques de
La première étape, l'immunisation, est sensi- Peyer. Ce choix dépend de la nature et de la dose
blement la même que celle décrite précédemment de l'antigène utilisé pour les immunisations et de
pour l'obtention d'anticorps polyclonaux, mais l'isotype recherché.
fait appel préférentiellement à des souris La deuxième étape consiste à fusionner en
(BALB/c), voire des rats ou des lapins. En raison condition stérile les cellules immunocompétentes
des facteurs génétiques individuels, plusieurs de l'animal avec des cellules de myélome générale-
individus doivent être immunisés simultanément ment issues de la même espèce. La fusion cellu-
par injections répétées de l'antigène environ laire se fait à l'aide d'un agent chimique, le
toutes les 3  semaines. La réponse anticorps est polyéthylène glycol (PEG), qui permet de fluidi-
suivie tout au long de cette période. Lorsqu'un fier les membranes plasmiques des cellules. Lors
animal bon répondeur a été identifié, un dernier de la reconstitution des membranes grâce à l'addi-
rappel est effectué par voie intraveineuse avant de tion de milieu de culture riche en sérum de veau
le sacrifier 4 jours plus tard. Il s'agit ici d'induire fœtal (SVF), les cellules en contact étroit peuvent
l'activation de cellules B mémoire spécifiques de fusionner pour former des hétérocaryons. Le ren-
l'antigène à un stade qui permette leur fusion dement de fusion est faible, moins de 1 % des cel-
avec les cellules de myélome. Généralement, les lules fusionnent et une cellule sur cent cinq génère
cellules immunocompétentes sont extraites à par- un hybride viable. Les lymphocytes n'ayant pas

Splénocytes Cellules de myélome

Antigène
Déterminants
antigéniques
Fusion

Cellules hybrides Isolement

Hybridomes

Clone 1 Clone 2 Clone 3

Anticorps monoclonaux
Fig. 2.2  Schéma récapitulatif de la production des anticorps monoclonaux.
Chapitre 2. Les anticorps comme réactifs 21

fusionné avec une cellule de myélome meurent de culture, permettant ainsi la synthèse d'ADN
progressivement dans les jours qui suivent la par la voie de sauvetage. Après la fusion, l'en-
fusion. Les cellules de myélome étant des cellules semble des cellules est ainsi distribué dans des
tumorales, il est par contre nécessaire d'éliminer puits de plaques de culture à raison d'une cellule
celles qui n'ont pas fusionné avec des lympho- par puits au maximum (principe de la dilution
cytes, afin de permettre aux hybridomes néofor- limite) et cultivé en milieu sélectif HAT (hypoxan-
més de se développer dans le milieu de culture. La thine, aminoptérine, thymidine) (fig.  2.3). Les
caractéristique mise à profit est que la lignée de hybridomes néoformés, seuls capables de se multi-
myélome utilisée est déficiente en hypoxanthine– plier, sont très instables génétiquement et seule-
guanine–phosphoribosyl–transférase (HGPRT). ment un sur cent cinq donne une cellule viable. Le
Cette enzyme intervient dans la voie de sauvetage milieu de culture sélectif est enrichi en facteurs de
de la synthèse des bases nucléotidiques. Les cel- croissance apportés par le SVF (20 %), des cock-
lules de myélome ne peuvent donc pas utiliser tails de cytokines contenant notamment de l'IL-6
cette voie pour répliquer leur ADN, surtout si et/ou des macrophages ou des splénocytes de
l'addition d'aminoptérine (A) dans le milieu de souris préalablement déposés dans les puits de
culture bloque la voie principale de synthèse des culture (cellules feeder).
nucléotides. Dans ces conditions, les cellules de La troisième étape consiste à sélectionner,
myélome qui n'expriment pas d'HGPRT fonc- après 15 à 20 jours environ, les hybridomes dont
tionnelle sont incapables de se diviser. Seules les le taux de croissance est optimal et qui sécrètent
cellules hybrides qui expriment une HGPRT fonc- un anticorps spécifique de l'antigène d'intérêt.
tionnelle provenant du génome du lymphocyte Lorsque les cellules arrivent à confluence, le sur-
peuvent alors se multiplier grâce à l'addition d'hy- nageant de chaque puits est analysé pour l'anti-
poxanthine (H) et de thymidine (T) dans le milieu corps et ses propriétés. Les cellules sont ensuite

AMP
HGPRT
Hypoxanthine IMP

Azasérine GMP
Aminoptérine

Synthèse
endogène

Aminoptérine

Thymidine TMP
Thymidine Kinase

Milieu HAT : Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine

Milieu Haza : Hypoxanthine, azasérine


Fig. 2.3  Caractéristiques du milieu nécessaire à la sélection des hybridomes pour la production d'anticorps
monoclonaux.
AMP : adénosine monophosphate ; GMP : guanosine monophosphate ; HGPRT : hypoxanthine–guanine–phosphoribosyl–
transférase IMP : inosine monophosphate.
22 Techniques Immunologiques

sous-clonées par dilution limite, car elles peuvent d'ADN codant pour les séquences de reconnais-
être encore hétérogènes et génétiquement ins- sance des antigènes, associées aux régions
tables. Le but final est d'obtenir des populations constantes d'une immunoglobuline humaine. Ce
d'hybridomes homogènes, stables génétiquement vecteur est ensuite introduit par transfection
et fortes productrices d'anticorps. Généralement dans des cellules de mammifère. Les anticorps
une série de trois clonages successifs est nécessaire humanisés ainsi obtenus ont été développés pour
à l'obtention de clones à fort taux de croissance et leur usage maintenant largement répandu en thé-
de sécrétion. Après 3 mois environ, les hybrido- rapeutique humaine.
mes obtenus pourront être soit conservés conge- La purification des anticorps monoclonaux est
lés dans l'azote liquide, soit cultivés en plus plus facile que celle des anticorps polyclonaux, car
grands volumes afin de caractériser précisément le milieu de culture est beaucoup moins complexe
les anticorps qu'ils sécrètent (spécificité, affinité, que le sérum. Malgré tout, de nombreux efforts
isotype). Il n'est pas rare de perdre beaucoup de visent à augmenter les rendements de production
clones à l'issue de cette troisième étape, soit par et de purification des anticorps monoclonaux en
défaut de croissance, soit par défaut de produc- travaillant sur la qualité des milieux de culture et
tion d'anticorps consécutifs aux réarrangements des cellules productrices.
chromosomiques. C'est pourquoi le milieu doit
être très riche en facteurs de croissance (20 %
SVF). L'étape de sélection étant particulièrement Conservation des anticorps
longue et coûteuse, il convient d'adapter la straté-
gie à l'application attendue des anticorps mono- La stabilité des anticorps polyclonaux purifiés est
clonaux à produire. Si, par exemple, il s'agit de diminuée par rapport à ceux qui sont présents
produire des anticorps contre une petite molécule dans un immunsérum. Elle dépend largement de
type haptène, le nombre de cellules à cloner leur concentration (idéalement 5 à 10 mg/mL) et
pourra être réduit, car il est probable que peu de de leur méthode de purification et de conserva-
clones B différents seront produits à l'issue de tion. L'exposition à des pH extrêmes et à des solu-
l'immunisation de l'animal. De plus, il est pos- tions de force ionique forte ou faible durant les
sible de sélectionner très tôt seulement les cellules étapes de purification tend à réduire leurs capaci-
qui sécrètent un anticorps d'isotype particulier ou tés d'interaction avec l'antigène et à favoriser leur
encore de contre-sélectionner certains anticorps agrégation et leur précipitation au cours du temps.
présentant de fortes réactions croisées, donc peu La purification par chromatographie échangeuse
spécifiques. d'anions est la méthode la moins dénaturante. Les
La production des anticorps monoclonaux agrégats sont à l'origine de réactions non spéci-
dépend de la quantité désirée, de la capacité de fiques générant un bruit de fond lors des réactions
culture du laboratoire et des bioréacteurs dispo- immunologiques en raison de leur caractère
nibles. La productivité cellulaire peut aller hydrophobe. Il faut s'assurer de l'élimination de
jusqu'à 4 g/L grâce à l'utilisation de lignées tels agrégats avant utilisation, par une centrifuga-
murines ou de hamster chinois (Chinese hamster tion (1000 g, 20 minutes, 20 °C).
ovary, CHO). À noter qu'il est possible d'obtenir Les techniques de purification et de conserva-
par génie génétique des hybridomes interespèces tion des anticorps monoclonaux influencent
(rat–souris, souris–rat, souris–homme) bien que égale­ment leur stabilité, ce qui peut conduire à
ceux-ci soient plus instables génétiquement. Les des modifications de leur spécificité, de leur affi-
hybridomes souris–homme sont particulière- nité ou encore être à l'origine d'une réactivité
ment intéressants dans les applications thérapeu- croisée. Les anticorps monoclonaux de souris de
tiques car ils entraînent peu de réactions immunes classes IgM, IgG2b et IgG3 sont à cet égard les
chez le receveur. Des stratégies d'ingénierie plus sensibles.
moléculaire ont été développées afin de cloner Au-delà des recommandations du fournisseur, il
dans un vecteur d'expression les séquences est conseillé de vérifier régulièrement l'activité des
Chapitre 2. Les anticorps comme réactifs 23

anticorps. Pour un archivage de longue durée, les gène et une meilleure capacité de détection des
solutions d'anticorps peuvent être congelées à protéines d'intérêt (tableau 2.1).
−80 °C, préférentiellement en présence de 10 à
25 % de glycérol, sous forme d'aliquotes afin
d'éviter de répéter des cycles de congélation– Tableau 2.1  Intérêts respectifs des anticorps
décongélation. Après décongélation, l'activité des polyclonaux et monoclonaux
anticorps doit être contrôlée de nouveau. Les Propriétés Anticorps Anticorps
solutions diluées doivent être conservées dans des polyclonaux monoclonaux
récipients présentant de faibles capacités d'adsorp- Affinité + ++
tion des protéines. Avidité ++ +
Réseau de com- ++ ±
plexes immuns

Intérêts respectifs des Temps de


production
Long Plus court

anticorps polyclonaux Quantité produite Limitée Illimitée mais


et monoclonaux dépend du volume
de chaque lot
Les anticorps polyclonaux sont constitués d'un Homogénéité des + +++
mélange de plusieurs espèces d'anticorps diffé- lots
rents dirigés contre plusieurs épitopes d'un même Spécificité + +++
épitopique
antigène. Une même molécule d'antigène peut
fixer en même temps plusieurs anticorps diffé- Réactions croisées Possibles Limitées
rents, chacun sur son épitope respectif. Cette pro- Détection de molé- Améliorée par Limitée par la
priété confère aux anticorps polyclonaux une cules faiblement la variété des monospécificité
exprimées spécificités épitopique
avidité beaucoup plus forte vis-à-vis de leur anti-
Chapitre 3
Techniques sans traceur

Immunoprécipitation corps dans des tubes très fins présente un aspect


d'anneau de précipitation, dont l'épaisseur aug-
mente, atteint un maximum, puis diminue en
L'immunoprécipitation et l'immunodiffusion
fonction des concentrations relatives d'antigène et
sont deux méthodes qui mettent à profit la spéci-
d'anticorps. Cette manipulation peut être réalisée
ficité de la réaction antigène–anticorps pour analy-
dans des tubes à hémolyse en laissant la réaction se
ser et/ou quantifier les complexes immuns. La
dérouler pendant une nuit puis en centrifugeant
mise en contact d'une solution de molécules d'an-
pour recueillir le précipité dans les culots de centri-
tigène à épitopes multiples avec un antisérum
fugation. La concentration en protéines totales du
polyclonal, spécifique de cet antigène et constitué
culot varie également en fonction des concentra-
d'une population hétérogène d'anticorps multiva-
tions relatives d'antigène et d'anticorps (fig. 3.1).
lents, aboutit à la formation d'un réseau tridimen-
Les faibles concentrations d'antigène corres-
sionnel qui apparaît sous la forme d'un précipité.
pondent à un large excès d'anticorps où toutes les
Initialement, le phénomène d'immunoprécipi-
molécules d'antigène sont recouvertes d'anticorps.
tation a été mis en évidence et caractérisé en milieu
Les complexes antigène–anticorps sont trop petits
liquide, puis très rapidement les techniques d'im-
pour former un réseau et de nombreuses molé-
munodiffusion en milieu gélifié se sont imposées,
cules d'anticorps restent libres dans le milieu. À
permettant la discrimination, l'identification ou la
l'inverse, l'ajout de grandes quantités d'antigène
quantification de différents systèmes antigène–
réalise les conditions d'un large excès d'antigène
anticorps précipitants. L'apparition d'appareils
où trop peu de molécules d'anticorps sont pré-
capables de quantifier un précipité (turbidimètres
sentes pour recouvrir les nombreuses molécules
et néphélémètres) a permis le développement de la
d'antigène. Les complexes antigène–anticorps sont
précipitation en milieu liquide, avec des applica-
là encore de petite taille et restent souvent solubles
tions très développées dans le domaine du dosage
dans le milieu. C'est dans la configuration intermé-
des protéines (immunochimie).
diaire, appelée zone d'équivalence, que se forme
un réseau important précipitant, complexant la
Méthodologie quasi-totalité des molécules d'antigène et
En milieu liquide, si des quantités croissantes d'an- d'anticorps.
tigène sont ajoutées à une solution d'anticorps de Deux principes optiques (fig.  3.2) d'appareil-
concentration fixe, un précipité apparaît progressi- lages automatisables, basés sur la déviation d'un
vement, dont l'importance varie avec le rapport faisceau monochromatique laser au contact des
antigène–anticorps. C'est l'expérience princeps du particules de précipité, ont été développés. La
ring test d'Oudin, dans laquelle l'interface entre turbidimétrie évalue ainsi la diminution de la
deux solutions superposées d'antigène et d'anti- lumière transmise dans une solution contenant

Méthodes en immunologie
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26 Techniques immunologiques

Surnageant

Précipité

Antigène multivalent
Anticorps libres Absence d’anticorps Antigènes libres
en excès et d’antigènes en excès
dans le surnageant

Anticorps polyclonal

Piège de dosage :

Quantité de précipité
la quantité de
précipité est la
même pour ces
deux quantités très
différentes
d’antigène

Quantité d’antigène

Fig. 3.1  Courbe de précipitation de Heidelberger.

des complexes immuns insolubles. La néphélémé- tie de la réaction est une agglutination (e.g. l'anti-
trie, par contre, mesure à côté du faisceau laser, corps fixé sur la particule capte l'antigène,
avec un angle précis, la lumière dispersée par les entraînant la formation d'un agglutinat) et les
complexes immuns insolubles, qui se comportent agglutinats formés se comportent comme des
comme des particules. La dispersion de la lumière particules de précipité.
par des particules en suspension est fonction de
leur taille. Les mesures se font dans la partie de la
Recommandations de mise en œuvre
courbe en excès d'anticorps et quantifient, selon
la loi de Rayleigh, la très forte amplification de la Les échantillons à doser ainsi que les antisérums
lumière dispersée vers l'avant aux petits angles doivent être rigoureusement limpides. Les mesures
lorsque le volume des particules augmente. se font dans la partie de la courbe en excès d'anti-
Actuellement, des techniques cinétiques réalisées corps pour réaliser une proportionnalité entre la
sur chaque échantillon permettent d'obtenir deux concentration d'immuncomplexes et la concentra-
mesures très rapprochées pour évaluer la forma- tion d'antigène. Malgré cette précaution, le piège
tion du précipité. Les techniques de néphélémé- majeur est la redissolution des précipités en large
trie et turbidimétrie particulaires, utilisant des excès d'antigène. Les automates déclenchent en
particules de latex sensibilisées de très petit dia- principe des redilutions, en se basant sur les varia-
mètre (entre 100 et 300 nm), permettent de se tions des résultats des mesures en cinétique.
rapprocher de la sensibilité d'une technique avec Toutefois, il faut parfois déclencher manuellement
marqueur (inférieure au mg/L). La première par- des dilutions supplémentaires.
Chapitre 3. Techniques sans traceur 27

Turbidimétrie : la mesure de lumière transmise produit un signal décroissant


avec la concentration d’antigènes.

Complexes antigène-anticorps

Source lumineuse
Détecteur
monochromatique

Néphélémétrie : la mesure de la dispersion de la lumière produit un signal croissant


avec la concentration d’antigènes.

Complexes antigène-anticorps

Source lumineuse
monochromatique

70°

Lentille
optique

te
cte
ur

Fig. 3.2  Principes de la turbidimétrie et de la néphélémétrie.

Avantages/inconvénients milieu de culture, lysat cellulaire) sont incubés


avec les anticorps. Cette étape permet la forma-
Avantages Inconvénients
tion des complexes antigène–anticorps. Les
Spécificité de la réaction Redissolution du précipité
antigène–anticorps Concentrations critiques
complexes sont séparés par simple centrifuga-
Rapidité des antigènes et des anticorps tion, ou grâce à un anticorps anti-immunoglo-
Automatisation Caractéristiques optiques bulines ou une protéine liant le Fc des
Nombreuses applications des sérums immunoglobulines, couplés à des billes.
Utilisation de systèmes non Sensibilité modérée (mg/L)
précipitants avec les techniques
• En clinique : la néphélémétrie est utilisée en
d'agglutination latex pratique courante pour le dosage des protéines
sériques, dont les isotypes majeurs des immu-
Exemples d'applications noglobulines (IgG, IgA, IgM et accessoire-
• En recherche : l'immunoprécipitation en milieu ment IgD) et certains composants du
liquide est couramment utilisée pour l'étude de complément (C3, C4, C1-inhibiteur et facteur
protéines. Les extraits protéiques à analyser (e.g. B). Les techniques avec particules de latex per-
28 Techniques immunologiques

mettent le dosage des facteurs rhumatoïdes, de sont partagés entre les deux antigènes, il y a forma-
certaines sous-classes d'IgG et des chaînes tion d'un éperon entre les deux arcs de précipita-
légères libres. tion, traduisant une identité partielle (fig. 3.3).
L'électrosynérèse, encore appelée contre-
immuno-électrophorèse, est une variante de l'im-
munodiffusion double dans laquelle la migration
Immunodiffusion de l'antigène vers l'anticorps est focalisée dans un
Méthodologie champ électrique, dans un tampon de pH adapté.
L'anticorps migre vers la cathode (pôle négatif) en
Les méthodes de précipitation en milieu gélifié raison du courant d'électro-endosmose, alors que
permettent soit l'analyse qualitative d'un mélange le pH est choisi de telle sorte que l'antigène migre
d'antigènes, soit le dosage immunochimique d'un vers l'anode (pôle positif) : il rencontre donc l'an-
antigène donné. Cela suppose de disposer d'une ticorps et forme un arc de précipitation au niveau
part d'antigènes au moins divalents, ce qui exclut de la zone d'équivalence.
les haptènes, et d'autre part d'anticorps précipi- La technique d'immuno-électrophorèse a été
tants, le plus souvent de nature polyclonale. Le mise au point par Grabar et Williams. Le premier
milieu gélifié permet la visualisation du précipité temps consiste en une migration électrophoré-
antigène–anticorps. La densité du gel dicte la tique en gel d'agarose après dépôt de la solution à
dimension des mailles du gel devant permettre la analyser dans un puits, permettant de séparer les
libre diffusion des molécules à analyser mais pié- protéines antigéniques en différentes fractions
ger le précipité. selon leur charge. À la fin de la migration, une
rigole transversale est creusée dans la gélose et un
antisérum y est déposé. Ce deuxième temps
Recommandations de mise en œuvre
immunologique consiste donc en une double dif-
L'immunodiffusion double d'Ouchterlony est une fusion dans un plan perpendiculaire à l'axe de
analyse qualitative qui consiste à déposer des solu- migration électrophorétique. Aux zones d'équiva-
tions d'antigène et d'anticorps dans des puits creu- lence respectives, il se forme autant d'arcs de pré-
sés en regard dans un gel d'agarose. Les molécules cipitation qu'il y a de systèmes antigène–anticorps.
diffusent uniquement en fonction de leur masse L'immunofixation est une variante méthodo­
moléculaire et il se forme des lignes de précipita- logique qui a l'avantage d'être plus rapide, un peu
tion pour chaque système antigène–anticorps aux plus sensible et en partie automatisable.
zones d'équivalence respectives. Cette méthode L'immunodiffusion radiale selon Mancini est
permet, en déposant plusieurs solutions antigé- une immunodiffusion simple bidimensionnelle
niques différentes en regard d'un antisérum quantitative. Un antigène soluble, déposé dans un
monospécifique au sein d'une rosace de six puits puits, diffuse radialement au sein d'un gel conte-
périphériques disposés autour d'un puits central, nant l'anticorps correspondant, qui doit donc être
d'analyser les identités entre les différents consti- précipitant et le plus souvent de nature polyclonale.
tuants. Lorsque deux antigènes identiques sont La réaction antigène–anticorps aboutit à la forma-
déposés dans des puits adjacents, ils sont reconnus tion de complexes insolubles visualisés sous forme
par les mêmes anticorps de l'antisérum, et les arcs d'un cercle autour du puits où a été déposé l'anti-
de précipitation sont continus, car il s'agit du gène. Cette réaction est caractérisée pour chaque
même système antigène–anticorps  : on parle système par un rapport optimal entre les concentra-
d'identité. Au contraire, lorsque les deux antigènes tions respectives d'antigène et d'anticorps donnant
sont différents, ils sont reconnus par deux groupes une précipitation maximale (zone d'équivalence).
d'anticorps différents, et les deux arcs de précipita- La surface de l'anneau de précipitation au point
tion se croisent. On parle de non-identité, liée à final de diffusion, donc le carré de son diamètre, est
l'existence de deux systèmes antigène–anticorps proportionnelle à la concentration en antigène. La
totalement distincts. Enfin, si certains des épitopes réaction se fait dans des plaques dans lesquelles est
Chapitre 3. Techniques sans traceur 29

Dépôt 1 Dépôt 2

A A A B

Anti-A
Anti-A Anti-B
Précipité

Dépôt de Non identité entre


l’anticorps les antigènes des
dépôts 1 et 2

B B A A’

Anti-B Anti-
A’

Identité entre les Identité partielle des


antigènes des dépôts 1 et 2 antigènes des dépôts 1 et 2
Fig. 3.3  Technique d'Ouchterlony, immunodiffusion double.
Représentation schématique des arcs de précipitation obtenus en comparant deux dépôts d'antigènes identiques,
différents ou partiellement identiques.
A : antigène A ; A′ : antigène A′ partiellement identique à A mais plus complexe ; Anti-A : anticorps anti-A ; Anti-A′ :
anticorps anti-A′ ; B : antigène B ; Anti-B : anticorps anti-B.

incorporé un étalonnage en trois points. Après dif- tillons à doser sont placés dans des puits pratiqués
fusion totale (24 à 72 heures), les diamètres des dans un gel contenant l'antisérum spécifique, puis
anneaux de diffusion sont mesurés et une droite soumis à une migration accélérée par électropho-
d'étalonnage est établie avec les valeurs de la rèse. À l'équivalence, les complexes antigène–anti-
gamme d'étalonnage (fig. 3.4). corps précipitent sous forme de fusées (rockets)
L'électro-immunodiffusion selon Laurell est dont la hauteur est proportionnelle à la concentra-
une méthode simple, rapide, reproductible et plus tion d'antigène à doser et est calculée par rapport
sensible que l'immunodiffusion radiale. C'est une à une gamme d'étalonnage incorporée dans la
immunodiffusion simple dans laquelle les échan- plaque.
30 Techniques immunologiques

Diamètre mesuré de l’anneau Établissement d’une droite étalon

mg/mL d’antigène X
1 2 3 4
Anneau de précipitation

Gélose
contenant
l’anticorps
anti-X

Dépôt d’une gamme étalon d’antigène X Dépôt de l’échantillon


d’antigène X à doser

Fig. 3.4  Technique de Mancini, immunodiffusion radiale.

Avantages/inconvénients Exemples d'applications


Méthodes Avantages Inconvénients • En recherche : ces techniques font partie histori-
quement des premières ayant permis d'explorer
Immunodiffusion Utilisation de Manque de sensibilité
double mélanges Technique longue les systèmes antigène–anticorps. Elles sont moins
d'Ouchterlony d'antigènes en (48 à 72 h) utilisées actuellement mais peuvent être utiles
conformation native pour vérifier la qualité des préparations antigé-
sans risque de perte
d'épitopes
niques au cours des étapes de purification.
conformationnels • En clinique :
Électrosynérèse Plus sensible que Équipement spécifique – l'immunodiffusion simple d'Ouchterlony et
l'Ouchterlony l'électrosynérèse ont été très utilisées pour
Rapide analyser les spécificités de certains anticorps
Immuno- Identification précise Qualitative uniquement antinucléaires ;
électrophorèse de nombreux Longue – l'immuno-électrophorèse permet de séparer
systèmes Interprétation
les fractions antigéniques et de rechercher des
antigène–anticorps spécialisée
anticorps dans les sérums de patients (identi-
Immunodiffusion Spécifique Longue
radiale de Quantitative Reproductibilité
fication d'anticorps anti-aspergillus ou anti-
Mancini Trousses moyenne (coefficient de candida). Elle est également très utilisée pour
commerciales variation ou CV 10 %) l'étude des protéines sériques humaines ;
Sensibilité moyenne – l'immunofixation est principalement utilisée
(1–3 mg/L)
Consommation pour caractériser les immunoglobulines
importante d'antisérums monoclonales ou oligoclonales, dans le sérum,
Électro- Rapide Consommation l'urine ou le liquide céphalo-rachidien (LCR) ;
immunodiffusion Plus sensible que importante d'antisérums – l'immunodiffusion radiale et l'électro-immu-
de Laurell l'immunodiffusion nodiffusion sont utilisées pour le dosage de
radiale
protéines.
Chapitre 3. Techniques sans traceur 31

Immunochromatographie peuvent être arrêtées par de l'antigène préalable-


ment fixé sur la membrane et sont seulement
reconnues par des anticorps anti-immunoglobu-
La technique d'immunochromatographie consiste
lines. Les billes n'ayant pas fixé l'antigène sont
en la migration, sur un support, de nano- ou
arrêtées par l'antigène de la membrane et par les
microparticules mises en contact avec des anti-
anticorps anti-immunoglobulines. Dans ce cas, un
gènes et/ou des anticorps. La première méthode
test positif se traduit par la formation d'une seule
développée par Singer et Plotz en 1956 est fondée
bande de billes d'or (fig. 3.5b).
sur un principe de chromatographie d'affinité de
L'immunochromatographie peut être utilisée
type ligand–récepteur correspondant à la réaction
de la même façon pour rechercher des anticorps
antigène–anticorps (i.e. immunochromatogra-
dans l'échantillon testé, avec des billes recouvertes
phie). Les complexes immuns sont immobilisés
d'antigène et des antigènes ou des anticorps anti-
sur une membrane, d'où le nom d'immunochro-
immunoglobulines sur la membrane.
matographie sur membrane (ICM). Cette
Le système peut être vertical ou horizontal pour
méthode a donné lieu au développement de tests
des immunochromatographies à migration verti-
de diagnostic rapide (TDR) qui permettent la
cale ou latérale.
recherche de divers antigènes ou d'anticorps de
De façon plus précise, le support sur lequel est
type IgG et/ou IgM. Il s'agit de tests unitaires,
fixée la membrane comporte à chaque extrémité
rapides et qualitatifs. Ils peuvent être quantitatifs
du papier absorbant. L'échantillon dans lequel est
si la coloration de la bande obtenue est comparée
recherché l'antigène ou l'anticorps est déposé
à un étalon.
dans un réservoir contenant les microparticules
colorées (e.g. latex ou or colloïdal) recouvertes
Méthodologie
respectivement par un anticorps ou un antigène.
Dans les applications visant à la détection d'anti- Le contenu du réservoir est déversé sur la mem-
gènes, le principe général consiste à mettre en brane et le papier absorbant placé à l'autre extré-
contact une solution biologique et des billes por- mité du dispositif active la migration du liquide
tant à leur surface des anticorps spécifiques de la contenant les billes, réalisant ainsi la
molécule recherchée. Ce mélange migre sur un chromatographie.
support possédant à sa surface des anticorps spé- La fixation des anticorps de capture peut se faire
cifiques de la même molécule d'intérêt. Si la par adsorption passive directe réalisée grâce à
molécule cible est présente dans l'échantillon bio- l'établissement de liaisons non covalentes de type
logique de départ, elle est prise en sandwich au hydrophobe et ionique entre la membrane et les
cours de la migration entre les deux anticorps et résidus non polaires ou ioniques des protéines.
les billes s'immobilisent sur le support. Lorsque Cette étape s'effectue classiquement en tampon
suffisamment de billes sont immobilisées, une alcalin de type Phosphate-Buffered Saline (PBS) à
coloration est détectable et indique la présence de pH 7,4 ou en tampon carbonate–bicarbonate à
la molécule d'intérêt. Deux types d'anticorps de pH 9,6 afin d'ioniser les molécules en solution
capture sont déposés en deux points pour former lors de cette étape. Des techniques alternatives de
une ligne de capture (fixation des complexes fixation par des liaisons covalentes ont été déve-
immuns sur les billes) et une ligne de contrôle loppées en modifiant le pH et la concentration en
(fixation des billes seules reconnues par un anti- protéines (0,5 à 10 mg/mL), ou en utilisant des
corps anti-immunoglobulines). Dans ce cas, un supports chimiquement activés. Après la fixation
test positif se traduit par la formation de deux des anticorps au support, il est nécessaire de neu-
bandes de billes d'or (fig. 3.5a). traliser les zones de la membrane restées libres. Il
Une alternative à cette technique sandwich, s'agit de l'étape de saturation qui permet d'éviter
pour la détection d'antigènes, est la méthode par toute adsorption ultérieure de matériel présent
compétition. Dans ce cas, les billes recouvertes dans l'échantillon testé. Elle s'effectue par incuba-
d'anticorps ayant fixé l'antigène recherché ne tion dans un tampon de type PBS additionné de
32 Techniques immunologiques

Arrêt des particules d’or


restées libres par l’anticorps
anti-immunoglobulines présent sur la membrane
reconnaissant l’anticorps des billes
n’ayant pas fixé d’antigène

Fixation de l’antigène
recherché sur l’anticorps des
particules d’or
et sur un anticorps spécifique
présent sur la membrane

Arrêt des particules d’or

Migration du prélèvement et des billes d’or Positif Négatif


le long de la membrane – 2 bandes – 1 bande
a
Fig. 3.5  Immunochromatographie sur membrane.
a. Selon un principe sandwich.

protéines comme de l'albumine bovine ou de la électrique) est connu et permet de déterminer


caséine. précisément les conditions physico-chimiques de
La membrane de migration peut être de type fixation sur les particules d'or. La sensibilisation
Nylon ou nitrocellulose avec une porosité com- peut également se faire par des anticorps poly-
prise entre 0,5 et 10 μm. clonaux au moyen de techniques d'adsorption
Le réservoir peut être en fibre de verre ou en ou de covalence en fonction du pH et de la
cellulose et doit être saturé par une solution de concentration en protéines (0,1 à 5 mg/mL). La
saccharose ou de protéines. Il est positionné sur suspension d'or colloïdal sensibilisé par des anti-
un papier filtre formant ainsi un seul élément des- corps doit être stabilisée par de l'albumine ou
tiné à recevoir l'échantillon testé. une solution de polyéthylène glycol (PEG). Les
Le filtre est également en fibre de verre ou en particules de latex sont une bonne alternative à
cellulose et peut être élaboré pour jouer lors du l'utilisation d'or colloïdal du fait du choix
dépôt du prélèvement un rôle de préfiltration de qu'elles offrent en taille et en couleur. Ces parti-
l'échantillon et de séparation du plasma. cules dites de latex peuvent en fait être compo-
L'or colloïdal est commercialisé sous forme de sées de polystyrène, de polyvinyltoluène, ou de
particules de 5 à 80 nm. La sensibilisation de l'or copolymères (styrène–acrylate, styrène–buta-
colloïdal par des anticorps monoclonaux est un diène ou styrène–divinylbenzène). Leur taille est
réel avantage car le pHi (ou Pi pour point iso­ comprise entre 0,02 et 3 μm de diamètre.
Chapitre 3. Techniques sans traceur 33

ou

Arrêt des particules d’or


restées libres par l’anticorps anti-immunoglobulines
présent sur la membrane
que les billes aient ou non fixé de l’antigène libre

Fixation des particules d’or


sensibilisées par un anticorps spécifique
sur l’antigène présent sur la membrane

Arrêt des particules d’or

Migration du prélèvement Positif Négatif


le long de la membrane –1 bande –2 bandes
b
Fig 3.5  Suite.
b. Sur membrane par compétition.

Des nanoparticules de 0,02 à 0,05 μm peuvent Avantages/inconvénients


également être utilisées. La fixation des anti-
Avantages Inconvénients
corps sur les particules de latex se fait comme
Tests unitaires Qualitatif ou au mieux semi-quantitatif
pour l'or colloïdal par une technique d'adsorp- Facilité d'utilisation Confirmation par un dosage ou une titration
tion, ou par la formation de liaisons covalentes Pré-analytique limité parfois nécessaire
en mettant à profit la présence de groupements Résultat rapide Coût élevé
chimiques (COOH, CH2NH2, ArNH2…) sur les Bonne sensibilité Tests unitaires (pas de grandes séries)
Bonne spécificité Précautions de mise en œuvre et
particules. d'interprétation

Recommandations de mise en œuvre Exemples d'applications


Les immunochromatographies sur membranes • En recherche : dans le domaine agro-alimentaire,
sont des tests de diagnostic rapide unitaires, les tests d'immunochromatographie sont utilisés
réalisables aussi bien en laboratoire, par le couramment pour la recherche et la détection de
médecin (doctor test) ou par le patient lui-même Listeria monocytogenes dans les aliments ou de
(test de grossesse par exemple). Le résultat est Plasmopara halstedii sur le tournesol.
très rapide (quelques minutes) et ne nécessite • En clinique :
en général que très peu de techniques – en pratique clinique, l'exemple le plus connu
pré-analytiques. est le test de grossesse qui révèle la présence
34 Techniques immunologiques

d'hormone chorionique gonadotrope (HCG) attaché à la feuille d'or et l'analyte est apporté
dans les urines ; par la microfluidique (flux continu). Si l'analyte
– ces tests sont également utilisés pour l'orien- interagit avec le ligand, la concentration locale
tation diagnostique de maladies infectieuses moléculaire augmente dans la région immédiate
comme la peste, la dengue, le paludisme, les du ligand, ce qui modifie l'indice de réfraction
infections à streptocoques ou la grippe (écou- locale. Le changement d'indice de réfraction a
villonnage nasal). pour effet de changer l'angle suite à la perte de
l'énergie par résonance, ce qui est enregistré par
le système. La cinétique de l'interaction dépend
Mesure d'affinité par du nombre des interactions analyte–ligand
résonance plasmonique (fig. 3.8). Une unité de résonance (RU) corres-
de surface pond à un changement de 0,0001° de l'angle
donnant une intensité minimale de lumière
réfléchie. Cette modification correspond à un
Le phénomène de résonance plasmonique de
changement de concentration de l'ordre de 1
surface (surface plasmonic resonance ou SPR) se
pg/mm2 pour la plupart des protéines. Le
produit à la réflexion d'un rayon lumineux pola-
BIAcore® constitue une technique sensible de
risé à l'interface entre deux milieux d'indices de
mesure des interactions ligand–récepteur.
réfraction différents (fig.  3.6). Une infime
variation de l'indice de réfraction (changement
de masse sur la surface) se traduit par un chan- Méthodologie
gement d'angle de réflexion totale de l'onde Les ligands sont fixés par liaison covalente sur
réfléchie. La technologie BIAcore® exploite la une cellule (chip) selon leur nature : protéines,
SPR pour objectiver la cinétique d'interaction acides nucléiques, lipides, polysaccharides. Les
analyte–ligand par la modification de l'angle de analytes (récepteurs) en solution sont appliqués à
la lumière réfléchie sur la surface où se trouve
fixé le ligand.
sans protéine avec protéine
Dans le système BIAcore®, les milieux sont
Intensité

représentés par la solution dans laquelle se


trouvent les analytes, d'une part, et une surface
qui sert de senseur (cellule ou chip), d'autre part.
L'interface est constituée d'un fin film d'or. La
SPR modifie la lumière réfléchie à un angle spé-
cifique. Cet angle varie avec l'indice de réfraction
près de la surface du côté opposé à la lumière Angle du rayon réfléchi
réfléchie, c'est-à-dire du côté de l'analyte
Fig. 3.7  Modification de l'indice de réfraction par la
(fig. 3.7). Dans le système BIAcore®, le ligand est fixation du ligand.

Source de lumière Détecteur optique


polarisée

Lame de verre

Film d’or

Direction du flot des protéines

Fig. 3.6  Représentation schématique du phénomène de SPR.


Chapitre 3. Techniques sans traceur 35

Saturation
Dissociation

résonance
Signal de
Association

Régénération

Ligne de base Retour à la ligne de base

Injection Fin de Temps (s)


l’injection
Fig. 3.8  Cinétique de la réaction analyte–ligand au cours de la SPR.

concentration constante et dans un flot continu. Exemples d'applications


Le suivi dans le temps de la variation de signal La technique Biacore® s'applique à la caractérisa-
RU (sensorgramme) détermine les constantes tion des interactions moléculaires impliquant les
cinétiques d'association et de dissociation avec, petites molécules et toutes les classes biologiques.
par le calcul qui s'ensuit, la valeur de paramètres Par l'injection séquentielle de plusieurs interac-
thermodynamiques de l'interaction analyte– tants, elle permet de faire une cartographie des
ligand : par exemple, constante d'affinité, domaines d'interaction et de définir la composi-
concentration en molécules fonctionnelles ou tion et le mécanisme d'assemblage de complexes.
stœchiométrie d'interaction. Elle peut être appliquée à la caractérisation
d'une réaction antigène–anticorps : mesure ther-
Recommandations de mise en œuvre modynamique (affinité), évaluation de la spécifi-
cité. Plus généralement, elle permet la mesure des
Il existe de nombreux supports adaptés aux ligands forces d'interaction entre deux protéines, par
selon leur nature chimique sans que de grandes exemple liaison ligand–récepteur, évaluation de la
quantités soient nécessaires. Par contre, il faut dis- transduction de signal (e.g. interaction entre pep-
poser en quantité suffisante des molécules à injec- tides contenant une phosphotyrosine et domaines
ter dans le flot continu. SH2, protéine G, cascade d'activation de
De petites molécules peuvent se trouver sous le phosphorylases).
seuil de sensibilité de l'appareil. Il est recom- Il n'y a pas d'application clinique de cette
mandé d'immobiliser la plus petite molécule du méthodologie qui trouve sa place en recherche
couple analyte–ligand. La liaison entre un ligand dans les domaines de l'immunologie, de la bio­
immobilisé et des cellules ne permet pas encore logie cellulaire, de la microbiologie. Elle est égale-
une mesure fiable des valeurs des constantes ment utilisée par l'industrie alimentaire pour des
d'association. analyses fines de la composition des aliments.

Avantages/inconvénients
Avantages Inconvénients Agglutination immunologique
Pas de nécessité de marquer Appareillage coûteux
les molécules (ligand 1 comme ligand 2) réservé à des plate- Les réactions d'agglutination mettent en jeu le
Calculs de valeurs de Ka (constante formes mutualisées plus souvent un antigène présent à la surface
d'association)
d'une particule d'une taille comprise entre 0,1 et
36 Techniques immunologiques

10 microns (hématies, leucocytes, plaquettes, importante et augmente la probabilité de ren-


spermatozoïdes, micro-organismes, billes de latex contres intermoléculaires. L'agglutination est
ou de sépharose) et des anticorps qui en sont spé- rapide à 37 °C mais la quantité d'anticorps agglu-
cifiques. La suspension de particules, d'abord tinés est plus importante à basse température
homogène, devient le siège d'agrégats visibles à (après 24 h), d'où la notion d'anticorps chauds et
l'œil nu ou au faible grossissement d'un micros- d'anticorps froids. Une modification du pH peut
cope ordinaire (objectif × 10). C'est un phéno- altérer la réaction d'agglutination, le pH optimum
mène d'association antigène–anticorps regroupant pour une réaction d'agglutination standard étant
les particules en amas. La réaction peut être compris entre 6 et 8. L'effet de la force ionique
détournée en recouvrant des particules d'anti- peut être contrariant ou facilitant, tout comme le
corps spécifiques d'antigènes plurivalents. pH. En effet, elle peut favoriser la formation du
L'utilisation de particules de très petite taille per- réseau par diminution du potentiel Zeta.
met d'utiliser une lecture en turbidimétrie ou en Les différentes modalités consistent à développer
néphélémétrie. Ces techniques d'agglutination une agglutination directe ou indirecte, active
microparticulaire peuvent être extrêmement sen- lorsque l'antigène est propre à la particule (e.g.
sibles. Leur spécificité dépend des qualités respec- groupe sanguin, bactérie) ou passive lorsque sont
tives des anticorps et des antigènes mis en jeu. utilisées des particules inertes sur lesquelles l'anti-
gène d'intérêt a été préalablement fixé. Les supports
les plus utilisés sont les billes de latex et les hématies.
Méthodologie
Les billes de latex sont des sphères de diamètres,
L'interaction des particules entre elles fait inter- charges et couleurs différents. Elles ont l'avantage
venir deux forces antagonistes, la force de répul- d'être biologiquement neutres et inertes. De plus,
sion (provenant des charges électriques elles sont activables chimiquement, ce qui permet
identiques des particules) et la tension interfa- de réaliser un couplage ou la fixation de l'antigène à
ciale (agrégation des particules entre elles). Le pH 8,2, bien que cette intervention ait un coût
potentiel Zeta représente la différence de poten- élevé. Les hématies de mouton permettent la fixa-
tiel entre le nuage ionique entourant la particule tion de l'antigène par simple contact, par traitement
et le milieu ambiant et peut être représenté par à l'acide tannique ou par un réticulant chimique
l'équation : Z = f[σ,1/D, 1/√D.μ]. Le potentiel (benzidine bis-diazotée, difluoro-dinitrobenzène,
Zeta est proportionnel à la charge σ de la surface glutaraldéhyde, carbodiimide, benzoquinone). Les
des particules, inversement proportionnel à la avantages des hématies sont leur universalité et leur
constante diélectrique D du milieu, et à la racine taille, leurs propriétés rhéologiques idéales, leur sta-
carrée de la force ionique du milieu μ. Le poten- bilité en suspension, leur surface présentant des gly-
tiel Zeta peut être positif (cationique) ou négatif coprotéines avec des ancrages covalents et leur
(anionique). Les anticorps spécifiques d'un anti- moindre coût. Les inconvénients sont leur instabi-
gène particulaire modifient l'état électrique de lité dans le temps (hémolyse en 3 semaines) impo-
cette particule en augmentant le potentiel Zeta, sant une fixation par des aldéhydes (formol) et la
il y a alors agglutination. mosaïque d'antigènes de surface pouvant générer
Les paramètres de la réaction sont critiques selon des réactions parasites avec des anticorps différents
que les anticorps sont directement agglutinants de ceux recherchés (hémagglutinations non inter-
(e.g. IgM produisant une agglutination en tampon prétables). Différentes étapes sont à réaliser pour
de force ionique 0,15 M) ou non agglutinants préparer des particules sensibilisées. Il faut tout
(incapables de produire une agglutination dans ces d'abord purifier l'antigène à fixer afin de limiter les
conditions). La nature des antigènes (nombre de réactions croisées. L'antigène est ensuite couplé, ce
sites antigéniques, localisation) et d'autres facteurs qui est une étape critique, par adsorption simple ou
expérimentaux peuvent aussi influer, tels que la par couplage chimique. Enfin, il faut évaluer la
température, le pH et la force ionique. Une tem- quantité d'antigène fixée, la sensibilité, la spécificité
pérature élevée entraîne une agitation moléculaire et la stabilité des suspensions.
Chapitre 3. Techniques sans traceur 37

L'agglutination directe (fig. 3.9) résulte de l'as- de réaliser une protéolyse des glycoprotéines de
sociation entre un anticorps agglutinant, d'isotype la surface cellulaire (papaïne, fucine, broméline,
IgG ou IgM, et un antigène à la surface de la par- trypsine) pour réduire le potentiel Zeta, ce qui
ticule. Elle se développe en tube, en microplaque, permet ainsi une meilleure accessibilité des anti-
sur lame ou sur une plaque cartonnée plastifiée. gènes en les démasquant.
Elle peut être qualitative ou quantitative, si une L'agglutination indirecte consiste à réticuler des
titration est effectuée, le titre étant l'inverse de la anticorps spécifiques non agglutinants fixés à la par-
dernière dilution de sérum à laquelle s'observe ticule par l'intermédiaire d'un anticorps secondaire
l'agglutination. anti-immunoglobuline (on parle d'antiglobuline).
On peut faciliter l'agglutination entre un anti-
gène particulaire et un anticorps non aggluti-
Recommandations de mise en œuvre
nant en diminuant la charge électrique, en
augmentant la constante diélectrique, ou en La technique d'agglutination sur lame ou sur
augmentant la force ionique du milieu. Ceci plaque se développe en mélangeant une goutte de
peut être obtenu en ajoutant des macromolé- sérum à une goutte de suspension de particules
cules (albumine bovine, dextran, Ficoll®) au sensibilisées, par agitation circulaire (3 à 5 minutes).
milieu réactionnel, pour favoriser les liaisons des La réaction est lue par la formation d'agrégats à
anticorps aux particules. Une autre solution est l'œil nu.

IgG

Particule
recouverte
d’antigène

IgM

Fig. 3.9  Exemple d'agglutination directe avec des anticorps agglutinants d'isotype IgG (en haut) ou IgM (en bas)
reconnaissant un antigène (en bleu) présent à la surface des particules agglutinées.
Dans l'agglutination passive, cet antigène n'appartient pas à la particule (en jaune) et y a été fixé pour utiliser la particule
comme support.
38 Techniques immunologiques

La technique d'hémagglutination se développe Exemples d'applications


en tube ou sur des microplaques à fond rond dans • En recherche : cette technique peut être appli-
lesquels sont placés le tampon de dilution, des quée à de nombreuses combinaisons antigène
globules rouges (sensibilisés ou témoins) et des anticorps.
dilutions du sérum à tester. La réaction est lue en • En clinique :
observant le dépôt des hématies au fond des puits – les groupes sanguins sont déterminés par
(fig.  3.10). Les contrôles de non-agglutination agglutination active ou directe. Ce type de
conduisent à une sédimentation en bouton des réactions est également appliqué aux séro-
globules rouges. À l'inverse, un voile d'agglutina- groupages bactériens (e.g. Salmonella,
tion se forme lorsque la réaction est positive. Shigella, E. coli entéropathogènes) ;
L'ajout de mercapto-2-éthanol (ou β-mercapto- – la recherche d'anticorps anti-hématies est réa-
éthanol) permet de différencier les réponses lisée dans le cadre des anémies hémolytiques
IgM/IgG, en annulant l'agglutination réalisée par par les tests de Coombs directs ou indirects ;
les pentamères d'IgM. Enfin, des colonnes rete- – l'agglutination passive est utilisée par
nant les agglutinats mais laissant passer les héma- exemple pour la recherche d'anticorps anti-
ties non agglutinées sont utilisées dans l'application toxoplasme dans un sérum après fixation
particulière des tests de Coombs. d'un antigène soluble de toxoplasme sur
des billes de latex ;
Avantages/inconvénients – la néphélémétrie microparticulaire est utilisée
pour le dosage des facteurs rhumatoïdes.
Avantages Inconvénients
Prise en compte de l'isotype et de Phénomènes de zone
l'affinité de l'anticorps (excès d'anticorps ou Mise à profit des capacités
Résultat qualitatif (négatif ou positif)
Quantification de l'avidité sur le temps
d'antigènes) imposant une
dilution des anticorps
cytotoxiques du complément
de réaction (agglutination en moins de Pour l'hémagglutination,
10 secondes à plus de 60 secondes) pas de dosage quantitatif, Le complément est un ensemble de protéines
Peu de matériel nécessaire mais titrage par dilution
Faible coût (courbe dose-réponse
solubles pouvant s'activer en cascade sous l'effet
Tests unitaires ou grandes séries avec référence) d'un déclencheur et aboutissant à la génération de
Rapidité Mauvaise conservation fragments bifonctionnels (C3b, C4b, C5b) et du
Technique sensible et spécifique des hématies dans le complexe d'attaque membranaire (CAM). Il
Dosages quantitatifs avec les temps (limite de
techniques d'agglutination 3 semaines, plusieurs
intervient dans la réponse immunitaire innée pour
microparticulaire mois si formolées et la lyse directe de micro-organismes, pour le
Différenciation de la réactivité IgG/IgM conservées à 4 °C) chimiotactisme et pour amplifier l'inflammation.
par le mercapto-2-éthanol Il contribue à la défense adaptative par coopéra-

Fig. 3.10  Lecture et interprétation d'hémagglutination en plaque.


Réaction positive : voile d'agglutination. Réaction négative : bouton ou point de sédimentation.
Chapitre 3. Techniques sans traceur 39

tion avec les anticorps pour la destruction de cel- peut être mise à profit in vivo pour la destruction
lules étrangères. Les tests diagnostiques exploitent de cibles cellulaires. Ceci a été à l'origine du déve-
cette réponse. loppement de nombreux anticorps monoclonaux
thérapeutiques. Actuellement, la majorité des
Méthodologie cibles antigéniques sont des récepteurs de surface
cellulaire.
Dans les tests utilisant le complément comme
Enfin, l'hémolyse est largement utilisée en bio-
révélateur (fixation du complément), le but est de
logie clinique pour explorer la fonctionnalité de
détecter et éventuellement de titrer des anticorps.
l'activation du complément.
Le sérum à tester doit d'abord être décomplé-
menté par incubation 30 minutes à 56 °C. Il est
ensuite mis en présence de l'antigène microbien, Recommandations de mise en œuvre
le plus souvent sous forme soluble et de complé- Comme mentionné précédemment, les sérums à
ment de cobaye. Si le sérum testé contient des tester doivent être décomplémentés afin de ne pas
anticorps, leur combinaison à l'antigène forme un interférer avec le système de révélation. Par ail-
complexe immun qui active et consomme le com- leurs, les sources animales de complément doivent
plément. La révélation de cette réaction se fait de être soigneusement titrées. Le tampon de faible
manière indirecte en ajoutant au test des hématies force ionique (i.e. Dextrose Gelatin Veronal Buffer
de mouton recouvertes d'anticorps anti-hématies ou DGVB) doit être ajusté pour son contenu en
de mouton (en conditions non hémaggluti- calcium (2,5 mM) et en magnésium (0,5 mM).
nantes). Si le complément n'a pas été consommé
(absence d'anticorps spécifiques), les anticorps Avantages/inconvénients
fixés sur les hématies l'activeront et une hémolyse
sera observée. L'absence d'hémolyse signe donc Avantages Inconvénients
un test positif. Faible coût Interférence des facteurs
Screening haut débit rhumatoïdes
L'activation du complément peut aussi être
Possibles réactions croisées
appliquée dans le typage HLA. Il s'agit de la tech- Faible sensibilité
nique sérologique en microplaque initialement
décrite par Terasaki. Les lymphocytes à tester sont
mis en contact avec des panels d'anticorps anti- Exemples d'applications
HLA de spécificité connue, prédéposés dans les La réaction de fixation du complément pour le
puits d'une plaque de microtitration. Après incu- dosage des anticorps sériques a longtemps été
bation, du sérum de lapin titré est ajouté comme appliquée aux sérodiagnostics d'infections bacté-
source de complément. Les lymphocytes sont riennes, virales ou parasitaires. Elle est à l'heure
lysés dans les puits où les anticorps se sont fixés sur actuelle de moins en moins utilisée du fait de ses
les antigènes HLA. Ceci est objectivé par la per- difficultés de réalisation et sa faible sensibilité. Elle
méabilité à un colorant normalement exclu des reste indispensable à certaines sérologies virales
cellules vivantes. (e.g. anticorps anti-adénovirus, anti-orthomyxovi-
La cytotoxicité dépendante du complément rus, antiparamyxovirus) ou bactériennes (e.g. anti-
(Complement Dependent Cytotoxicity ou CDC) corps antimycoplasmes).
Chapitre 4
Techniques avec traceurs

Types de traceurs coloré proportionnellement à la quantité d'enzymes


et donc de la molécule à laquelle elle est conjuguée.
La mesure est réalisée à l'aide d'un spectrophoto-
Dans la plupart des cas, les immuno-analyses uti-
mètre et le résultat est exprimé en unités arbitraires
lisent un réactif (antigène ou anticorps) associé à
de densité optique (DO). En métabolisant plusieurs
un traceur détectable permettant de révéler la
molécules de substrat, les enzymes amplifient le
liaison antigène–anticorps spécifique. Les tra-
signal, permettant la détection de très faibles quan-
ceurs augmentent la sensibilité d'une immuno-
tités de cibles. Le substrat et le chromogène non
analyse et permettent de déceler des quantités
dégradés ne doivent pas perturber la lecture et le
plus faibles de cible que les méthodes qui ne les
produit coloré doit être facilement détectable. De
utilisent pas. Trois grands types de traceurs sont
plus, il est préférable que l'enzyme, le substrat et le
utilisables, des enzymes, des fluorochromes et
produit soient absents des préparations à analyser.
des radio-isotopes. Initialement, ce sont ces der-
En raison de leur très grande spécificité, les anti-
niers qui ont permis la mise en évidence de
corps sont souvent utilisés dans des réactions
réactions antigène–anticorps non décelables
­
immuno-enzymatiques qualitatives ou quantita-
directement. Les contraintes liées à l'utilisation
tives visant à détecter des antigènes. Le couplage
des radio-isotopes ont conduit à développer des
du traceur sur les anticorps ne doit pas altérer leur
méthodes immuno-enzymatiques et d'immuno-
immunoréactivité ni la capacité du traceur à géné-
fluorescence qui ont progressivement supplanté
rer un signal.
les techniques radio-immunologiques.
Dans les techniques immuno-enzymatiques
en phase liquide, le produit coloré doit demeu-
rer soluble et rester détectable par spectropho-
Les enzymes comme traceurs
tométrie ou chimioluminescence. Dans les
L'utilisation d'enzymes comme traceurs a été intro- techniques en phase solide (e.g. membranes
duite dans la seconde moitié du xxe siècle pour offrir synthétiques, cellules, tissus), le produit coloré
une alternative aux radio-isotopes. Pour être effi- précipite au site précis de la réaction antigène–
caces en tant que traceurs, les enzymes candidates anticorps et est détecté macroscopiquement ou
doivent privilégier des contraintes michaeliennes microscopiquement.
avec un faible KM pour leur substrat, catalyser des
réactions irréversibles, être stables, résistantes aux
1
Un chromogène est une molécule incolore capable de
interférences et faciles à conjuguer sans perte d'acti-
former un produit coloré à la suite d'une réaction chimique.
vité. L'activité enzymatique en présence d'un subs- Par exemple, la diaminobenzidine (DAB) est oxydée lorsque la
trat adapté et d'un chromogène1 génère un produit peroxydase catabolise le peroxyde d'hydrogène (H2O2).

Méthodes en immunologie
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42 Techniques immunologiques

L'anticorps (ou l'antigène) est couplé à une peuvent se lier à une molécule de streptavidine.
enzyme soit de façon covalente, soit par des liaisons L'addition à la réaction finale de molécules de bio-
non covalentes biospécifiques. Pour le couplage tine bivalentes (liées à l'aide d'un agent réticulant
covalent, les méthodes les plus courantes utilisent le ou linker) couplées à l'enzyme et de streptavidine
glutaraldéhyde, le m-periodate ou des déri- permet la formation de volumineux complexes
vés  de  maléimide. L'utilisation d'esters de dans lesquels les sites restés libres de la streptavidine
N-hydroxysuccinimide (NHS) permet d'établir un reconnaissent la biotine de l'anticorps conjugué.
pontage entre l'enzyme et l'anticorps. Le système C'est le système streptavidine–biotine ou avidine–
biospécifique de conjugaison non covalente est biotine (Avidin–Biotin Complex ou ABC) (fig. 4.1).
basé sur l'interaction entre la biotine (vitamine Les enzymes les plus utilisées sont la peroxydase
soluble, appelée selon les pays vitamine B8, B7 ou et la phosphatase alcaline en raison de leur simplicité
H) et la streptavidine (purifiée à partir de d'utilisation et de leur sensibilité (tableau 4.1).
Streptomyces avidinii) ou l'avidine (isolée des blancs La peroxydase de raifort (horseradish peroxidase
d'œufs). Cette interaction a une affinité extrême- ou HRP), présente dans des racines de végétaux
ment forte de l'ordre de 10−14 M. Deux systèmes telles que les radis noirs, est une petite glycopro-
peuvent être utilisés. Dans le plus simple, la biotine téine de 40 kDa, ce qui lui permet de diffuser faci-
est conjuguée à l'anticorps et la streptavidine à l'en- lement dans les tissus ou les cellules lors des
zyme, toutes deux de façon covalente. Une alterna- marquages, tout en limitant les interférences avec
tive permet de développer un système la protéine conjuguée. Elle catalyse la réaction
d'amplification de la réaction antigène–anticorps. d'oxydoréduction suivante qui aboutit à former
En effet, jusqu'à quatre molécules de biotine un chromogène oxydé et de l'eau :

Anticorps primaire Antigène Dimère de biotine ( ) + enzyme

Anticorps secondaire biotinylé Saturation Streptavidine

Fig. 4.1  Représentation schématique du système d'amplification du complexe avidine–biotine (ABC).


Chapitre 4. Techniques avec traceurs 43

H 2O2 + [ chromogène incolore ] - H 2 utilisés, la lecture est classiquement réalisée au


microscope à fluorescence. Pour éviter l'effet délé-
® 2 H 2O + [ chromogène oxydé coloré ] tère de la lumière d'excitation sur l'œil, le système
Elle peut aussi catalyser l'oxydation du luminol développé par Johan Sebastiaan Ploem, dit d'épi-
en 3-aminophthalate pour les techniques basées illumination, équipe maintenant tous les micros-
sur la chimioluminescence. La HRP peut aussi copes à fluorescence. Ainsi, seule la lumière émise
dans ce cas être amplifiée par certains produits par le fluorochrome est perçue par l'observateur.
chimiques (enhancers) pour faciliter la détection Une autre caractéristique du phénomène de
de la réaction d'où le terme enhanced chemilumi- fluorescence réside dans le fait que cette lumière
nescence (ECL). émise résulte du changement transitoire de spin
La phosphatase alcaline (PAL), absente des des électrons du fluorochrome et est donc labile.
végétaux, est dérivée d'intestins de veau ou Il est important d'éviter l'exposition des fluoro-
d'Escherichia coli. Elle catalyse l'hydrolyse d'une chromes à la lumière en dehors de l'expérimenta-
liaison ester monophosphate pour libérer un ion tion et d'effectuer rapidement l'observation.
phosphate et un groupement hydroxyle libre en L'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) est le
présence d'eau. Par exemple, le paranitrophényl fluorochrome qui a été utilisé initialement et reste
phosphate incolore est ainsi transformé en parani- l'une des substances les plus populaires. Il est modé-
trophényle (pNP) jaune : rément photosensible et émet une lumière jaune-vert
après excitation par une lumière bleue (488 nm).
[ pNP ] - HPO-4 + H O ® [ pNP ] - OH + H PO-4
2 2 Le développement majeur des techniques dites
d'immunofluorescence réside dans le fait qu'un
Les autres enzymes utilisées incluent l'acétylcho- nombre croissant de fluorochromes ont été déve-
linestérase de l'organe électrique de l'anguille élec- loppés (tableaux 4.2 et 4.3), d'abord excitables
trique (Electrophorus electricus) et, de façon moins par la même lumière mais émettant dans des lon-
courante, la β-galactosidase d'Escherichia coli. gueurs d'onde différentes, et plus récemment
En général, les réactions enzymatiques sont excitables par diverses sources et émettant dans
arrêtées par l'addition de solutions d'acide ou de une grande variété de longueurs d'onde. Ces pro-
base diluées qui changent le pH du milieu et inac- grès, couplés au développement de lasers permet-
tivent l'enzyme. tant une excitation par un faisceau cohérent très
précis, ont permis notamment l'avènement des
techniques de cytométrie multiparamétrique dite
Les fluorochromes encore polychromatique/multicolore.
comme traceurs
Les techniques mettant à profit la phosphores- Les radio-isotopes
cence, et plus tard la fluorescence, se sont rapide- comme traceurs
ment avérées également utiles pour une détection
sensible des réactions antigène–anticorps. Les deux principaux radio-isotopes utilisés dans les
Un fluorochrome est une substance qui est techniques immunologiques sont l'iode-125 (125I)
capable d'absorber l'énergie d'une source lumineuse et le tritium (3H). Ils sont employés pour le mar-
et d'émettre en retour un rayonnement d'une lon- quage d'une molécule qui sert alors de traceur
gueur d'onde supérieure. On définit ainsi pour radioactif. Ce caractère radioactif restreint leur uti-
chaque fluorochrome deux longueurs d'onde diffé- lisation, soumise à une réglementation spécifique.
rentes : excitation optimale, émission maximale. Il L'iode-125 est un radionucléide artificiel dont
est nécessaire de mettre en jeu un appareillage (spec- la période radioactive est de 59,7  jours. Il émet
trofluorimètre) équipé pour disposer d'une source des rayonnements X (raie principale 27 keV) et γ
d'excitation du fluorochrome et d'un système de (raie principale 35 keV) dont la détection est assu-
détection du signal. Dans les tests d'immunofluores- rée par un scintillateur solide d'iodure de sodium
cence sur tissus ou sur cellules, encore largement associé à un photomultiplicateur.
44
Tableau 4.1 Caractéristiques des différents substrats de la réaction enzymatique développée en immuno-analyse
Enzyme Substrat/chromogène/ Technique État du Couleur Longueur Sensibilité Avantage Inconvénient
fluorigène produit final d'onde,
absorption

Techniques immunologiques
HRP TMB 3,3′,5,5′-tétramé- ELISA, IHC, ICC Soluble ou Bleu et devient 370 ou entre 620 +++ Non cancérigène Photosensible
thylbenzidine précipité jaune en présence et 650 nm
d'acide sulfurique 450 nm si stoppé
(pour arrêter la par H2SO4
réaction)
HRP OPD orthophénylène ELISA Soluble Orangé 450 nm ou 492 si ++ Disponible en Photosensible
diamine stoppé par HCl ou tablettes Toxique
H2SO4
HRP ABTS 2,2′-azino-di- ELISA Soluble Bleu–vert. La 405/450 nm +++ Stable Pas utilisable en
(3-éthylbenzthiazoline réaction peut être western-blot
sulphonate) stoppée par du
dodécylsulfate de
sodium
HRP AEC IHC Précipité Rouge NA ++ Moins toxique que
3-amino-9-éthylcarbazole la DAB
bon contraste
en hématoxyline
eosine
HRP 5-ASA acide 5-aminosa- ELISA Soluble Arrêt de la réac- 450 nm ++ Non toxique Préparation longue
licylique ou mésalazine tion par NaOH (médicament)
HRP 4CN 4-chloro-1-naphtol IHC Précipité Bleu noir NA + Peu de bruit de Peu sensible
fond
HRP DAB diaminobenzidine IHC, ICC, IB Précipité Marron foncé NA +++ Localisation Cancérigène
précise des
antigènes
HRP Orthotolidine ELISA Soluble Bleu 630 nm +++ Préparation
simple
HRP Luminol ELISA, IB (CS) Soluble Bleu. Émission à NA +++ Réutilisation Photosensible
413 nm, excita- plus facile des
tion à 355 nm membranes

Tableau 4.1 Suite
Enzyme Substrat/chromogène/ Technique État du Couleur Longueur Sensibilité Avantage Inconvénient
fluorigène produit final d'onde,
absorption
PAL pNPP paranitrophénol ELISA Soluble Jaune 405 nm +++ Substrat très Non recommandé pour
phosphate stable à tempé- les études en cinétique
rature ambiante Couleur pâle
(< 30 °C)
Révélation lente
PAL BCIP/NBT ELISA sans NBT Soluble ou Bleu–violet 670 nm en ELISA +++ Non photosensible
5-bromo-4-chloro- IB, IHC avec NBT précipité Soluble dans
3′-indolyphosphate/ l'alcool
nitro-bleu de tétrazolium
PAL FDP fluorescein ELISA Soluble Vert. Émission à NA +++ Très sensible, Photosensible
diphosphate 528 nm, excita- génération de
tion à 485 nm fluorescéine très
fluorescente
PAL DDAO ELISA, IB (CS) Soluble Rouge. Émission NA +++ Marquage stable Photosensible

Chapitre 4. Techniques avec traceurs 45


7-hydroxy-9H-(1,3- à 633 nm quand sur les blots
dichloro-9,9-dimethyla- excitation He-Ne
cridin-2-one)
PAL MUP 4-methylumbellife- ELISA (CS) Soluble Violet. Émission NA +++ Stable, facile à Fluorescence optimale
ryl phosphate à 440 nm quand utiliser en milieu basique
excité à 360 nm Variantes à utiliser aux
ou par UV pH bas
Acétylcholinestérase Réactif d'Ellman ELISA Soluble Jaune 405–412 nm + Peu utilisé
acétylthiocholine/DNTB Acétylthiocholine instable
acide 5,5′-dithio-bis-
(2-nitrobenzoïque)
NBT : Nitrobleu de tétrazolium ; CS : chimioluminescence ; IB : immunoblot ; IHC : immunohistochimie ; NA : non applicable.
46 Techniques immunologiques

Tableau 4.2  Caractéristiques des différents fluorochromes et tandems les plus utilisés en immunofluorescence
Fluorochrome Tandem Couleur Laser Longueur Longueur Sensibilité
d'excitation d'onde d'excita- d'onde d'émis-
tion (nm) sion (nm)
FITC : Non Vert Bleu 495 519 Moyenne
isothiocyanate de
fluorescéine
PE : Non Jaune Bleu 480/565 578 Forte
phycoérythrine
PE-Cy5 : Oui Rouge Bleu 480/565/650 670 Bonne
phycoérythriine-
cyanine 5
PE-Cy7 : Oui Rouge Bleu 480/565/743 767 Bonne
phycoérythriine-
cyanine 7
PerCP-Cy5.5 : Oui Rouge Bleu 490 675 Moyenne
peridinin-chlo-
rophylle/cyanine
5.5
ECD : phycoery- Oui Orange Bleu 486 620 Forte
thrine-Texas red
Cy5 : Cyanine 5 Non Rouge Rouge 650 670 Moyenne
Cy5.5 : Cyanine Non Rouge Rouge 675 694 Moyenne
5.5
APC : Non Rouge Rouge 650 660 Forrte
allophycocyanine
APC-Cy7 : Oui Rouge Rouge 650/755 767 Faible
allophycocya-
nine-cyanine 7
Pacific blue Non Bleu UV/violet 403 455 Faible
Krome Orange ®
Non Orange UV/violet 398 528 Forte
Horizon V500 Non Bleu-vert UV/violet 415 500 Forte

Le tritium présente une période radioactive de s­tabilité du marquage peut être très variable
12,3 ans et est un émetteur β de faible énergie. Sa d'un traceur à l'autre. Par ailleurs, il convient
détection dans des échantillons biologiques néces- de  noter la production de nouveaux radio-élé-
site d'y ajouter un réactif scintillant dont l'émis- ments ou radiopharmaceutiques adaptés à l'em-
sion finale de photons est détectée par un ploi diagnostique et thérapeutique d'anticorps
compteur à scintillation. monoclonaux.
Comme pour les autres traceurs, il faut que le
marquage radioactif ne modifie pas la structure
moléculaire, en particulier l'immunoréactivité. Dosages immuno-
Après couplage, le traceur doit être utilisé rapi- enzymatiques (ELISA) ou
dement afin d'obtenir le signal optimal corrélé à immuno-fluorescents (FLISA)
son activité spécifique2. Il est à noter que la
La technique d'ELISA (Enzyme-Linked
2
L'activité spécifique correspond au nombre de désinté-
grations d'une substance radioactive par unité de temps et de
ImmunoSorbent Assay) aussi appelée EIA (Enzyme
masse. Immuno Assay) a été mise au point au début des
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 47

Tableau 4.3  Fluorochromes colorant les noyaux et utiles pour la mesure du cycle cellulaire, de la viabilité ou pour
identifier les cellules nucléées
Fluorochrome Propriétés Couleur Laser d'excitation Longueur d'onde Longueur d'onde
d'excitation (nm) d'émission (nm)
DAPI : diamidino Se lie aux régions Bleu UV 351 647
phénylindole riches en A-T
Peut pénétrer dans
les cellules intactes
IP : iodure de Intercalant marquant Rouge Bleu 505/540 620
propidium les cellules non
viables
Bet : bromure Intercalant marquant Bleu Bleu 320/518 605
d'éthidium les cellules non
viables
7-AAD : 7-amino- Intercalant marquant Bleu Bleu 546 647
actinomycine les cellules non
viables
Draq5 : 1,5-bis{[2- Marquage nucléaire Bleu ou Rouge Rouge 646 697
(dimethylamino) des cellules vivantes
ethyl]amino}-4,
8-dihydroxyan-
thracene-9,10-dione
Syto 16® Marquage nucléaire Vert Bleu 488 518
des cellules vivantes
CyTRAK Orange® Marquage nucléaire Orange Bleu 488 615
des cellules vivantes

années 1970 par deux chercheurs de l'université le type d'ELISA utilisé. On distingue plusieurs
de Stockholm, Eva Engvall et Peter Perlmann. types d'ELISA en fonction de la nature de la
Comme son nom l'indique, la technique ELISA molécule à doser et de la technique de révélation :
repose sur une réaction immunologique se dérou- ELISA direct, indirect, sandwich ou compétitif
lant sur un support solide et révélée par une réac- (tableau 4.4 et fig. 4.2).
tion enzymatique en phase liquide. La mesure de
la réaction colorée finale se fait à l'aide d'un spec-
Méthodologie
trophotomètre. Un fluorochrome est utilisé pour
révéler la réaction dans la variante FLISA Les techniques ELISA comportent différentes
(Fluorescence-Linked ImmunoSorbent Assay). étapes (fig. 4.3).
L'ELISA peut être réalisé à visée qualitative ou
quantitative selon que l'on utilise ou non une Adsorption des molécules (fig. 4.3 : ①)
courbe d'étalonnage (ou gamme étalon). Cette der- La première étape clé de l'ELISA repose sur l'im-
nière doit être réalisée avec une solution de concen- mobilisation de la molécule à adsorber sur un sup-
tration connue de la molécule que l'on cherche à port solide, le plus généralement des microplaques
doser. Le seuil de détection des ELISA quantitatifs (de 96 ou 384 puits) de polystyrène à fond plat à
est de l'ordre du pmol/L ou du ng/mL. Des haute capacité d'adsorption. Il s'agit principalement
dosages semi-quantitatifs peuvent être réalisés en d'une adsorption passive directe réalisée grâce à
comparant la densité optique obtenue avec l'échan- l'établissement de liaisons non covalentes de type
tillon à celle d'une série de calibrateurs. hydrophobe et ionique entre le plastique et les rési-
Les antigènes d'intérêt ou les anticorps spéci- dus non polaires ou ioniques des protéines. Cette
fiques sont immobilisés sur le support solide selon étape s'effectue classiquement en tampon alcalin
48 Techniques immunologiques

Tableau 4.4  Différents types d'ELISA utilisables selon l'analyte recherché : antigène ou anticorps
Analyte recherché Type de technique Analyte adsorbé Premier réactif Deuxième réactif Réactif soluble de
ELISA soluble soluble révélation
Antigène Antigène Anticorps de / Substrat/
détection marqué chromogène
Direct
Anticorps Anticorps Antigène marqué / Substrat/
chromogène
Anticorps Indirect Antigène Anticorps primaire Anticorps secondaire Substrat/
marqué chromogène
Antigène Sandwich Anticorps de capture Antigène Anticorps de Substrat/
détection marqué chromogène
Anticorps Antigène Anticorps Anticorps marqué Substrat/
chromogène
Compétitif
Antigène Anticorps Antigène Antigène marqué Substrat/
chromogène

ELISA direct ELISA indirect

ELISA sandwich

Antigène couplé Anticorps couplé


ELISA compétitif ELISA compétitif

Enzyme Substrat Produit coloré ou fluorescent Antigène Antigène compétitif

Fig. 4.2  Représentation schématique des différents types d'ELISA ou de FLISA.



1 lavages 2 lavages 3 lavages 4 lavages 5

Gamme

blanc

Densité optique

Densité optique
négatif

Chapitre 4. Techniques avec traceurs 49


6
positif

Concentration Concentration

Gamme étalon Dosage (sigmoïde)


Fig. 4.3  Différentes étapes d'un ELISA de type sandwich.
50 Techniques immunologiques

type Phosphate-Buffered Saline (PBS) pH 7,4 ou plusieurs molécules peuvent se fixer à l'anticorps
carbonate–bicarbonate pH 9,6 afin d'ioniser les primaire, ce qui amplifie le signal. Par ailleurs, cette
molécules en solution lors de cette étape. Toutefois, alternative évite les risques de perte de réactivité de
l'adsorption passive directe peut avoir des limites l'anticorps primaire suite à son couplage chimique
(faible capacité d'absorption, mauvaise orientation direct avec une enzyme ou la biotine. Dans l'ELISA
de la protéine adsorbée, dénaturation, contamina- sandwich, en règle générale, l'anticorps de capture
tion par d'autres protéines…) et des alternatives ont est un anticorps polyclonal, alors que l'anticorps de
dû être développées. Il s'agit par exemple de l'utili- détection est un monoclonal.
sation de plaques pré-adsorbées avec des protéines A
ou G du staphylocoque très affines pour les frag- Révélation (fig. 4.3 : ⑤)
ments Fc des immunoglobulines, ou recouvertes de Après lavages, l'étape ultime de l'ELISA est la révé-
streptavidine permettant la fixation d'antigènes bio- lation consistant en l'ajout du substrat et du chro-
tinylés. Il est possible également d'utiliser un sup- mogène spécifiques de l'enzyme. Cette étape est
port chimiquement activé présentant des réalisée dans un tampon adapté à l'activité enzyma-
groupements hautement réactifs permettant d'éta- tique du système de révélation. La mesure de la den-
blir des liaisons covalentes entre la microplaque et sité optique peut être réalisée en cinétique ou en
l'antigène ou l'anticorps de capture. Il est nécessaire point fixe après arrêt de la réaction par ajout d'un
de procéder à un lavage en tampon type PBS ou tampon acide ou basique détruisant l'activité enzy-
TBS (Tris-Buffered Saline) afin d'éliminer le maté- matique. À ce stade, la quantité de signal émis est
riel non adsorbé. Des détergents doux (comme le proportionnelle à la quantité de la molécule à doser.
Tween-20®) sont classiquement ajoutés à faible Il est à noter que d'autres systèmes de révéla-
concentration (0,05 %) pour faciliter les lavages. tion peuvent être employés, notamment de type
fluorométrique ou chimioluminescent en fonc-
Saturation du support adsorbant (fig. 4.3 : ②) tion du type de substrat utilisé. Dans ces cas, le
Après l'étape de liaison au support, il est néces- support d'immobilisation doit être compatible
saire de neutraliser les zones du support restées avec le moyen de détection, notamment un
libres. Il s'agit de l'étape de saturation qui permet support opaque pour une révélation en
­
d'éviter toute adsorption ultérieure de matériel chimioluminescence.
présent dans l'échantillon à doser ou lors de l'ajout
des autres réactifs. Elle s'effectue par ajout de Expression des résultats (fig. 4.3 : ⑥)
tampon riche en protéines (type PBS + albumine Selon le type d'ELISA utilisé, différentes courbes
bovine sérique) suivi d'une étape de lavage. de titration peuvent être obtenues.
Première réaction antigène–
anticorps (fig. 4.3 : ③) Recommandations de mise en œuvre
Après la saturation de la plaque et des lavages, le Pour des résultats exploitables en ELISA et éviter
premier réactif soluble est déposé dans les puits et la perte de sensibilité, il est nécessaire de trouver
la plaque est incubée. Pendant cette étape, les un bon équilibre entre le signal spécifique émis et
antigènes ou les anticorps en solution vont se lier le bruit de fond non spécifique. Ce bruit de fond
à la molécule adsorbée. Dans les ELISA directs, ce résulte de l'adsorption de protéines contaminantes
premier réactif est couplé à l'enzyme. non éliminées lors des lavages et capables de fixer
de manière non spécifique les réactifs de révéla-
Deuxième réaction antigène– tion. L'obtention d'un rapport signal/bruit accep-
anticorps (fig. 4.3 : ④) table nécessite d'optimiser l'étape de saturation,
Après plusieurs lavages, sauf dans les ELISA directs, d'adapter les concentrations des réactifs de capture
le deuxième réactif soluble, couplé à l'enzyme, est et de révélation et de prêter un soin particulier aux
déposé et la plaque est incubée. Dans les ELISA lavages. Le bruit de fond résultant des différentes
indirects, ce réactif est un anticorps secondaire dont étapes de manipulation est contrôlé par la réalisa-
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 51

tion de puits dits blancs pour lesquels l'ensemble • En recherche : le dosage de protéines d'intérêt
des étapes réactionnelles sont effectuées en l'ab- dans des surnageants ou lysats cellulaires est réa-
sence de la molécule à doser remplacée par une lisé fréquemment en ELISA.
solution tampon de type PBS. La densité optique • Applications industrielles et vétérinaires : ces
des puits blancs est soustraite de la valeur obtenue techniques sont également appliquées dans le
pour les puits de dosage. La densité optique des contrôle qualité des produits finis ou en cours
puits blancs doit être inférieure à 0,1. Si la densité de production, ainsi qu'en épidémiologie et
optique des échantillons à doser dépasse la valeur contrôle vétérinaire.
de 2, les résultats ne sont plus interprétables car • En clinique : l'ELISA est très utilisée pour le
l'absorbance n'est plus proportionnelle à la sérodiagnostic des maladies infectieuses et
concentration (domaine de validité de la loi de pour le diagnostic et le suivi de maladies
Beer-Lambert). Il est alors nécessaire de diluer les auto-immunes.
échantillons et d'effectuer un nouveau dosage.

Avantages/inconvénients Dosages radio-


De manière générale l'ELISA est une technique immunologiques (RIA)
sensible, rapide, adaptée à la réalisation de grandes
séries de dosage et offre la possibilité d'une auto- Les techniques radio-immunologiques ont pu être
matisation totale. mises au point à la suite de la découverte des radio-
isotopes qui constituent des traceurs très sensibles.
Exemples d'applications Ces techniques ont été initialement développées pour
L'ELISA est une technique très couramment le dosage de l'insuline, puis d'autres hormones.
développée dans le domaine du diagnostic biolo- Pendant longtemps, l'iode-125 a été le seul mar-
gique ou en recherche fondamentale. queur radioactif utilisé dans la mise au point et la

Avantages Inconvénients Alternatives


Immobilisation Facile et rapide Dénaturation de l'antigène ou de Passage à une immobilisation
l'anticorps et perte de sensibilité indirecte
Risque de fixation de protéines Amélioration des lavages et de la
non spécifiques et saturation
d'augmentation du bruit de fond
Révélation directe Durée plus courte Perte de réactivité liée au Révélation indirecte
Pas de problème de réactivité couplage Utilisation d'anticorps polyclonaux
croisée liée à l'utilisation d'un Pas d'amplification du signal de capture et d'un anticorps
anticorps secondaire couplé Coût du couplage du réactif de monoclonal de détection pour les
révélation ELISA sandwich
Nécessité de disposer de deux
anticorps monoclonaux dirigés
contre des épitopes distincts de
l'antigène pour les ELISA
sandwich n'utilisant pas
d'anticorps polyclonal de capture
Révélation indirecte Amplification du signal donc de la Une étape supplémentaire, durée Adapter la concentration de
sensibilité de l'ELISA plus longue l'anticorps et le nombre de
Réactifs de révélation Risque de réactivité croisée et lavages
indépendants de la spécificité d'augmentation du bruit de fond Diluer les échantillons
recherchée et donc utilisables Interférences avec les facteurs
pour différents tests rhumatoïdes et agglutinines
froides lors de dosages sanguins :
risque de faux positifs
52 Techniques immunologiques

r­éalisation des immunodosages de substances pré- est marqué à l'iode-125 et utilisé comme traceur.
sentes à des concentrations très faibles dans les L'antigène de l'étalonnage ou de l'échantillon est
liquides biologiques et les tissus. Il a été progressive- pris en sandwich entre les deux anticorps. L'excès
ment supplanté par l'emploi de marqueurs non isoto- de traceur est éliminé par une étape de lavage. La
piques (enzymatiques et luminescents) offrant une radioactivité mesurée est proportionnelle à la quan-
plus grande facilité d'emploi sans les restrictions tité d'antigène présente dans l'échantillon.
réglementaires liées à la manipulation des produits
radioactifs. La sensibilité des techniques radio-­
­
immunologiques est de l'ordre du pmol/L ou du Méthode par immunoprécipitation en phase
ng/mL. Cette sensibilité permet le dosage de cer- liquide (e.g. test de Farr pour le dosage des
taines hormones stéroïdes, de vitamines, de médica- auto-anticorps anti-ADN double brin)
ments, de marqueurs tumoraux ou d'auto-anticorps. Cette méthode permet de rechercher des anticorps à
l'aide d'antigènes purifiés marqués à l'iode-125. Les
Méthodologie complexes immuns (Ag*-Ac) formés dans le milieu
réactionnel sont précipités par l'addition de polyé-
L'utilisation des trousses d'immuno-analyse relève thylène glycol (PEG) ou de particules recouvertes
d'une décision administrative autorisant la mani- de protéine A (spécifiques des immunoglobulines
pulation des substances radioactives. Elles com- humaines et des anticorps de souris). Après centrifu-
portent des protéines ou des anticorps couplés à gation et élimination du surnageant, la quantité de
un radio-isotope tels que l'iode-125 (125I) ou le radioactivité dans le précipité est proportionnelle à
tritium (3H). L'activité radioactive manipulée est la concentration en anticorps de l'échantillon.
de l'ordre de 10 à 100 kilo-becquerels (kBq). La Cette technique peut être appliquée au dosage
détection radiométrique des échantillons biolo- de petits antigènes ne présentant qu'un épitope,
giques est réalisée dans des compteurs gamma comme les haptènes, des peptides ou certains médi-
équipés de détecteurs associés à des logiciels de caments. On applique alors le principe de la compé-
traitement des données appropriés. tition entre cet antigène recherché et le même
On distingue plusieurs types de RIA. marqué à l'iode-125 ajouté au milieu réactionnel
en même temps que des anticorps spécifiques. La
Méthode par compétition quantité de radioactivité mesurée dans les com-
(ou par défaut d'anticorps) plexes immuns précipités est inversement propor-
Le principe repose sur la compétition entre des molé- tionnelle à la quantité de l'antigène recherché.
cules d'antigène marquées (Ag*) et non marquées
(Ag) d'une même espèce vis-à-vis d'un nombre donné Recommandations de mise en œuvre
et limité de sites de liaison anticorps. L'anticorps (Ac)
est fixé sur une phase solide, paroi de tube ou billes de Une gamme d'étalonnage est indispensable pour
polystyrène. L'excès de traceur est éliminé après incu- tout dosage radio-immunologique pour convertir
bation par une étape de lavage. La quantité des formes les mesures de radioactivité (coups par minute ou
liées (Ag*-Ac) est inversement proportionnelle à la cpm) en concentration. Elle repose sur la mesure
quantité de l'analyte non marqué (Ag) présent dans de la radioactivité du bruit de fond (liaison non
l'échantillon. Les trousses de dosage fournissent le spécifique), de celle des échantillons (Bo) et de
support solide (tubes, billes), l'analyte marqué et une celle des points de gamme (B) permettant de cal-
gamme étalon couvrant le domaine de mesure. culer la capacité de liaison de l'analyte selon la for-
mule suivante :
Méthode sandwich
Le principe du dosage s'appuie sur la reconnais- [cpm (étalon ou échantillon) -
sance de l'antigène dosé par deux anticorps spéci-
B cpm (liaison non spécifique)]
fiques de deux sites antigéniques distincts et = ´ 100
accessibles. Un premier anticorps est adsorbé sur un Bo ( % ) [cpm (étalon zéro) -
support solide (tube ou bille). Le second anticorps cpm (liaison non spécifique)]
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 53

Avantages/inconvénients Immunodosages
multiplex sur billes
Avantages Inconvénients
Faible encombrement Utilisation réglementée des
stérique du tritium radio-isotopes (e.g. précaution
La technologie d'immunodosages multiplex
Grande spécificité d'utilisation, habilitation des personnels utilise des microbilles de polystyrène de 5 à
Grande sensibilité de la et des locaux, gestion des déchets) 8  μm (selon les fournisseurs), recouvertes de
détection Demi-vie courte de l'iode-125 molécules (e.g. peptides, anticorps, acides
Grande stabilité du signal Variation des contrôles de qualité
émis par le tritium internes des trousses de RIA nucléiques) fixées de manière covalente par une
Interférence de la bilirubine, de liaison entre le groupement amine de la molé-
l'hémoglobine, voire des lipoprotéines cule et les fonctions carboxyliques des micro-
billes. L'originalité de cette technique repose
Exemples d'applications sur la détection simultanée de plusieurs analytes
Les techniques RIA ont été supplantées par les (jusqu'à 100) à partir d'un faible volume
techniques ELISA. Il subsiste quelques domaines d'échantillon, d'où le terme de multiplexage.
d'application en hormonologie, cancérologie Le principe est de capturer l'analyte avec les
(marqueurs tumoraux), auto-immunité (anticorps billes et de révéler cette capture avec un traceur
anti-ADN natif) ou pharmacologie (dosage de fluorescent, selon une technique de type sand-
médicaments et de toxiques). wich (fig. 4.4).

Le colorant
fluorescent
est dans la
masse de
chaque bille

Billes de fluorescence différente

Immunodosage :
anticorps de capture sur
la bille puis révélation par
un anticorps fluorescent

Lecture en cytométrie : identification de chaque bille par sa


fluorescence intrinsèque et détection de la présence
éventuelle de l’anticorps secondaire témoignant de la capture
de l’antigène par la bille
Fig. 4.4  Principe du multiplexage sur billes.
Exemple d'un système à laser rouge (635 nm) et à laser vert (532 nm).
54 Techniques immunologiques

Méthodologie nir les moyennes d'intensité de fluorescence nor-


Le multiplexage est rendu possible par l'utilisation malisées de chaque réaction.
de microbilles dans lesquelles sont incorporées des Les résultats peuvent être rendus en intensité
quantités définies de fluorochromes, le plus souvent relative par rapport à une bille seuil contrôle néga-
rouge et orange. Jusqu'à 100 types de billes diffé- tif ou, quantitativement, en valeur de concentra-
rentes, émettant chacune une fluorescence de lon- tion, d'unités arbitraires ou internationales selon
gueur d'onde spécifique, peuvent être générés et la nature du calibrateur utilisé.
mélangés. Ces mélanges rassemblent des billes dont
chaque type est recouvert de molécules différentes Avantages/inconvénients
(e.g. peptides, anticorps, sondes d'acides nucléiques,
Ces avantages et limites recouvrent celles des
enzyme) en fonction de l'application envisagée.
techniques immuno-enzymatiques et de cytomé-
Les billes sont incubées avec les échantillons à
trie en flux.
analyser dans des plaques de 96 puits. L'étape de
lavage suivant cette incubation n'est pas obliga- Avantages Inconvénients
toire et dépend du type d'analyse et du fournisseur. Nombreux paramètres Risque de perte/diminution de la
Une seconde incubation est réalisée en présence dosés simultanément réactivité liée au couplage covalent
d'un traceur couplé à un fluorochrome, générale- Faible volume sur les microbilles
ment la phycoérythrine. Le traceur peut être un d'échantillon (quelques Mise au point parfois difficile
dizaines de μL) Risque de réactivité croisée surtout
anticorps pour la détection de protéines ou d'auto- Grande étendue du dans la recherche d'auto-anticorps
anticorps. On peut aussi mettre à profit le système domaine de mesure Pas de standardisation et variabilité
d'amplification streptavidine–­phycoérythrine, par Rapidité et très bonne interlots (surtout pour la recherche
exemple pour la révélation d'un amplicon biotinylé sensibilité, au moins d'auto-anticorps)
équivalente à la technique Sensibilité des lasers aux variations de
fixé à des sondes oligonucléotidiques portées par ELISA température
les billes. Large spectre Sensibilité des microbilles et du
La suspension de billes est entraînée dans une d'applications traceur à la lumière
veine liquide à travers un fluorimètre ou un cyto- Nécessité de calibration fréquente de
l'appareil
mètre en flux. Après excitation par un laser, chaque Comme pour l'ELISA, la présence de
bille émet sa fluorescence intrinsèque qui permet lipides, de bilirubine ou de facteurs
son identification dans un masque d'acquisition rhumatoïdes interfère avec la
technique
pré-établi. L'excitation du traceur, éventuellement
Non adapté aux broyats cellulaires
par un second laser, s'il est présent sur la bille,
témoigne de la positivité de la réaction sur un ou
plusieurs types de billes. Un minimum de 100 billes Exemples d'applications
de chaque type est analysé. En parallèle, l'analyse de
Les domaines d'application de la technologie
la lumière diffractée latéralement permet de détec-
d'immuno-analyse par multiplexage sur billes sont
ter les doublets de billes, exclus de l'analyse.
très étendus.
• En recherche : le dosage des cytokines dans des
Recommandations de mise en œuvre
fluides biologiques ou dans des surnageants ou
La validation des résultats s'appuie sur des lysats cellulaires utilise cette méthodologie. Il
contrôles. Les trousses incluent des billes contrôle est par ailleurs désormais possible d'effectuer
positif (e.g. billes recouvertes d'immunoglobu- des analyses transcriptomiques (mRNA,
lines humaines, sérum contenant des quantités miRNA) grâce aux plates-formes de multi-
connues de l'analyte à doser). L'utilisation de plexage sur billes.
billes contrôle négatif permet de déterminer l'in- • En clinique : le multiplexage est utilisé pour la
tensité de fluorescence associée au bruit de fond détection et la quantification d'auto-anticorps
de la réaction. Cette valeur doit être déduite de (diagnostic et suivi de maladies auto-immunes),
celle mesurée sur les billes tests et permet de défi- d'allo-anticorps (anti-HLA en transplantation
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 55

d'organes) ou d'anticorps post-infectieux. Le Méthodologie (fig. 4.5)


couplage de sondes oligonucléotidiques sur les Séparation protéique (fig. 4.5 : ➀)
billes permet le typage d'allèles (très utilisé pour
les typages HLA, en transplantation notam- La première étape d'un western-blot consiste en la
ment), l'analyse de polymorphismes ou de séparation des molécules polypeptidiques par élec-
mutations, ou encore la détection d'acides trophorèse sur gel de polyacrylamide (PolyAcryla-
nucléiques viraux ou bactériens. mide Gel Electrophoresis ou PAGE). Si cette
séparation est réalisée en conditions natives, les pro-
téines sont séparées selon leurs propriétés physiques
intrinsèques (taille et charge globale), ce qui permet
Immuno-empreinte/ le maintien de la conformation et des interactions
western-blot entre polypeptides ou encore des activités enzyma-
tiques. A contrario, l'addition d'agents dénaturants
La technique d'immuno-empreinte ou western- tels que le laurylsulfate de sodium (sodium dode­
blotting3 a été décrite en 1973. Elle consiste en cylsulfate ou SDS) permet, en chargeant négative-
une électrophorèse dénaturante permettant la ment l'ensemble des protéines contenues dans
séparation des protéines d'une solution, suivie de l'échantillon, de les séparer uniquement en fonction
leur transfert sur une membrane tout en respec- de leur taille. Cette technique appelée SDS–PAGE
tant le positionnement de chaque protéine sur le est très largement employée pour déterminer la
gel d'électrophorèse. La détection est ensuite réa- masse moléculaire des polypeptides contenus dans
lisée sur la membrane, de manière directe grâce à un échantillon. La porosité du gel de séparation
des anticorps spécifiques couplés à un traceur ou dépend de sa réticulation qui peut être contrôlée par
de manière indirecte en utilisant alors un anticorps la quantité d'acrylamide et de bisacrylamide qui le
spécifique et un anticorps secondaire couplé à un composent. Cette porosité doit être adaptée à la
traceur enzymatique (permettant la production taille des protéines à analyser. La séparation de pro-
d'un précipité coloré ou la génération d'électrons téines de petite taille est effectuée sur des gels de
captés par un film) ou fluorescent (nécessitant forte réticulation (autour de 15 % d'acrylamide),
l'utilisation d'une caméra ou d'un système d'ima- alors que les protéines de grande taille sont séparées
gerie adapté). Cette technique est qualitative, sur un gel de faible réticulation (7,5 %). L'utilisation
voire semi-quantitative, dans la mesure où l'inten- de gels composés d'un gradient de concentration
sité du signal émis est corrélée à la quantité d'anti- d'acrylamide et de bisacrylamide permet la sépara-
gène adsorbé sur la membrane. tion de protéines de gamme de taille plus étendue,
L'immunodot (dot-blot) ou immunoslot (slot- de quelques kilodaltons (kDa) à plusieurs milliers.
blot), selon la forme des dépôts, est une technique Un gel de faible réticulation (gel de concentration)
dérivée du western-blot dans laquelle les anti- est coulé au-dessus du gel de séparation analytique
gènes, natifs, issus de tissus, de lysats cellulaires ou pour favoriser ainsi la résolution et la séparation lors
recombinants, sont directement déposés sur une de la migration.
membrane souple. Il n'y a pas de séparation préa- Il existe également des gels réalisant un gradient
lable des protéines sur gel. En revanche, les étapes de pH qui permettent de séparer les protéines en
de révélation sont comparables pour les deux fonction de leur point isoélectrique. Ce gel peut
méthodes. constituer une première séparation dans la tech-
nique bidimensionnelle.

Transfert (fig. 4.5 : ➁)
3
  Cette dénomination est un clin d'œil en référence à la
Après séparation, les protéines sont transférées
technique de séparation et d'identification des ADN déve-
loppée par Sir Edwin Mellor Southern. Par extension amu- sur une membrane de nitrocellulose ou de
sante, la détection des ARN a été appelée northern-blot et polyvinylidene difluorure (PVDF) placée en
celle des protéines western-blot. Il n'y a pas d'eastern-blot ! contact direct avec le gel. Ce transfert est réalisé
56 Techniques immunologiques

1
2 3 4
Protéines contrôle Extrait protéique
(PM connu) à analyser Transfert Saturation Marquage

Gel SDS-PAGE Membrane de polyacrylamide ou PDVF

Enzyme
Substrat
Produit coloré ou fluorescent

Anticorps primaire
5
Anticorps secondaire

Fig. 4.5  Étapes méthodologiques du western-blot.

par l'application d'un champ électrique permet- Saline (PBS) ou Tris-Buffered Saline (TBS) sup-
tant la migration électrophorétique des protéines plémenté d'un détergent doux comme le Tween-
depuis le gel vers la membrane ou par transfert 20® ou le NP-40 à faible concentration (0,05 %).
passif (plus long et rendement plus faible). Les Les étapes de lavages sont primordiales pour assu-
protéines fixées sur la membrane sont l'empreinte rer un rapport signal/bruit de fond optimal.
en miroir des protéines ayant migré dans le gel.
Révélation et analyse
Saturation et lavages (fig. 4.5 : ➂) des résultats (fig. 4.5 : ➃ et ➄)
Les divers types de membranes utilisées ont une La révélation de la(des) protéine(s) d'intérêt
forte affinité pour les protéines et une étape de fixée(s) sur la membrane est effectuée par incuba-
saturation des surfaces non occupées est indispen- tion dans un bain d'anticorps, soit directement en
sable afin d'éviter la fixation non spécifique des utilisant un anticorps spécifique couplé à un tra-
anticorps de révélation. Cette étape est cruciale ceur, soit indirectement en utilisant un anticorps
pour obtenir un bon rapport signal/bruit de fond secondaire reconnaissant le domaine Fc de l'anti-
et une bonne sensibilité de la technique. Les tam- corps primaire. Plusieurs lavages sont nécessaires
pons de saturation sont réalisés généralement à entre chaque incubation de la membrane avec les
base de lait (riche en caséine) ou de sérum (riche anticorps. Le traceur couplé à l'anticorps est une
en albumine). À l'issue de l'étape de saturation, la enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline) ou
membrane est lavée pour éliminer tout matériel un marqueur luminescent ou fluorescent. Les
non fixé. Comme pour la technique ELISA, les réactions chromogéniques sont révélées directe-
tampons de lavage sont de type Phosphate-Buffered ment par observation immédiate de la membrane.
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 57

Les substrats chimioluminescents nécessitent l'uti- sible d'intégrer et ainsi de quantifier les bandes
lisation d'un film sensible aux photons ou d'un obtenues après révélation grâce à un scanner ou
appareillage comportant une chambre noire et une caméra et de comparer les quantités relatives
une caméra haute sensibilité (CCD ou CMOS). de protéines dans plusieurs conditions analytiques.
La lumière émise est détectée grâce à un appareil- Il faut prendre soin d'utiliser un contrôle de
lage dédié. La révélation chromogénique est la charge protéique, représenté par une protéine,
moins coûteuse mais présente les désavantages l'actine par exemple pour des extraits cellulaires,
d'être peu sensible et d'une perte de signal sur le dont le taux ne varie pas quelles que soient les
long terme. L'alternative de la révélation chimio- conditions analytiques. La détermination de la
luminescente offre l'avantage d'une meilleure sen- masse moléculaire4 en SDS–PAGE de protéines
sibilité par l'utilisation de films recouverts de contenues dans un échantillon nécessite la sépara-
molécules photoréactives. Cette technique de tion sur le même gel et le transfert sur la même
révélation est très largement employée. Plus membrane de protéines de masse moléculaire
récemment, des techniques de révélation avec tra- connue (standard de migration). Ces protéines
ceurs fluorescents ont été développées mais elles peuvent être pré-colorées pour permettre leur
nécessitent un appareillage de détection dédié. visualisation directe sur le gel et la membrane
Elles offrent cependant l'avantage de permettre après transfert. Le temps de migration électropho-
l'utilisation de plusieurs fluorophores pour la rétique des protéines est inversement proportion-
détection simultanée de plusieurs protéines sur la nel au logarithme de leur masse moléculaire.
même membrane plutôt que des révélations suc- L'établissement d'une courbe d'étalonnage à par-
cessives qui peuvent être effectuées avec les autres tir de ces standards permet de mesurer la masse
techniques. moléculaire de la protéine d'intérêt après évalua-
tion de sa mobilité relative (Rf).
Recommandations de mise en œuvre
Avantages/inconvénients
De nombreux paramètres entrent en jeu pour le
bon déroulement d'un western-blot. Le pH des
Avantages Inconvénients
tampons et la composition du gel influencent la
mobilité des protéines, tandis que l'efficacité du Analyse de complexes Risque de perte de réactivité
protéiques, de plusieurs vis-à-vis des anticorps de
transfert dépend de la nature des protéines, des protéines simultanément, des révélation. Lors de séparations
tampons assurant la conduction, de la force du modifications post- électrophorétiques en conditions
courant électrique (généralement faible force traductionnelles des protéines dénaturantes, seuls les épitopes
(e.g. phosphorylation) linéaires séquentiels persistent
ionique et faible courant) et de la durée du
Détermination de la masse Conditions optimales de
transfert. moléculaire, de l'état de migration et de transfert à
La composition des tampons de lavage, la déter- glycosylation des protéines déterminer pour chaque type de
mination des concentrations optimales des anti- Large application analytique protéines à analyser
dépendant du vaste choix Risque de réactivité non
corps primaires et/ou secondaires sont également d'anticorps spécifiques spécifique des anticorps
critiques pour un bon rapport signal/bruit de Mesure quantitative possible secondaires en technique de
fond et une sensibilité adéquate. Le seuil de sensi- révélation indirecte
bilité du western-blot est de l'ordre du nano- Durée technique beaucoup plus
longue qu'un ELISA et moins
gramme (ng) de protéines. L'optimisation des standardisable
méthodes de détection, notamment à l'aide de
fluorophores infrarouge, permet de descendre
jusqu'au picogramme (pg). L'intensité des bandes
spécifiquement révélées est directement propor- 4
  La masse moléculaire (MM) ou poids moléculaire
tionnelle à la quantité d'anticorps ayant reconnu (PM), pour Molecular Weight (MW), est ici mesurée de
l'antigène à la surface de la membrane, et donc à façon relative par rapport à la migration des peptides dans
la quantité de protéines d'intérêt fixées. Il est pos- le gel (Mr, relative molecular mass).
58 Techniques immunologiques

Exemples d'applications Recommandations de mise en œuvre


• En recherche : cette technologie est utile pour Pour une formation optimale de complexes immuns
évaluer l'expression d'une protéine d'intérêt et et éviter les effets de zone (excès d'antigène empê-
permet également l'analyse de l'état de sa chant la visualisation correcte des bandes), il est
phosphorylation ou de sa glycosylation. Des recommandé de diluer les échantillons à tester à
interactions entre protéines et l'analyse de une concentration protéique finale de 1 g/L.
produits de co-­immunoprécipitation reposent
aussi sur ce principe. Avantages/inconvénients
• En clinique : la confirmation d'un diagnostic séro-
logique positif d'infection par le VIH nécessite un Avantages Inconvénients
western-blot. La détection d'auto-­anticorps est
Technique fiable, de mise en Risque de phénomène de zone
fréquemment effectuée en immunodot (auto- œuvre aisée (automatisation en cas d'excès d'antigène
antigènes fixés sur les membranes). partielle) Technique relativement longue
Spécificité importante, tend à (2 à 3 h)
remplacer l'immuno-
électrophorèse sur gel
Immunofixation
La technique d'immunofixation permet la détec- Exemples d'applications
tion d'antigènes par la formation de complexes • En recherche : cette technique, potentiellement
immuns entre un antisérum polyclonal spécifique applicable à la détection de fragments antigé-
et son antigène cible. C'est une technique qualita- niques de protéines dans les milieux ­biologiques,
tive de précipitation en milieu gélifié. Après migra- est en fait d'usage très limité.
tion des antigènes dans un gel (le plus souvent • En clinique : cette technique est largement uti-
d'agarose), des antisérums polyclonaux spécifiques lisée pour la détection et le typage des dysglo-
sont déposés sur le gel conduisant à la formation bulinémies (myélome multiple, maladie de
de complexes immuns qui précipitent in situ. Ils Waldenström) par immunofixation des immu-
sont révélés par ajout d'un colorant des protéines. noglobulines sériques.

Méthodologie
La technique d'immunofixation se déroule en plu- Puces à protéines/protein
sieurs étapes. La première étape consiste à déposer arrays
l'échantillon à analyser dans les puits d'un gel
d'agarose et à y faire migrer les protéines sous l'effet Les puces à protéines ou biopuces correspondent à
d'un champ électrique. La mobilité des protéines l'assemblage organisé de quelques dizaines à
est fonction de leur charge globale et dans une quelques centaines de peptides ou d'anticorps sur
moindre mesure de leur taille. À l'issue de la migra- une surface miniaturisée, de quelques centimètres
tion, un antisérum polyclonal dirigé contre les anti- carrés en général. Dans sa version la plus courante,
gènes protéiques à caractériser est appliqué sur le une puce à protéines est utilisée pour détecter et
gel. Les anticorps diffusent dans le gel et entraînent quantifier les ligands de ces protéines dans un
la formation de complexes immuns précipitant avec échantillon biologique. Les applications médicales
les protéines reconnues. Ces complexes immuns en développement de cette technologie concernent
sont retenus dans le gel après lavage pour éliminer le diagnostic et le suivi de maladies auto-immunes,
les protéines non fixées ou non précipitées et leur allergiques, infectieuses et malignes. En recherche
fixation est assurée par un tampon acide. Les bandes fondamentale, les puces à protéines permettent
de précipité sont révélées par un colorant des pro- l'identification de spectres d'activité enzymatique,
téines, tel que l'amidoschwarz ou le violet acide. Au d'épitopes et d'inhibiteurs biologiques. Les deux
chapitre 9, la figure 9.2 illustre cette méthode. intérêts majeurs des puces à protéines sont :
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 59

• l'obtention simultanée d'un grand nombre de L'échantillon (e.g. sérum, urine, surnageant de
données biologiques pour un échantillon culture) est déposé à la surface de la biopuce.
donné ; Après incubation et lavage, la présence dans
• le faible volume d'échantillon et d'analyte l'échantillon de ligands pour les protéines de la
nécessaire. puce est révélée par des anticorps spécifiques liés à
Chaque peptide testé correspond à un para- un traceur (e.g. enzymes, fluorogènes). Il existe
mètre distinct, d'où le nom de technique de bio- également des méthodes de détection sans tra-
puces ou multiplex, à ne pas confondre avec les ceur, associées à des logiciels de biomathématique,
multiplexes sur billes. Lorsque le support est basées sur la mesure de l'impédance optique ou la
recouvert d'anticorps on parle de puce à anticorps spectrométrie de masse.
ou antibody array (fig. 4.6).
Recommandations de mise en œuvre
Méthodologie
Les conditions techniques doivent tenir compte de
Le support le plus courant est le verre. Les pep- la stabilité des ligands de la puce. En immunologie
tides sont généralement produits individuellement médicale, le sérum destiné à rechercher des immu-
et immobilisés secondairement par une suite noglobulines avec une méthode de biopuce doit
d'étapes chimiques de fonctionnalisation de la être conservé à + 4 °C pendant 48 h ou congelé
surface de verre, pulvérisation et séchage des pep- au-delà.
tides aux emplacements attribués et formation de Chaque peptide présent sur la puce est généra-
liaisons covalentes entre le peptide et le support. lement fixé en duplicat ou en triplicat. Le signal
Une méthodologie alternative consiste à synthéti- de chaque spot est analysé séparément, accepté
ser les molécules d'intérêt directement sur le sup- ou rejeté. Le résultat de chaque peptide corres-
port. D'autres types de supports existent comme pond à la moyenne des résultats du duplicat ou
les gels de polyéthylène glycol, des surfaces recou- du triplicat. L'intensité de fixation des ligands est
vertes d'or ou des membranes de nitrocellulose. mesurée de manière semi-quantitative, ou quan-
titative si une courbe de calibration est dispo-
nible pour l'analyte considéré. Compte tenu du
nombre important de peptides analysés simulta-
nément et de l'intérêt de décrire un profil de
réponse, l'intensité mesurée est souvent visuali-
sée par un code couleur. Dans certains cas, des
algorithmes prenant en compte les réponses à
plusieurs marqueurs peuvent être développés.
Pour chaque support, il faut réaliser des contrôles
négatifs et positifs.

Avantages/inconvénients

Avantages Inconvénients
Témoin Témoin Quantité d'échantillon biologique Mise au point et interprétations
négatif positif de 50 μL à 10 mL nécessitant une expertise
Rapidité d'obtention des importante
Fig. 4.6  Exemple de puce à anticorps détectant des résultats Panel de peptides fixe et captif
phosphoprotéines. Tests multiplex rendant compte du fabricant
Les témoins positif et négatif indiquent le bon de la complexité des systèmes Sensibilité et spécificité à définir
fonctionnement de la technique. Chaque couple de spots étudiés Appareillage spécifique en
correspond à une phosphoprotéine particulière, contenue Adaptables à de nombreux fluorimétrie
dans l'échantillon testé et reconnue par les anticorps de la domaines
membrane.
60 Techniques immunologiques

Exemples d'applications rochromes, à la simplification des techniques de


• En recherche : de nombreuses puces existent préparation des échantillons cellulaires et à la
pour la détection de cytokines, de chimiokines, sophistication des logiciels d'analyse.
des profils de phosphorylation, des voies de Le cytomètre en flux est composé d'un système
transduction ou encore de l'apoptose. fluidique, d'un banc optique associé à des circuits
• En clinique : des puces commerciales à aller- électroniques de recueil des signaux et d'une
gènes permettent de rechercher des IgE spéci- informatique d'acquisition et d'analyse des don-
fiques de 112 allergènes (111 protéines purifiées nées (fig. 4.7).
ou recombinantes et 1 oligosaccharide) et sont
utilisées principalement chez des patients poly- Méthodologie
sensibilisés pour déterminer un profil de sensi-
bilisation associé à la production d'IgE dirigées Le système fluidique d'un cytomètre en flux assure
contre un ensemble d'allergènes. Des puces à au moyen d'une buse le transport et l'alignement
allergènes ciblées peuvent être employées selon des cellules avant leur entrée dans la chambre
le contexte clinique : allergie au lait, anaphylaxie d'analyse et leur passage devant la source lumi-
d'effort aux protéines du blé. Il existe des puces neuse. Son principe repose sur la focalisation
à auto-antigènes pour le lupus érythémateux hydrodynamique de l'échantillon. La suspension
systémique, permettant de détecter des profils cellulaire est injectée dans l'axe d'une veine liquide
de fixation des auto-anticorps ou du complé- (liquide de gaine ou sheath). Le débit du liquide
ment, et également une puce pour la détection de gaine est constant, et la vitesse du flux aug-
des toxines botuliques. mente en entraînant passivement les cellules. Avec
un diamètre de buse adapté et une concentration
appropriée de la suspension cellulaire, les cellules
défilent devant le faisceau laser les unes après les
Cytométrie en flux autres très rapidement (jusqu'à plusieurs dizaines
de milliers de cellules par seconde) en vue de leur
La cytométrie en flux est une technologie per- analyse individuelle. En fin de parcours, la suspen-
mettant une mesure individuelle des caractéris- sion cellulaire est évacuée vers un flacon de collec-
tiques physiques et/ou biologiques de particules, tion des déchets. Elle peut aussi, dans les
le plus souvent des cellules, en suspension dans cytomètres possédant une fonction de trieur, être
un flux liquide qui assure leur alignement avant séparée de façon à recueillir des fractions définies
de passer devant une ou plusieurs sources lumi- sur leurs paramètres cytométriques.
neuses de type laser. Les signaux optiques, dif- Le nombre de cellules nécessaire pour réaliser
fraction de lumière et fluorescence, mesurés lors une analyse dépend principalement de la fré-
de ce passage permettent une évaluation simulta- quence de la population d'intérêt dans l'échantil-
née des différentes caractéristiques de chaque lon, mais aussi de la disponibilité du matériel
cellule. L'analyse s'effectue cellule par cellule et biologique et du résultat attendu. Plus le nombre
l'échantillon initial doit donc être une suspen- de cellules analysées est élevé, plus la probabilité
sion dans laquelle les cellules sont dissociées. de mesurer avec précision des sous-populations
Cette technologie fait appel à de nombreux d'intérêt augmente (tables de Rümke). Un des
concepts et a bénéficié des progrès réalisés dans intérêts de la cytométrie en flux est de permettre
la mécanique des fluides, la quantification des l'analyse rapide de populations de milliers d'évé-
signaux optiques, la technologie des lasers et le nements. Les méthodes les plus sensibles utilisées
développement de l'informatique. Les cyto- couramment pour rechercher des populations
mètres en flux sont devenus des outils perfor- rares permettent, en analysant entre 105 et 106 cel-
mants et fiables. Ce développement se poursuit lules, d'atteindre une sensibilité fiable de 10−5,
grâce à la disponibilité accrue de réactifs comme c'est-à-dire de détecter un événement sur 100 000
les anticorps monoclonaux et de nouveaux fluo- ou dix sur un million.

FLUIDIQUE OPTIQUE INFORMATIQUE
Side scatter (SSC)
00101010101
11010101001
01011101010

Contrôle du voltage des


photomultiplicateurs
Gestion des compensations
de fluorescence
Pour chaque cellule :
- taille (FSC)
- granularité (SSC)
- fluorescence dans chaque
longueur d’onde d’émission
(FL)
Fenêtrages (gating)
Représentations graphiques
Hiérarchie des fenêtrages

Chapitre 4. Techniques avec traceurs 61


Colorisation
Backgating
Source laser Forward scatter (FSC)

Mesure concomitante de la diffusion (FSC) et de la diffraction


(SSC) du faisceau laser ainsi que de chaque fluorescence émise
lors de l’excitation d’un fluorochrome

Hydrofocalisation du flux cellulaire Lentille Masque bloquant le faisceau laser en l’absence de cellules
dans le liquide de gaine

Miroirs dichroïques Filtres passe-bande Photomultiplicateurs

Fig. 4.7  Principaux composants d'un cytomètre en flux.


62 Techniques immunologiques

Si les cellules à étudier sont adhérentes à un FSC) est proportionnelle à la taille de la cellule. La
support ou constituent un tissu, il est indispen- lumière mesurée perpendiculairement à l'axe de la
sable de les détacher de leur support par traite- lumière incidente (side scatter ou SSC) dépend de
ment mécanique (grattage), chimique (EDTA) la structure (granularité, rapport nucléocytoplas-
ou enzymatique (trypsine), ou de dissocier le mique) de la cellule.
tissu (par dilacération mécanique ou par la Après excitation par le faisceau laser, indépen-
trypsine ou la collagénase). Ces traitements damment de cette diffraction, les cellules
peuvent plus ou moins endommager la surface émettent une fluorescence naturelle (autofluo-
cellulaire. rescence) et surtout un signal correspondant à
Le système optique est composé de la source leur marquage éventuel par un fluorochrome.
lumineuse, d'un système de filtres et de miroirs Les lasers argon qui ont une longueur d'onde
conduisant la lumière émise et diffractée indivi- d'émission de 488 nm sont fréquemment instal-
duellement par chaque cellule vers des photomul- lés sur les cytomètres. Aux instruments reposant
tiplicateurs transformant les signaux lumineux en sur la longueur d'onde d'excitation d'un seul
signaux électriques. Dans la chambre d'analyse, la laser (argon le plus souvent) ont succédé des
veine fluidique est traversée par le faisceau lumi- cytomètres disposant de deux ou trois lasers,
neux d'un ou plusieurs lasers. La technologie laser voire plus. Ceci a permis d'élargir la gamme des
est utilisée pour sa puissance, sa focalisation et sur- fluorochromes utilisables, excitables à des lon-
tout son monochromatisme. gueurs d'onde différentes et a conduit au déve-
Dans tous les cas, la lumière incidente est diffu- loppement de solutions innovantes pour les
sée en fonction de la morphologie et de la struc- bancs optiques (fig. 4.8).
ture de chaque cellule. La lumière diffusée dans L'autofluorescence des cellules sert à régler le
l'axe de la lumière incidente (forward scatter ou voltage des photomultiplicateurs qui recueillent

Représentation schématique
de deux systèmes de bancs
optiques de cytomètres à trois
lasers ( ) pour de la
cytométrie en huit couleurs (en
haut) ou dix couleurs (en bas)

Fig. 4.8  Schémas simplifiés des solutions développées par les industriels de la cytométrie en flux pour gérer le recueil
des fluorescences.
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 63

ensuite les signaux émis par les cellules marquées. du paramètre étudié (en canaux) et en ordon-
Idéalement, plus de 90 % des cellules non mar- née le nombre de cellules par canal. Comme
quées doivent pouvoir être détectées, au plus près chaque cellule peut émettre plusieurs signaux
du premier canal de mesure de la lumière émise, différents, il est possible de combiner, sur un
pour chaque longueur d'onde mesurable par l'ins- même graphique, deux paramètres indépen-
trument utilisé, donc selon toutes les sources dants. Dans un graphique en nuage de points
d'excitation disponibles. ou histogramme biparamétrique, chaque cel-
Les signaux lumineux émis par les cellules lule est placée en fonction de la valeur des deux
fluorescentes sont focalisés et séparés en fonc- paramètres mesurés et représentée par un point.
tion de leur direction et de leur longueur d'onde, Le nombre de cellules présentant les mêmes
au moyen de miroirs dichroïques et de filtres, valeurs peut être visualisé dans une troisième
pour être acheminés vers des photodétecteurs dimension par des courbes de niveaux ou des
(photomultiplicateurs ou PMT) qui transfor- intensités de couleur. Pour chaque type de
ment les signaux lumineux en signaux élec- représentation, on peut utiliser une échelle
triques et les amplifient. Chaque photodétecteur linéaire ou logarithmique (4 à 7 décades). Il est
est désigné par un code (e.g. FL1, FL2) corres- surtout possible de conditionner l'acquisition
pondant à un intervalle de longueur d'onde pré- d'un paramètre à celle d'autres paramètres au
cis. Les miroirs dichroïques réfléchissent moyen, en particulier, de zones d'intérêt
sélectivement une partie de la lumière qu'ils (fenêtres ou gates) définies par l'utilisateur ou
reçoivent. Ainsi, un miroir dichroïque 488 réflé- par des logiciels dédiés et générées en cascade.
chit les lumières de longueur d'onde inférieure Ainsi, au sein d'une population hétérogène, il
ou égale à 488 nm et transmet les émissions de est possible de cibler les informations prove-
longueur d'onde supérieure vers les miroirs nant de plusieurs populations spécifiques. Il est
dichroïques suivants. Après ce tri, le signal lumi- également possible, pour une définition opti-
neux passe dans un filtre passe-bande (band-pass male multiparamétrique des composants d'une
filter). Par exemple, un filtre passe-bande 488 suspension cellulaire donnée, de développer
de 50 nm focalise la lumière dans un intervalle des analyses mathématiques en composantes
de longueur d'onde de 488 ± 25 nm (463 à principales (ACP ou PCA)5.
513  nm). Différents filtres passe-bande, éven-
tuellement interchangeables, sont utilisés en Recommandations de mise en œuvre
fonction du modèle de cytomètre. Les photodé- Le bon fonctionnement du cytomètre est vérifié
tecteurs transforment enfin la lumière collectée chaque jour à l'aide de billes fluorescentes cali-
en une impulsion électrique dont l'intensité est brées qui permettent de détecter des anomalies
proportionnelle à l'énergie lumineuse reçue. Ces liées à l'instrument comme la baisse de puissance
signaux sont amplifiés avant d'être digitalisés par du faisceau laser ou une variation de son aligne-
un convertisseur analogique/digital qui asso- ment. En pratique, ces anomalies sont maintenant
cie  à l'amplitude de chaque signal un numéro rares et leur correction éventuelle revient au
de  canal, dont la valeur codée en bits est utili- fabricant.
sable par le système informatique qui stocke et
traite les données.
Lors de l'acquisition, les nombreux signaux
reçus pour chaque événement détecté par le
5
  Analyses mathématiques en composantes principales
(ACP) ou, en anglais, Principal Component Analysis
faisceau laser sont classés au fur et à mesure de
(PCA). L'analyse en composante principale permet de clas-
leur apparition et participent ainsi à la constitu- ser les paramètres d'une série de signaux recueillis au sein
tion de graphiques de répartition des cellules d'une population hétérogène en fonction de leur valeur
(fig. 4.9). Les données reçues peuvent être pré- représentative de chaque sous-population et de déterminer
sentées sous forme d'histogramme de distribu- les critères séparant au mieux les différents sous-ensembles
tion de fréquence avec en abscisse l'amplitude de la population.
64
Techniques immunologiques
Fig. 4.9  Exemples de représentation de l'analyse de résultats de cytométrie en flux.
Ligne du haut, graphe de gauche, représentation des cellules d'un échantillon de moelle osseuse en fonction de leur taille (FSC) et de leur granularité (SSC) et dessin d'une
fenêtre (A) d'élimination des débris. Les trois graphes suivants montrent les mêmes cellules (fenêtrage sur A) en fonction de l'expression de CD45 (marqueur panleucocytaire) et
de leur granularité (SSC) avec trois représentations différentes : simple biparamétrique, densité cellulaire et contours.
Ligne du milieu, au centre, graphe CD45/SSC dans lequel les trois populations majoritaires sont colorisées. À gauche, représentation monoparamétrique de l'expression de CD15
sur l'ensemble des cellules (fenêtre A). À droite, représentation monoparamétrique de l'expression de CD3 sur les lymphocytes (fenêtre magenta).
Ligne du bas, expression de CD19 et CD3 en fonction de la granularité des cellules (SSC) avec le code couleur de l'histogramme central. Les marqueurs sont exprimés sur des
lymphocytes (magenta). Le troisième histogramme est une représentation biparamétrique des lymphocytes (fenêtre magenta) CD4 et CD8. Les lymphocytes doublement négatifs
(--) sont des lymphocytes B et des cellules NK. L'histogramme de droite montre l'expression de CD15 et CD10 sur les granuleux mais pas sur les monocytes, avec un fenêtrage
booléen prenant en compte les granuleux et les monocytes (G + M).
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 65

La responsabilité du cytométriste réside plus dans • la déviation par un champ électrique des goutte-
la maîtrise des conditions pré-analytiques et analy- lettes chargées et leur recueil dans un récipient
tiques. Les mesures de fluorescence faites par un différent de celui destiné au recueil des déchets.
cytomètre sont relatives et dépendent de nombreux Les cellules ainsi triées peuvent faire l'objet
facteurs comme le pH, la température, le milieu d'analyses complémentaires morphologiques ou
dans lequel les cellules sont en suspension, la vitesse moléculaires. Si elles sont encore vivantes, elles
de passage, la combinaison des fluorochromes utili- peuvent également être mises en culture.
sés, la qualité et la préservation des fluorochromes.
Le choix des fluorochromes, une fois établie la Imageur en flux
sensibilité minimale des photomultiplicateurs à L'inconvénient principal de la cytométrie en flux
l'aide de cellules non marquées, doit être réalisé est de limiter l'analyse morphologique à deux
avec soin. Il faut tenir compte à la fois de la puis- mesures de lumière diffusée. L'utilisation du mar-
sance d'émission du fluorochrome sélectionné et queur panleucocytaire CD45 a apporté une
de l'intensité d'expression attendue pour le mar- dimension supplémentaire qui ne compense
queur choisi. De plus, en raison de la superposition cependant pas totalement l'absence d'observation
plus ou moins importante des spectres d'émission directe. Les imageurs en flux de type ImageStream
des fluorochromes disponibles, il est nécessaire de Amnis® combinent l'étude quantitative de la cyto-
réaliser une compensation électronique des fuites métrie en flux multilasers à l'étude morpholo-
de fluorescence d'un fluorochrome donné dans le gique. Les cellules (e.g. leucocytes, levures,
canal d'émission d'un autre. Cette opération est micro-organismes) passent devant un objectif de
devenue extrêmement complexe avec la sophistica- microscope et des images en fluorescence sont
tion des instruments. Des outils de réglage automa- produites pour chaque cellule par une caméra
tique de ces compensations sont disponibles mais (fig. 4.10). Il est ainsi possible de visualiser directe-
ne dispensent pas d'un choix éclairé des combinai- ment toutes les caractéristiques de chaque cellule.
sons marqueur/fluorochrome dans les panels La vitesse de passage et le nombre de cellules ana-
actuels de huit ou dix couleurs. L'effet trompette, lysées sont toutefois moindres que pour un cyto-
ou de spreading, qui n'est pas compensable, doit mètre standard, ce qui fait des deux instruments
également être pris en compte. D'une manière des outils complémentaires. Le puissant logiciel
générale, pour l'étude de sous-populations cellu- d'analyse associé à ces nouveaux outils permet des
laires au sein d'un groupe de cellules présentant un applications multiples en termes de morphologie,
marqueur commun, il faut éviter les fuites de la signalisation cellulaire, localisation intracellulaire
population mère vers les populations filles alors que (e.g. visualisation de translocations moléculaires ou
l'inverse est plus véniel (par exemple, on peut tolé- de colocalisations) ou interactions cellulaires.
rer des fuites vers CD45 mais pas de fuites depuis
CD45 pour des sous-populations leucocytaires). Avantages/inconvénients

Trieur de cellules (Fluorescence


Avantages Inconvénients
Activated Cell Sorter ou FACS)
Analyses multiparamétriques Coût d'achat et de maintenance
Au-delà de sa fonction analytique, le cytomètre en Analyses qualitatives et des cytomètres
flux permet le tri de sous-populations cellulaires quantitatives Complexité des analyses
spécifiques. La réalisation de ce tri passe par : Rapidité d'acquisition multiparamétriques
Analyse d'un grand nombre de Mauvaise stabilité de certains
• la définition analytique des cellules à trier par le cellules fluorochromes (e.g. tandems)
jeu des fenêtrages en cascade isolant la popula- Identification de populations Non-visualisation des cellules
tion d'intérêt rares (sauf imageurs en flux)
Traçabilité et rémanence des
• le fractionnement du jet, en aval du laser, en
données
gouttelettes contenant chacune une cellule Isolement des cellules (i.e.
• le chargement électrostatique des gouttelettes trieurs en flux)
identifiées comme d'intérêt Grande variété d'applications
66 Techniques immunologiques

– la cytométrie en flux offre également une


méthodologie rapide et simple à mettre en
œuvre pour l'analyse du cycle cellulaire par la
mesure de la fluorescence émise par l'ADN
marqué par exemple par de l'iodure de propi-
dium, proportionnelle au contenu en ADN de
chaque cellule. Ceci permet de suivre, par
comparaison avec des cellules normales, la dis-
tribution des cellules dans les différentes phases
du cycle G0/G1–S–G2 avec respectivement
1N, entre 1 et 2N, et 2N de chromatine. Cette
méthode permet aussi de détecter des cellules
présentant un contenu anormal en ADN : par
exemple, hypoploïdie (signal 1N trop bas),
hyperploïdie (signal 1N trop haut), apoptose
(pic sub-G1). De nombreuses études de phar-
macologie font ainsi appel à la cytométrie en
flux pour l'étude de drogues antimitotiques ou
impliquées dans la prolifération cellulaire.

Marquages cellulaires et
Imagerie en flux
tissulaires, immunocytologie
Fig. 4.10  Exemple d'image obtenue avec l'ImageStream
Amnis®.
et immunohistologie
Les techniques d'immunofluorescence tissulaire
Exemples d'applications ou d'immunohistochimie sont utilisées pour
• En recherche : la cytométrie en flux est un outil détecter, localiser, voire estimer le niveau d'ex-
indispensable à une grande partie des travaux pression de protéines d'intérêt sur un matériel
expérimentaux chez l'animal ou avec des lignées cytologique ou des coupes tissulaires. Cette tech-
cellulaires. D'autres développements intéressent le nique se décompose en trois étapes principales qui
champ de la microbiologie ou l'océanographie. sont (i) la préparation de l'échantillon contenant
• En clinique : l'antigène à étudier, (ii) l'utilisation d'un anticorps
– la cytométrie en flux est utilisée régulièrement dirigé contre l'antigène recherché et (iii) l'apport
en immunologie et en hématologie pour le dia- d'un système révélateur pour visualiser
gnostic ou le suivi thérapeutique de différentes l'immunoréaction.
affections. Ces applications peuvent concerner :
– l'identification (immunophénotypage) des Méthodologie
populations et sous-populations cellulaires Les tissus sont analysés après fixation chimique,
en fonction de leurs marqueurs de diffé- inclusion et coupe en paraffine, ou après congéla-
renciation (e.g. évaluation des sous-popula- tion et coupe au cryostat.
tions lymphocytaires sanguines, diagnostic La fixation avec inclusion en paraffine ou la
des hémopathies), congélation préviennent de toute dégradation
– des études fonctionnelles évaluant notam- secondaire à une prolifération bactérienne ou à
ment la prolifération, la cytotoxicité, la l'action des enzymes libérées lors de la mort cellu-
production de cytokines, l'apoptose, la dégra- laire, et confèrent au tissu une rigidité indispen-
nulation des basophiles, la phagocytose ; sable à sa découpe.
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 67

Le fixateur chimique le plus utilisé est le formal- Les blocs inclus en paraffine sont découpés avec
déhyde. Ce produit réalise des pontages intermo- un microtome en coupes d'une épaisseur de 4 à 5
léculaires qui préservent bien la morphologie μm. Un cryomicrotome (ou cryostat) permet de
cellulaire et tissulaire. Cependant, il induit une réaliser des coupes de tissus congelés à une tempéra-
importante dénaturation des antigènes dont les ture de −30 à −20° C, d'une épaisseur de 5 à 10 μm.
épitopes peuvent être altérés. L'éthanol et l'acé- Pour les tissus fixés, un démasquage antigé-
tone sont des fixateurs précipitants qui préservent nique est nécessaire pour rompre les liaisons molé-
mieux l'antigénicité des protéines mais qui ont un culaires créées par le fixateur, modifier la
effet dénaturant sur la morphologie cellulaire et configuration spatiale des épitopes et améliorer
tissulaire. leur accessibilité aux anticorps. Ce démasquage
L'inclusion d'un tissu dans la paraffine ou dans peut être enzymatique, avec de la pronase (0,1 % à
une résine génère des variations thermiques qui 37 °C) ou physique par chauffage au micro-ondes
peuvent également être délétères pour certains ou en autocuiseur en tampon citrate ou EDTA.
épitopes. Des anticorps monoclonaux ou polyclonaux
La fixation en congélation est obtenue par l'im- peuvent être utilisés pour rechercher l'expression
mersion du tissu dans un liquide refroidissant de la protéine d'intérêt dans le tissu. Les anticorps
(isopentane à −130 °C) ou directement dans l'azote monoclonaux sont plus sensibles à la qualité de la
liquide (snap-freezing, −196 °C) puis son maintien fixation en raison de leur spécificité plus étroite.
en vapeur d'azote liquide ou au moins à −80 °C. Les anticorps polyclonaux de spécificité plus large
Avant la coupe, le tissu congelé est enrobé dans une ont l'avantage de reconnaître différents épitopes
substance protectrice (cryoprotecteur OCT) qui se de l'antigène. Leur avidité et leur spécificité sont
solidifie rapidement au froid et permet de consti- variables suivant les lots.
tuer un bloc plus facile à manipuler au cryomicro- Pour révéler la fixation de l'anticorps au tissu, une
tome. Le maintien de l'intégrité des antigènes est méthode directe ou indirecte peut être employée. La
préservé dans les tissus congelés car les protéines se méthode directe utilise directement des anticorps
trouvent dans un état structurel moins dénaturé. marqués (ou conjugués), appelés anticorps de révéla-
Cependant, la préservation de la morphologie du tion. Cette technique est simple et rapide, de locali-
tissu est moins bonne qu'avec un fixateur chimique. sation précise mais de sensibilité médiocre (fig. 4.11).

Fluorochrome

Anticorps primaire

Anticorps secondaire

Antigène

Immunofluorescence Immunofluorescence
directe indirecte
Fig. 4.11  Principe d'un marquage immunocytologique par immunofluorescence directe ou indirecte.
68 Techniques immunologiques

La méthode indirecte utilise un anticorps pri- Une étape de mise au point est nécessaire pour
maire non marqué spécifique de l'antigène, dont déterminer les conditions d'un marquage optimal :
sa fixation est révélée par un anticorps secondaire conditions de démasquage, concentration des
marqué. Cette méthode est privilégiée lorsque le anticorps primaire et secondaire, concentration
niveau d'expression de l'antigène à analyser est des chromogènes, temps de révélation.
faible. Une amplification supplémentaire du signal Il faut souligner qu'un anticorps performant en
initial peut être obtenue par l'utilisation d'un sys- western-blot n'est pas nécessairement adapté à
tème streptavidine–biotine ou avidine–biotine l'immunohistochimie. Les fournisseurs d'anti-
(e.g. ABC) décrit dans le chapitre sur les traceurs corps précisent généralement si l'anticorps a été
enzymatiques. Il est également possible de réticu- testé sur coupes de tissus congelés ou inclus en
ler un anticorps tertiaire marqué par la protéine A paraffine.
ou la protéine G. Des contrôles négatifs et positifs doivent être
Les traceurs fluorescents tels que l'isothiocya- réalisés. Les contrôles négatifs peuvent être
nate de fluorescéine (FITC) ou la phycoéry- (i)  un immunomarquage sans incubation avec
thrine (PE) sont surtout utilisés sur coupes l'anticorps primaire, (ii) une incubation avec un
congelées. Ils confèrent une grande sensibilité à anticorps de même isotype à la même concentra-
la technique et permettent des analyses confo- tion que l'anticorps primaire, dirigé contre un
cales, autorisant l'examen de colocalisations cel- antigène absent du tissu, (iii) une incubation de
lulaires. Ils nécessitent un montage en milieu l'anticorps sur un tissu ne renfermant pas l'anti-
aqueux labile et la lumière émise disparaît au gène ou (iv) une incubation avec l'anticorps pri-
cours du temps. maire spécifique préalablement saturé par
Les traceurs enzymatiques, tels que la peroxy- l'antigène purifié.
dase de raifort (HRP) associée pour chromogène Les contrôles positifs sont réalisés en utilisant
à la diaminobenzidine (DAB), donnent une colo- des témoins externes et internes.
ration stable brune. La phosphatase alcaline est L'analyse de l'immunomarquage est le plus sou-
également utilisée avec le chromogène Fast blue vent qualitative et tente de définir quelles cellules
pour une coloration bleue ou avec le Fast red pour sont positives et quelle est la localisation cellulaire
une coloration rouge. Ces traceurs permettent du marquage (membranaire, cytoplasmique ou
une visualisation en microscopie optique. Les nucléaire). Une analyse visuelle semi-quantitative
marquages sont stables, des doubles marquages peut être réalisée en prenant en compte le comp-
peuvent être réalisés sans pour autant permettre tage des structures ou cellules immunomarquées
de visualiser de colocalisation. La précision du par unité de surface ou champ microscopique.
marquage est moyenne en raison d'une diffusion Des outils spécifiques ont été développés pour
du précipité. permettre une analyse quantitative des immuno-
marquages. La première étape consiste le plus
souvent en une numérisation de l'immunomar-
Recommandations de mise en œuvre quage par un scanner haute résolution. Une ana-
Il est nécessaire de s'assurer de la spécificité du lyse quantifiée de l'immunomarquage est ensuite
marquage et de l'absence de bruit de fond. Des réalisée par un programme d'analyse d'image
marquages non immuns peuvent se produire, dédié.
secondaires à des interactions ioniques, hydro- Un exemple récent d'utilisation des immuno-
philes ou hydrophobes entre l'anticorps et des marquages à des fins pronostiques en pathologie
protéines du tissu ou encore secondaires à une tumorale colorectale est fourni dans la figure 4.12.
activité biotine endogène du tissu ou une mau- Un score immunitaire basé sur la quantification
vaise inhibition des peroxydases endogènes tissu- des populations immunitaires CD3 et CD8 res-
laires. Des marquages immuns non spécifiques pectivement dans la tumeur et au niveau du front
peuvent être la conséquence de réactions d'invasion est calculé. Ce score immunitaire amé-
croisées. liore la prédiction de récidive des patients.
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 69

a b
IHC Scanner
automate haute résolution

c d

Microscopie virtuelle et
programme d’ analyse d’image

Fig. 4.12  Exemple d'immunomarquage de tumeur colorectale pour le calcul informatisé du score immunitaire prédictif.
a. Détection automatique du tissu.
b. Identification de la région tumorale et du front d'invasion.
c. Quantification des populations immunomarquées (CD8+) et représentation des résultats selon une cartographie de
densité.
d. Illustration de la détection des cellules immunomarquées CD8+.

Puce tissulaire être évaluée de manière extrêmement rapide sur


(Tissue MicroArray) un grand nombre d'échantillons.

Méthodologie
La technique des puces tissulaires ou Tissue
MicroArrays (TMA) est une technologie à haut Différentes étapes d'une puce tissulaire
débit permettant d'obtenir des profils d'expression Construction de la puce
de protéines d'intérêt par immunohistochimie ou Pour la construction de la puce tissulaire (bloc
hybridation in situ en fluorescence (FISH) à partir TMA), un plan de fabrication est tout d'abord
de tissus fixés inclus en paraffine. Des carottes de défini. Une carte de la puce est élaborée, décrivant
tissus sont prélevées au moyen d'un carotteur tissu- les échantillons à positionner dans chaque emplace-
laire (tissue arrayer ou microarrayer) dans des ment de la matrice lignes/colonnes du bloc. La
zones sélectionnées du bloc tissulaire donneur, puis zone tissulaire prélevée sur le bloc donneur est
sont incluses selon un plan préétabli dans un bloc sélectionnée d'après l'examen microscopique de la
receveur. Une puce tissulaire peut réunir d'une coupe histologique colorée à étudier (fig.  4.13).
centaine à un millier de carottes tissulaires dans un Selon les instructions du plan de fabrication, chaque
seul bloc. Ainsi, une seule coupe histologique carotte de tissu de 0,6 à 2 mm de diamètre est pré-
d'une puce tissulaire permet d'analyser simultané- levée dans le bloc donneur à l'aide du carotteur tis-
ment plusieurs centaines d'échantillons tissulaires sulaire. Un trou correspondant, de même diamètre,
formant des spots. Cette analyse assure une grande est préparé dans le bloc receveur. La carotte tissu-
homogénéité de la technique sur l'ensemble des laire est alors incluse à son emplacement dans le
spots analysés et constitue une économie de temps, bloc TMA. Pour éviter des variations de hauteur
de réactifs et de matériel biologique. des carottes qui pourraient provoquer des pertes de
Les techniques des puces tissulaires permettent spots lors de la coupe, la totalité du trou receveur
de constituer des archives de tissus tumoraux. Une doit être remplie au besoin par plusieurs fragments
fois le bloc constitué, l'expression de protéines du même tissu. La réalisation de blocs contenant
d'intérêt sur une large cohorte de patients peut des centaines de carottes tissulaires est une tâche
70 Techniques immunologiques

Fig. 4.13  Schéma de construction de la puce tissulaire.


Partie gauche, plan de bloc TMA du centre de la tumeur. Partie droite, sélection sur les coupes histologiques des régions à
transférer sur la puce.

Spot contrôle: amygdale TMA cancer du rein; marquage CD8 Spot marquage CD8 Agrandissement

Fig. 4.14  Lame de puce tissulaire immunomarquée par un anticorps anti-CD8.


Partie gauche : amygdale (spot contrôle positif) ; centre, vue générale de la puce tissulaire ; partie droite, spot de tumeur du
rein et son agrandissement (spot assay).

longue et minutieuse nécessitant au préalable de manuelle. Le résultat d'un immunomarquage est


disposer d'une large gamme d'échantillons. représenté sur la figure 4.14.
Des cultures cellulaires peuvent également faire
l'objet d'inclusions en blocs spécifiques en utili- Recommandations de mise en œuvre
sant des culots fixés. Le bloc donneur doit avoir une épaisseur minimum
de 3 à 4 mm afin d'éviter des variations de hauteur
Réalisation des coupes des carottes. Pour compenser les effets de bord
Le bloc receveur est ensuite coupé par un micro- observés en périphérie lors des immunomarquages,
tome standard afin d'obtenir des puces (ou bio- des carottes de tissus normaux doivent être dispo-
puces) tissulaires. Chaque coupe de 5 μm sées en périphérie de la puce tissulaire. Le plan de
d'épaisseur est placée sur une lame de verre. Ce construction de la puce doit être minutieusement
transfert est délicat, avec une perte estimée entre défini. Une orientation du bloc TMA par des repères
10 et 30 % des spots. d'architecture ou des carottes tissulaires témoins est
nécessaire afin d'éviter des erreurs d'identification
Immunomarquages des spots. Enfin, des programmes d'analyse d'image
Les puces tissulaires sont immunomarquées dédiés à la quantification des immunomarquages sur
comme des coupes tissulaires standard, à l'aide puce tissulaire sont disponibles pour faciliter la lec-
d'un automate dédié ou selon une technique ture de chaque spot (fig. 4.15).

Chapitre 4. Techniques avec traceurs 71
Fig. 4.15  Exemple d'analyse d'image d'un immunomarquage sur puce tissulaire.
a. Quantification par analyse d'image d'une coupe de TMA de cancer de rein immunomarquée avec un anticorps anti-CD8.
b. Spot témoin bruit de fond.
c. Détection de la tumeur.
d. Spot essai immunomarqué par des anticorps anti-CD8.
e. Spot analysé : tumeur en bleu, lymphocytes péritumoraux en rouge, lymphocytes intratumoraux en jaune.
72 Techniques immunologiques

Avantages/inconvénients loupe ou d'un microscope, éventuellement relié à


un système informatique.
Avantages Inconvénients
Détection et visualisation de la Problème de représentativité Méthodologie
localisation histologique des des échantillons en TMA
antigènes et des structures Dégradation de certains
L'exemple décrit ici est celui le plus couramment
associées épitopes par les techniques de utilisé détectant la sécrétion de cytokines par des
Visualisation des interactions fixation lymphocytes T spécifiques (fig. 4.16).
cellulaires Techniques longues et délicates La technique ELISpot est réalisée dans des
Analyses tissulaires à haut débit Reproductibilité variable
(i.e. TMA) Méthode semi-quantitative
plaques de culture de 96 puits dont le fond est
Données histologiques constitué d'une membrane de Nylon ou de nitro-
archivables cellulose. La membrane est préalablement recou-
verte par un anticorps dit de capture reconnaissant
la cytokine d'intérêt pendant au moins 18 heures
Exemples d'applications à 4 °C. Après cette étape de sensibilisation de la
• En recherche : l'immunofluorescence tissulaire membrane du fond des puits, la suspension cellu-
est particulièrement utilisée pour la localisation laire ajustée à 1.106 cellules/mL en milieu de
précise des infiltrats immunitaires dans les tissus culture approprié est mise en présence des anti-
inflammatoires des modèles animaux patholo- gènes d'intérêt (e.g. peptides viraux, tumoraux ou
giques. bactériens). La présence de cellules dendritiques,
• En clinique : la recherche d'auto-anticorps spé- de monocytes et/ou de lymphocytes B assure la
cifiques de maladies auto-immunes dans les tis- présentation de ces antigènes aux cellules T spéci-
sus, ainsi que l'étude des infiltrats immunitaires fiques, leur activation et l'induction de la sécrétion
dans les tumeurs, font généralement appel à la de cytokines. Les antigènes utilisés sont des pep-
technique d'immunohistochimie. L'utilisation tides synthétiques (de huit à dix acides aminés cor-
du principe de TMA permet des analyses à haut respondant à des peptides optimaux présentés par
débit d'échantillons tissulaires. des molécules du CMH ou de 15 acides aminés
recouvrant toute une protéine d'intérêt), des pro-
téines entières ou des virus recombinants. Un
ELISpot puits contrôle négatif (cellules seules) et un puits
contrôle positif (cellules stimulées par un mito-
La technique ELISpot (enzyme-linked immuno­ gène, le plus souvent la phytohémaglutinine ou
spot) permet de détecter individuellement des cel- PHA) sont réalisés en parallèle. Chaque condition
lules produisant une protéine sécrétée de stimulation est appliquée en duplicat ou
spécifiquement (e.g. cytokine, granzyme, immu- triplicat.
noglobuline). La protéine sécrétée par la cellule Les plaques sont incubées à l'étuve à 37 °C pen-
est captée par un anticorps fixé préalablement sur dant 6 à 20 heures. Les cellules T spécifiques de
une membrane de Nylon ou de nitrocellulose l'antigène testé sécrètent la cytokine qui est fixée
dans le fond de puits de culture où sont placées les localement par l'anticorps de capture. Après des
cellules, additionnées éventuellement de stimuli étapes de lavage visant à éliminer les cellules, les
adéquats (e.g. mitogènes, antigènes). La présence plaques sont incubées à 37 °C pendant 4 heures
de la protéine sécrétée est révélée, après élimina- avec un deuxième anticorps biotinylé dit de révé-
tion des cellules, par un deuxième anticorps cou- lation, reconnaissant un épitope de la cytokine
plé à une enzyme et la formation d'un produit mais différent de celui reconnu par l'anticorps de
chromogène. Chaque point (ou spot) représente capture. La révélation fait intervenir la streptavi-
l'empreinte d'une cellule productrice de la pro- dine couplée à une enzyme (le plus souvent la
téine d'intérêt. Le nombre de cellules ayant pro- phosphatase alcaline). Après de nouveaux lavages,
duit un spot coloré est déterminé à l'aide d'une les plaques sont ensuite incubées entre 10 et
Chapitre 4. Techniques avec traceurs 73

Cellules mononucléées

Antigène

Anticorps de capture

Membrane

Cytokine sécrétée

Anticorps de révélation
bioltinylé

Streptavidine/phosphatase
alcaline et chromogène

Numération des spots:


un spot = une cellule sécrétrice de cytokine

Fig. 4.16  Étapes d'une technique ELISpot cytokine.

15  minutes avec un substrat de l'enzyme (e.g. loupe ou d'un microscope, éventuellement équipé
BCIP/NBT, 5-bromo-4-chloro-3′-indolyl phos- d'une caméra assistée par ordinateur. Les résultats
phate et chlorure de nitro-bleu de tétrazolium) sont exprimés en nombre de cellules formant des
qui, catabolisé par l'enzyme, se colore, précipite et spots (Spot Forming Cells ou SFC) par million de
identifie les zones de production de la cytokine. cellules mononucléées (SFC/106 cellules) pour
La réaction colorimétrique est arrêtée par de l'eau chaque condition de stimulation après soustrac-
distillée. Après séchage à température ambiante et tion du bruit de fond obtenu dans les puits corres-
à l'abri de la lumière, les points colorés (spots) qui pondant aux cellules seules (témoin négatif).
apparaissent sur la membrane correspondent aux
cellules spécifiques de l'antigène ayant produit la Recommandations de mise en œuvre
cytokine en réponse à la stimulation. Les spots L'intérêt de cette technique repose sur l'identifi-
sont comptés dans chaque puits à l'aide d'une cation individuelle de cellules productrices de la
74 Techniques immunologiques

protéine d'intérêt. Elle nécessite donc de travailler lysent cette dernière. Parallèlement à leur
à partir de cellules fraîchement prélevées, séparées activité cytolytique, les lymphocytes T CD8+
et mises en culture quelques heures après le cytotoxiques produisent des cytokines telles
recueil. La période de culture impose également que l'IFN-γ ou le TNF-α. Les deux fonctions
des conditions stériles. Enfin, la quantification (cytotoxicité et production de cytokines) sont
nécessite de disposer d'un comptage le plus précis globalement corrélées et induites par les
possible des cellules pour lesquelles la production mêmes signaux. La technique ELISpot IFN-γ
de la protéine d'intérêt est recherchée. Les sus- est maintenant reconnue comme étant la
pensions de cellules mononucléées obtenues après méthode de référence pour quantifier rapide-
centrifugation sur gradient de densité (Ficoll®) ment, à partir d'une faible quantité de cellules
contiennent plusieurs types cellulaires, et une mononucléées, le nombre de cellules CD8+
quantification spécifique de la population cellu- spécifiques d'antigènes viraux ou tumoraux.
laire testée, avant l'ajustement de la suspension Elle permet aussi d'identifier les peptides
cellulaire, peut nécessiter une analyse en cytomé- immunodominants et d'analyser la diversité
trie en flux. Ceci permet par exemple un décompte du répertoire des réponses lymphocytaires
précis des lymphocytes T CD8+, producteurs de T CD8+ ;
cytokines, ou des lymphocytes B producteurs – les cytokines Th2 (IL-4 notamment) sont
d'immunoglobulines. particulièrement intéressantes pour analyser
les réponses allergiques de faible intensité qui
Avantages/inconvénients peuvent être détectées plus facilement par
cette technique sensible ;
Avantages Inconvénients – la technique ELISpot B est utilisée pour
Bonne sensibilité Nécessite de travailler avec des caractériser les réponses humorales. Elle per-
Test fonctionnel cellules isolées, fraîchement met de déterminer le nombre de lympho-
Quantification du nombre de mises en culture en conditions cytes B sécrétant des immunoglobulines, ou
cellules productrices d'une stériles le nombre de lymphocytes B spécifiques d'un
cytokine Sécrétion cytokinique spontanée
Applicable aux biothérapies pouvant induire un bruit de fond antigène. Dans le premier cas, un anticorps
Technique simple au regard des au regard d'une stimulation anti-isotype est fixé sur la membrane, permet-
informations obtenues antigénique spécifique tant de détecter la production d'immunoglo-
Permet l'identification Technique sensible aux
bulines (e.g. IgM, IgG, IgA). Dans le second
simultanée de plusieurs vibrations lors de l'incubation
cytokines sécrétées (ELISpot sur la nuit cas, c'est l'antigène fixé sur la membrane qui
fluorescent) Ne permet pas de doser les capture l'immunoglobuline spécifique pro-
molécules sécrétées duite. Dans les deux cas, les immunoglobu-
L'ELISpot fluorescent nécessite
un appareillage spécifique pour
lines sécrétées sont révélées par un anticorps
la lecture du résultat biotinylé anti-immunoglobuline, puis une
réaction colorimétrique.
• En clinique : la technique d'ELISpot basée sur
Exemples d'applications la détection de cytokines, grâce à sa sensibilité et
• En recherche : sa reproductibilité, est largement utilisée pour
– dans le cas de l'analyse des réponses lympho- analyser les réponses immunes spécifiques T ou
cytaires T CD8+, la détection de la sécrétion B au cours de pathologies comme les infections
d'IFN-γ est généralement utilisée. En effet, virales chroniques, les cancers et les allergies.
les lymphocytes T CD8+ reconnaissent leur Elle permet aussi l'évaluation des protocoles
épitope à la surface d'une cellule cible et vaccinaux.
Chapitre 5
Techniques de biologie moléculaire

Techniques d'amplification informations qualitatives que quantitatives lorsque


utilisées en immunologie l'ADN est en quantité trop faible pour être analysé
ou utilisé dans des réactions biochimiques.
La biologie moléculaire, qui concerne principale-
ment l'étude des acides nucléiques, a connu un Méthodologie
essor important depuis la fin du xxe siècle. En Il s'agit de réaliser une succession de réactions de
immunologie, ces techniques sont par exemple réplication d'une matrice d'ADN double brin.
appliquées à l'étude du répertoire des récepteurs Deux oligonucléotides (fragments d'ADN simple
aux antigènes des lymphocytes B et T. Elles brin synthétiques de 20 à 30 nucléotides égale-
reposent sur l'amplification de séquences nucléo- ment appelés amorces), définis par l'expérimenta-
tidiques spécifiques à partir d'ADN ou d'ARN de teur, correspondent à des séquences spécifiques
façon qualitative ou quantitative. Une application des brins sens et anti-sens de la matrice cible.
récente originale, l'immuno-PCR, utilise ce Chaque amorce s'hybride sur un brin opposé de
principe pour la détection d'une réaction
­ l'ADN de la matrice et borde la séquence à ampli-
antigène–anticorps. fier. La PCR comprend trois étapes réalisées à des
températures clés différentes, en présence d'un
mélange des quatre nucléotides (A, C, G et T) et
Réaction de polymérisation de Taq polymérase (fig. 5.1) :
en chaîne (PCR) • dénaturation de l'ADN double brin à 94 °C en
matrice simple brin ;
La réaction de polymérisation en chaîne • hybridation des amorces sur la matrice ;
(Polymerase Chain Reaction ou PCR), conceptua- • copie de la zone cible de l'ADN par la Taq
lisée en 1983 par Kary Mullis (prix Nobel de polymérase.
chimie en 1993), permet d'obtenir des copies Ces trois étapes sont répétées 30 à 40 fois
multiples d'ADN (jusqu'à quelques micro- (cycles de PCR), doublant à chaque fois la quan-
grammes) à partir de quelques molécules d'ADN tité d'ADN. Les produits de chaque étape ser-
à l'aide de la Taq polymérase, une ADN polymé- vant de matrices pour les étapes suivantes, la
rase résistante aux températures élevées. Cette quantité d'ADN évolue de façon exponentielle
technique a été automatisée avec le développe- puis linéaire pour finalement atteindre un pla-
ment de thermocycleurs qui peuvent faire varier la teau. Ainsi, après 30 cycles de PCR, en quelques
température de l'échantillon de façon très précise. heures, on obtient théoriquement 230 copies de la
Cette technologie a donné lieu à de très nom- cible initiale. Les produits de la PCR (amplicons)
breuses applications fournissant aussi bien des sont détectés sous forme de bandes selon leur

Méthodes en immunologie
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76 Techniques immunologiques

94°C 60°C 72°C

5’ 3’
Brin sens ou codant
Brin anti-sens
ADN à amplifier ou complémentaire
3’ 5’

Premier cycle
de PCR
Deuxième cycle
Xn = X0 x 2n de PCR

Fig. 5.1  Principe de la réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction ou PCR).


L'ADN est soumis à une succession de changements de température : dénaturation à 94 °C (séparation des deux brins
d'ADN) ; hybridation (ou annealing) des amorces spécifiques (amorce sens en rose, amorce anti-sens en bleu) avec la
matrice à la température de fusion (Tf vers 60 °C) ; polymérisation enzymatique à 72 °C à partir des amorces. Répétition
des trois étapes entre 30 et 40 fois. La quantité de la séquence à amplifier est définie par l'équation Xn = X0 × 2n (n : nombre
de cycles ; X0 : quantité initiale d'ADN ; Xn : quantité d'ADN au énième cycle).

taille après électrophorèse en gel d'agarose et haitable de déterminer expérimentalement la tem-


coloration (e.g. bromure d'éthidium ou BEt), ou pérature optimale d'hybridation des amorces.
par électrophorèse capillaire. Enfin, cette réaction étant très sensible aux
contaminations, il faut toujours travailler avec des
Recommandations de mise en œuvre gants, des pointes avec filtre pour pipettes automa-
En plus de la Taq polymérase classique, plusieurs tiques et du matériel dépourvu de toute trace
autres types d'ADN polymérase sont commerciali- d'ADN. Un contrôle négatif (sans ADN) doit être
sés, telles que les Hot Start DNA polymérases uti- systématiquement réalisé pour chaque PCR afin de
lisées pour réduire les réactions non spécifiques et s'assurer de l'absence de contamination. Un circuit
les polymérases fidèles qui, comme leur nom l'in- à sens unique, avec plusieurs pièces dédiées sépa-
dique, font très peu d'erreurs lorsqu'elles reco- rées, doit être mis en place dans le laboratoire afin
pient l'ADN cible. Ces dernières travaillent d'éviter le mélange des produits nucléotidiques.
généralement moins vite que les polymérases clas-
siques et sont utilisées pour les applications exi- Exemples d'applications
geant le moins d'erreurs possibles telles que le • En recherche : la technique de PCR permet
séquençage et la mutagénèse dirigée. d'étudier les variations génétiques et d'identifier
La spécificité des amorces est un facteur crucial les déficits moléculaires. La PCR a de très nom-
pour le succès de la PCR. Cette spécificité résulte breuses applications dans le domaine de la micro-
en grande partie de la façon dont elles ont été biologie et pour l'étude des variations génétiques
définies. Pour une PCR classique, les amorces dans les cellules humaines ou animales.
doivent mesurer 18 à 20 nucléotides de long, • En clinique :
avoir un pourcentage de guanine et cytosine (GC) – la clonalité est évaluée par l'analyse des gènes
de 40 à 60 %, ne pas s'hybrider sur elles-mêmes, des récepteurs pour l'antigène ;
ne pas présenter de mésappariement avec la cible, – les tests de diagnostic microbiologique utili-
ne pas être complémentaires entre elles et enfin sant la PCR sont capables de détecter la pré-
être choisies au sein d'une zone spécifique d'une sence d'agents pathogènes plus tôt que les
seule cible. Pour améliorer la spécificité, il est sou- méthodes sérologiques.
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 77

Reverse transcription-PCR (AMV) et celui du virus de la leucémie murine de


Moloney (MMLV). En pratique, les MMLV sont
La Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) vise à les plus utilisées.
détecter et analyser des ARN (ARNm ou totaux)
présents même en très faible quantité dans un Exemples d'applications
échantillon biologique et comprend deux étapes. • En recherche :
La première utilise une transcriptase inverse – l'étude du profil d'expression génique permet
pour transformer l'ARN en ADN complémen- d'avancer dans la compréhension des méca-
taire (ADNc). La seconde étape est la PCR qui nismes de physiologie immunitaire ;
permet d'amplifier cet ADNc. Le résultat est – la RT-PCR permet de détecter n'importe quel
visualisé par migration sur gel ou électrophorèse transcrit dans un échantillon biologique ;
capillaire. – cette technique s'applique également à la
détection des virus à ARN, ou des gènes en
Méthodologie cours de transcription dans les cellules immu-
La transcription inverse (Reverse Transcription ou nitaires comme les cytokines ou les TLR.
RT) consiste tout d'abord à mélanger les ARN • En clinique :
avec un oligo-dT, oligonucléotide composé uni- – la technique de PCR s'applique à l'analyse
quement de thymidine qui s'hybride à la queue des variations d'expression génique impli-
poly-A des ARNm, ou avec un mélange d'oligo- quées dans une pathologie. Elle ouvre vers
nucléotides longs de six nucléotides (hexamères) de nouvelles cibles thérapeutiques ou de
et de séquences aléatoires qui s'hybrident sur tous diagnostic ;
les ARN (avec ou sans queue poly-A), selon que – la détection de cellules tumorales peut être
l'on souhaite amplifier uniquement les ARNm réalisée par la recherche de la présence de
pour l'ensemble du pool de la cellule. Ces mélanges transcrits spécifiques (e.g. mutations, trans-
sont ensuite dénaturés pour limiter les éventuelles crits de fusion).
structures secondaires. Pour cela, l'ensemble est
placé durant 2 min à 70 °C, puis 2 min supplé- qRT-PCR ou RT-PCR quantitative
mentaires sur la glace pour éviter la renaturation.
Ensuite, un mélange des quatre nucléotides et la La PCR quantitative en temps réel (Quantitative
transcriptase inverse sont ajoutés pour une incu- Real Time-Polymerase Chain Reaction ou qRT-
bation à 37 °C durant 1 h 30. L'étape de PCR se PCR), permet la quantification d'un ADN ou
déroule telle que décrite précédemment. d'un ARN spécifique de façon fiable. Cette
méthode est basée sur la détection et la mesure
Recommandations de mise en œuvre quantitative d'un marqueur fluorescent (la plupart
du temps le SYBR Green I) dont l'émission est
L'intégrité de l'ARN est un élément essentiel pour proportionnelle à la quantité d'ADN générée pen-
disposer d'une matrice ADNc de qualité. Il faut dant la PCR. La réaction de PCR est suivie direc-
donc éviter de le contaminer ou de le dégrader. tement sur la quantité de fluorescence émise à la
Pour cela, quelques précautions doivent être prises fin de chaque étape d'élongation pendant laquelle
telles que porter des gants pour protéger les la polymérase recopie l'ADN (fig.  5.2), d'où le
échantillons des RNases apportées par le manipu- nom de PCR en temps réel très fréquemment uti-
lateur, utiliser les tampons et du matériel sans lisé. Le concept de cycle seuil (cycle threshold ou
RNase (matériel dit RNase-free). Il est aussi Ct) est à la base d'une quantification précise et
recommandé d'ajouter un inhibiteur de RNases à reproductible. Il est défini par le nombre de cycles
la transcriptase inverse. de PCR requis pour atteindre un signal d'émission
Il existe deux grands types de transcriptases de fluorescence statistiquement et significative-
inverses : celui du virus du myéloblastome aviaire ment plus élevé que le bruit de fond. Ce dernier
78 Techniques immunologiques

0.15

0.125 Zone où
les
courbes
0.1
diffèrent
Fluorescence

0.075

0.05

Seuil = limite du Zone où


bruit de fond les
Ct
courbes
0.025
sont les
mêmes

0
5 10 15 20 25 30 35 40

Nombre de cycles
Fig. 5.2  Courbes de fluorescence obtenues lors d'une PCR en temps réel quantitative (qPCR, triplicata).
Le cycle seuil (Ct) représente le nombre de cycles requis pour que le signal de fluorescence soit significativement supérieur
au bruit de fond. Cycle seuil déterminé au cours de la phase exponentielle, phase la plus reproductible de la réaction
de PCR (cf. courbe verte).

est d'autant plus petit que la matrice initiale à bridation aux caractéristiques des amorces et à
amplifier est abondante. La valeur du Ct est tou- leur concentration. Le programme type pour
jours définie au cours de la phase exponentielle une qRT-PCR est le suivant : (1) dénaturation
d'amplification, phase la plus reproductible de la de l'ADNc (e.g. 94 °C, 5 min) ; (2) dénatura-
réaction. Cette valeur de Ct peut ensuite être tra- tion rapide du double brin (e.g. 94 °C, 15 sec) ;
duite en un résultat quantitatif en la comparant (3) hybridation à la température d'hybridation
avec les valeurs de Ct générées lorsque des trans- optimale des amorces (e.g. 45 sec) ; (4) élonga-
crits de gènes de ménage (housekeeping genes, tion (e.g. 72 °C, 30 sec) ; (5) répétition 40 fois
e.g.  β-actine, β2-microglobuline), dont l'expres- des étapes 2 à 4 ; (6) élongation finale à 72 °C.
sion est constante, sont amplifiés. La quantifica-
tion ne requiert aucune manipulation post-PCR. Recommandations de mise en œuvre
La qRT-PCR est encore plus sensible aux conta-
Méthodologie minations que la PCR classique. Il faut donc res-
Les étapes de la qRT-PCR sont les mêmes que pecter les mêmes règles à ce sujet et extraire les
celles d'une PCR classique, excepté la révélation ARN dans une pièce spécifique lorsqu'elle est réa-
des amplicons qui est analysée en temps réel. lisée sur des ADNc.
Les amorces pour la qRT-PCR répondent aux Il est recommandé de déterminer l'efficacité de
mêmes critères de spécificité que celles de la la qRT-PCR pour chaque couple d'amorces afin
PCR classique pour un fragment de 100 à 200 de s'assurer que la modification d'expression d'un
paires de bases (pb). Comme pour une PCR gène n'est pas due à une différence d'efficacité
classique, il faut appliquer la température d'hy- d'amplification. Pour cela, il faut appliquer la qRT-
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 79

PCR sur une gamme de dilutions d'ADNc afin de Méthodologie


déterminer l'équation de la droite Ct = f(log cc La PCR-SSO/ASO comprend deux étapes :
ADNc matriciel). L'efficacité, E = 10(−1/pente), cor- • amplification avec des amorces génériques ;
respondant au pourcentage de doublement entre • puis hybridation avec des sondes oligonucléoti-
chaque cycle, est acceptable entre 90  et 110 %. diques spécifiques.
Enfin, les qRT-PCR doivent être développées au Cette technologie permet d'analyser un grand
moins deux fois en triplicat. Idéalement, les Ct nombre d'échantillons à moindre coût. Diffé-
doivent être normalisés par rapport à plusieurs rentes techniques de réalisation et de révélation
gènes de référence ou gènes de ménage. existent, hybridation directe ou inverse sur mem-
brane de nitrocellulose ou sur puce, électropho-
Exemples d'applications rèse en gel d'agarose, restriction enzymatique,
• En recherche : la qRT-PCR est utilisée à la fois voire RT-PCR.
dans des modèles animaux et de lignées cellu- La PCR-SSP fait appel à des amorces spécifiques
laires, pour étudier les modulations géniques des régions polymorphiques qui sont les seules à
générées par les manipulations expérimentales, être amplifiées. Les produits amplifiés sont séparés
par exemple les variations de l'activation de la sur gel et les résultats interprétés en fonction des
production de cytokines. bandes observées.
• En clinique : la qRT-PCR est utilisée pour Enfin, la PCR-SBT implique une amplification
une quantification de l'expression génique, par PCR suivie du séquençage direct du produit
par exemple, la modulation hormonale ou de PCR.
iatrogène de tissus ou de cellules. Elle permet
aussi la recherche de mutations ponctuelles Exemples d'applications
ou de polymorphismes (Single Nucleotide
• En recherche : ces techniques font également
Polymorphism ou SNP) et la recherche du
partie de l'arsenal des technologies de médecine
chimérisme après greffe de cellules souches
légale et criminelle.
hématopoïétiques. En microbiologie, elle est
• En clinique : ces techniques sont très utiles pour le
utile pour la détection et la quantification
typage du CMH (typage HLA générique) et pour
rapide d'agents pathogènes viraux, bactériens
l'analyse des réarrangements des gènes des immu-
ou parasitaires.
noglobulines, notamment à la recherche de mala-
die résiduelle dans les hémopathies lymphoïdes.
Génotypage par PCR-SSO,
PCR-SSP et PCR-SBT (fig. 5.3)
Immuno-PCR
Les techniques de PCR-SSO (pour Sequence
Specific Oligoprobes) ou PCR-ASO (pour Allele Le cas particulier de l'immuno-PCR est celui
Specific Oligonucleotides), PCR-SSP (pour d'une technique récente qui associe à la détection
Sequence Specific Primers) et PCR-SBT (pour de l'antigène cible par un anticorps l'amplification
Sequencing Based Typing) font appel à la PCR clas- exponentielle, par PCR, d'un ADN fixé à ce der-
sique pour amplifier des régions comportant un nier (fig. 5.4). Cette méthode combine les avan-
polymorphisme et permettent de détecter les tages des deux systèmes analytiques engagés
SNPs. Leur intérêt est d'amplifier considérable- successivement de l'immunodosage (spécificité et
ment la séquence recherchée. L'utilisation de affinité) et de la révélation (amplification qPCR).
sondes spécifiques permet selon les cas de détecter Elle permet de détecter de petites quantités de
le polymorphisme positivement (la sonde n'hy- protéines antigéniques de l'ordre du picogramme
bride qu'avec l'ADN variant) ou négativement (il ou du femtogramme. Le choix de l'oligonucléo-
n'y a pas d'amplification/hybridation si le poly- tide comme marqueur est infini et permet d'appli-
morphisme est présent). quer cette méthode en multiplex.
80
PCR-SSO PCR-SBT PCR-SSP

Techniques immunologiques
Amplification avec des Amplification de régions codantes Amplification de l’ADN avec
amorces génériques spécifiques de gènes des amorces spécifiques

Séquenceur automatique Électrophorèse des


Hybridation sur filtre des
produits de PCR
produits de PCR avec des
sondes oligonucléotidiques
spécifiques
Produits
spécifiques

Contrôles
positifs

Analyse de la séquence par


comparaison du chromatogramme
avec des bases de données
Interprétation Interprétation
Fig. 5.3  Comparaison des techniques de PCR-SSO, PCR-SBT et PCR-SSP.
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 81

ELISA sandwich Immuno-PCR

Substrat Oligonucléotide fixé sur l’anticorps de révélation


Produit coloré ou fluorescent pour initier la PCR
Enzyme fixée sur l’anticorps de révélation Antigène
Anticorps de révélation

Anticorps de capture

Fig. 5.4  Systèmes de détection des antigènes par test immuno-enzymatique (ELISA) et par l'immuno-PCR.

Ses principales applications actuelles sont dans protéines d'agents infectieux (bactéries, virus,
le champ de la microbiologie, avec la détection de moisissures, polypeptides des maladies à prions).

Avantages/inconvénients
PCR RT-PCR qRT-PCR Immuno-PCR
Avantages Étude qualitative et Étude qualitative et Étude quantitative des ADN et Détection d'antigènes
semi-quantitative de l'ADN semi-quantitative des ARN ARN Rapidité
Coût faible Coût faible Rapidité Grand nombre
Rapidité Rapidité Grand nombre d'échantillons d'échantillons
Grand nombre Grand nombre d'échantillons Sensibilité plus élevée que la Faible volume
d'échantillons Nombreux couples d'amorces PCR et la RT-PCR Sensibilité élevée (pico- à
Nombreux couples disponibles dont les conditions Suivi en direct de la réaction femtogramme)
d'amorces disponibles d'utilisation ont été optimisées Analyse immédiate de la Suivi en direct de la
dont les conditions qualité de l'amplification réaction
d'utilisation ont été Applications en système
optimisées multiplexé
Stabilité des matrices ADN
Inconvénients Sensibilité plus faible que Sensibilité plus faible que la Coût du thermocycleur plus Nécessite un
la qRT-PCR qRT-PCR élevé thermocycleur en temps
Attention aux ARN sensible aux nucléases Mise au point plus longue réel (qRT-PCR)
contaminations Attention aux contaminations mais de plus en plus de Contaminations possibles
Pas de suivi en direct de la Pas de suivi direct de la couples d'amorces avec des par l'échantillon
réaction réaction conditions d'utilisation
Qualité de l'amplification Qualité de l'amplification optimisées sont disponibles
examinée obligatoirement examinée obligatoirement sur ARN sensible aux nucléases
sur la migration la migration Attention aux contaminations
82 Techniques immunologiques

Diagnostic de clonalité, nal suit une distribution gaussienne (fig. 5.6). La


analyse du répertoire population lymphocytaire issue de l'expansion
d'un seul lymphocyte forme un clone lymphocy-
taire. Chaque cellule du clone a la même région
Lors de l'ontogénie lymphocytaire T ou B, les hypervariable. Cette expansion provoque la surre-
précurseurs cellulaires réarrangent les gènes présentation dans l'échantillon d'une taille de
codant pour la partie variable de leur récepteur, séquence hypervariable donnée (voir fig. 5.6).
TcR (T cell Receptor) ou BcR (B cell Receptor), Le principe de l'analyse de la clonalité ou des
respectivement. Ce sont les gènes V (± D) et J des analyses du répertoire consiste à mettre en évi-
chaînes lourdes (IgH), puis des chaînes légères dence la présence ou l'absence d'expansion d'un
kappa et lambda pour les lymphocytes B et les lymphocyte au sein d'une population polyclonale.
gènes des chaînes delta, puis gamma, puis bêta, Deux remarques sont importantes à ce stade :
puis alpha pour les lymphocytes T exprimant un • la mise en évidence d'une sur-représentation
TCRαβ. Lors de ces réarrangements, la région la d'un clone lymphocytaire ne préjuge pas de la
plus hypervariable du récepteur (CDR3) est cause de la prolifération clonale et monoclona-
constituée par la jonction des segments V (D) J. lité n'est pas synonyme de malignité. Certaines
Cette jonction est spécifique de la cellule dans infections virales peuvent en effet induire des
laquelle est effectué ce réarrangement qui implique expansions lymphocytaires de diversité très
des délétions et des additions de nucléotides aléa- étroite ;
toires en nature et en nombre. Cette jonction • il s'agit bien d'étudier la déviation observée par
représente la signature génétique du lymphocyte rapport à une répartition gaussienne de réfé-
(fig.  5.5). L'extrême variabilité ainsi générée se rence et l'analyse doit être faite sur des prélève-
traduit par des différences de taille des régions ments riches en lymphocytes.
hypervariables entre lymphocytes. Cette variabi-
lité de taille est exploitée pour étudier globale-
ment le répertoire lymphocytaire. Le nombre de Méthodologie
bases enlevées et ajoutées au niveau des jonctions Bien que le principe soit le même, la méthodolo-
étant aléatoire, la répartition des tailles de la gie est un peu différente selon que l'on cherche à
région hypervariable dans un échantillon polyclo- mettre en évidence une population clonale dans

Fig. 5.5  Création de la région hypervariable CDR3 lors de l'ontogénie B.


Locus 14q32, gènes de chaîne lourde du BCR (IgH). N1 et N′ correspondent à des délétions et des additions de
nucléotides aléatoires en nature et en nombre.
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 83

CDR1 CDR2 CDR3 PROTÉINE

VH N DH N JH ADN

FR3 JH

FR2 JH PCR
FR1 JH

Fig. 5.6  Amplification des régions CDR3.

un échantillon suspect de maladie lymphoprolifé- L'oligonucléotide JH doit alors être couplé à un


rative clonale (e.g. lymphome, leucémie lym- fluorochrome. Les lymphoproliférations tumo-
phoïde chronique) ou selon que l'on étudie la rales B que l'on cherche à mettre en évidence par
réaction immunitaire à un processus physiolo- cette technique étant le plus souvent constituées
gique ou pathologique non tumoral. de cellules de type centro- ou post-germinatif, la
région VDJ spécifique du clone tumoral com-
porte généralement des mutations somatiques
Diagnostic de clonalité B non prédictibles. Celles-ci pouvant empêcher l'hy-
dans un contexte tumoral bridation des oligonucléotides, il est impératif de
La recherche d'une clonalité B est effectuée le plus n'affirmer l'absence de clone tumoral qu'après
souvent sur l'ADN extrait de l'échantillon à analy- avoir réalisé les trois PCR FR1, FR2 et FR3. En
ser. Il s'agit d'amplifier toutes les séquences cas de négativité, il est fortement recommandé de
hypervariables présentes dans l'échantillon et d'en compléter avec une analyse des réarrangements
étudier la taille. Pour ce faire, on utilise un oligo- des chaînes légères.
nucléotide consensus capable de s'hybrider sur les
six segments J présents dans le génome, combiné
à des oligonucléotides complémentaires des seg- Diagnostic de clonalité T
ments VH en 5′ de la région CDR3. Les segments dans un contexte tumoral
VH étant regroupés en six familles, il est néces- Il existe deux types de récepteurs T, alpha-bêta et
saire d'utiliser six oligonucléotides VH dans gamma-delta. Les proliférations tumorales sont
chaque réaction de PCR multiplex. De plus, les très largement alpha-bêta. Cependant, le locus
oligonucléotides VH peuvent être complémen- bêta est très complexe. Si cette complexité permet
taires soit de la région FR3 (PCR FR3-JH), soit de bien aborder les analyses de répertoire immuni-
de la région FR2 (PCR FR2-JH), soit de la région taire, elle rend difficile l'utilisation de ce locus
FR1 (région FR1-JH) des segments VH (fig. 5.7). pour des analyses de clonalité en routine. Par
Le choix des oligonucléotides a été optimisé lors contre, les gènes codant la chaîne gamma étant
d'une étude européenne appelée Biomed 2 et leur réarrangés très précocement au cours de l'ontogé-
séquence est publique. Une fois les séquences nie T, ils peuvent servir de marqueur de clonalité
amplifiées, l'analyse de leur taille est faite par quel que soit le type de récepteur exprimé in fine
migration sur gel d'acrylamide, le plus souvent sur par la population tumorale. De plus, le locus
un séquenceur qui permet une résolution à la base gamma est d'organisation très simple, ce qui faci-
près, en utilisant le logiciel public GeneScan. lite son exploration. Sur le même principe que
84 Techniques immunologiques

Échantillon polyclonal Clone surreprésenté


Fig. 5.7  Migration des produits PCR.
Marqueur de taille en rouge, échantillon en bleu.

pour la clonalité B, il est possible, en utilisant nucléotide Cb (complémentaire du segment


quatre oligonucléotides complémentaires des constant) pour toutes les PCR. Chaque PCR
régions V et trois oligonucléotides complémen- donne lieu à une analyse de fragments. Un réper-
taires des régions J, d'amplifier la signature c­ lonale toire est ainsi représenté par 24 images qui consti-
de tous les lymphocytes T présents dans un échan- tuent un spectratype, initialement obtenu en
tillon. Il est parfois demandé des précisions sur la rendant les produits radioactifs avant migration
nature TCRαβ ou TCRγδ de la population clo- sur gel d'acrylamide, mais actuellement réalisé
nale. Pour y répondre, il est nécessaire d'analyser par migration en fluorescence comme pour une
les réarrangements des chaînes delta et bêta du analyse de clonalité (fig.  5.8). Le logiciel
TCR. Ceci n'est fait que dans quelques labora- Immunoscope a été développé initialement par
toires spécialisés. l'équipe de Philippe Kourilsky à l'Institut Pasteur,
puis largement amélioré pour intégrer les don-
Étude du répertoire lymphocytaire nées et les interpréter.
au cours de la réponse immune L'analyse du répertoire par cytométrie en flux
utilise des anticorps monoclonaux spécifiques de
La question posée est différente dans ce contexte
chacune des familles Vb. Leur utilisation permet
car on ne cherche pas à mettre en évidence une
de reconnaître 70 % des cellules T CD3+.
population tumorale unique, mais à étudier les
variations de toutes les populations lymphocy-
Modalités de mise en œuvre
taires. Il s'agit le plus souvent de populations lym-
phocytaires T alpha-bêta. Ces analyses font appel Pour être interprétable, le diagnostic de clonalité
soit simplement à la diversité du segment Vb uti- ne peut se faire que dans un tissu envahi par une
lisé dans le réarrangement (analyse en cytométrie population lymphocytaire suspecte en quantité
en flux) soit à la diversité VDJ (technique de bio- suffisante. En pathologie tumorale, ceci intervient
logie moléculaire). donc en deuxième intention, lorsque l'anatomo-
Lors de l'analyse par biologie moléculaire, le pathologiste ou le cytométriste a des doutes sur la
locus Vb est caractérisé par la grande diversité des nature clonale (tumorale) de la population. Il
segments Vb, qui peuvent être regroupés en convient d'être prudent concernant les prescrip-
24 familles Vb. Les segments Jb étant également tions d'analyse de clonalité dans le sang où le
très divers (13 oligonucléotides sont nécessaires risque d'exploitation abusive des résultats est
pour reconnaître tous les segments Jb), la tech- maximal (e.g. conclure à l'absence de lymphome
nique la plus courante consiste à utiliser comme parce que la clonalité circulante est négative, alors
matrice de l'ARN transformé en ADN complé- que la tumeur est dans la peau ou le poumon).
mentaire après transcription reverse. Ceci permet L'étude de la clonalité au cours des réponses
de réduire l'analyse du répertoire à 24 PCR : un immunitaires nécessite de connaître le contexte de
PCR par segment Vb en utilisant le même oligo- l'immunisation explorée.
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 85

PCR Vb1 - Cb

PCR Vb2 - Cb

PCR Vb23 - Cb

Fig. 5.8  Étude du répertoire Vbêta.

Avantages/inconvénients Exemples d'applications


Biologie moléculaire Cytométrie en • En recherche : ces techniques sont utilisées
flux pour analyser des variations dans les répertoires
Nécessité Oui Oui lymphocytaires T et/ou B, dans la recherche de
d'une nouveaux vaccins ou du micro-environnement
expertise tumoral. En expérimentation animale, ces
Coût élevé Non Oui méthodes permettent de monitorer la réponse
Précision sur Non (sauf à trier Oui, combinaison recherchée ou modulée.
la nature les cellules avant des anticorps • En clinique : l'analyse des variations des réper-
du répertoire analyse) anti-Vβ avec toires T et/ou B permet d'immunomonitorer la
modifié des anticorps
d'intérêt (e.g. reconstitution immunitaire post-greffe, ainsi
CD4, CD8, CD25) que l'évolution de ces répertoires sous trithéra-
Analyse Oui Non pie ou après vaccination.
rétrospective
possible
Analyse Oui Non Puces à ADN
de matériel
tissulaire fixé
(DNA microarrays)
Identification Oui : nécessite une étape Non
précise d'un de séquençage La technologie des puces à ADN (micropuces
clone pour ou microarrays) utilise les propriétés que pos-
le suivi
sède l'ADN monocaténaire (simple brin) à
86 Techniques immunologiques

reformer spontanément, par réaction d'hybrida- Hybridation génomique


tion, une structure bicaténaire (double brin) comparative sur puce (CGH array)
lorsqu'il rencontre un brin complémentaire dans
des conditions optimales de température et de Le caryotype a longtemps constitué l'approche
salinité. Le principe de la technique consiste à pangénomique exclusive permettant d'identifier
hybrider sur une micromatrice (e.g. lames de des anomalies de nombre ou de structure des
verre) recouverte de sondes (oligonucléotides chromosomes. L'hybridation chromosomique
simple brin dont la taille peut varier de 20 à grâce à l'utilisation de sondes fluorescentes
70  nucléotides) des acides nucléiques d'intérêt (Fluorescence In Situ Hybridization ou FISH) a
ou cibles (cDNA ou ADN génomique) préala- augmenté les capacités de résolution de cette
blement marqués par un fluorophore. Après approche cytogénétique et permis la recherche
hybridation, l'acquisition des signaux de fluores- ciblée d'anomalies récurrentes au sein de groupes
cence est réalisée à l'aide d'un scanner lors de de pathologies.
l'excitation des fluorophores par un laser. Les L'hybridation génomique comparative sur puce
cyanines 3 et 5 (Cy3 et Cy5) de la famille des à ADN ou Comparative Genomic Hybridization
polyméthines sont les molécules fluorescentes array (CGH array), également appelée caryotype
les plus classiquement utilisées pour le marquage moléculaire, constitue désormais le lien entre l'ap-
des acides nucléiques. proche microscopique traditionnelle représentée
Les deux champs d'application les plus courants par le caryotype ou la FISH et les techniques de
concernent les études d'hybridation génomique biologie moléculaire. Elle permet de mettre en
comparative (Comparative Genomic Hybridization évidence des anomalies chromosomiques quanti-
ou CGH) et de transcriptomique ou profil tatives (amplification ou délétion) de petite taille
d'­expression génique (Gene Expression Profile ou (20 à 30 kilobases, Kb) non visibles sur les caryo-
GEP). types conventionnels. La sensibilité de cette tech-
Plus récemment, le développement de micro- nologie varie, selon la résolution des puces
puces dédiées à l'exploration des micro-ARN utilisées, de 15 Kb (15 000 sondes) à 1 Mb (1 mil-
(miRNA) et des profils de méthylation du génome lion de sondes). Avec une densification accrue du
a étendu les capacités d'investigation de cette nombre de sondes dans les régions codantes, la
technologie. technique de CGH array permet une approche
À l'inverse des techniques ciblées, quantita- globale et hautement résolutive d'exploration de
tives mais limitées en termes de nombre de la totalité du génome.
cibles explorées, les technologies des puces à
ADN permettent des études comparatives pan-
Méthodologie
génomiques explorant plusieurs dizaines de mil-
liers de cibles simultanément en une seule La technique comprend six étapes majeures dont
expérience sur chaque puce. La plasticité de les principales sont schématisées sur la figure 5.9 :
cette technique a également permis la réalisa- 1. extraction d'ADN génomique ;
tion de puces à façon contenant un enrichisse- 2. digestion enzymatique de l'ADN génomique ;
ment en sondes pour certaines régions 3. marquage et purification ;
génomiques (CGH) ou certains gènes (trans- 4. hybridation ;
criptomique) d'intérêt. Ainsi, l'évolution et le 5. digitalisation de la puce (scanner) ;
développement de puces ciblées sur l'ensemble 6. lecture et interprétation à l'aide de logiciels
des kinases exprimées dans une cellule (kinome), dédiés.
sur l'apoptose ou sur le cycle cellulaire, ont per- L'extraction de l'ADN génomique est réalisée
mis d'appliquer cette technologie à de nouveaux suivant les techniques classiques de déprotéinisa-
champs d'exploration. tion au chloroforme et au phénol, suivies d'une

ADN
génomique
de référence
Digestion Marquage
enzymatique (Cy3, vert) 3

Mélange
1 2
équimolaire
Digestion Marquage
enzymatique (Cy5, rouge)

ADN
génomique
à explorer
Hybridation
4
Spot identifiable de compétitive
sondes identiques

Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 87


Scanner:
- Excitation des fluorochromes
5
- Capture de l’image

a) Hybridation majoritaire de l’ADN de référence = b)


délétion de la région dans le génome cible étudié
b) Hybridation majoritaire de l’ADN cible étudié = a)
amplification de la région dans le génome cible
étudié 6
c) Hybridation équilibrée entre l’ADN cible étudié et Intégration des signaux,
l’ADN de référence = absence d’anomalie dans la extraction des données
région couverte par la sonde Laser : excitation des et traduction graphique
c) fluorochromes

Fig. 5.9  Schématisation des différentes étapes de l'hybridation génomique comparative sur puce.
ADNg = ADN génomique.
88 Techniques immunologiques

précipitation de l'ADN dans l'éthanol. Il convient quage et de calculer l'activité spécifique en pmol
cependant d'obtenir une quantification précise et de cyanine/μg d'ADN. Les fragments d'ADN
une évaluation fiable de la qualité de l'ADN extrait. marqués sont purifiés par centrifugation sur mem-
La seconde étape consiste à procéder à une brane filtrante de 30 kDa, qui permet d'éliminer
digestion enzymatique de l'ADN génomique à l'excédent d'enzyme, de cyanines et de nucléo-
l'aide des enzymes RsaI et AluI (5 U/500 ng tides susceptibles d'interférer avec l'étape
d'ADN pendant 2 h à 37 °C), suivie d'une inacti- d'hybridation.
vation de ces dernières par dénaturation ther- L'échantillon d'ADN cible marqué à la Cy5
mique (20 minutes à 65 °C). La digestion permet (rouge) et l'ADN de référence marqué à la Cy3
l'obtention de fragments d'ADN génomique de (vert) sont mélangés de façon équimolaire, déna-
petite taille (200–500 paires de bases) adaptés à turés à 95°C pour l'obtention de fragments
l'hybridation. Il est essentiel de contrôler l'effica- simple brin et déposés sur la puce à ADN pour
cité de la digestion par électrophorèse microcapil- l'étape d'hybridation sur les sondes (24 heures à
laire afin de s'assurer de la digestion complète des 65°C).
échantillons, de l'absence de fragments d'ADN de Lorsque la période d'hybridation est écoulée,
haut poids moléculaire et d'une quantité d'ADN plusieurs lavages successifs dans des tampons dif-
homogène entre échantillons. férents sont nécessaires avant de pouvoir obtenir
Le marquage à la cyanine est réalisé par incor- une image digitalisée de la puce. Lors de la lecture
poration aux fragments d'ADN digérés, de déoxy- par le scanner, chaque spot est excité par un laser
nucléotides (dUTP) marqués à la cyanine (Cy3 ou et l'intensité de fluorescence est mesurée pour les
Cy5) en utilisant l'enzyme Exo(-)Klenow deux longueurs d'ondes d'excitation, 550 (Cy3)
(2 heures à 37 °C). Une étape d'inactivation ther- et 647 nm (Cy5).
mique de l'enzyme (10 minutes à 65 °C) est éga- L'intégration des signaux de fluorescence, l'ex-
lement nécessaire. L'incorporation des cyanines traction des données et leur traduction graphique
est mesurée par spectrophotométrie à micro­ (fig. 5.10) sont réalisées à l'aide de logiciels dédiés.
volume qui permet d'évaluer l'efficacité du mar- Une différence dans le nombre de copies entre

Fig. 5.10  Représentation graphique d'une aberration chromosomique (amplification du bras long du chromosome 1)
retrouvée dans les cellules CD38+/CD138+ de myélome multiple d'un patient.
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 89

l'ADN cible étudié et l'ADN de référence, pour Enfin, il est important de considérer le choix de
un locus donné, modifie le rapport d'intensité des la résolution des puces (15 K, 44 K, 60 K, 105 K,
deux fluorochromes. Les ratios de fluorescence 180 K, 244 K, 400 K ou 1 M) qui permet d'opti-
(Log2[intensité Cy5/intensité Cy3]) permettent miser le coût et les besoins analytiques.
de déterminer l'amplification ou la délétion d'une
région génique, en se basant sur la fluorescence de Avantages/inconvénients
l'ADN de référence.
Avantages Inconvénients
Contrairement au caryotype Compte tenu du principe de
Recommandations de mise en œuvre traditionnel ou à la FISH, le CGH compétition de la technique,
Le CGH array permet d'analyser des déséqui- array ne nécessite pas de notamment pour l'exploration
matériel frais ex vivo ni d'étape d'anomalies au sein de
libres quantitatifs du génome en termes de perte de culture cellulaire ni populations tumorales, il est
ou de gain. Cette technologie constitue un outil l'obtention de mitoses en essentiel de s'assurer que la
de choix pour rechercher et caractériser en une nombre suffisant population étudiée représente
Cette analyse peut être réalisée au moins 40 % de l'échantillon
seule expérience des anomalies chromosomiques
à distance du prélèvement analysé. Il ne faut pas négliger
sur l'ensemble du génome d'un individu. (plusieurs années) à partir du le recours à un tri cellulaire afin
Cependant, de nombreux paramètres peuvent moment où les ADN ont été d'obtenir un enrichissement de
interférer avec le succès du résultat de l'hybrida- correctement conservés. Elle la population cible
permet donc de procéder à des Les translocations équilibrées
tion. Les étapes de contrôle, de quantification, de études rétrospectives et des correspondant à un échange
marquage et de lavage sont essentielles et critiques échanges de matériel parfaitement conservé de
pour la validation du résultat. Un défaut de diges- interlaboratoire matériel génétique (sans perte
tion de l'un ou des deux ADN en compétition Des protocoles dédiés à ni gain) ne peuvent pas être
l'analyse de tissus fixés (FFPE) détectées par cette technologie
pour l'hybridation sur les sondes a pour effet la se développent. Du fait d'une Le coût reste actuellement élevé
génération de fragments d'ADN de trop grande fragmentation de l'ADN par le
taille, inappropriés pour l'hybridation, et fausse le processus de fixation, la
résultat. Un défaut de marquage de l'un des deux technique reste pour le moment
moins robuste que lorsqu'elle
ADN a pour conséquence une sous-estimation du est appliquée à des ADN extraits
signal. Le pH des tampons et la stringence des de tissus frais
lavages sont également critiques pour limiter le
bruit de fond lié à des hybridations inadéquates et
assurer une plus grande sensibilité. Exemples d'applications
Plusieurs jours sont nécessaires pour l'obten- • En recherche : permettant une exploration
tion d'une hybridation sur puce, cependant en complète du génome, ces techniques ont de
dehors d'une hotte chimique (ou sorbonne) et multiples applications pour la compréhension
d'un four à hybridation, les différentes étapes du fonctionnement cellulaire.
décrites ne nécessitent pas d'équipement spécia- • En clinique : dans les syndromes lymphoprolifé-
lisé et/ou coûteux. Il est donc possible de procé- ratifs, la présence ou l'absence d'anomalies
der à l'essentiel de la réalisation de la technique génomiques ont souvent une valeur pronos-
dans un laboratoire habitué à manipuler les tique importante. Dans la leucémie lymphoïde
acides nucléiques. Le passage sur le scanner pour chronique par exemple, la délétion des chromo-
l'obtention d'une image digitalisée de la puce et somes 11 ou 17 (17p avec perte du gène sup-
l'acquisition des données ne durent que quelques presseur de tumeur p53) ou des anomalies du
minutes. Le temps d'occupation du scanner étant bras long du chromosome 11 (11q23) sont de
très court, il est possible de mettre en œuvre mauvais pronostics. L'identification des gènes
cette technique dans un laboratoire indépendant présents dans les régions ciblées par ces micro-
mais pouvant bénéficier d'un accès à un parc anomalies peut également permettre une
technologique, dans le cadre de mutualisation ­meilleure compréhension du processus physio-
d'équipements. pathologique de ces proliférations.
90 Techniques immunologiques

Transcriptomique l'utilisation d'un laser excitant la molécule fluores-


cente. L'intensité de fluorescence émise est pro-
portionnelle à la quantité d'ADNc présente, et
L'analyse du transcriptome recherche l'ensemble
donc à la quantité de transcrits du gène cible ini-
des gènes exprimés (transcrits) dans une cellule et
tialement contenue dans la population cellulaire
traduit un processus dynamique, contrairement à
étudiée.
l'analyse du génome. Les techniques de transcrip-
L'analyse non supervisée du transcriptome peut
tomique mesurent les niveaux d'expression des
également être réalisée par séquençage d'une
gènes, révélés par la quantification des ARN, par
librairie de fragments d'ADNc obtenus après
exemple : ARN messagers (ARNm), micro-ARN
transcription inverse des ARN extraits à partir
(miRNA). Ces techniques peuvent permettre la
d'une population cellulaire cible. Il s'agit des tech-
caractérisation d'un tissu ou d'un type cellulaire
niques SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
défini, ou la comparaison de transcriptomes entre
et de leurs variantes. La technique RNA-Seq, déve-
différentes conditions expérimentales.
loppée plus récemment que les précédentes, utilise
directement un séquençage haut débit des ADNc.
Méthodologie
Les différentes méthodes d'analyse du transcriptome
Recommandations de mise en œuvre
nécessitent la transformation préalable des ARN en
ADN complémentaire (ADNc) par transcription Pour toutes ces techniques, la validation des résul-
inverse et, le plus souvent, leur amplification. tats nécessite la présence de contrôles internes
L'analyse du transcriptome peut être réalisée avec d'expression négative et positive. De plus, la
des techniques reposant sur les propriétés d'hybrida- notion de normalisation est importante afin de
tion de l'ADN simple brin à son brin complémen- comparer les niveaux d'expression des gènes entre
taire. En conditions contrôlées, cette hybridation est différents échantillons cellulaires. Dans la plupart
très spécifique, même en présence d'une faible des cas, un ou plusieurs gènes dont l'expression
concentration de brins complémentaires. est considérée comme invariante ou peu variante
Les analyses supervisées portent sur la quantifi- pour le ou les types cellulaires étudiés sont utilisés
cation de transcrits sélectionnés a priori. Cette pour cette normalisation. Ces gènes, appelés
analyse peut être effectuée par northern-blot ou gènes de ménage ou housekeeping genes, servent
PCR quantitative (Q-PCR simple ou multiplex), d'étalon interne et les résultats sont le plus sou-
en puits ou sur des cartes permettant la réalisation vent exprimés en valeur relative d'expression par
de 384 réactions simultanément (array cards). rapport à un échantillon de référence.
Les approches non supervisées quantifient La préparation des ARN destinés à être convertis en
simultanément l'expression de dizaines de milliers ADNc avant analyse est un point crucial et utilise dif-
de transcrits sur des puces d'expression. Ces der- férentes techniques selon ce que l'on souhaite explo-
nières sont de petits supports en verre ou en sili- rer. Ainsi, les ARNm sont repérés par leur extension
cium sur lesquels sont déposées plusieurs milliers poly-A, par exemple à l'aide de billes magnétiques
de sondes, séquences d'oligonucléotides dessinées couplées à des oligonucléotides poly-T, alors que
par le fabricant pour reconnaître le plus spécifi- les miRNA sont séparés sur la base de leur taille.
quement possible des brins d'ADNc. Ces puces Les études transcriptomiques, contrairement aux
sont mises en contact avec l'ensemble des ADNc études du protéome, peuvent être réalisées à partir
préparés, marqués avec une molécule fluores- d'une quantité faible de matériel biologique. Les
cente. L'hybridation permet la reconnaissance des techniques d'analyse non supervisée peuvent être
ADNc spécifiques appelés cibles par les sondes de mises en œuvre à partir d'une quantité d'ARN de
la puce par complémentarité et appariement. Suite l'ordre du nanogramme, et donc d'une quantité
à cette étape, la puce d'expression est lue grâce à minime de cellules. Certaines techniques per-
un scanner repérant les tandems sonde/cible fluo- mettent même d'étudier l'expression a priori de
rescents. La quantification est possible grâce à dizaines de gènes à partir d'une cellule unique
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 91

(single cell Q-PCR), amenant à la révélation de géniques, est un apport important dans la com-
sous-populations cellulaires non encore identifiées. préhension des mécanismes de cancérogenèse.
Il n'y a cependant pas de corrélation systéma-
tique entre les niveaux d'expression génique
apportés par les analyses transcriptomiques et la Polymorphismes géniques
production des protéines correspondantes. En
effet, les modifications post-transcriptionnelles Le polymorphisme est défini au niveau d'une popu-
contribuent à des variations importantes de lation par le nombre et les fréquences des allèles à
l'abondance et des caractéristiques des protéines un locus donné. Un gène polymorphe est un gène
traduites. L'analyse du transcriptome fournit ainsi présentant au moins deux formes alléliques de fré-
des informations qui nécessitent une validation, à quence supérieure ou égale à 1%, et le degré de
l'échelle protéique ou fonctionnelle. polymorphisme d'une population est défini par son
pourcentage de gènes polymorphes. Pour des
Avantages/inconvénients formes alléliques de fréquence inférieure ou égale à
Technique Q-PCR Array Puces SAGE RNA- 1%, c'est-à-dire dans la majorité des maladies géné-
cards d'expression Seq tiques humaines, on parle de cryptopolymorphisme
Analyse Oui Oui Non Non Non ou, s'agissant de pathologie, de mutation causale.
supervisée La mesure du polymorphisme fournit une estima-
Identification Non Non Non Oui Oui tion de la diversité globale entre individus d'une
de transcrits même population ou entre populations. L'analyse
alternatifs
de la diversité génétique entre populations résout
Débit Très faible Faible Haut Moyen Haut les questions phylogénétiques. Des marqueurs du
d'analyse
polymorphisme génétique sont examinés pour
Quantité de Moyenne Moyenne Faible Faible Faible
leurs associations à des pathologies.
matériel
nécessaire
Les polymorphismes et leur
Exemples d'applications utilité en immunogénétique
• En recherche : la comparaison de profils trans- Les mutations géniques qui affectent un gène dans
criptomiques est un puissant outil d'analyse l'une de ses séquences peuvent influer sur sa fonc-
pour comprendre les modifications induites par tion et retentir sur le phénotype associé. Sur le plan
des conditions expérimentales contrôlées, qu'il fonctionnel, une mutation peut s'associer à une
s'agisse de cellules en culture ou de variations à perte ou à un gain de fonction. Les marqueurs poly-
l'échelle d'un ou plusieurs organes dans des morphes de l'ADN sont des polymorphismes d'un
organismes entiers. seul nucléotide (Single Nucleotide Polymorphism ou
• En clinique : l'apport de la transcriptomique, et SNP), des polymorphismes de longueur de frag-
plus particulièrement l'analyse par puces d'ex- ments de restriction (Restriction Fragment Length
pression réalisée à partir de prélèvements tumo- Polymorphism ou RFLP) ou des polymorphismes de
raux dans les années 2000, a eu un impact fort courtes séquences répétées en tandem (microsatel-
sur la définition de sous-types de pathologies lites ou STR, pour Short Tandem Repeat), parfois
tumorales. En effet, des valeurs pronostiques des insertions/délétions.
ont pu être attribuées à des groupes de patients Les polymorphismes sont examinés pour :
de profils d'expression génique différents. C'est • mesurer la diversité génétique afin de définir
le cas par exemple pour les lymphoproliférations la  composition génétique d'une population
B matures, comme les lymphomes B diffus à (notion de fréquence allélique) ;
grandes cellules ou les lymphomes folliculaires. • rechercher l'émergence d'une mutation patho-
La technique de RNA-Seq, permettant la détec- logique (notion d'ancêtre commun dans les
tion de transcrits résultant de mutations études génétiques des populations) ;
92 Techniques immunologiques

• évaluer la susceptibilité à un phénotype patho- existe un équilibre des fréquences alléliques et


logique (notion de gène associé) ; génotypiques d'une génération à l'autre.
• identifier un gène modificateur pour une ­maladie Le polymorphisme génétique affecte la plupart
(sévérité) ou un traitement (pharmacogénétique). des gènes impliqués dans la réponse immunitaire,
Le polymorphisme sur l'ADN-Y ou l'ADN générant une susceptibilité à certaines pathologies
mitochondrial constitue le support des lignages ou des variabilités d'efficacité thérapeutique
paternels ou maternels, respectivement. (tableau  5.1). Il est particulièrement important
Les polymorphismes sont relevés sur les séquences dans le système HLA où l'ensemble des allèles aux
nucléotidiques de l'ADN génomique par des tech- différents loci constitue l'haplotype caractéristique
niques conventionnelles d'amplification PCR-SSP d'un individu.
ou PCR-RFLP ou par séquençage direct.
Pour toutes les applications en immunogéné-
tique bi-allélique, le modèle Hardy-Weinberg est Exemples d'applications
introduit, le cycle vital considérant deux sexes • En recherche : la recherche des polymorphismes
séparés entre les stades adultes reproducteurs de peut permettre d'expliquer certaines variations
deux générations successives et postulant qu'il de résultats expérimentaux.

Tableau 5.1  Exemples de polymorphismes hors HLA associés à des dysfonctions de l'immunité


Protéine Gène(s) Type de poly- Association pathologique
morphisme
Complément C4 C4A SNP C4AQo et/ou C4BQo marqueurs de susceptibilité aux
C4B maladies à complexes immuns
Facteur H CFH SNP Variant Y402H : susceptibilité à la dégénérescence
maculaire liée à l'âge
Récepteur CR1 CR1 HindIII RFLP Génotype L/L associé à une faible réponse à l'éculizumab,
anticorps monoclonal dirigé contre la fraction C5 du
complément
Mannan binding lectin (MBL) MBL2 SNP Variants R52C, G54D et G57E associés à la susceptibilité
aux infections méningococciques
Récepteurs Récepteur FcγRIIb (CD32) FCGR2B SNP Variants −343C et I232T : susceptibilité au lupus
au Fc des IgG érythémateux systémique
Récepteur Fc short tandem FCGR3A SNP Variant V158F associé à une faible réponse au rituximab
repeat RIIIa (CD16) (anti-CD20) et à l'infliximab (anti-TNF)
Récepteur Fc short tandem FCGR3B SNP Variants R36S, N65S et D82N : susceptibilité à la
repeat RIIIb (CD16, antigène neutropénie allo-immune du nouveau-né
du neutrophile HNA-1/2)
Cytokines TNF-α TNFA SNP Variant A308 allèle de susceptibilité au syndrome de
Löfgren
SNP Variant T857 allèle de susceptibilité à la sarcoïdose
Microsatellite 5 long tandem repeats (LTR) identifiés comme marqueurs
de susceptibilité à la polyarthrite rhumatoïde
Récepteur au TNF de type 1 TNFRSF1A SNP Variant rs1800693 (intron 6) associé au risque de sclérose
en plaques
Récepteur au TNF de type 2 TNFRSF1B SNP Variant M196R associé à une bonne réponse thérapeutique
aux antagonistes du TNF-α
IL-28B IFNL3 SNP Variant C/C rs12979860 (séquence 5′) associé à une bonne
réponse au traitement de l'hépatite C par interféron–
ribavirine et à une clairance naturelle du VHC
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 93

• En clinique : l'étude du polymorphisme géné- in vivo, du type de cellule utilisée et de l'objectif


tique s'applique aux activités enzymatiques, de l'expérimentation. Les cellules utilisées peuvent
avec perte ou gain de fonction, aux fonctions être des procaryotes ou des eucaryotes, des cel-
immunologiques, avec les modifications asso- lules primaires, des lignées cellulaires, des cellules
ciées pouvant affecter l'efficacité d'une théra- immunitaires, des cellules issues d'autres organes
peutique ciblée (pharmacogénétique) ou la (e.g. rein). Le transgène doit d'abord être extrait
protection vis-à-vis d'une infection, ainsi qu'aux ou construit. Cette construction peut être très
polymorphismes de l'ADN en déséquilibre de sophistiquée et associer au gène d'intérêt un ou
liaison à des gènes de causalité. plusieurs autres gènes. Par exemple, le gène
codant pour une protéine fluorescente, la green
fluorescent protein (GFP), permet de repérer
Transfections cellulaires/ visuellement ou en cytométrie en flux les cellules
expression conditionnelle ayant intégré le transgène. Les constructions
peuvent aussi contenir des gènes induisant une
Transfections cellulaires d'ADN résistance aux antibiotiques qui permettent
ensuite de sélectionner les cellules transfectées en
La transfection est une procédure qui permet ajoutant cette molécule au milieu de culture. Il est
l'introduction d'acides nucléiques étrangers également possible d'inclure des gènes suicides,
dans des cellules. Cet outil est utilisé pour qui permettent de détruire in  vivo les cellules
l'étude de la fonction des gènes, de leur régula- transfectées si elles deviennent inutiles ou dange-
tion et de leurs produits, les ARN messagers et reuses, par exemple en administrant du ganciclovir
les protéines. aux animaux ou aux patients après transfection
On distingue deux types majeurs de transfec- cellulaire de la thymidine kinase (TK). Enfin, des
tions. Une transfection dite stable introduit le systèmes encore plus précis permettent de condi-
matériel génétique dans le génome de l'hôte et tionner l'expression du transgène à son intégra-
l'expression du transgène est maintenue même tion dans certains types cellulaires ou à des
lorsque les cellules transfectées se répliquent. À conditions spécifiques d'activation en fonction
l'inverse, les gènes transfectés de façon transitoire d'un promoteur inclus dans la construction. Les
sont exprimés pour une période de temps limitée recombinases Cre sont particulièrement utilisées
et ne sont pas intégrés dans le génome. Le choix dans ce cas. Les techniques biologiques impliquent
de la transfection stable ou transitoire dépend de l'insertion de la construction à transfecter dans un
l'objectif de l'expérience. vecteur d'expression, le plus souvent un virus. On
La transfection permet de produire des pro- parle alors de transduction. Les techniques
téines recombinantes dans des cellules de mam- chimiques reposent sur la composition cationique
mifères ou de procaryotes. C'est aussi un outil du milieu dans lequel est placé l'ADN à transfec-
fin pour augmenter ou inhiber l'expression d'un ter. L'ADN est alors inclus dans un complexe
gène ciblé dans des cellules spécifiques et analy- chargé positivement, attiré par la surface chargée
ser son rôle. Il est également possible d'étudier négativement des membranes cellulaires. Les
la localisation intracellulaire des protéines techniques physiques ciblent directement la ou les
codées par le transgène et les conditions de leur cellules à transfecter. Il peut s'agir d'une injection
adressage. directe, de l'utilisation de particules recouvertes
d'ADN propulsées de manière ballistique (on
parle de fusil/pistolet à gène ou gene gun), ou de
Méthodologie
rayons laser pulsés formant de petits pores dans la
De nombreux procédés de transfection ont été membrane par lesquels l'ADN peut pénétrer dans
développés reposant sur des méthodes biolo- le cytosol. Enfin, une des techniques les plus utili-
giques, chimiques ou physiques. La technique est sées se sert du courant électrique pour réaliser une
choisie en fonction de son utilisation in vitro ou électroporation.
94 Techniques immunologiques

Recommandations de mise en œuvre Exemples d'applications


La technique idéale doit avoir une efficacité de • En recherche : de nombreux modèles expéri-
transfection élevée, une faible toxicité cellulaire, mentaux reposent sur l'introduction de
des effets minimes sur la physiologie normale, être matériel génétique dans des lignées cellu-
spécifique, facile à utiliser et reproductible. laires ou des cellules souches embryonnaires
L'utilisation de vecteurs viraux soulève la ques- pour générer des animaux transgéniques. Un
tion de leur potentiel infectieux ou tumorigène, exemple est l'introduction du gène de CD5
qui doit être contrôlé en manipulant aussi le dans des cellules B de la lignée Daudi pour
génome viral. Ils sont également susceptibles d'in- mimer des cellules CD19+/CD5+ tumorales
duire des réponses immunitaires potentiellement (LLC, lymphome du manteau).
délétères pour la transfection envisagée. • En clinique : des lymphocytes T transfectés
L'intégration des gènes apportés par le virus se fait pour exprimer un récepteur pour l'antigène
de façon aléatoire dans le génome et peut avoir (TCR) chimérique spécifique d'antigènes cellu-
des effets inattendus comme l'inhibition de gènes laires (e.g. CD19) sont utilisés pour cibler des
suppresseurs de tumeurs, l'arrêt de la transcription cellules tumorales. On parle de récepteurs
de gènes importants pour le fonctionnement cel- chimériques ou chimeric antigen receptor
lulaire, l'activation d'oncogènes. (CAR).
Les méthodes chimiques et physiques peuvent
être toxiques pour les cellules.
La transfection d'ARN
Avantages/inconvénients Il est également possible de transfecter directe-
ment des ARN messagers dans les cellules. Les
Méthodes Avantages Inconvénients avantages de ce procédé par rapport à la trans-
Biologiques : Très efficaces Difficiles à fection d'ADN sont nombreux. Il supprime le
Vecteurs viraux, par Faciles à utiliser construire risque d'intégration dans le génome de l'hôte.
exemple adénovirus, Utilisables in vivo Risque de mutation
virus adéno-associés insertionnelle
L'efficacité de la transfection est indépendante
(AAV pour Immunogénicité si du cycle cellulaire. Il n'est pas nécessaire d'uti-
adeno-associated utilisation in vivo liser un vecteur potentiellement immunogène.
virus), virus de la Taille limitée de L'expression est rapide et ajustable en modi-
vaccine, lentivirus l'ADN à transfecter
fiant la quantité d'ARNm transfectée et la fré-
Chimiques : Très efficaces Efficacité variable quence de transfection. Enfin, les ARNm
– polymères Faciles à utiliser selon les types
cationiques : Applicables à des cellulaires transfectés sont exprimés en quelques minutes
DEAE-dextran, tissus Toxicité pour car ils ne nécessitent pas de passage par le noyau
polyéthylèneimine, Pas de limite de certaines cellules et la transcription.
dendrimères, taille pour le
La découverte que des petites molécules d'ARN
polybren transgène
– phosphate de peuvent régir la stabilité et/ou la traduction de
calcium l'ARN messager, et par conséquent la synthèse des
– lipides cationiques : protéines, a révélé un nouveau niveau de régula-
lipofectine,
lipofectamine
tion post-transcriptionnelle. Les microARN
(miARN ou miRNA) sont de petits ARN non
Physiques : Principe simple Nécessite une
– injection directe par Faciles instrumentation codants qui régulent l'expression des gènes après
micro-aiguille d'utilisation adaptée leur transcription en s'appariant à des séquences
– inoculation par in vivo complémentaires dans les régions non traduites en
particules ballistiques 3′ des ARNm cibles. Ils font partie du réseau
– électroporation
– laser pulsé d'ARN modulateurs qui jouent un rôle central
– nanoparticules dans le fonctionnement des cellules. Les études
magnétiques fonctionnelles indiquent que les miARN sont
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 95

impliqués dans la régulation de presque toutes les des compartiments cellulaires précis comme des
voies biologiques et que leurs changements d'ex- axones ou des dendrites, ou dans des organelles
pression sont associés à plusieurs pathologies comme les mitochondries, l'appareil de Golgi,
humaines, dont les cancers et les maladies auto- ou le noyau. La transfection, de façon sûre et
immunes. En ciblant les oncogènes et les gènes fiable, dans un organisme entier ouvre des pers-
suppresseurs de tumeurs, les miARN ont la capa- pectives thérapeutiques importantes dont les
cité de moduler les processus cellulaires clés qui premières applications commencent à se faire
définissent le phénotype de la cellule, ce qui en fait jour.
des outils thérapeutiques très prometteurs. • En clinique : plusieurs essais thérapeutiques ont
été développés en utilisant l'interférence ARN
Méthodologie pour traiter des cancers, des infections virales ou
L'interférence d'ARN (ARNi ou RNAi) est un des anomalies génétiques.
outil puissant pour induire l'inactivation spéci-
fique d'un gène et en observer les conséquences
phénotypiques. Deux voies peuvent être utilisées Protéomique
pour obtenir des ARNi dans une cellule. La pre-
mière consiste à introduire directement de l'ARN Sont rapportées ici les grandes lignes méthodo­
synthétique dans le cytoplasme sous forme de logiques nécessaires aux études des protéomes, à
duplex, le plus souvent à l'aide de polymères lipi- savoir les électrophorèses mono- ou bidimension-
diques. On parle de petits ARN interférents nelles, la digestion sur gel et l'identification et
(siARN ou siRNA, pour small interference RNA). caractérisation des protéines par spectrométrie de
La seconde consiste à construire une cassette d'ex- masse (mass spectrometry ou MS).
pression dans le noyau, le plus souvent par infec- Il est reconnu qu'il n'existe pas toujours, dans
tion virale. Ses produits sont ensuite exportés dans une cellule, une corrélation exacte entre la quan-
le cytoplasme sous forme d'ARN en épingle à che- tité d'ARNm et l'abondance des protéines corres-
veux (shARN ou shRNA, pour short hairpin pondantes. À la simple traduction de l'ARNm
RNA) ou de pré-miARN. Les ARN interférents s'ajoutent des mécanismes de modification post-
forment des complexes capables d'inhiber la for- traductionnelle susceptibles de contrôler le taux
mation des produits d'expression des gènes (pro- de synthèse, la demi-vie et la fonctionnalité des
téines), on parle de RISC pour RNA-Induced protéines. Il est donc important de pouvoir com-
Silencing Complex. pléter les données de génomique et de transcrip-
tomique par une étude de l'ensemble des protéines
Avantages/inconvénients ou protéome.
Ce concept de protéome a été introduit par
Avantages Inconvénients Wilkins en 1994 lors de la première édition de la
Pas d'intégration au génome Fragilité des ARN conférence sur l'électrophorèse bidimensionnelle
Transfection indépendante du Sensibilité aux RNAses (2D). Le premier rapport faisant référence à la
cycle cellulaire Interférence avec les réseaux de
Pas de vecteur immunogène régulation des ARN protéomique est apparu en 1995. La protéo-
Expression rapide mique désigne l'étude du protéome comme l'en-
semble des protéines présentes dans une cellule,
un tissu, un organe ou un organisme. La protéo-
Exemples d'applications mique est une étude dynamique, car un génome
• En recherche : les technologies de transfection peut conduire à différents protéomes en fonction
se sont beaucoup développées et sont à l'origine des étapes du cycle cellulaire, de la réponse à dif-
de multiples travaux ayant permis d'élucider le férents signaux biologiques ou d'états physiolo-
fonctionnement cellulaire. Dans le futur, il est giques/pathologiques variés. En pratique, la
envisagé de pouvoir délivrer des acides protéomique s'attache à identifier et caractériser
nucléiques étrangers (surtout des ARN) dans les protéines extraites d'un organe, d'un tissu,
96 Techniques immunologiques

d'une cellule ou d'un fluide biologique. Elle vise comme le CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)
aussi à définir leur localisation subcellulaire et leur dimethylammonio]-1-propanesulfonate) et/ou
rôle biologique, ainsi que les interactions pro- non ioniques (Triton® X100), afin d'aider à la
téines–protéines, protéines–ADN ou protéines– solubilisation et de prévenir la précipitation des
ARN. La spectrométrie de masse est devenue la protéines extraites. Des inhibiteurs de protéases
méthode de choix pour les études protéomiques sont également ajoutés ainsi que des inhibiteurs
grâce au développement des méthodes d'ionisa- de phosphatases. L'extrait protéique est concentré
tion douce telles que la désorption laser assistée par précipitation à l'acétone ou à l'acide trichlo-
par matrice6 (Matrix Assisted Laser Desorption/ roacétique glacial. Après centrifugation, le culot
Ionization ou MALDI) et l'électronébulisation protéique est solubilisé et les protéines quanti-
(Electrospray Ionization ou ESI). fiées. Pour une analyse par électrophorèse 1D- ou
2D-SDS-PAGE, environ 40 à 50 μg de protéines
sont mélangées avec du glycérol (10 %) dans le
Protéomique conventionnelle tampon d'électrophorèse. La séparation des pro-
Méthodologie téines par électrophorèse 1D se fait en conditions
dénaturantes, l'ouverture des ponts disulfures
Une analyse protéomique par spectrométrie de étant réalisée par les conditions réductrices et le
masse, réalisée par une approche bottom-up ou par SDS qui se fixe sur les protéines, les dénature et
une approche top-down, est composée des princi- leur confère des charges négatives masquant les
pales étapes suivantes : charges de la protéine native. La séparation se fait
• préparation des échantillons par extraction des alors uniquement en fonction de la masse molécu-
protéines à partir de la matrice biologique et laire. La résolution de la migration est obtenue en
décomplexification des extraits par séparation modifiant la taille des pores du gel par la concen-
des protéines sur gels d'électrophorèse tration en acrylamide (10 à 15 %) ou le pH du
(1D-/2D-SDS-PAGE pour 1 Dimension/2 tampon d'électrophorèse. L'analyse sur un gel 2D
Dimensions Sodium Dodecyl Sulfate- combine une isoélectrofocalisation (IEF) dénatu-
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) ou par chro- rante et une électrophorèse SDS-PAGE. La pre-
matographie liquide (LC) ; mière dimension est une migration horizontale en
• incorporation des protéines à une matrice pour fonction du point isoélectrique (pI) des protéines.
analyse par MALDI ou séparation par chroma- Cette séparation se fait sur des bandelettes de gel
tographie liquide, couplée ou non à une source présentant des gradients de pH immobilisés (pH
ESI, puis spectrométrie de masse simple ou 3–10). Après cette migration, les protéines sont
combinée (MS et MS/MS pour Tandem Mass regroupées en fonction de leur pI. Elles sont sépa-
Spectrometry) ; rées une seconde fois orthogonalement en fonc-
• interprétation des données : identification, tion de leur masse moléculaire par un SDS-PAGE.
caractérisation ou quantification (fig. 5.11). Les gels sont colorés (e.g. bleu de Coomassie, bleu
La première étape consiste à enrichir l'extrait colloïdal, nitrate d'argent, fluorophore).
en protéines par l'intermédiaire d'une solution de Pour la deuxième étape, après excision des
solubilisation (tampon de lyse) adaptée à l'électro- bandes de gel 1D ou des spots de gels 2D,
phorèse sur gel ou à la séparation par chromato- la(les) protéine(s) est(sont) hydrolysée(s) en
graphie liquide. Ce tampon de lyse est composé fragments peptidiques par la trypsine. Après
d'un agent dénaturant/chaotropique (e.g. urée réduction par le dithiothréitol (DTT) et alkyla-
et/ou thiourée), de détergents zwitterioniques tion des résidus cystéine par l'iodoacétamide, la
trypsine est insérée dans les morceaux de gel par
déshydratation avec de l'acétonitrile et réhydra-
6
  Les trois principales matrices pour les protéines sont
l'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (4HCCA), tation dans le tampon de trypsinolyse : 25 mM
l'acide sinapinique (SA) et l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque (NH4)2CO3. Après une nuit à 37°C, les frag-
(DHB). ments trypsiques sont extraits du gel (e.g. 50 à

Échantillon Extraction Extrait protéique

PROTÉOMIQUE BOTTOM - UP
Séparation des protéines 1D-SDS-PAGE 2D-SDS-PAGE Bandes de gels 1D Spots de gels 2D

Digestion sur bandes ou spots Extraction et préfractionnement (SPE*) Peptides

* extraction en phase solide

Séparation des peptides 1D-, 2D-nano-LC & MS - MS/MS Spectres de masse (MS et MS/MS)

Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 97


Séquençage direct de la LC-MALDI-MS/MS, LC- ESI-MSn Spectres de masse (MS et MS/MS)

TOP-DOWN
protéine

Identification Caractérisation Analyses bio-informatiques Graphes statistiques, ontologie, PCA, etc.

Fig. 5.11  Paradigme de la protéomique bottom-up et top-down.


PCA : Principal Component Analysis.
98 Techniques immunologiques

70% d'acétonitrile en milieu acide). Le mélange en mode d'acquisition données-dépendant


peptidique peut être fractionné par nanochro- (DDA), soit en mode d'acquisition données-
matographie en veine liquide (nano-LC) 1D ou indépendant (DIA). Les fragments obtenus expé-
2D avant analyse en spectrométrie de masse. Il rimentalement sont comparés à des masses, issues
peut également être analysé directement, après de la digestion théorique in silico des protéines,
incorporation à la matrice sélectionnée, en présentes dans les banques de séquences et de la
MALDI-MS ou MALDI-MS/MS (ce qui ajoute fragmentation théorique des peptides associés
une dimension de caractérisation structurale) (e.g. bases Sequest, Mascot, OMSSA, X !tandem).
pour définir une empreinte massique (MALDI- Il existe de nombreux moteurs de recherche pour
TOF pour le mode linéaire et MALDI-TOF/ l'analyse des données de protéomique basée sur
TOF pour le mode réflectron sur des peptides une approche dite d'empreinte de fragmentation
< 4–5 kDa pour une résolution optimale) repré- massique (Peptide Mass Fingerprinting ou PMF).
sentative de la(des) protéine(s) digérée(s). Cette Chacun présente ses spécificités et ses critères de
approche est dite bottom-up. Par opposition, score, de qualité, de similitudes entre les données
une approche top-down est utilisée lorsque l'on expérimentales et les données théoriques issues
s'attache à l'identification d'une protéine des banques criblées.
entière sans digestion enzymatique préalable.
Le mélange peptidique est alors analysé par Recommandations de mise en œuvre
MALDI-MS ou MALDI-MS/MS pour définir Les analyses protéomiques sont sensibles aux
une empreinte massique représentative de contaminations par les kératines, omniprésentes
la(des) protéine(s) digérée(s). Il peut également sur les cheveux et la peau. Il est donc nécessaire
être fractionné par nanochromatographie en de manipuler en portant des gants à usage unique,
veine liquide (nano-LC) 1D ou 2D avant ana- une charlotte, un masque et une blouse. Les
lyse en spectrométrie de masse. La séparation contrôles positifs et négatifs sont importants afin
1D-nano-LC se fait par chromatographie de minimiser les risques de faux positifs et de faux
liquide HPLC (High Performance Liquid négatifs pour les analyses protéomiques différen-
Chromatography) en phase inverse ou Reversed- tielles. Une protéine comme la sérum-albumine
Phase (RP de type C4, C8, C18), alors qu'en bovine peut être utilisée comme contrôle positif
2D une première dimension d'enrichissement parmi les échantillons afin de monitorer les diffé-
par échange d'ions (cations) ou affinité est sui- rentes étapes, de l'enrichissement à la digestion
vie d'une RP-nano-HPLC. Les fractions sont enzymatique des bandes de gels. À titre de
éluées par un gradient d'acétonitrile en milieu contrôle négatif, une bande de gel non colorée
acide (0,1 % TFA si LC-MALDI-MS ou peut être prélevée et traitée comme une bande
MALDI-MS/MS, 0,1 % acide formique si d'intérêt. Ceci permet de vérifier une éventuelle
LC-ESI-MS/MS). contamination durant la préparation du gel et les
La troisième étape, d'identification et de étapes de digestion. Il est souhaitable de laver
caractérisation des protéines, se fait par analyse l'ensemble des consommables (tubes, cônes) et
MS et MS/MS sur des équipements présentant les pipettes par de l'eau acidifiée (0,1 % acide tri-
différentes géométries. Il existe cinq types d'ana- fluoroacétique ou formique), puis par de l'acéto-
lyseurs utilisant le temps de vol (time of flight ou nitrile à 50 % et de les sécher à l'alcool. Cette
TOF) des ions, une trappe ionique, un quadru- précaution minimise les risques de contamination
pôle, la spectrométrie de masse à transformée de par les kératines. La découpe de spots ou bandes
Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron de gels 2D ou 1D doit être soigneuse car ce
Resonance ou FT-ICR) ou un orbitrap (trappe carottage peut être extrêmement variable d'une
ionique couplée à un piège à ions). Ces instru- bande ou d'un spot à l'autre, d'un gel à l'autre et
ments sont équipés de sources d'ionisation de même au sein d'une même bande de gel. Il en
type MALDI ou ESI. L'acquisition des spectres résulte un risque élevé de variabilité et donc de
de fragmentation (MS/MS, voire MSn) se fait soit faux positifs ou de faux négatifs (tableau 5.2).
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 99

Exemples d'applications biomolécules, telles que des peptides et des


Le séquençage et l'annotation du génome de la protéines, au sein même de tissus. Contrairement
drosophile ont été achevés en 2000. Alors que les à la protéomique conventionnelle dans laquelle
analyses génomiques et transcriptomiques engen- l'information spatiale est perdue, l'imagerie
draient une somme croissante d'informations sur MALDI offre la possibilité de corréler la masse
les séquences et sur l'expression des ARNm, moléculaire et l'abondance relative de protéines
aucune donnée protéomique relative à la réponse ­recensées en spectrométrie de masse avec la
immunitaire de la drosophile n'était publiée. Afin localisation de ces informations au sein même
d'analyser cette réponse à différents agents infec- du tissu. Il est ainsi possible de repérer en
tieux (champignons, levures, bactéries par ­histologie ou en immunohistologie des groupes
exemple), une étude protéomique différentielle a de cellules d'intérêt (jusqu'à une vingtaine) et
été menée (fig. 5.12). d'en cartographier les peptides/protéines par
une analyse par MS/MS avec ou sans digestion
enzymatique, directement à partir de la zone
Protéomique et imagerie MALDI d'intérêt.

L'objectif est ici de décrire les principes de l'étude


Méthodologie
protéomique par imagerie moléculaire ou « histo-
protéomie moléculaire  » par spectrométrie de Dans sa composante la plus classique, la procédure
masse (MS) et désorption laser assistée par matrice d'imagerie MALDI est résumée sur la figure 5.13.
(imagerie MALDI). Les tissus prélevés sont congelés ou fixés et inclus
L'imagerie MALDI a émergé à la fin du en paraffine, la congélation étant préférée. Des
xx e siècle. Elle permet de rechercher, d'identi- coupes sont ensuite réalisées à l'aide d'un micro-
fier et de réaliser une quantification relative de tome. Chaque coupe est déposée sur un support

Tableau 5.2  Avantages et limites des techniques protéomiques bottom-up et top-down


Bottom-up Top-down
Avantages Approche mature Permet d'identifier et de localiser les PTMs sur les
Adaptée aux grosses protéines protéines
Permet l'étude des protéines membranaires Observation de la protéine sur plusieurs états de
Études quantitatives possibles avec des tags d'affinité ou des isotopes charge
stables Précision de la mesure
Études différentielles possibles Bon recouvrement
Analyses haut débit Moindre sensibilité aux contaminations
Couplage LC-ESI-MS/MS
Analyses sur des mélanges complexes
Gels commerciaux précoulés
Méthodes de coloration variées
Large gamme de gels d'isofocalisation
La digestion trypsique génère des fragments chargés positivement
Limites Limitée aux protéines de plus de 10 kDa Approche récente
Identification d'isoformes difficile Protéines isolées
Perte d'informations (localisation, présence de PTMs) Protéines solubles
Faible couverture de séquence Taille de la protéine
La coloration à l'argent diminue le rendement d'extraction des Instrument de haute résolution de 100 000 à
fragments de digestion 500 000 m/Δm*
Perte de fragments trypsiques Techniques de fragmentation multiples : CID, ETD,
Parc instrumental coûteux ECD**
Difficulté du carottage (spots/bandes), faux positifs et faux négatifs Environ une dizaine de protéines identifiées par
Attention aux contaminations (kératine) expérience
* m/Δm ou FWHM pour Full Width at Half Maximum peak height désignant la largeur du pic à 50 % de sa hauteur maximale.
** CID : Collision-Induced Dissociation ; ETD : Electron Transfer Dissociation ; ECD : Electron Capture Dissociation.
100
Techniques immunologiques
Fig. 5.12  Exemple d'analyse protéomique bottom-up de la réponse immunitaire de la drosophile (avec et sans marquage isotopique).
L'analyse différentielle consiste à comparer les protéines contenues dans le sang de drosophiles avant et après une infection microbienne.
L'inductibilité de la réponse immunitaire chez la drosophile suite à une infection microbienne a été mise à profit dans cette étude.
A. Cartes 2D colorées au bleu de Coomassie colloïdal. Infection par : un champignon (A1) ; une bactérie G + (A2) ; une bactérie G− (A3).
B. Diagramme de Venn représentant la répartition du nombre de spots régulés en fonction de l'agent infectieux.
C. Identité de quelques protéines dont l'abondance varie en fonction de l'agent infectieux.
D. Deuxième analyse protéomique menée avec un marquage isotopique différentiel ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) en solution, digestion
enzymatique, prépurification car chromatographie d'affinité et séparation des fragments peptidiques par LC-ESI-MS/MS.

Coloration histologique

Lame de verre ITO Image (histologique/MS)

Lavage
± digestion

Cryosection Étapes de lavage Ajout de matrice Analyse MALDI Cartographie MS


(ImagePrep)

Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 101


Tissu congelé
(azote liquide)

Étape 1 Étape 2 Étape 3 Étape 4 Étape 5 Étape 6


échantillonnage et préparation des ± digestion sur application de la analyses traitement des
congélation coupes coupe et lavage matrice MALDI-MSI données

Fig. 5.13  Déroulé expérimental de l'approche d'histoprotéomie moléculaire par imagerie MALDI (six étapes fondamentales).
Étape 1 : collecte de l'échantillon et cryoconservation. Étape 2 : préparation au cryomicrotome de la coupe histologique déposée sur une lame conductrice ITO (oxyde
d'indium étain). Étape 3 : digestion enzymatique optionnelle, puis lavage de la coupe en particulier pour éliminer les lipides. Étape 4 : application de la matrice
(nébulisation ou goutte). Étape 5 : analyses par MALDI en mode linéaire positif ou négatif. Étape 6 : traitement des données (cartographie et statistiques) et rendu des
images.
102 Techniques immunologiques

conducteur puis délipidée par passage dans des support compatible avec les sources MALDI uti-
bains successifs de solvants organiques (e.g. étha- lisées. Il est préférable que le support soit
nol, chloroforme, hexane, isopropanol) avec ou conducteur pour ne pas altérer les champs élec-
sans digestion enzymatique préalable par la tryp- triques en source. Les conditions de dépôt de la
sine. Après déshydratation et séchage sous vide (20 matrice doivent être adaptées en fonction de
min), l'extraction sans délocalisation peut être réa- l'échantillon. Dans le cas d'une analyse directe de
lisée directement à cette étape en déposant la tissus, des spots discrets de matrice peuvent être
matrice sur la coupe sous atmosphère contrôlée, réalisés soit par l'intermédiaire d'une micropi-
afin de permettre l'ionisation et l'acquisition des pette, soit par l'utilisation d'un appareil de
spectres de masse (> 500 Da). Les données sont microdépôt automatisé. Pour la réalisation d'une
acquises en mode linéaire positif/négatif pour image entière, la coupe de tissu doit être entière-
l'identification du peptidome/protéome. En cas ment recouverte de matrice soit à l'aide d'une
de caractérisation structurale, des analyses complé- micropipette, soit par vaporisation par un spray
mentaires en mode réflectron positif sont effec- pneumatique. La méthode de microdépôt est de
tuées. Suite à l'acquisition des données par plus en plus utilisée pour minimiser la délocalisa-
MALDI-MSI (Mass Spectrometry Imaging), la tion des molécules pouvant être entraînées par
matrice est lavée de la surface de la coupe afin d'ef- les solvants. Le choix de la matrice (tableau 5.3)
fectuer une coloration histologique. Dans les est important pour optimiser l'analyse des com-
spectres acquis par imagerie MALDI, l'intensité posés en termes de nombre de molécules détec-
des signaux est matérialisée par une échelle de cou- tées, de résolution des pics, d'intensité du signal
leur superposée à la coupe histologique numérisée. et de la gamme de masse accessible. Dans le cas
Ces spectres sont analysés par des logiciels spéciale- d'une identification, les analyses sont effectuées
ment développés pour l'imagerie afin de fournir en mode automatique linéaire positif. Le mode
une étude statistique des données acquises par ana- négatif peut être envisagé dans des cas très parti-
lyse en composantes principales (APC) ou culiers de recherche de phosphopeptides. Le
Principal Component Analysis (PCA). L'analyse est mode réflectron positif est utilisé lorsque la
effectuée en mode non supervisé afin de créer des coupe de tissu a subi un traitement par digestion
groupes de spectres représentatifs des ions molécu- trypsique afin d'obtenir la caractérisation des
laires dans la région choisie de la coupe. Dans le cas peptides/protéines. Le temps d'analyse est un
où des régions histologiques distinctes sont carac- facteur limitant pour l'acquisition des spectres.
térisées sur une coupe, une analyse supervisée peut Ce temps dépend de la fréquence des tirs laser,
être réalisée dans les différentes zones d'intérêt. de la rapidité de déplacement du support pen-
Une classification (hierarchical clustering) de l'en- dant l'analyse et du temps d'acquisition de l'élec-
semble des ions détectés sur une coupe histolo- tronique. L'utilisation de lasers pouvant atteindre
gique par imagerie MALDI permet de détecter des de grandes fréquences de répétition est particu-
peptides/protéines partageant une localisation lièrement souhaitable (200–1000 Hz) et permet
commune au sein d'une coupe histologique. La de prévenir la dégradation de l'échantillon. La
corrélation entre les images MALDI et les colora- reproductibilité du déplacement de la cible sup-
tions histologiques permet la r­econstitution de port des lames est un paramètre important pour
cartes peptidiques/protéiques tridimensionnelles. la qualité des images. La résolution spatiale de
l'image reconstruite est dépendante du nombre
Recommandations de mise en œuvre de points d'acquisition. La distance entre deux
La congélation des pièces histologiques à analy- points doit être au minimum égale au diamètre
ser se fait suivant une procédure adaptée à l'ima- du faisceau laser. De nombreux paramètres
gerie MALDI avec un contrôle précis peuvent affecter la reconstruction de l'image,
(température et durée) de la congélation et de la notamment le traitement des données avant
conservation des pièces étudiées. Les coupes de extraction (e.g. lissage, soustraction du bruit de
5  à 20 μm d'épaisseur sont transférées sur un fond, filtrage).
Chapitre 5. Techniques de biologie moléculaire 103

Tableau 5.3  Matrices utilisées pour l'imagerie MALDI


Matrice Nom complet Biomolécules Aspect de la cristallisation
CHCA α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Peptides/polypeptides (< 20 kDa) Homogène petits cristaux
++
CHCA/ANI α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Peptides/polypeptides (< 20 kDa) Homogène petits cristaux
+ aniline +++
DHB 2,5-dihydroxybenzoic acid Peptides/polypeptides (< 20 kDa) Peu homogène gros cristaux
Drogues, lipides ---
DHB/ANI 2,5-dihydroxybenzoic acid Peptides/polypeptides (< 20 kDa) Homogène
+ aniline Drogues, lipides Faible désorption des protéines
+
DHB/3-AP 2,5-dihydroxybenzoic acid Peptides/polypeptides (< 20 kDa) Homogène
+ 3-acetyl pyridine Srogues, lipides Faible désorption des protéines
+
SA 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnaic Protéines (> 10 kDa) Irrégulière
acid Gros cristaux
--
SA/ANI 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnaic Protéines (> 10 kDa) Homogène
acid + aniline +++
SA/3-AP 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnaic Protéines (> 10 kDa) Homogène
acid + 3-acetyl pyridine +++

Exemples d'applications hépatocellulaire. Dans l'exemple montré en


À l'ère des omiques, l'imagerie MALDI ouvre de figure 5.14, un modèle d'inflammation hépatique
nouvelles perspectives à la protéomique appliquée chez la souris a été utilisé pour mettre en place la
en médecine et en biologie. À ce titre, l'imagerie procédure méthodologique avant d'entamer
MALDI peut être utilisée pour la recherche de l'étude sur des biopsies de foie humain.
marqueurs de pathologies comme le carcinome
104
Coloration hématoxyline

Techniques immunologiques
m/z 2101

Coupe de foie
m/z
1005 Fusion des
deux données

Fusion des deux


données m/z 14566
Coloration
hématoxyline

m/z 5135

0% 100 %
Échelle d’intensité des ions par imagerie MALDI
Fig. 5.14  Exemple d'analyse par imagerie MALDI.
Des coupes histologiques de foie de souris, avec un intérêt particulier sur les zones d'infiltration lymphoïde, sont analysées en MALDI-MSI afin d'effectuer
un regroupement (clusterisation) des peptides et protéines exprimés. Une échelle d'intensité des abondances relatives de chacun des ions moléculaires des peptides
et protéines (m/z) est exprimée par un gradient de couleur à travers la zone d'analyse afin de générer une image moléculaire.
Chapitre 6
Tests cellulaires

Étude cytologique Au milieu du xxe siècle, la découverte du prin-


des cellules immunitaires cipe Coulter7 a conduit au développement de
compteurs automatiques plus ou moins miniaturi-
sés. Certains sont également capables d'établir la
Le décompte et l'analyse microscopique des cel- viabilité cellulaire. L'avènement de la cytométrie
lules immunitaires sont des étapes importantes en flux à la fin des années 1960 a permis la fabri-
et critiques des investigations utilisant des tests cation d'instruments associant le nombre de cel-
cellulaires. Cela peut intervenir à différents lules détectées au volume prélevé. Certains de ces
stades des expérimentations, pour qualifier compteurs disposent d'un système s'apparentant à
l'échantillon initial ou observer les modifications la cytométrie en flux et tiennent compte de la dif-
induites par les tests pratiqués. Le comptage et fraction de la lumière par les cellules et de leur
l'observation phénotypique des cellules immuni- conductivité pour différencier les sous-popula-
taires concernent différents types d'échantillons tions de l'échantillon (e.g. lymphocytes, granulo-
biologiques : sang, moelle osseuse, liquide cytes ou « polynucléaires », monocytes).
céphalo-rachidien (LCR), humeurs vitrée et La simple observation en contraste de phase d'une
aqueuse, liquides d'épanchement, liquides de suspension cellulaire entre lame et lamelle, ou au
lavage, organes lymphoïdes et tissus dilacérés fond d'un puits ou d'une boîte de culture avec un
mécaniquement ou digérés par des enzymes, microscope inversé, permet de visualiser la taille, la
cultures cellulaires. forme et la granularité des cellules. Lors du comp-
tage cellulaire en hématimètre, l'addition préalable
Méthodologie d'un colorant pénétrant dans les cellules et marquant
le noyau (e.g. colorant de Türck), permet de différen-
De façon traditionnelle, les cellules sont comptées
cier plus précisément les différents types cellulaires.
sur des lames en verre ou en plastique à l'aide d'un
La technique la plus classiquement utilisée,
quadrillage délimitant un volume précis (0,1 mm3)
en particulier pour les prélèvements sanguins,
défini par la profondeur entre la lame et la lamelle
consiste à déposer puis étaler quelques micro-
(fig.  6.1). Le nombre de cellules par unité de
litres de l'échantillon sur une lame de verre,
volume est établi par l'observation en microscopie
appelé frottis (e.g. frottis sanguin). Il est égale-
optique. Ces lames sont appelées cellules de
ment possible de projeter les cellules sur une
comptage ou hématimètres. Les plus usitées sont
les cellules de Malassez, de Thoma, de Nageotte
et de Neubauer. La coloration des cellules en pré- 7 
Le principe Coulter repose sur la mesure de la différence
sence d'une substance ne pénétrant que dans les de résistance électrique (impédance) générée par le passage
cellules mortes (e.g. bleu trypan) permet de comp- dans un orifice de cellules en suspension dans une solution
ter précisément les cellules vivantes. saline tamponnée.

Méthodes en immunologie
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106
Techniques immunologiques
Hématimètre
Lamelle

Cellule de Malassez.
Dimensions : L : 2,5 mm, l : 2 mm,
profondeur 0,20 mm. Constituée
de 100 rectangles d’égales surfaces.
Le quadrillage total a un volume
de 1 µL. Comptage dans 10 carrés
et résultat multiplié par 10.

Cellule de Thoma.
Le quadrillage total a un volume de
0,1 µL, côté : 1 mm, hauteur : 0,1 mm.
16 grands carrés contenant chacun
16 petits carrés + 4 groupes de 3 lignes
horizontales + 4 groupes de 3 lignes
verticales. Côté de chaque petit carré : Par convention, les cellules
0,05 mm. Volume délimité par à cheval sur un trait ne sont
1 petit carré : 0,00025 µL. Volume comptées que sur deux des
délimité par 16 petits carrés : 0,004 µL. côtés de chaque carré.
Ici on comptera 6 cellules.
Les cellules plus foncées seront
comptées dans les carrés
adjacents.
Fig. 6.1  Schéma d'une cellule de comptage cellulaire ou hématimètre.
Chapitre 6. Tests cellulaires 107

lame de verre par une cytocentrifugeuse, le Recommandations de mise en œuvre


milieu étant absorbé par un buvard. Les cellules Les cellules à compter doivent être en suspension
sont concentrées en un disque sur la lame, homogène dans un milieu tamponné préservant
appelé cytospin ou cytocentrifugat. Après leur structure ou leur survie. Les cellules sont
séchage à l'air, les cellules sont fixées et colorées dénombrées sur un échantillon représentatif de la
par immersion de la lame dans une série de solu- suspension. Il peut être nécessaire de diluer ce der-
tions de colorant tamponnées. À titre d'exemple, nier, en particulier pour les comptages en micro­
la coloration de May-Grünwald-Giemsa fait scopie optique, lorsque la suspension est trop riche
intervenir le méthanol (fixateur), l'éosine (colo- pour l'individualisation des cellules. À l'inverse, il
rant acide qui se fixe aux structures basiques), le peut être intéressant de concentrer une suspension
bleu de méthylène (colorant basique qui se fixe cellulaire trop diluée par cytocentrifugation pour
aux structures acides) et l'azur de méthylène disposer du nombre suffisant de cellules dans l'hé-
(colorant métachromatique qui passe du bleu matimètre et d'une meilleure précision. L'évalua-
au rouge en contact avec la chromatine et les tion de la concentration cellulaire rapporte le
structures azurophiles). De plus, un marquage nombre relevé au volume de l'hématimètre et des
de ces cellules avec différents anticorps dilutions–concentrations éventuelles de l'échantil-
­permet  les études par immunocytochimie ou lon. Le volume total de la suspension est considéré
immunofluorescence. pour le nombre absolu de cellules disponibles.
Le microscope s'est aujourd'hui diversifié pour Des précautions sont nécessaires pour minimi-
améliorer l'observation des structures. Les micro­ ser la mortalité cellulaire, notamment en travail-
scopes optiques actuels utilisent la lumière directe lant rapidement après le recueil de l'échantillon
ou la fluorescence. Les progrès réalisés dans les (e.g. échantillon sanguin vieilli). De même, l'utili-
sources d'excitation, les recueils des fluorescences sation du bleu trypan nécessite un comptage dans
émises, l'accès à des images de très faible profon- les minutes qui suivent en raison de sa toxicité
deur de champ et la reconstitution informatique pour les cellules. Dans le cas particulier de cellules
des images tridimensionnelles (microscopie décongelées, il convient d'attendre la restauration
confocale) ont considérablement fait évoluer de l'intégrité de la membrane cytoplasmique avant
l'analyse cytologique. d'utiliser les cellules, en particulier pour le comp-
Une autre manière d'observer les cellules à tage en présence de bleu trypan.
une résolution plus forte consiste à utiliser la Une observation optimale des caractéristiques
microscopie électronique à transmission – MET cellulaires impose de respecter les fonctions vitales
(Transmission Electron Microscopy ou TEM) ou à des cellules (e.g. pH, osmolarité, température).
balayage – MEB (Scanning Electron Microscopy L'observation de cellules en culture (dans leur
ou SEM). Dans le premier cas, des coupes ultra- puits ou leur boîte) ne doit pas perturber les condi-
fines de cellules ou de tissus sont fixées dans une tions de stérilité et d'atmosphère. Il est impératif
résine pour une observation précise des consti- de fixer les cellules à observer après leur dépôt sur
tuants subcellulaires. Dans le second cas, la sur- une lame de verre. Cette fixation rend les cellules
face de l'échantillon fixé et éventuellement adhérentes au support, préserve les structures cel-
recouvert d'une fine couche de métal résistant lulaires, facilite la pénétration des colorants ou des
au passage des électrons (e.g. or) est visualisée anticorps et assure une conservation sur le long
lors de son balayage par le faisceau d'électrons. terme. Les lames peuvent être recouvertes d'une
Ces techniques permettent aussi d'étudier les lamelle avec un milieu de montage et scellées
interactions cellulaires (e.g. synapses immuno­ (lutage) pour une conservation prolongée.
logiques, phagocytose). Enfin, l'utilisation d'an- Dans le cas de populations cellulaires com-
ticorps couplés à des particules d'or permet de plexes, il est souhaité de déterminer les propor-
réaliser des immunomarquages en microscopie tions de chaque sous-population identifiée par ses
électronique.
108 Techniques immunologiques

caractéristiques morphologiques, en pourcentage. nucléaires basophiles, lymphocytes et mono-


Il faut dans ce cas compter un effectif de cellules cytes. La valeur absolue de chaque population
suffisant pour obtenir un résultat fiable et repré- est ensuite calculée. En cas d'anomalies détec-
sentatif de chaque pourcentage. Par la connais- tées par l'automate, un frottis sanguin est réa-
sance concomitante du nombre absolu de cellules lisé et coloré au May-Grünwald-Giemsa : les
dans la population est évaluée la taille de chaque pourcentages et la morphologie de ces diffé-
sous-population en valeur absolue. rentes cellules sont examinés au microscope
optique par un cytologiste ;
– des liquides comme les lavages broncho-
Avantages/inconvénients alvéolaires ou le LCR sont examinés
au  microscope après coloration d'un
Avantages Inconvénients
cytocentrifugat.
Approche qualitative Limites de la microscopie
et quantitative nécessitant un entraînement
Garant de la qualité spécifique Immunophénotypage
des techniques ultérieures Petit nombre de cellules
d'immunologie cellulaire examinées (sauf dans
Techniques d'observation les compteurs automatisés) L'immunophénotypage consiste à identifier et
diversifiées apportant plusieurs Préparation et stabilité éventuellement à numérer dans un échantillon de
types d'informations des colorants cellules hétérogènes une population particulière,
Automatisable Temps de coloration long
parfois très minoritaire, en utilisant comme sonde
Délai à respecter pour la
viabilité des cellules des anticorps marqués dirigés contre des antigènes
Pré-analytique stérile exprimés sélectivement par la population d'inté-
parfois nécessaire rêt. Les cellules peuvent être en suspension (e.g.
sang) ou au sein de tissus (e.g. coupe) et les anti-
gènes peuvent être membranaires ou intracyto-
Exemples d'applications plasmiques, leur identification nécessitant alors
• En recherche : une étape de perméabilisation. Les marqueurs les
– le comptage des cellules conditionne les tests plus utilisés sont des fluorochromes ou des
fonctionnels in vitro ou la mise en culture de enzymes. Après marquage des cellules, la lecture
cellules primaires ou de lignées. C'est égale- est réalisée au microscope pour les coupes tissu-
ment un des indicateurs de l'expansion d'une laires et les cellules adhérentes ou étalées, ou à
population en prolifération ; l'aide d'un cytomètre en flux pour les cellules en
– un contrôle morphologique permet de véri- suspension.
fier l'intégrité des cellules ou au contraire leur
entrée en apoptose ou en nécrose. Dans le cas
particulier des cellules microgliales, la forme Méthodologie
des cellules donne des indications sur leur La méthode la plus courante est l'immunofluores-
stade d'activation ; cence avec analyse par cytométrie en flux. Les cel-
– la microscopie électronique apporte des lules peuvent également être analysées au
informations précieuses sur les structures microscope après avoir été déposées sur une lame.
subcellulaires. Des techniques directes ou indirectes sont utili-
• En clinique : sées. Les méthodes directes sont les plus répan-
– dans les laboratoires d'analyses médicales, les dues car elles permettent des marquages multiples
cellules immunitaires du sang circulant sont en incubant les cellules avec un ou plusieurs anti-
dénombrées avec l'aide des automates de cyto- corps, le plus souvent monoclonaux, conjugués à
logie qui comptent les leucocytes et les pour- des fluorochromes. Les méthodes indirectes
centages de polynucléaires (ou « granulocytes ») consistent à incuber les cellules avec un anticorps
neutrophiles, polynucléaires é­ osinophiles, poly- non marqué, lui-même révélé ensuite par un
Chapitre 6. Tests cellulaires 109

second anticorps anti-immunoglobuline conjugué concentration optimale, à la limite de saturation.


à un fluorochrome. Dans ce cas les marquages Le choix des fluorochromes conjugués aux anti-
multiples sont plus délicats, nécessitant d'utiliser corps doit être réalisé avec soin, surtout lors de
des anticorps provenant d'espèces différentes marquages multiples. Il est ainsi préférable de pri-
révélés par des anti-immunoglobulines adaptées. vilégier des fluorochromes brillants à rendement
Des techniques d'amplification, basées sur l'utili- quantique élevé pour détecter des antigènes fai-
sation de systèmes de type streptavidine–biotine, blement exprimés. Il peut être judicieux d'ajouter
peuvent être utilisées pour augmenter le signal. des fluorochromes vitaux pour ne pas prendre en
Quand la suspension cellulaire à analyser contient compte les cellules mortes susceptibles de fixer les
une proportion très faible de cellules d'intérêt, le anticorps de manière non spécifique. L'utilisation
marquage peut être précédé ou suivi d'étapes de billes pour les mesures directes en valeur abso-
d'enrichissement comme la préparation de cellules lue se fait à l'aide de tubes préremplis contenant
mononucléées par un milieu de séparation. Il est les billes et le mélange d'anticorps ou par addi-
également courant de lyser les globules rouges tion, à la fin du marquage, d'un volume de billes
après marquage pour les échantillons sanguins. La identique à celui de l'échantillon. L'utilisation de
cytométrie en flux permet d'analyser de huit à dix billes pour l'évaluation en valeur absolue des cel-
fluorescences de manière simultanée sur un grand lules d'un échantillon biologique implique de ne
nombre de cellules et de réaliser ainsi une analyse pas réaliser d'étape de lavage et d'effectuer une
statistique quantitative de la répartition des cel- simple lyse des hématies (lyse sans lavage). Les
lules. Les résultats sont exprimés soit en pourcen- techniques de marquage sont manuelles ou uti-
tage de cellules marquées au sein d'une population lisent des automates de préparation.
complexe, soit directement en valeur absolue, en
ajoutant à un volume donné de la suspension cel- Avantages/inconvénients
lulaire un volume identique de microbilles fluo-
rescentes. Cette technique est directement Avantages Inconvénients
applicable aux échantillons non enrichis. Il est à Techniques rapides et Appareillage relativement
noter que, puisque la cytométrie en flux permet relativement peu coûteuses onéreux
d'évaluer l'intensité de la fluorescence, chaque Nombreux anticorps disponibles Personnel qualifié
sur le marché permettant de Délai limité entre le prélèvement
cellule peut être identifiée par la présence ou l'ab- réaliser des analyses et l'immunomarquage
sence de marquage, ou par le niveau d'expression multiparamétriques et Nécessité de disposer de
d'un antigène donné : par exemple les sous-­ d'identifier des cellules rares cellules en suspension sans
populations de cellules NK sont identifiées par des dans des préparations altération de l'expression
complexes antigénique
anticorps anti-CD56 en deux catégories, faible- Automatisation possible Choix parfois complexe des
ment fluorescentes (CD56dim) et fortement fluo- Quantification du niveau anticorps pour les analyses
rescentes (CD56bright). d'expression des antigènes multiparamétriques
Mesure des valeurs absolues

Recommandations de mise en œuvre


Le délai entre le recueil des cellules et le marquage Exemples d'applications
par les anticorps doit être le plus court possible, de • En recherche : les techniques d'immunophéno-
préférence moins de 24 heures. Il existe des stabi- typage ont de nombreuses applications dans
lisants permettant de différer le marquage jusqu'à l'exploration des modèles expérimentaux ou la
72 voire 96 heures. Il est possible de disperser les caractérisation des mécanismes fonctionnels des
cellules contenues dans un tissu, par exemple avec lignées cellulaires.
des enzymes, pour obtenir une suspension cellu- • En clinique :
laire. Il convient alors de s'assurer que le traite- – l'immunophénotypage a de très nombreuses
ment n'altère pas l'expression des antigènes à applications en immunologie, hématologie,
identifier. Les anticorps utilisés doivent être en biologie de la reproduction ;
110 Techniques immunologiques

– l'étude des sous-populations lymphocytaires 1,077. Il est très utilisé pour isoler les lymphocytes
est appliquée au diagnostic des déficits immu- sanguins qui ont précisément cette densité. Dans
nitaires congénitaux et au suivi des patients ce cas, le sang dilué est déposé au-dessus d'une
infectés par le VIH, ayant reçu une greffe phase de Ficoll®. Après centrifugation entre 400 et
d'organe ou de cellules hématopoïétiques. 600 g à température ambiante pendant 20 à
L'immunophénotypage permet de : numérer 30 minutes, les globules rouges et les granulocytes
les sous-populations lymphocytaires ; suivre (ou « polynucléaires ») se trouvent dans le fond du
l'état d'immunodépression et/ou apprécier la tube, en dessous du Ficoll®, tandis que les lym-
reconstitution immunitaire ; phocytes forment un tapis (ou anneau) à la surface
– l'immunophénotypage des hémopathies du Ficoll®. Les monocytes restent dans la phase
malignes permet de définir la lignée impli- supérieure (plasma + diluant). Le recueil de cette
quée, le stade de différenciation, le suivi de phase et du tapis de lymphocytes permet d'obtenir
l'efficacité des thérapeutiques ; une suspension de cellules mononucléées dites
– l'exploration fonctionnelle des cellules circu- communément PBMC (Peripheral Blood
lantes en cytométrie en flux concerne l'étude Mononuclear Cells). Celles-ci sont lavées dans un
des capacités de prolifération cellulaire ou de tampon salin phosphaté (e.g. PBS pour Phosphate-
cytotoxicité, la mesure de l'apoptose, l'appré- Buffered Saline) de façon à éliminer toute trace de
ciation des capacités de phagocytose, la détec- Ficoll®, qui peut être toxique pour les cellules si
tion de l'activation des basophiles… elles y sont exposées trop longtemps.
D'autres gradients tels que le dextran per-
mettent de séparer les granulocytes (ou « polynu-
Séparation et tri cellulaire cléaires ») par simple sédimentation. La densité du
Percoll® peut être adaptée à la population que l'on
Les méthodes classiques de centrifugation simple souhaite enrichir (i.e. densité de 1,03 à 1,08).
ou en gradients de densité sont largement utili- La technique d'élutriation permet de séparer de
sées pour séparer différentes populations cellu- grandes quantités de cellules dans de bonnes
laires présentes notamment dans le sang comme conditions de stérilité. Elle se réalise dans un élu-
les hématies, les leucocytes et les plaquettes. Le triateur qui centrifuge les cellules en gradient de
développement de nouvelles technologies utili- densité avec un prélèvement automatique au
sant des anticorps monoclonaux permet niveau des interphases. Cette technique est princi-
aujourd'hui d'enrichir par sélection positive ou palement limitée à des applications cliniques, telles
négative une population cellulaire donnée, voire que la séparation de monocytes.
de la purifier à haut niveau grâce aux trieurs de
cellules. Recommandations de mise en œuvre
Il faut connaître la densité des cellules à séparer
pour effectuer cette sélection correctement en
Techniques de séparation gradient discontinu. Il est particulièrement impor-
par densité tant de travailler à la bonne température, car la
densité varie en fonction de ce paramètre. Ainsi les
Méthodologie séparations de lymphocytes sur gradient de Ficoll®
doivent s'effectuer à 20 °C et non dans une centri-
Certaines populations cellulaires ont des densités
fugeuse réfrigérée.
suffisamment différentes pour permettre leur
séparation à l'aide de gradients de densité
(fig.  6.2). On distingue essentiellement des gra- Exemples d'applications
dients de densité discontinue dont le plus clas- • En recherche : la séparation de cellules sur gra-
sique est le Ficoll®. Ce dernier est un glucide dient de densité est un préalable à de nom-
ramifié artificiel dont la densité à 20 °C est de breuses techniques d'analyse fonctionnelle des
Chapitre 6. Tests cellulaires 111

Séparation sur gradient de Ficoll®

Plasma, plaquettes,
monocytes
Sang dilué

Lymphocytes
Ficoll®
Ficoll® Granulocytes (ou « polynucléaires »)
Hématies

Séparation sur gradient de Percoll®

Densité
1,000

1,050

1,077

Fig. 6.2  Séparations en gradients de densité.

lymphocytes. Les suspensions de PBMC Certains types cellulaires (e.g. monocytes,


contiennent à la fois des lymphocytes et des macrophages) ont la propriété d'adhérer sponta-
cellules présentatrices d'antigènes et per- nément au plastique. Ainsi une simple incubation
mettent d'étudier les réponses cellulaires aux pendant 2 heures à 37 °C des cellules mononu-
antigènes. cléées du sang ou de la moelle osseuse permet de
• En clinique : comme mentionné plus haut, faire adhérer au moins 80 % des cellules mono-
l'élutriation est utilisée en biothérapie cellulaire macrophagiques d'une suspension cellulaire préa-
pour séparer les cellules qui sont ensuite injec- lablement préparée par Ficoll®. Cette technique
tées au patient. est très utilisée pour pré-enrichir les lymphocytes
présents dans la fraction non adhérente qui sont
recueillis avec précaution par un simple lavage.
Elle permet aussi de séparer les monocytes/
Techniques de séparation macrophages présents dans la fraction adhérente
en phase solide qui sont ensuite recueillis par lavages en PBS froid
contenant un chélateur de calcium (e.g. EDTA)
Méthodologie
et/ou par grattage mécanique (cell scraper ou rub-
Le principe de la séparation en phase solide est de ber policeman).
retenir les cellules soit par une adhérence sponta- L'adhérence immune ou panning consiste à
née, soit par l'intermédiaire d'anticorps ou de lec- recouvrir préalablement une boîte de Petri à l'aide
tines fixés sur un support solide. d'anticorps ou de lectines. Les cellules sont incu-
112 Techniques immunologiques

bées dans la boîte de Petri durant 1 h 30 à tempé- dans la colonne. Les cellules non retenues sont
rature ambiante, permettant la fixation des cellules tout d'abord éluées en milieu PBS et recueillies,
au fond de la boîte par interaction entre les anti- c'est la fraction négative. Les cellules retenues par
gènes membranaires et les anticorps, ou entre la l'aimant (fraction positive) sont ensuite recueillies
lectine et ses ligands cellulaires. Les cellules non par rinçage après avoir enlevé le champ magné-
fixées sont ensuite recueillies par aspiration du sur- tique. Cette technique est très utilisée soit pour
nageant et lavages en PBS froid. Il s'agit de la frac- enrichir directement une population cellulaire
tion dite négative. Les cellules (fraction positive) (sélection positive), soit pour obtenir cette popu-
ayant adhéré au fond de la boîte peuvent être lation par élimination des autres populations
recueillies par grattage mécanique. Cette tech- (sélection négative). La pureté de la suspension
nique simple et relativement peu coûteuse permet obtenue peut atteindre 90 à 95 % selon la fré-
de pré-enrichir une population cellulaire d'intérêt quence de la population de départ. Toutefois une
de façon très spécifique, notamment si des anti- des limites de cette technique est qu'il n'est géné-
corps monoclonaux sont utilisés. ralement possible d'enrichir les cellules par sélec-
Le principe des rosettes est d'entourer les cel- tion positive qu'à l'aide d'un seul marqueur, car la
lules d'intérêt avec des globules rouges et de sépa- persistance de billes magnétiques à la surface des
rer les rosettes ainsi formées sur un gradient de cellules empêche de réaliser une deuxième sélec-
Ficoll®. Les rosettes se trouvent alors au fond du tion positive. Cette difficulté peut être contour-
tube, entraînées par le poids des hématies. Après née en utilisant des billes liées à l'anticorps par un
élimination des autres cellules, les globules rouges pontage clivable par une enzyme. En revanche, il
peuvent être lysés, et les cellules d'intérêt (enro- est possible de pré-enrichir une population cellu-
bées) peuvent être recueillies. Cette technique laire d'intérêt par sélection négative puis d'utiliser,
relativement ancienne a été utilisée pendant long- dans un deuxième temps, une sélection positive.
temps pour enrichir les lymphocytes T humains
qui reconnaissent spécifiquement les globules Recommandations de mise en œuvre
rouges de mouton.
Des billes peuvent aussi être utilisées pour sépa- Il est nécessaire de bien choisir sa stratégie de
rer les cellules. Ce sont le plus souvent des billes sélection, positive ou négative, en fonction de
paramagnétiques couplées à des anticorps mono- l'usage ultérieur des cellules, en particulier s'il est
clonaux. Ces billes de taille variable (quelques souhaité effectuer ensuite des tests fonctionnels
nanomètres à 3 μm selon le fabricant) sont géné- qui peuvent être perturbés par la rémanence des
ralement formées soit de polysaccharide recouvert billes. La viabilité cellulaire reste en général très
de ferritine, soit de dextran ou d'époxy recouvert bonne.
de fer. Le principe repose sur le marquage des cel-
lules avec soit des anticorps monoclonaux directe- Exemples d'applications
ment couplés aux billes (marquage direct), soit • En recherche : le tri cellulaire est très utilisé en
des anticorps primaires fixés sur les cellules d'inté- recherche fondamentale en préalable à la mise
rêt qui sont ensuite mises en présence d'anticorps en culture ou pour les tests fonctionnels. Par
secondaires couplés aux billes paramagnétiques exemple, un tri des monocytes est nécessaire
(marquage indirect). La séparation des cellules avant de déclencher leur différenciation en cel-
couplées aux billes paramagnétiques s'effectue lules dendritiques par l'addition de facteurs de
dans le champ magnétique généré par un aimant. croissance et de cytokines.
La population spécifiquement reconnue par la • En clinique : dans le diagnostic de certaines
réaction antigène–anticorps peut être mélangée hémopathies où la population pathologique
aux billes ou déposée sur une colonne remplie est peu représentée, il peut être utile de la
d'une matrice de sphères magnétiques. Un champ trier au préalable. C'est le cas pour les tech-
magnétique est ensuite appliqué et les cellules niques de FISH (Fluorescence In Situ
marquées sont retenues sur la paroi du tube ou Hybridization) recherchant la translocation
Chapitre 6. Tests cellulaires 113

t(4 ;14) du myélome au sein des plasmocytes fonction du signal recueilli au moment de leur
triés sur une colonne CD138. Le chimérisme passage et généré par les propriétés de la cellule
donneur–­receveur dans les suites de greffe de qu'elles contiennent.
cellules souches hématopoïétiques est égale- La première phase du tri cellulaire repose ainsi
ment réalisé de façon différentielle après avoir sur une analyse fine et multiparamétrique par
trié les lymphocytes T CD3+ et les monocytes cytométrie en flux des populations à séparer. Elle
CD14+. prend en compte, comme la cytométrie en flux
classique, la diffraction de la lumière aux petits et
aux grands angles, ainsi que des paramètres immu-
Tri cellulaire par cytométrie en flux nologiques d'expression ou non d'antigènes
reconnus par des anticorps fluorescents.
Méthodologie (tableau 6.1) La deuxième phase du tri vise à déterminer, à
Le trieur de cellules est un cytomètre en flux (voir l'issue de cette analyse, les paramètres permettant
chapitre 4). La différence consiste en la présence de décider quelle(s) est(sont) la(les) population(s)
d'un cristal piézo-électrique qui fractionne le jet à enrichir ou à éliminer. Les nouvelles générations
liquidien contenant les cellules en suspension en de trieurs permettent de purifier, à des degrés de
gouttelettes individuelles grâce à une vibration à pureté supérieure à 99 %, simultanément jusqu'à
haute fréquence. Les gouttelettes qui passent six populations cellulaires d'intérêt à des vitesses
devant le faisceau laser contiennent ainsi chacune allant jusqu'à 50 000 cellules par seconde, tout en
de façon optimale une seule cellule. Ces goutte- conservant une bonne viabilité cellulaire.
lettes peuvent être chargées électriquement et Chaque population cellulaire peut être recueillie
ainsi être déviées dans un champ électrique en stérilement, à condition que la préparation initiale

Tableau 6.1  Comparaison des techniques de séparation cellulaire

Gradient de Élutriation Rosettes Panning Tri magnétique Tri par cytomé-


densité trie en flux
Enrichissement Oui Oui Oui Oui Oui Oui
Purification Non Non Non Non Non Oui
Degré d'enri- Bon Excellent Bon Bon Excellent Excellent
chissement ou (pureté > 95 %) (pureté > 99 %)
de purification
Spécificité Modérée Bonne Modérée à bonne Bonne Excellente Excellente
(multimarquages)
Rendement Excellent Excellent Bon Bon Variable Variable
Activation des Modérée Modérée Variable (certains Variable (certains Variable (certains Variable (certains
cellules triées tris positifs) tris positifs) tris positifs) tris positifs)
Viabilité Bonne Excellente Bonne Bonne Variable à bonne Excellente
Stérilité Possible Absolue Possible Possible Possible Possible
Rapidité Très rapide Long Rapide Moyen Rapide Variable (en fonc-
d'exécution (20 minutes) (> 3 h en (1 h en moyenne) (2 h en moyenne) (1 h en moyenne) tion du nombre
moyenne) de cellules à
trier)
Coût Faible Élevé Variable Variable Élevé Élevé
Équipement Non Oui Non Non Variable Oui
sophistiqué
Qualification du Non Oui Non Non Non Oui
personnel
114 Techniques immunologiques

le soit, dans des tubes contenant soit un milieu de Culture cellulaire et co-cultures
culture qui permettra de cultiver les cellules après
le tri, soit dans un milieu permettant l'extraction
La culture cellulaire permet de maintenir en vie
d'ARN ou d'ADN. La plupart des trieurs de cel-
des cellules séparées de leur environnement d'ori-
lules sont également équipés d'un cloneur per-
gine. Le terme « culture in  vitro » est générale-
mettant le recueil des cellules dans des plaques
ment associé à cette technologie. Deux catégories
multipuits (clonage).
principales de cellules sont utilisées, des cellules
Le tri cellulaire par cytométrie en flux est surtout
dites primaires directement recueillies depuis
utilisé en recherche. Cette technique extrêmement
l'animal ou l'être humain et dont la durée de vie
performante nécessite un appareillage spécifique et
en culture est limitée, et des lignées cellulaires
coûteux dont le maniement ne peut être fait que
immortalisées ou tumorales qui peuvent être
par des utilisateurs ayant une formation et une
maintenues en culture indéfiniment. La culture
expertise adéquates. Il est important de souligner
cellulaire exige de recréer des conditions nutri-
que la qualité d'un tri cellulaire dépend aussi de la
tives, biochimiques et biophysiques contrôlées,
préparation cellulaire de départ quant à son homo-
proches de celles dans lesquelles les cellules évo-
généité, sa viabilité et sa stérilité.
luent naturellement, et de travailler en conditions
stériles. Les co-cultures reposent sur la culture
Recommandations de mise en œuvre conjointe de différents types cellulaires dans le but
Il est important en amont de maîtriser la prépara- d'étudier leurs interactions. Les cultures et co-
tion cellulaire, surtout si des conditions de stérilité cultures cellulaires sont à la base de nombreux
sont nécessaires en aval. La définition des fenê- tests classiquement utilisés en laboratoire.
trages d'analyse cytométrique est cruciale, car
seules les cellules identifiées comme répondant aux Méthodologie
critères du tri peuvent recevoir la charge électrique
La culture cellulaire requiert la manipulation des
permettant de les déflecter quelques microsecondes
cellules en condition stérile (poste de sécurité
après leur passage devant le système optique.
microbiologique ou PSM) afin d'éviter les conta-
La viabilité des cellules a longtemps été un pro-
minations par des bactéries, champignons, levures
blème majeur avec des tris de plusieurs heures. Les
ou virus. De manière générale, les cellules sont
nouveaux instruments ont grandement amélioré
mises en culture dans des boîtes, flacons ou plaques
cet aspect.
en polystyrène dont les surfaces sont éventuelle-
ment traitées pour favoriser ou éviter une adhé-
Exemples d'applications rence des cellules au support. Cette mise en culture
• En recherche : se fait dans un milieu nutritif salin, tamponné (pH
– de nombreuses stratégies de recherche 7,4) et stérile, dont la composition varie selon le
peuvent être mises en place après un tel tri. type cellulaire et l'espèce dont proviennent les cel-
C'est le cas par exemple de l'enrichissement lules. Ce milieu est complété par des additifs per-
en lymphocytes T régulateurs (Treg) difficiles mettant des apports en nutriments et facteurs de
à isoler par tri magnétique, mais dont les croissance (e.g. sérum de veau fœtal décomplé-
fonctions peuvent être étudiées après sépara- menté, glutamine) et par des antibiotiques pour la
tion en cytométrie (lymphocytes T CD3+, protection vis-à-vis d'éventuels contaminants.
CD4+, CD25bright, CD127low) ; Certaines cellules primaires ou lignées exigent éga-
– un autre exemple est celui de l'isolement de lement des facteurs de croissance spécifiques (e.g.
cellules dendritiques plasmacytoïdes CD4+, cytokines) pour se maintenir ou se différencier en
CD56+, CD123+, DR+. culture. Les boîtes, flacons ou plaques multipuits
• En clinique : comme mentionné plus haut, le tri contenant les cellules sont placés dans des incuba-
cellulaire en cytométrie est peu utilisé pour le teurs pour lesquels sont définis la température
diagnostic. (37  °C en général), l'hygrométrie (saturation)
Chapitre 6. Tests cellulaires 115

et le taux en CO2 (5 % pour les cellules de mammi- considérée et des conditions de culture. La
fère). Les contenants ne doivent pas être étanches culture de ces lignées impose une dilution régu-
de manière à assurer les échanges gazeux avec l'at- lière, visant à maintenir une concentration cellu-
mosphère de l'étuve ; ceci est assuré par différents laire compatible avec la croissance des cellules et
systèmes de circulation des gaz. leur utilisation.
Les cellules en croissance prolifèrent soit en sus- Les co-cultures consistent en la mise en culture
pension, soit en adhérant au support. Au bout conjointe de plusieurs types cellulaires. Elles
d'un temps variable selon le type cellulaire et la peuvent avoir pour objectif d'analyser la réponse
densité initiale, les cellules peuvent atteindre une de cellules dites répondeuses suite à leur interac-
densité maximale au-delà de laquelle elles ne tion avec un ou plusieurs autres types de cellules
peuvent plus survivre. Il est nécessaire de collecter dites stimulantes. Plusieurs types de réponses
les cellules pour les utiliser ou de les diluer pour peuvent être recherchés comme la prolifération
une nouvelle mise en culture (on parle de passage cellulaire, la sécrétion de cytokines, la cytotoxi-
cellulaire ou repiquage) avant que cette densité cité ou encore la suppression d'une réponse. Une
maximale ne soit atteinte. Lorsque des cellules telle analyse suppose d'avoir établi le nombre de
adhérentes recouvrent l'ensemble de la surface du cellules à utiliser dans le test, le rapport entre les
support, on dit qu'elles arrivent à confluence. Par cellules répondeuses et les cellules stimulantes,
ailleurs, l'étape de dilution des cellules adhérentes ainsi que la technique de mesure de la réponse.
nécessite de décoller celles-ci du support. Ceci Dans certains cas, les co-cultures ont également
peut être fait soit par décollement mécanique avec pour objectif de favoriser la prolifération et/ou la
un grattoir (cell scraper ou rubber policeman), soit différenciation de cellules difficiles à maintenir,
par action d'un agent de chélation des ions diva- comme les kératinocytes primaires qui se
lents (e.g. EDTA) et/ou d'une enzyme (e.g. tryp- cultivent de façon optimale sur un tapis de fibro-
sine), permettant de rompre les liaisons établies blastes produisant des facteurs de croissance.
par les cellules avec le support. Dans certains cas, il est ainsi possible de réaliser
Si les cellules d'une culture primaire sont repi- des cultures organotypiques tridimensionnelles,
quées pour une seconde culture, on parle de permettant de reconstituer des épithéliums plu-
culture secondaire. La durée de vie des cellules ristratifiés comme la peau.
primaires en culture varie de quelques jours à
quelques semaines, à l'exception notable des cel-
lules souches qui peuvent être maintenues pen-
dant des périodes plus longues. La mise en culture
des cellules primaires suppose une phase préalable
d'isolement et, dans certains cas, de purification.
À titre d'exemple, les cellules mononucléées du
sang humain peuvent être isolées à partir d'une
poche de sang après lyse des globules rouges et/
ou centrifugation en gradient de Ficoll®. Une
étape de purification peut être utilisée pour sélec-
tionner une population parmi ces cellules (e.g.
monocytes CD14+) par tri magnétique ou cyto-
métrie en flux.
Les lignées cellulaires peuvent dériver de cel-
lules cancéreuses, de cellules embryonnaires Fig. 6.3  Photographie en microscopie optique
(fig. 6.3) ou de cellules immortalisées ex vivo, par à contraste de phase d'une lignée adhérente
de fibroblastes de souris (lignée 3 T3–L1) à 70 %
infection avec un virus par exemple. Elles se de confluence.
maintiennent en culture indéfiniment en se divi- Ces cellules ont été obtenues à partir de fibroblastes
sant selon un rythme qui dépend de la lignée embryonnaires de souris.
116 Techniques immunologiques

Les cellules peuvent être archivées par congéla- mycoplasmes dans les lignées cellulaires (par colo-
tion en présence d'un cryoprotecteur (e.g. DMSO ration des cellules, test enzymatique ou PCR),
5–10 %) dans des ampoules conservées dans afin de pouvoir les traiter si nécessaire avec des
l'azote liquide. Elles prolifèrent de nouveau après antibiotiques spécifiques des mycoplasmes.
décongélation, élimination du cryoprotecteur et Le changement de couleur du milieu de culture
remise en culture. peut aussi traduire la souffrance cellulaire induite
par un simple épuisement des nutriments.
Recommandations de mise en œuvre
Il est nécessaire d'observer régulièrement les cel- Avantages/inconvénients
lules au microscope afin d'apprécier leur état et
leur densité. Dans tous les cas, la mise en culture Avantages Inconvénients
requiert un comptage préalable des cellules, qui Maintien indéfini des lignées Manipulations en conditions
permet de les diluer à la concentration adéquate et cellulaires stériles
Stocks de cellules relativement Contrôle des conditions de
de vérifier la viabilité des cellules si nécessaire. stables permettant des études culture : température, CO2,
Cette numération peut se faire soit au microscope comparatives à grande échelle hygrométrie
dans des chambres de comptage, soit à l'aide de Co-cultures permettant l'étude Repiquages/passages fréquents
fine d'interactions cellulaires si prolifération rapide
compteurs automatisés.
Grande variété de tests Entretien des lignées
Pour éviter que les cellules cultivées et utilisées applicables aux cellules en Contaminations par les
dans les laboratoires ne dérivent trop par rapport à culture mycoplasmes
la lignée d'origine, il est recommandé de relancer Viabilité parfois faible des
cultures primaires
régulièrement une culture à partir d'une ampoule Modifications des caractères de
du stock initial. Un grand nombre de lignées cel- certaines lignées cellulaires
lulaires sont référencées et commercialisées par les
centres internationaux de référence et de conser-
vation des lignées cellulaires : l'European Collection Exemples d'applications
of Cell Cultures (ECACC) et l'American Type • En recherche : des cellules de mammifères sont
Culture Collection (ATCC). cultivées dans la grande majorité des laboratoires
Les cultures cellulaires peuvent être accidentel- de recherche en immunologie. En effet, la culture
lement contaminées par des bactéries extracellu- de lignées est couramment utilisée pour préparer
laires ou intracellulaires (e.g. mycoplasmes), des des cellules qui seront utilisées dans de multiples
levures ou des champignons. Certaines de ces tests (e.g. transfection, transduction, cytotoxi-
contaminations sont suspectées lors d'un change- cité), mais aussi pour produire des anticorps
ment de couleur du milieu, lorsque celui-ci (hybridomes) ou encore des particules virales. Les
contient un indicateur de pH, révélateur d'une cellules primaires, isolées de modèles animaux ou
acidification (e.g. couleur jaune, bactéries) ou à partir de donneurs ou de patients, sont utilisées
d'une alcalinisation (e.g couleur rose, levures), et comme modèles ex vivo pour comprendre les pro-
confirmées par simple observation au microscope. priétés des différents types cellulaires, leurs inter­
D'autres contaminations (e.g. mycoplasmes, virus) actions et les éventuelles modifications qui
peuvent en revanche ne pas être aisément détec- peuvent être impliquées en pathologie.
tées. Le plus souvent, des antibiotiques à large • En clinique :
spectre sont utilisés pour prévenir les infections – les cultures cellulaires sont utilisées pour éva-
bactériennes. Toutefois, les mycoplasmes ne sont luer la capacité de prolifération des lympho-
pas sensibles à ces antibiotiques et peuvent infec- cytes en présence d'un mitogène (recherche
ter les cellules en culture, ce qui peut induire une de déficit immunitaire fonctionnel) ou d'un
modification du cycle réplicatif ou des voies de antigène (recherche de sensibilisation de l'im-
transduction, ou modifier la sensibilité de certains munité cellulaire). Les réponses allogéniques
tests. Il est commun de rechercher la présence de peuvent être évaluées dans des cultures mixtes
Chapitre 6. Tests cellulaires 117

(Mixed Lymphocyte Reaction ou MLR) asso- La mise en évidence de la prolifération cellulaire


ciant des cellules mononucléées de deux indi- par détection de la réplication d'ADN est égale-
vidus différents ; ment réalisable in vivo, dans des modèles animaux.
– les techniques de culture cellulaire sont égale- Le BrdU est administré par injection et/ou dans
ment à la base du développement des biothé- l'eau de boisson, en prise unique ou quotidienne-
rapies qui permettent de conditionner ex vivo ment, selon la nature des cellules à marquer. Les
des cellules ensuite administrées à leur don- cellules ayant incorporé le BrdU sont détectées
neur initial (e.g. cellules dendritiques chargées par immunocytochimie ou par cytométrie en flux
d'antigène) ou à un receveur (e.g. cellules sur des coupes de tissus ou des cellules en suspen-
souches hématopoïétiques). sion. Il est possible de coupler la mesure du BrdU
à un immunophénotypage des cellules. Dans cer-
tains cas, après plusieurs semaines d'administra-
Prolifération cellulaire tion, l'apport de BrdU est stoppé et sa dilution
dans les cellules filles est suivie.
La détection de la dilution d'un colorant fluo-
L'activation des lymphocytes, spécifique ou non
rescent dans les cellules filles repose sur le mar-
spécifique, in vivo ou in vitro, conduit à leur pro-
quage préalable des protéines cytoplasmiques ou
lifération. Les principales stratégies utilisées pour
membranaires des cellules dont la prolifération
évaluer la prolifération cellulaire reposent sur la
souhaite être suivie. Lors de chaque division, ces
détection de la réplication de l'ADN ou sur la
constituants cellulaires sont distribués de façon
mesure de la distribution équitable entre les cel-
égale entre les cellules filles, qui sont donc deux
lules filles, à chaque division cellulaire, de colo-
fois moins fluorescentes que la cellule mère.
rants fluorescents avec lesquels les cellules activées
L'intensité de fluorescence des cellules, mesurée
sont initialement marquées.
par cytométrie en flux, reflète le nombre de divi-
sions qui les séparent des cellules marquées initia-
Méthodologie
lement (fig. 6.4).
La mesure de la réplication de l'ADN consiste à En pratique, cette technique exige en premier
détecter les cellules qui prolifèrent en marquant lieu d'isoler les cellules dont la prolifération sou-
l'ADN néosynthétisé lors de la phase S du cycle haite être évaluée, souvent des lymphocytes T. Ces
cellulaire. Elle repose sur l'ajout, dans le milieu cellules doivent être lavées, comptées puis placées
dans lequel les cellules sont en suspension, de thy- en concentration adéquate dans un milieu de
midine marquée par un radio-isotope (e.g. 3H- culture. Selon le colorant choisi, le marquage
TdR pour thymidine tritiée) ou d'un analogue de résulte de sa liaison covalente aux protéines cytoso-
nucléotide, la bromodéoxyuridine (BrdU). Pour liques et membranaires (carboxyfluorescéine dia-
les tests in vitro, les cellules dont la capacité proli- cétate succinimidyl ou CFSE ; eFluor 670) ou de
férative doit être mesurée sont isolées et mises en son intégration dans les membranes cellulaires
culture dans des conditions de stimulation adap- (PKH26). L'incubation des cellules avec une
tées. Après 36 à 72 heures de culture, la thymidine concentration de colorant adéquate se fait à l'obs-
tritiée ou le BrdU sont ajoutés au milieu de culture curité pendant 10 à 15 minutes pour les colorants
et sont alors incorporés dans l'ADN en cours de marquant les protéines et en 1 à 5 minutes pour les
réplication des cellules qui entrent en division. colorants lipophiles s'intégrant dans les mem-
Huit à 12 heures plus tard, les cellules incubées branes. Le marquage est ensuite stoppé par ajout
avec de la thymidine tritiée sont lavées, lysées et la de sérum de veau fœtal puis les cellules sont lavées.
radioactivité est mesurée à l'aide d'un compteur à Il est utile de vérifier rapidement à ce stade que les
scintillation. Lorsque le BrdU est utilisé, la proli- cellules sont marquées de façon intense et homo-
fération est mesurée par immunodétection à l'aide gène. Les cellules marquées sont soit mises en
d'un anticorps anti-BrdU, couplé à un fluoro- culture dans différentes conditions pour un test de
chrome ou à une enzyme. prolifération in  vitro, soit injectées à un animal
Lymphocytes T CD4+
Lymphocytes T CD4+ + CFSE Cellules dendritiques

118
Techniques immunologiques
Co-culture 3 jours

Cytométrie en flux

1 2
Cellules non activées Cellules activées Lymphocytes T + CD Lymphocytes T + CD-OVA
Canal contrôle sans marquage
(intensité de fluorescence)

Nombre de cellules

Nombre de cellules
CFSE (intensité de fluorescence) CFSE (intensité de fluorescence) CFSE (intensité de fluorescence)
Fig. 6.4  Mesure de la prolifération de lymphocytes T par dilution du CFSE.
Des lymphocytes T CD4 OT-II, spécifiques d'un peptide de l'ovalbumine de poule (OVA), ont été isolés et marqués avec 5 μM de CFSE pendant 15 minutes.
Après lavage, les lymphocytes ont été mis en culture en présence de cellules dendritiques préalablement chargées ou non en OVA (CD-OVA et CD respectivement), à un rapport
de dix lymphocytes pour une cellule dendritique.
➀ Trois jours plus tard, la prolifération des lymphocytes est visualisée par cytométrie en flux. Pour les lymphocytes cultivés avec des cellules dendritiques ne présentant pas
l'OVA (LT + CD), on observe une seule population de lymphocytes intensément fluorescents : ces lymphocytes ne se sont pas divisés. Pour les lymphocytes cultivés avec des
cellules dendritiques chargées en OVA (LT + CD-OVA), on détecte huit populations correspondant à des lymphocytes présentant des intensités de fluorescence distinctes.
➁ Les histogrammes correspondants sont numérotés de 0 (lymphocytes non divisés) à 7 (cellules filles obtenues après sept divisions) en orange. Les logiciels d'analyses
permettent de connaître le pourcentage de cellules dans chaque pic et de calculer des index de prolifération.
Il est à noter qu'ici les représentations ➀ et ➁ proviennent de deux expériences différentes.
Chapitre 6. Tests cellulaires 119

pour le suivi de la prolifération après stimulation in Recommandations de mise en œuvre


vivo. Trois à sept jours plus tard, les cellules sont L'utilisation de thymidine tritiée impose le suivi
collectées à partir des puits de culture ou à partir de la réglementation en vigueur en termes de
des organes lymphoïdes de l'animal. Pour chaque radioprotection. La prolifération par incorpora-
condition de stimulation, les cellules sont mises en tion de thymidine tritiée est exprimée en coups
suspension dans un tampon salin additionné de par minute (cpm) ou par un index de proliféra-
protéines, marquées si nécessaire avec un mélange tion. Ce dernier utilise la formule :
d'anticorps couplés aux fluorochromes adéquats et
enfin analysées au cytomètre en flux. L'analyse des cpm avec stimulation - cpm sans stimulation
résultats bénéficie de l'existence de logiciels ayant cpm sans stimulation
des fonctions dédiées à l'analyse de prolifération Les tests sont généralement réalisés en triplicats et
par dilution de colorants fluorescents. il est nécessaire de disposer d'un témoin négatif per-
Une autre alternative consiste à mesurer la pro- mettant de définir le bruit de fond de la manipula-
lifération par l'activité succinate déshydrogénase tion et le seuil de détection des signaux spécifiques.
qui transforme les sels de tétrazolium en formazan Lors des tests utilisant la dilution du CFSE, il
jaune. La densité optique du surnageant cellulaire convient de préserver le colorant de l'exposition à
est proportionnelle à la prolifération (fig. 6.5). la lumière avant le marquage des cellules et de
La prolifération peut également être mesurée prendre les précautions nécessaires à la manipula-
par le marquage de la protéine Ki67 qui est tion de ce réactif potentiellement toxique. Il faut
exprimée au cours de la transcription de l'ARN vérifier l'adéquation entre le laser du cytomètre en
ribosomal dans les cellules en division. Cette flux et le colorant choisi, ainsi que la compatibilité
technique est surtout appliquée aux coupes avec les autres fluorochromes éventuellement uti-
tissulaires en immunofluorescence ou en
­ lisés. Les pics doivent être bien visibles et le
immunohistochimie. contrôle non stimulé ne doit pas avoir proliféré.

Sel de
tétrazolium
Absorbance (A492)

Succinate
déshydrogénase
cellulaire (CTLL-2)

Formazan

Fig. 6.5  Mesure de la prolifération par l'activité de la succinate déshydrogénase.


La réaction d'oxydation des sels de tétrazolium par la succinate déshydrogénase produit du formazan détectable par
mesure de l'absorbance à 492 nm. Le suivi de A492 de la suspension de cellules CTLL-2 en fonction de doses croissantes
d'interleukine-2 (IL-2) mesure la réponse proliférative.
120 Techniques immunologiques

Avantages/inconvénients nucléées de l'organisme des mammifères expri-


ment à leur surface un CMH de classe I, ce qui
Méthode de détection Avantages Inconvénients permet aux lymphocytes cytotoxiques d'être
de la prolifération potentiellement actifs sur n'importe quelle cel-
Réplication incorporation Sensibilité Usage de matériel lule infectée ou transformée. Les mécanismes
de l'ADN de thymidine radioactif aboutissant à l'expression de courts peptides
tritiée Ne permet pas linéaires, au sein des molécules du CMH de
d'identifier la
population classe I à la surface des cellules nucléées, sont
qui prolifère regroupés sous le terme d'apprêtement. Ce
incorporation Sensibilité Étape phéno­mène permet aux protéines intracellulaires
d'analogues Facilement supplémentaire de cytosoliques, après couplage à l'ubiquitine (ubi-
de BrdU utilisable détection du BrdU quitynilation), d'entrer dans le protéasome qui
in vivo Potentiellement
mutagène
est un complexe multi-enzymatique cytoplas-
mique où elles sont clivées en courts peptides
Dilution d'un colorant Facilement Marquage des
fluorescent (CFSE, utilisable lymphocytes avant d'une longueur de huit à dix acides aminés. Ces
eFluor670, PKH26) in vivo activation peptides sont transportés dans le réticulum endo-
Identification Indétectable après plasmique par un transporteur spécifique (TAP)
et analyse sept divisions et associés à la poche de la molécule du CMH de
phénotypique
des cellules en classe I. Ces complexes sont ensuite exprimés à la
prolifération surface de la cellule malade pour pouvoir être
reconnus par le TCR des lymphocytes T qui leur
sont spécifiques. Les peptides liés aux molécules
Exemples d'applications du CMH de classe I peuvent être caractérisés par
• En recherche : la prolifération a de nombreuses élution de molécules CMH purifiées, à partir
applications pour l'exploration des réponses d'extraits cellulaires. Au sein de leur séquence,
immunitaires dans des modèles animaux ou de certains acides aminés situés en position 2, 3 ou
culture cellulaire. 9 correspondent à des points d'ancrage à la
• En clinique : les tests de prolifération aux mito- molécule du CMH. L'identification de ces acides
gènes ou aux antigènes sont utilisés pour l'ex- aminés critiques pour l'ancrage aux molécules du
ploration des déficits immunitaires ou des CMH de classe I les plus fréquemment répan-
hypersensibilités. dues a permis d'établir des algorithmes prédictifs
d'épitopes T d'après séquençage.
Une fois reconnue la cellule cible, le CTL, au
Cytotoxicité, cours de liens cellulaires étroits, libère le contenu
fonction cytotoxique de granules lytiques contenant de la perforine et
des lymphocytes T CD8+ des granzymes A et B. Ces cytotoxines conduisent
à la lyse des cellules cibles par apoptose. Par ail-
Les lymphocytes T cytotoxiques (Cytotoxic T leurs, l'activation de la cellule T CD8+ conduit à
Lymphocytes ou CTL) sont des effecteurs majeurs l'expression membranaire du ligand de FAS (Fas-
de l'immunité adaptative dont le rôle est d'élimi- L). Fas-L, en se liant à son récepteur Fas (CD95),
ner toute cellule modifiée par un virus intracellu- exprimé constitutivement à la surface de la plu-
laire ou par transformation tumorale. Ces part des types cellulaires, induit la mort par apop-
lymphocytes, par le biais de leur récepteur pour tose de la cellule cible. Parallèlement à leur
l'antigène (TCR), reconnaissent spécifiquement activité cytolytique, les CTL produisent, lors de la
un complexe peptide–CMH de classe I exprimé à reconnaissance de la cellule infectée, des cyto-
la surface des cellules cibles. Toutes les cellules kines telles que l'IFN-γ.
Chapitre 6. Tests cellulaires 121

Méthodologie avant de réaliser le test. Schématiquement, les


Pendant de nombreuses années, le test de relargage cellules mononucléées sont activées une nuit avec
du 51Chrome a été le test de référence permettant de la phytohémagglutinine, lavées, irradiées et
l'évaluation d'une réponse CTL cytolytique spéci- remises en suspension pour être co-cultivées avec
fique d'antigène. Pour réaliser ces tests, les cellules un autre aliquot de cellules du même sujet en
cibles, exprimant de façon endogène (infection par présence de facteurs de croissance des lympho-
le virus étudié, transfection ou infection à l'aide de cytes T comme l'IL-2 ou le TGF-β. Les cellules
gènes de la vaccine recombinées avec les gènes d'in- sont testées pour leur activité cytotoxique entre le
térêts) ou exogène (adsorption de peptides) les 15e et le 28e jour. Cette méthode ne permet
antigènes d'intérêt, sont marquées avec du 51Cr. qu'une évaluation qualitative de la réponse
Pour que les CTL soient actifs, la cellule cible utili- cytotoxique.
sée doit être histocompatible avec les cellules effec- Ce désavantage peut être corrigé par l'utilisa-
trices, c'est-à-dire qu'elle doit exprimer les mêmes tion de tests en dilution limite (LDA). En effet
molécules du CMH. Chez l'homme, cette condi- pendant ce test, des cellules effectrices, préstimu-
tion nécessite l'obtention d'une lignée autologue lées ou non avec l'antigène d'intérêt, sont mises
pour chaque sujet étudié. Une solution alternative en culture, à différentes concentrations pouvant
est d'utiliser des lignées partiellement histocompa- aller de 100 000 à 0,1 cellules par puits, pendant
tibles, ce qui demande soit le typage des molécules 15  jours avant de faire un test de relargage du
du CMH, soit des cellules transfectées avec
51
Cr. Une analyse mathématique permet de don-
des molécules du CMH. Une fois incorporé dans ner la fréquence de lymphocytes T effecteurs cyto-
les cibles, le 51Cr change de valence et ne peut plus toxiques spécifiques d'antigène. Cette méthode
sortir spontanément des cellules cibles. Après fastidieuse peut donner des fréquences variables
lavage, les cellules cibles ainsi marquées sont dépo- d'une expérience à l'autre, mais elle permet une
sées en quantité fixe dans les puits d'une plaque de évaluation du compartiment des CTL.
culture à 96 puits et incubées, pendant 4 heures à Ces deux méthodes mesurent la fonctionnalité des
37 °C, avec les cellules effectrices supposées spéci- CTL effecteurs définie par la lyse des cellules cibles.
fiques d'antigène à différents rapports effecteurs/ Il est également possible de détecter les cellules T
cibles. Un triplicat de chaque rapport effecteurs/ CD8+ spécifiques d'antigène en utilisant des tétra-
cibles est réalisé. Des puits de culture positifs (cibles mères de molécules de CMH de classe I couplées à
et détergent) et négatifs (cibles sans effecteurs) sont des peptides et conjuguées à un fluorochrome.
réalisés en parallèle. La lyse des cellules cibles induit Une dernière alternative, qui ne teste pas la
une perte de l'intégrité membranaire et le relargage cytotoxicité, mais la spécificité des cellules, est la
du 51Cr dans le milieu de culture. La quantité de méthode ELISpot décrite par ailleurs.
radioactivité relarguée dans les surnageants de
culture recueillis à l'aide de tampons collecteurs est Recommandations de mise en œuvre
lue sur un compteur gamma ou bêta et est propor-
tionnelle à l'activité cytotoxique de la population L'utilisation des méthodes reposant sur le relar-
CTL effectrice. Elle est exprimée en coups par gage du 51Cr implique un élément radioactif et
minute (cpm). Pour chaque condition, le pourcen- donc des contraintes technologiques importantes
tage de lyse spécifique est calculé par la formule : pour l'acquisition des réactifs et l'élimination des
déchets. Par ailleurs, la nécessité d'amplifier la
cpm expérimental – cpm témoin négatif population cytotoxique in vitro conduit nécessai-
cpm témoin positif – cpm spontané rement à un biais dans l'évaluation de la fréquence
des CTL effecteurs cytotoxiques. Il faut par ailleurs
Pour améliorer la sensibilité du test de relar- noter que seuls les CTL pouvant survivre, se divi-
gage du 51Cr, il est souvent nécessaire d'amplifier, ser et maintenir leur fonction cytotoxique en
in vitro, la population des CTL effecteurs par des culture pendant 15 à 21  jours sont évalués. Les
restimulations successives pendant 15 à 21 jours vrais CTL effecteurs prêts à lyser les cellules cibles,
122 Techniques immunologiques

en phase finale de différenciation après plusieurs Exemples d'applications


cycles de division cellulaire in vivo, ne peuvent plus • En recherche : des fonctions cytotoxiques spéci-
proliférer in vitro, mais sont plutôt apoptotiques. fiques sont recherchées en expérimentation ani-
Sans restimulation ex vivo et lorsque leur fréquence male après infection virale ou administration de
est suffisante, ces méthodes permettent d'analyser cellules tumorales.
la population des CTL effecteurs cytotoxiques, • En clinique : ces tests sont utilisés pour évaluer
alors qu'après restimulation in vitro c'est la popu- la capacité cytotoxique spécifique vis-à-vis de
lation des CTL mémoire qui est évaluée. cellules infectées par Mycobacterium tuberculo-
Le désavantage majeur de l'utilisation des tétra- sis, le virus de l'immunodéficience humaine, le
mères est la faible sensibilité de la méthode cytomégalovirus ou le virus d'Epstein-Barr.
(1/5000) comparée à la méthode ELISpot
(1/50 000) ou à la méthode LDA (1/10 0000).
Comme il a pu être montré dans l'infection par le
virus Epstein-Barr (EBV), les fréquences de CTL Apoptose
détectées en test ELISpot sont 5,3 fois plus faibles
que les fréquences mesurées en test LDA, et 4,4 La mort cellulaire existe sous deux formes princi-
fois plus fortes que les fréquences mesurées en uti- pales : la nécrose ou l'apoptose.
lisant la méthodologie tétramère. L'ELISpot cor- La nécrose est une mort cellulaire qui survient
rèle relativement bien avec les fréquences de CTL lors d'un dommage tissulaire, elle entraîne la rup-
mesurées en LDA et davantage encore avec l'utili- ture des cellules qui déversent leur contenu cellu-
sation des tétramères, alors que la corrélation laire dans le tissu environnant et provoquent une
entre les méthodes tétramères et LDA n'est pas inflammation.
satisfaisante. Comme le montrent de nombreuses L'apoptose est un processus physiologique de
études, la méthode LDA sous-estime de 10 à mort cellulaire programmée déclenché par des
50 fois la population des CTL effecteurs. événements moléculaires intracellulaires. La cel-
lule apoptotique est en général phagocytée et
Avantages/inconvénients digérée par les phagocytes sans libération du
contenu de son cytoplasme, ne provoquant pas
d'inflammation. Les cellules peuvent s'autodé-
Avantages Inconvénients
truire lorsqu'elles sont devenues inutiles, endom-
Relargage Mise en évidence directe Charge préalable des magées ou dysfonctionnelles.
du de la cytotoxicité cellules cibles en 51Cr
51
Chrome Sensibilité Utilisation d'un isotope Il existe deux voies principales d'induction de
Mesure du potentiel Nécessité de l'apoptose : la voie mitochondriale (intrinsèque)
mémoire restimulations et la voie des récepteurs à domaine de mort
(extrinsèque) (fig.  6.6). Ces deux voies abou-
tissent à l'activation d'une famille de protéines, les
Dilutions Mise en évidence directe Longueur du test
caspases, qui agissent sur des molécules associées à
limites de la cytotoxicité Stimulation prolongée
Sensiblité accrue et en conditions l'apoptose. Le déroulement de l'apoptose débute
Évaluation du pool multiples par une translocation des phosphatidylsérines du
effecteur feuillet interne au feuillet externe de la membrane
Tétramères Moindre sensibilité Détection de la fixation cellulaire, et se poursuit par la  condensation du
du tétramère, pas de la cytoplasme, du noyau et de la chromatine,
fonction cytotoxique
Nécessité de connaître
une  fragmentation de l'ADN, un bourgeonne-
le typage HLA du patient ment de la membrane plasmique ainsi qu'une
ELISpot Forte sensibilité Mesure de la production perte de l'asymétrie membranaire. Il y a ensuite
d'une cytokine formation de corps apoptotiques qui sont digérés
Pas de réelle évaluation par les macrophages environnants. Plusieurs tech-
de la cytotoxicité
niques, s'adressant à des phases différentes de
Voie intrinsèque Voie extrinsèque Voie perforine/granzyme


Fas-L
V

Annexine V
Récepteur de
mort

Perforine
FADD Bourgeonnement
de la membrane
Procaspase 8
plasmique
Caspase 8
Lésions de l’ADN Flip flop des
Phosphatidyl-
Granzyme B sérines
BH3 BH3

IV

APOPTOSE
I
III Condensation

Y
du noyau
PARP1
Cascade des PARP1

Chapitre 6. Tests cellulaires 123


caspases
Fragmentation
Procaspase 3 de l’ADN
Cytochrome C
Apoptosome

APAF1
Caspase 3
Procaspase 9 Caspase 9
II

Fig. 6.6  Représentation schématique des mécanismes de l'apoptose.


124 Techniques immunologiques

l'apoptose, sont disponibles. Leur combinaison de DiOC6(3) pour une quantité de cellules don-
permet une approche complète du phénomène. née. Il est impératif d'incuber les cellules le temps
indiqué pour éviter les marquages non
spécifiques.
Mesure des modifications L'utilisation de découplants respiratoires
mitochondriales liées à l'apoptose comme le FCCP (carbonyl cyanide p-trifluoro-
methoxyphenylhydrazone) est indispensable
Les modifications mitochondriales au cours de pour évaluer l'existence d'une chute de
l'apoptose sont caractérisées par une perméabili- potentiel  mitochondrial (contrôle positif de
­
sation de la membrane externe via l'action de dépolarisation).
protéines pro-apoptotiques de la famille BCL2
induisant le relargage du cytochrome c et
d'autres protéines toxiques dans le cytosol. On Évaluation de l'altération
observe par ailleurs une chute du potentiel mito- des membranes plasmiques
chondrial transmembranaire qui peut être liée à l'apoptose
mesuré par des sondes potentiométriques en
cytométrie en flux. Après un signal pro-apoptotique, les phospholi-
pides et en particulier la phosphatidylsérine (PS)
basculent de la face interne à la face externe de la
Méthodologie membrane cellulaire et peuvent se lier à l'annexine
Le 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide, ou V. In  vivo, l'exposition des phosphatidylsérines
DiOC6(3), est un colorant qui s'accumule dans les représente un signal « eat me » qui facilite la pha-
membranes des mitochondries mais aussi au gocytose des cellules apoptotiques par les
niveau du réticulum endoplasmique et de la mem- macrophages.
brane plasmique.
Les cellules en suspension à étudier sont trai- Méthodologie
tées ou non par des inducteurs d'apoptose. Les
cellules sont comptées et incubées 20 minutes à Les cellules (adhérentes ou en suspension) sont
température ambiante en présence d'une incubées ou non en présence d'inducteurs d'apop-
concentration connue de DiOC6(3) dans du tose, lavées et centrifugées. Le culot est remis en
tampon salin phosphate (PBS). Le marquage suspension dans un tampon contenant de l'an-
mitochondrial est associé à l'utilisation d'un nexine V pendant 30 minutes à température
marqueur d'exclusion pour vérifier l'intégrité de ambiante, puis avec de l'IP ou du 7-AAD,
la membrane plasmique et les cellules sont donc 10  minutes avant l'analyse. Les cellules peuvent
incubées également 10 minutes avec de l'iodure être immunophénotypées simultanément en les
de propidium (IP), ou du 7-aminoactinomycine marquant par des anticorps monoclonaux.
D (7-AAD). Les cellules peuvent être immuno- L'annexine V se comporte comme une sonde
phénotypées simultanément en les marquant par fluorescente qui marque uniquement les cellules
des anticorps monoclonaux. L'analyse est réali- en apoptose, elle ne se lie pas aux cellules vivantes
sée par cytométrie en flux (fig. 6.7). Les cellules et ne traverse pas la membrane plasmique. Les
vivantes ont une fluorescence mitochondriale molécules d'annexine V peuvent être couplées à
forte qui diminue dans les cellules différents fluorochromes pour être détectées en
apoptotiques. cytométrie en flux ou en microscopie à fluores-
cence. Les cellules vivantes sont double négatives
pour l'annexine V et l'IP ou le le 7-AAD ; les cel-
Recommandations de mise en œuvre lules en apoptose précoce sont annexine V+ et
Pour avoir des résultats reproductibles, il est indis- IP/7AAD− et les cellules en apoptose tardive sont
pensable d'utiliser une concentration déterminée annexine V+ IP/7-AAD+ (voir fig. 6.7).

Non traitées Traitées
Cellules
I Cellules mortes Analyse du potentiel respiratoire mitochondrial par cytométrie en flux
vivantes
Cellules Les cellules en culture sont traitées ou non par des inducteurs d’apoptose. Les

7 -AAD
Cellules vivantes
apoptotiques cellules sont lavées, centrifugées et le culot cellulaire est incubé dans le tampon
Diminution du
potentiel phosphate (PBS) contenant le DiOC6(3) et du 7-AAD. Les cellules vivantes ont
respiratoire une intensité de fluorescence du colorant forte (à gauche), qui diminue dans les
mitochondrial cellules en apoptose (à droite), les cellules mortes ont perdu leur potentiel
membranaire mitochondrial et effluent le 7-AAD (à droite).
DiOC6(3)
Clivage de PARP visualisé par western-blot
III 1 2 Les protéines des extraits cellulaires sont séparées sur gel de polyacrilamide puis
113 kD transférées sur une membrane incubée avec un anti-PARP-1 puis un anticorps
PARP
Clivage de 89 kD secondaire couplé à la peroxydase. L’anti-PARP met en évidence les formes
PARP intacte (113kD) et clivée (89 kD) de PARP dans les cellules apoptotiques(2).
M 1 2
Mesure de la fragmentation de l’ADN sur gel d’agarose
Mesure sur gel

IV Les cellules sont lysées et l’ADN isolé est déposé sur un gel d’agarose contenant
1,5 kb du bromure d’éthidium. La visualisation de l’ADN se fait en lumière UV.
1 kb
M : témoin de masse moléculaire. 1 : échantillon non traité. 2 : échantillon traité
0,5 kb par un inducteur d’apoptose : l’ADN est clivé au niveau des liens
Fragmentation de l’ADN

internucléosomiques en multiples fragments de 180 paires de base.

a b Mesure de la fragmentation d’ADN par TUNEL


Non traitées Traitées 1 2
Ajout par la Tdt à l’extrémité 3’-OH de l’ADN de d-UTP fluorescents.
Nombre de cellules

Apoptose
a : Détection des cellules apoptotiques par cytométrie en flux.
TUNEL

b : Observation en microscopie (1). Le noyau des cellules est mis


a 3 en évidence par le DAPI (2). 3 : superposition de 1 et 2. La cellule

Chapitre 6. Tests cellulaires 125


verte est en apoptose et on distingue le noyau bleu d’une cellule
vivante.
Non traitées Traitées
Apoptose
V Cellules tardive
vivantes Apoptose
précoce
Analyse de la fixation de l’annexine V par cytométrie en flux
Les cellules lavées sont incubées dans un tampon contenant de l’annexine-PE et
Flip des
7 AAD

du 7-AAD. Les cellules vivantes sont annexine V– et 7-AAD– (à gauche), les


phosphatidyl
cellules en apoptose précoce sont annexine V+ et 7-AAD– (à droite), les cellules
- sérines
en apoptose tardive sont annexine V+ 7-AAD+.

Annexine V

Fig. 6.7  Méthodes d'étude de l'apoptose.


126 Techniques immunologiques

Recommandations de mise en œuvre transférées afin d'éviter le bruit de fond avant le


Le marquage par des intercalants de l'ADN transfert. Les lavages de 5 minutes de la mem-
comme l'IP ou le 7-AAD est indispensable pour brane sont importants pour éviter le bruit de
faire la différence entre les cellules apoptotiques et fond causé par l'anticorps secondaire. Il faut véri-
les cellules nécrotiques. L'analyse doit être réalisée fier le temps et le voltage ou l'ampérage lors de la
dans l'heure qui suit le marquage, sinon toutes les migration électrophorétique en fonction de la
cellules deviennent perméables et sont IP ou masse des protéines afin qu'elles ne sortent pas
7-AAD positives. du gel.

Activation des caspases Étude de la fragmentation


et apoptose de l'ADN associée à l'apoptose
par électrophorèse sur gel
Les caspases 3 et 7 peuvent cliver la poly-ADP- de l'ADN génomique
ribose polymerase (PARP-1 ; 113 kD) en frag- La fragmentation de l'ADN génomique au cours
ments de 89 kD qui sont des marqueurs d'apoptose de l'apoptose est un événement irréversible qui
précoce et en fragments de 24 kD qui peuvent induit la mort cellulaire. L'endonucléase clive
être détectés par western-blot. l'ADN entre les nucléosomes, générant des frag-
ments d'ADN qui forment sur un gel d'agarose
Méthodologie une image caractéristique en barreaux d'échelle
composés de fragments de multiples de 180 paires
Les extraits cellulaires sont préparés par lyse des de bases.
cellules dans un tampon de lyse puis par sonica-
tion. Les protéines sont ensuite dénaturées dans
un tampon contenant du 2-mercaptoéthanol et Méthodologie
du sodium dodécyl sulfate (SDS) en chauffant à Il s'agit de détecter de l'ADN de faible poids
95 °C 5 minutes. Les protéines sont séparées selon moléculaire (LMW-DNA), augmenté dans les cel-
leur masse par migration sur gel SDS- lules apoptotiques, et de l'ADN de haut poids
polyacrylamide et transférées sur une membrane moléculaire (HMW-DNA), réduit dans les cel-
de nitrocellulose. Celle-ci est incubée avec un lules apoptotiques. Le LMW-DNA qui a subi une
anticorps (IgG) polyclonal de lapin anti-PARP-1 fragmentation peut être facilement séparé du
qui détecte des formes intactes et clivées de PARP- HMW-DNA. Cette technique est utilisable sur le
1. Après plusieurs lavages, la membrane est alors sang total, les cellules en culture ou sur des tissus
incubée avec un anti-lapin conjugué à une enzyme après digestion par la protéinase K. Les lysats cel-
et enfin avec un substrat chromogénique ou lulaires sont placés dans des tubes à filtre en pré-
chimioluminescent. Cette technique permet la sence d'hydrochlorure de guanidine (agent
détection de l'apoptose précoce. Contrairement chaotropique) qui dénature les acides nucléiques.
aux deux précédentes, elle étudie l'apoptose glo- Le support est lavé pour élimer les impuretés et
bale d'une population et non cellule par cellule. Il l'ADN est recueilli par élution dans du tampon
est également possible de quantifier la caspase salin faible, préalablement chauffé. L'ADN purifié
3  dans des lysats cellulaires par des techniques est mélangé avec le tampon de dépôt et déposé sur
ELISA. un gel d'agarose contenant du bromure d'éthi-
dium. La migration se fait dans du tampon Tris,
Recommandations de mise en œuvre Borate, EDTA (TBE) et l'ADN est visualisé sous
La membrane doit être incubée avec de la BSA une lampe à ultraviolets (UV). Là encore, c'est
(bovine serum albumine) ou du lait pour saturer l'apoptose globale de l'échantillon qui est
les sites de fixation non occupés par les protéines examinée.
Chapitre 6. Tests cellulaires 127

Recommandations de mise en œuvre Altération des membranes plasmiques


Il faut manipuler avec des gants le bromure d'éthi- Distinction apoptose/nécrose Risque de mort cellulaire si
dium qui est un intercalant de l'ADN très toxique. Immunophénotypage délais trop longs
concomitant
Des lunettes de protection et/ou un masque sont
nécessaires pour visualiser les gels avec les UV. Activation des caspases
Détection de l'apoptose précoce Identification globale de
l'apoptose au sein d'une
Étude de la fragmentation population
de l'ADN associée à l'apoptose Fragmentation de l'ADN
par méthode TUNEL Immunophénotypage Identification globale de
concomitant avec la méthode l'apoptose au sein d'une
Les brins d'ADN cassés générés au cours de TUNEL population en western-blot
l'apoptose peuvent être marqués à leur extrémité Application possible sur coupes Bromure d'éthidium toxique
tissulaires
3′-OH par des d-UTP couplés à des fluorochromes
(fluorescéine ou TMR pour tétraméthylrhoda-
mine) en présence de terminal déoxynucléotidyl Exemples d'applications
transférase (TdT). • En recherche : toutes les conditions expérimen-
La méthode TUNEL (Tdt-mediated X dUTP tales in  vitro, in  vivo ou ex  vivo susceptibles
nick end- labeling) est la technique la plus sensible d'entraîner une apoptose cellulaire bénéficient
pour détecter l'apoptose précoce dans les cellules des techniques décrites ici pour mettre en évi-
en suspension ou adhérentes, les frottis ou les tis- dence cette réaction ou tester des substances
sus congelés ou inclus en paraffine. capables de l'inhiber.
• En clinique : les techniques de détection
Méthodologie d'apoptose sont utilisées pour analyser la
Les cellules sont perméabilisées pour permettre réponse des cellules à un stress, à un agent
aux enzymes de traverser la membrane plasmique, toxique ou à d'autres agressions. Par exemple,
puis elles sont incubées avec un mélange conte- l'apoptose permet de mesurer la réponse
nant des nucléotides modifiés (d-UTP couplé au in vitro d'une cellule tumorale à un traitement
fluorochrome) et la TdT qui permet la fixation du anticancéreux. Les techniques de mesure de
d-UTP sur l'extrémité 3′-OH des fragments l'apoptose peuvent aussi permettre d'analyser la
d'ADN. La fluorescence incorporée est analysée fonctionnalité des lymphocytes T cytotoxiques
par cytométrie en flux ou en microscopie à fluo- vis-à-vis des cellules cibles infectées par un virus.
rescence ou optique. Elles peuvent également être utilisées dans le
diagnostic de certaines pathologies. Par
Recommandations de mise en œuvre exemple, le syndrome lymphoprolifératif lié à
l'X est un déficit immunitaire dans lequel les
Les cellules sont fixées avec du formaldéhyde et
lymphocytes T cytotoxiques ne meurent pas
du glutaraldéhyde avant la perméabilisation pour
quand l'infection est contrôlée par le système
éviter de perdre les petits fragments d'ADN.
immunitaire ; on retrouve alors une proliféra-
tion de ces lymphocytes T liée à un défaut
Avantages/inconvénients
d'apoptose.
Avantages Inconvénients
Modifications mitochondriales Suppression
Détection spécifique Conditions strictes pour garantir
de l'apoptose par voie la reproducibilité
mitochondriale Les tests de suppression cellulaire peuvent être
Immunophénotypage réalisés in vitro ou in vivo et consistent à mesurer
concomitant la capacité de cellules à inhiber des réponses
128 Techniques immunologiques

immunitaires. Les cellules suppressives peuvent un colorant cellulaire, par exemple du CFSE
être de différentes origines comme des lympho- (CarboxyFluorescein Diacetate Succinimidyl Ester)
cytes régulateurs (e.g. Treg, Breg), des cellules dont la quantité initiale est répartie également
présentatrices d'antigènes ou des cellules mésen- dans les cellules filles à chaque division, ce qui per-
chymateuses. Ces cellules agissent par contact met de suivre la prolifération cellulaire par cyto-
direct et/ou par l'intermédiaire de médiateurs métrie en flux. À cette co-culture sont ajoutées
solubles (e.g. cytokines) pour inhiber, spécifique- des cellules présentatrices d'antigènes préalable-
ment ou non, l'activité de cellules cibles. L'effet ment irradiées ou dont la prolifération est bloquée
de la suppression peut se traduire par une diminu- chimiquement (e.g. actinomycine D), ainsi que
tion de la capacité effectrice des cellules ciblées, l'antigène d'intérêt destiné à stimuler les lympho-
une inhibition de leur prolifération, leur élimina- cytes T conventionnels et/ou régulateurs. Ces
tion et éventuellement la disparition de symp- cellules présentatrices d'antigènes sont idéalement
tômes cliniques in vivo. purifiées à partir du même échantillon biologique,
voire lors du même tri cellulaire si l'appareillage
disponible le permet, en recueillant les cellules
Méthodologie
mononucléées n'exprimant pas le marqueur CD3
À la suite des travaux de Shimon Sakaguchi ayant (e.g. lymphocytes B, monocytes et cellules dendri-
décrit les cellules T régulatrices CD4+CD25+ en tiques, qui sont toutes les trois susceptibles de
1995, Angela Thornton et Ethan Shevach ont été présenter des antigènes).
les premiers à décrire le test de suppression in vitro Après culture à 37 °C pendant 72 à 96 heures
qui sert toujours de référence. Le principe de ce de ce mélange cellulaire test et des témoins adé-
test consiste à mettre en co-culture les cellules quats (en particulier sans Treg), la suspension cel-
dont on recherche la fonction suppressive, comme lulaire est lavée et marquée de nouveau par un
des cellules Tregs (CD3+CD4+CD25+), avec les anticorps anti-CD4 afin de repérer par cytométrie
lymphocytes T conventionnels (e.g. en flux la prolifération des cellules T répondeuses
CD3+CD4+CD25−, CD3+CD4+CD127+) dont (en excluant les cellules présentatrices d'antigène
on cherche à inhiber la prolifération et les fonc- de l'analyse). Si les Tregs sont bien suppresseurs,
tions effectrices (fig.  6.8). Cette co-culture peut cette prolifération est moindre en leur présence
aussi contenir des cellules présentatrices d'anti- (fig.  6.9). L'effet inhibiteur des cellules régula-
gène afin de stimuler les lymphocytes spécifiques trices sur les lymphocytes conventionnels peut
d'un antigène précis. aussi être visualisé par un test d'incorporation de
Les cellules mononucléées sanguines totales thymidine tritiée (3H-TdR). Le dosage des cyto-
sont tout d'abord isolées par gradient de densité. kines (e.g. IL-2) dans le surnageant de co-culture
Les populations lymphocytaires CD3+CD4+ sont ou la recherche des cytokines intracytoplasmiques
ensuite purifiées séparément sur un cytomètre en dans les cellules répondeuses sont des alternatives
flux disposant d'une fonction de trieur à la mesure de la prolifération.
(Fluorescence Activated Cell Sorter ou FACS), en Il est également possible de réaliser ces tests
se basant sur l'immunophénotype différentiel in vivo en injectant des Tregs purifiés à des ani-
CD25high/CD127low des Tregs humains et maux immunisés ou greffés. Si ces cellules sont
CD25low/CD127high des cellules T convention- efficaces, elles inhibent les réponses spécifiques
nelles naïves, révélé à l'aide d'un cocktail d'anti- humorales et cellulaires ou la réaction du greffon
corps monoclonaux. Après ce tri, les cellules sont contre l'hôte.
lavées pour éliminer toute trace de chélateur de Cette méthode peut aussi être utilisée pour
calcium (e.g. EDTA) et mises en co-culture dans mesurer la capacité des Tregs à supprimer une
des plaques à 96 puits en proportions équivalentes réaction allogénique au cours d'une culture mixte
(1:1) ou non (e.g. 1:2 ; 1:10). Pour apprécier la entre des lymphocytes T du receveur et des lym-
prolifération des cellules T naïves, ces dernières phocytes T irradiés du donneur, sans utiliser de
subissent une étape préalable de marquage avec cellules présentatrices d'antigène ni d'antigène.
Tri cellulaire


Antigène
2 x 104 CD4+CD25+CD127lowTreg +
5 x 104
cellules
CD25

+ présentatrices
irradiées
2 x 104 CD4+CD25–CD127+
Marquage CFSE

Cellules en
RPMI + 5 % sérum
CD127

72–96 h à 37 oC
Lymphocytes Lymphocytes + Antigène
+ Antigène + Tregs

Prolifération des CD4+CD25– :

Chapitre 6. Tests cellulaires 129


- en visionnant le puits de la plaque de culture au
microscope qui montre la différence de taille des
cellules ;
- en mesurant la dilution du CFSE (marqueur de
division cellulaire) par cytométrie en flux.

CFSE
Fig. 6.8  Illustration d'une suppression in vitro.
130 Techniques immunologiques

100 100

80 80

% Suppression
% Prolifération

60 60

40 40

20 20
R = cellules répondeuses
0 S = cellules suppressives 0

5)
)
)
R
)

5)
)

.5
R

:1
.5
:1

.2
:0
(1
.2
:0
(1

:0
(1
:0
(1

+S

(1
+S

(1

+S
+S

+S
R

+S

R
R

R
R

Fig. 6.9  Résultats d'inhibition de prolifération des lymphocytes CD4+CD25− par des Tregs CD4+CD25+CD127low
spécifiques du même antigène cible.

Recommandations de mise en œuvre Exemples d'applications


Une alternative au tri par cytométrie est l'utilisa- • En recherche : les tests de suppression in vitro per-
tion de billes magnétiques anti-CD25 pour puri- mettent l'analyse des propriétés de nombreux
fier les Tregs, mais elle fait courir le risque d'une types cellulaires suspectés d'agir par ce mécanisme,
contamination par des cellules T effectrices acti- dans des modèles animaux ou humains. Les
vées qui sont transitoirement CD25+, ou par des modèles animaux de transfert adoptif de cellules
cellules non lymphocytaires T. En effet, les suppressives sont des modèles expérimentaux per-
méthodes d'enrichissement ou de purification des mettant d'analyser finement les mécanismes de
cellules utilisées pour la co-culture peuvent géné- régulation immunitaire, en particulier la spécificité
rer une contamination par des populations cellu- sélective des cellules suppressives.
laires et/ou moléculaires (e.g. endotoxines) • En clinique : la manipulation des Tregs en théra-
indésirables. pie cellulaire humaine fait déjà l'objet d'essais cli-
Les cellules présentatrices d'antigène primaires niques, dans le domaine des greffes de cellules
peuvent être remplacées par une lignée cellulaire souches hématopoïétiques ou en auto-immunité.
disponible dans le commerce.
Les cellules répondeuses peuvent être des cel-
lules naïves ou mémoire. Dans ce dernier cas, il est Phagocytose/autophagie
indispensable de s'assurer qu'elles sont dans un
état quiescent avant la mise en culture. Les divers tests de phagocytose permettent d'éva-
luer la capacité des phagocytes (macrophages ou
Avantages/inconvénients granulocytes/« polynucléaires  » neutrophiles) à
  

internaliser des micro-organismes. Les tests


Avantages Inconvénients
peuvent comparer différents micro-organismes ou
divers types de phagocytes issus de cultures cellu-
Analyse d'une activité Nécessité de connaître l'identité
suppressive globale ou phénotypique (CMH) des cellules laires, d'échantillons cliniques ou de modèles ani-
spécifique d'un antigène suppressives d'intérêt maux. Pour l'analyse des phagocytes, des particules
ou d'un tissu Potentielle conversion inertes telles que des micro-organismes morts ou
Préparation de immunophénotypique et/ou maturation des particules de latex sont utilisées. Les tests de
suspensions cellulaires in vivo des cellules suppressives
à visée thérapeutique Lourdeur de la production en grade phagocytose sont souvent quantitatifs.
clinique (BPF/GMP, Bonnes Pratiques de Les tests de bactéricidie et la production des
Fabrication) de cellules suppressives réactifs oxydants qu'elle implique sont traités dans
spécifiques d'un antigène cible
les sous-chapitres ci-après.
Chapitre 6. Tests cellulaires 131

Méthodologie cyte jusqu'à l'internalisation de multiples phago-


Les phagocytes peuvent être issus d'une lignée somes et sa maturation. La cytométrie en flux
cellulaire (e.g. HL60, PLB985, Raw264), d'une requiert un marquage fluorescent des particules
culture primaire (macrophages péritonéaux par et un choix prudent des fenêtres d'analyse
exemple) ou être fraîchement isolés (neutrophiles (fig. 6.10). Les particules seules et les phagocytes
du sang). La phagocytose demande un effort seuls sont les principaux contrôles négatifs.
important à la cellule et tout phagocyte affaibli par Normalement, ils ont une taille différente qui se
un temps de préparation trop long, de mauvaises distingue en forward scatter (FSC).
conditions de culture ou une transfection est Dans tous les cas, il faut veiller à la distinction
moins efficace. Les phagocytes doivent se trouver entre les particules adhérant aux phagocytes et
dans un tampon physiologique, ayant un pH les particules internalisées. Même au microscope,
neutre, contenant des cations divalents, du glu- cette distinction n'est pas toujours évidente.
cose et un peu de protéines (0,1 % BSA ou de L'utilisation de particules fluorescentes permet
sérum). de réaliser un quenching de la fluorescence extra-
La phagocytose de micro-organismes vivants cellulaire avec un réactif éteignant la fluorescence
requiert une culture et une opsonisation immé- mais n'entrant pas dans les cellules, laissant
diatement avant l'expérience. Les particules intacte la fluorescence des particules internali-
inertes, bactéries ou levures mortes, ou encore sées. Le bleu trypan est un bon quencher de la
billes de latex, peuvent être préparées ou ache- fluorescéine.
tées. On trouve notamment dans le commerce La quantification de la phagocytose fournit
des E. coli, S. aureus et levures ou des parois de deux informations, le nombre de phagocytes ayant
levures (zymosan) marqués à la fluorescéine ou au internalisé au moins une particule et le nombre de
Texas Red. Une opsonisation avec un sérum particules internalisées par phagocyte.
immun contenant des anticorps contre la parti-
cule augmente considérablement l'efficacité de la
phagocytose. Les particules sont incubées avec le Recommandations de mise en œuvre
sérum immun pendant 1 heure à 37 °C sous agi- Les résultats sont souvent exprimés en indice de
tation lente et lavées en PBS. Les particules ainsi phagocytose (IP) selon la formule :
opsonisées peuvent être conservées à −80 °C
pendant plusieurs mois. IP = (% de phagocytes contenant au moins une particule)
La mise en contact des micro-organismes avec × ( nombre moyen de particules par cellule )
les phagocytes se fait à 37 °C dans un tampon
physiologique avec des phagocytes en suspension Dans une population de phagocytes, le pour-
ou adhérant à un support en verre ou en plas- centage des cellules ayant phagocyté peut dépasser
tique. Si les phagocytes sont adhérents, leur 50 %, mais peut aussi être inférieur à 10 %, par
capacité de phagocytose dépend aussi de leur exemple après une transfection transitoire
mobilité pour trouver des particules à internali- quelques heures avant la phagocytose. Le nombre
ser. La phagocytose peut être stoppée en refroi- de particules par cellule dépend fortement du rap-
dissant la préparation à 4 °C. La détection se fait port de départ particule/phagocyte (e.g. 1:1,
soit par comptage au microscope soit par cyto- 10:1), du temps et de la nature (taille, opsonisa-
métrie en flux. La microscopie est simple, donne tion) des particules. Le pourcentage et le nombre
un aperçu visuel du résultat et permet de réaliser moyen de particules phagocytées peuvent varier
une documentation photographique. Cependant, indépendamment. Pour une analyse fine, l'affi-
le comptage est laborieux, surtout si de multiples chage des deux indicateurs donne plus d'informa-
échantillons sont à tester. La vidéomicroscopie tions que l'indice de phagocytose.
permet de suivre la dynamique de la phagocytose En fonction des conditions du test, le proces-
du premier contact entre la particule et le phago- sus de phagocytose implique la migration des
132 Techniques immunologiques

1000 1000
Gate: R1

800 RN1

100
600

counts
SSC

400
10

200

A 1 B 0
1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000
FSC FL1
500 1200
Gate: R1 Gate: R2

400 RN1 960 RN2

44,6 %
counts

counts

300 720

200 480

100 240

C D
0 0
0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000
FL1 FL1
Fig. 6.10  Des particules de zymosan (préparation de parois de levure S. cerevisiae) ont été marquées à la fluorescéine
et opsonisées avec un sérum humain.
Les phagocytes (lignée PLB-985 différenciée) ont été incubés avec le zymosan pendant 45 min à 37 °C et ensuite analysés
par cytométrie en flux. Phagocytes (R1) et zymosan (R2) se distinguent sur les paramètres morphologiques (FSC et SSC,
A). L'autofluorescence (FL1) des phagocytes définit le seuil de détection de cellules ayant phagocyté au moins une
particule (RN1, B). L'analyse de la fluorescence (FL1) des particules se fait sur la fenêtre des phagocytes (R1, C).
On observe que 44,6 % des phagocytes ont une fluorescence au-dessus du seuil d'autofluorescence et ont donc
internalisé au moins une particule de zymosan. La fluorescence du zymosan est analysée sur la fenêtre R2. La fluorescence
moyenne des phagocytes est de 10,2 (en RN1, C) et la fluorescence moyenne du zymosan est de 2 (RN2, D). Donc les 44,6 %
de phagocytes au-dessus du seuil ont en moyenne internalisé cinq particules chacun.

phagocytes, l'adhérence aux particules (opsoni- peuvent altérer les fluorophores et ainsi modifier
sation, récepteurs du phagocyte), l­ 'internalisation le résultat indépendamment du niveau de phago-
et la digestion des particules. Une différence cytose. Ceci est particulièrement important pour
d'indice de phagocytose entre deux échantillons les granulocytes (ou « polynucléaires ») neutro-
peut être liée à un ou plusieurs de ces philes. Des contrôles supplémentaires tels que la
paramètres. neutralisation du phagosome avec un ionophore à
Les conditions drastiques à l'intérieur du pha- la fin de la phagocytose sont parfois nécessaires
gosome (e.g. pH, enzymes, radicaux oxygénés) pour interpréter les résultats.
Chapitre 6. Tests cellulaires 133

Avantages/inconvénients • la macro-autophagie est caractérisée par la for-


mation d'un autophagosome, structure consti-
Test Avantages Inconvénients tuée d'une double membrane entourant le
Microscopie Facile à réaliser Comptage laborieux matériel à dégrader. Cette forme d'autophagie
Aperçu direct Variabilité est impliquée dans l'élimination des micro-
Peu coûteux interindividuelle organismes intracellulaires. Chez l'homme,
des lecteurs
l'initiation du processus nécessite la participa-
Vidéomicroscopie Cinétique de chaque Appareillage
tion des kinases ULK1, ULK2, VPS34, de la
phagocytose coûteux
Aperçu de la Optimisation longue Bécline 1 et des protéines LC3. Ces molécules,
dynamique des conditions désignées par le terme ATG (autophagy related
Documentation en Nombre genes), constituent de bons marqueurs d'auto-
analyse d'image d'événements
analysables limité
phagie au cours d'une infection cellulaire ;
• la micro-autophagie consiste en l'internalisa-
Cytométrie en flux Mesure quantitative Appareillage
sur de grands coûteux
tion directe de matériel cytoplasmique au niveau
nombres de cellules Protocoles d'analyse de la membrane du lysosome ;
Corrélation avec spécifiques • l'autophagie dépendante des chaperonines
d'autres paramètres concerne des protéines solubles prises en charge
comme les
marqueurs de par des chaperonines qui les amènent jusqu'au
surface lysosome pour y être dégradées.
Dans le cas d'une invasion microbienne, la macro-
autophagie est déclenchée par différents signaux liés
Exemples d'applications à la présence du micro-organisme (fig.  6.11). Il
• En recherche : de nombreux travaux fondamen- peut s'agir de la reconnaissance directe du patho-
taux s'attachent à explorer les fonctions des gène, par l'intermédiaire de récepteurs impliqués
phagocytes. dans l'adhésion (e.g. CD46 pour HHV6 ou les adé-
• En clinique : les tests de phagocytose sont novirus B et D), ou de la reconnaissance des PAMPs
nécessaires pour l'exploration des déficits de (Pathogen Associated Molecular Patterns : e.g. LPS,
l'immunité innée. MDP) par différents récepteurs de type PRRs (Pat-
tern Recognition Receptors : e.g. TLR4, NOD2).
Les altérations cellulaires dues au développement
microbien induisent également le processus d'auto-
Cas particulier de l'autophagie
phagie. Ainsi, la destruction de la membrane du
L'autophagie est un processus physiologique qui phagosome par Listeria expose des β–galactosides
assure l'élimination et le renouvellement des internes perçus par des galectines. Ces lectines
molécules à longue durée de vie et des organites induisent l'activation d'une chaîne d'adaptateurs
de la cellule. Il contribue ainsi à l'homéostasie cel- moléculaires en relation avec des protéines ATG, ce
lulaire permettant notamment le recyclage d'élé- qui initie un processus d'autophagie. Les carences
ments nutritifs. nutritionnelles, notamment en acides aminés,
Au cours de ce processus, présent chez tous les consécutives au développement microbien, repré-
organismes eucaryotes, le matériel cytoplasmique sentent le signal originel du processus d'autophagie.
est acheminé vers un lysosome dans lequel il est Enfin, certaines cytokines (IL-1β, TNF, IFN-β) sti-
dégradé. Lorsque des micro-organismes intracel- mulent le processus d'autophagie.
lulaires sont impliqués, l'autophagie constitue une En plus de son rôle dans l'élimination des
réponse immunitaire de la cellule. pathogènes lors de la fusion de l'autophagosome
Trois types majeurs de processus autophagiques avec un lysosome, l'autophagie interagit avec
ont été décrits : d'autres mécanismes de l'immunité.
134 Techniques immunologiques

Legionella pneumophilia
Pathogènes 1 2 3

RavZ
TLR a

Listeria
Shigella
CMH-II
Autophagosome + peptide
Inlk b
lscA
NF-kB
Lysosome Inflammation

Phagophore

Fig. 6.11  Schématisation de la contribution de la macro-autophagie à l'immunité antibactérienne de la cellule.


1. Au cours de l'entrée des bactéries, la reconnaissance des PAMPs par les TLRs induit la mise en route des mécanismes
de l'autophagie. Des structures membranaires, issues principalement du réticulum endoplasmique, s'organisent en
phagophores (doubles membranes) sous l'action des protéines ATG dont LC3 (•). Certaines bactéries, comme Listeria et
Shigella, dégradent la membrane endoplasmique ; cette altération induit également les mécanismes d'autophagie (1a).
En ce qui concerne les bactéries ayant pu atteindre le cytosol (1b), une compétition s'établit alors entre l'activation des
mécanismes d'autophagie due à la reconnaissance du micro-organisme (partie droite) et les mécanismes bactériens
d'échappement résultant de l'action de protéines de masquage (InlK, IscA) et de la formation d'une queue d'actine (partie
gauche).
2. L'élongation du phagophore aboutit à la constitution de l'autophagosome.
3. L'autophagosome fusionne avec un lysosome, ce qui se traduit par la destruction des bactéries. Certains fragments
peptidiques et nucléiques se lient respectivement aux molécules HLA-II et aux TLRs (ex. : TLR9) ; il en résulte une capacité
accrue de la présentation antigénique et de l'activation du facteur NF-кB. Dans le cas de Legionella pneumophila,
la bactérie inhibe la fusion avec le lysosome (RavZ) et se réplique dans l'autophagosome.

L'autophagosome délivre des PAMPs et des de l'autophagie. Ainsi, la protéine IcsB de Shigella
épitopes antigéniques lors de sa fusion avec le masque les déterminants VirG reconnus par la pro-
lysosome, permettant aux TLR des endosomes et téine ATG-5, tandis que la protéine InlK de
aux molécules CMH de classe II d'interagir avec Listeria décore la bactérie de protéines cellulaires.
leur ligand. Le chargement des peptides dans ces Les virus VIH, HHV-1 et Influenza codent des
molécules de classe II concerne également des protéines se complexant à la Bécline 1, empêchant
exopeptides, ce qui augmente et diversifie l'activa- son activation. Enfin, la polymérisation de l'actine
tion des lymphocytes T CD4+. par Shigella et Listeria éloigne les bactéries du site
Dans le cas du virus Coxsackie B, l'activation de d'autophagie. Dans le cas de Legionella pneumo-
TLR3, qui engendre la production d'interféron de phila, l'autophagosome constitue même la niche
type 1, est dépendante du processus d'autophagie. réplicative de la bactérie qui est capable de bloquer
En effet, l'ARN viral est peu accessible dans les la fusion avec le lysosome en décomplexant les pro-
endosomes, car il est protégé par la capside virale. téines LC3 des membranes de l'autophagosome.
Du fait de sa propriété d'éliminer les altérations Les Picornavirus utilisent les autophagosomes
cellulaires et les pathogènes, l'autophagie contri- comme plate-forme réplicative et comme système
bue à réduire l'inflammation. de libération de nouveaux virions et le virus de la
La plupart des pathogènes ont développé des dengue induit l'autophagie des gouttelettes lipi-
mécanismes d'échappement, voire de subversion diques afin de produire l'énergie nécessaire à sa
Chapitre 6. Tests cellulaires 135

réplication. Enfin, le virus de l'hépatite C (VHC) 37 °C dans un tube en verre, sous agitation douce.
utilise l'autophagie pour inhiber la réponse inflam- Les bactéries opsonisées doivent être utilisées
matoire et la production d'interférons de type 1. immédiatement ou congelées à −80 °C.
L'autophagie est vraisemblablement un des pre- Pour la co-culture, il est nécessaire de respecter un
miers mécanismes d'immunité apparu chez les ratio bactéries : phagocytes de 10:1 et de prévoir un
eucaryotes. Sa pérennité au cours de l'évolution contrôle avec des bactéries seules afin de connaître
témoigne de son efficacité pour combattre les leur taux de croissance durant la manipulation, ainsi
pathogènes intracellulaires qui ont développé de que l'effet négatif des tampons utilisés. Les tubes
nombreux mécanismes d'échappement à l'auto- sont incubés à 37 °C sous agitation douce et des
phagie, tandis que les cellules ont multiplié et diver- échantillons sont prélevés à différents temps pour
sifié les modalités d'initiation de ce processus, établir une courbe de perte de viabilité bactérienne.
notamment en ciblant les différentes étapes du Une centrifugation différentielle permet de
développement du pathogène (e.g. adhésion, endo- séparer les bactéries non phagocytées, qui restent
cytose, libération cytosolique, multiplication). dans le surnageant des phagocytes ayant interna-
lisé des bactéries.
L'étape de quantification des bactéries est réalisée
Bactéricidie par un comptage des Colony Forming Units (CFU).
Après lyse hypotonique, les culots cellulaires sont
L'activité bactéricide permet aux phagocytes d'éli- étalés sur un gel d'agarose et incubés à 37 °C pen-
miner les micro-organismes après les avoir internali- dant une nuit. Les colonies sont comptées afin
sés dans les vacuoles de phagocytose. Cette activité d'établir la perte de viabilité des bactéries en fonc-
comprend deux mécanismes principaux, la produc- tion du temps d'incubation avec les phagocytes.
tion de formes réactives de l'oxygène et la libération
de peptides antimicrobiens et protéolytiques dans la
Recommandations de mise en œuvre
vacuole de phagocytose. L'activité bactéricide peut
être quantifiée en mesurant la perte de viabilité de Afin d'éviter une trop grande variabilité dans les
bactéries après leur mise en culture avec des phago- résultats, il est nécessaire de travailler en milieu
cytes. Si les bactéries non phagocytées ne sont pas stérile avec des tubes en verre. L'agitation pendant
séparées des phagocytes, on obtient à la fois une la co-culture est importante afin d'éviter la forma-
quantification de la phagocytose et de la bactérici- tion d'agrégats de phagocytes et d'assurer un bon
die. Pour quantifier uniquement la bactéricidie, il contact entre phagocytes et bactéries.
est nécessaire d'éliminer par centrifugation les bac- Les résultats sont présentés sous forme d'une
téries non phagocytées. Afin de faciliter la lecture de courbe de viabilité des bactéries en fonction du
la viabilité bactérienne, des techniques utilisant de la temps d'incubation avec les phagocytes. Il est pos-
thymidine radiomarquée ou de l'acridine orange sible aussi d'établir des constantes de phagocytose
ont été proposées, mais sont peu utilisées. et de bactéricidie. Il existe différentes formules de
calcul spécifiques.
Méthodologie
Avantages/inconvénients
Les phagocytes peuvent être issus de lignées cellu-
laires, de cultures primaires ou être isolés à partir
de sang frais. Dans ce cas, ils doivent être mainte- Avantages Inconvénients
nus à température ambiante et utilisés dans Différenciation entre L'étalement des bactéries et le
l'heure. phagocytose et bactéricidie comptage des CFU exigent un
De nombreuses bactéries sont utilisables, dont Techniques de microbiologie travail manuel long et délicat
simples et peu onéreuses La réalisation des courbes
Staphylococcus aureus. Il est indispensable d'opso- nécessite des manipulations
niser les bactéries avant le test de bactéricidie en multiples (dilutions et cinétique)
les mettant en contact avec du PBS contenant Les calculs sont longs
et complexes
10 % de sérum autologue, pendant 30 à 60 min à
136 Techniques immunologiques

Exemples d'applications NADPH oxydase dans la granulomatose septique


• En recherche : nombreux travaux fondamen- chronique (Chronic Granulomatous Disease ou
taux sur les fonctions des phagocytes. CGD).
• En clinique : exploration des déficits de l'immu- Les FRO produites par la face externe de la
nité innée. membrane plasmique sont physiologiquement
peu concentrées dans le milieu extracellulaire.
Cependant, produites de façon excessive ou inap-
propriée et mal compensées par les systèmes anti-
Métabolisme oxydatif oxydants, les FRO peuvent induire un stress
oxydant et participer à la survenue de lésions tissu-
En dehors du métabolisme mitochondrial, les laires observées par exemple dans la polyarthrite
sources cellulaires majeures de formes réactives rhumatoïde, la maladie de Crohn ou le syndrome
de l'oxygène (FRO), appelées également espèces de détresse respiratoire aiguë. Les FRO induisent
réactives de l'oxygène (Reactive Oxygen Species différentes lésions biochimiques. La peroxydation
ou ROS) sont les NADPH oxydases (nicotina- lipidique aboutit à une désorganisation membra-
mide adénine dinucléotide phosphate oxydases) naire. Les protéines sont fragmentées, s'agrègent
et en particulier la NADPH oxydase phagocy- et sont oxydées sur leurs groupements sulfhy-
taire. En effet, un des mécanismes majeurs driles. Des cassures et des mutations de l'ADN se
conduisant à l'élimination des agents pathogènes produisent sous l'effet des FRO.
par les phagocytes (granulocytes/«  polynu- La NADPH oxydase phagocytaire est un com-
cléaires » neutrophiles, monocytes, macrophages) plexe enzymatique multiprotéique, initialement
est la production rapide et massive d'anions découvert dans les phagocytes. Lorsque les cel-
superoxyde, source des autres FRO. L'oxygène lules sont au repos, la NADPH oxydase est inac-
consommé par les phagocytes est converti enzy- tive et ses composants sont dispersés entre
matiquement en anion superoxyde (O2•−) par différents compartiments cellulaires, membra-
une réduction monovalente utilisant la NADPH naires et cytosoliques. La NADPH oxydase pha-
cellulaire provenant de la voie des hexoses mono- gocytaire est formée de deux protéines
phosphates qui sert de donneur d'électrons. membranaires, la gp91phox et la p22phox consti-
Cette réaction est catalysée par la NADPH oxy- tuant le cytochrome b558, et de quatre protéines
dase. L'O2•− est la source des autres FRO, hau- cytosoliques, p67phox, p47phox, p40phox et
tement toxiques, qui sont le peroxyde Rac. Après stimulation, le regroupement de ces
d'hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyl OH•. différents composants forme une enzyme active
Par ailleurs, la myéloperoxydase libérée dans la produisant les FRO. À la fin du xxe siècle, l'amé-
vacuole de phagocytose catalyse la transforma- lioration de la sensibilité des techniques de mesure
tion de H2O2 en présence d'un halogène tel que des FRO a permis la détection de faibles quantités
le chlore (Cl−) en acide hypochloreux, haute- dans différents types cellulaires autres que les cel-
ment bactéricide. D'autres réactions entre ces lules phagocytaires (e.g. épithéliales, musculaires
différentes FRO et leur environnement donnent lisses vasculaires, endothéliales, neuronales). Leur
naissance à d'autres composés également haute- production a d'abord été attribuée à la respiration
ment toxiques tels que le radical hydroxyle. mitochondriale mais l'utilisation d'inhibiteurs de
La production des FRO se fait sur la face la chaîne respiratoire et des flavoenzymes a prouvé
interne de la membrane du phagosome, au contact qu'une flavoprotéine homologue à la gp91phox
de l'agent pathogène phagocyté, atteignant ainsi en était responsable. Elle a été appelée NOX1 et la
de hautes concentrations dans le milieu clos qu'est gp91phox renommée NOX2. Actuellement, six
le phagosome. Les FRO jouent un rôle majeur enzymes définies par leur pourcentage d'identité
dans la bactéricidie, comme le montre la survenue avec NOX2 sont répertoriées dans deux sous-
d'infections bactériennes ou fungiques sévères et/ familles : NOX1-5 (pour NADPH oxydase) et
ou répétées lors de dysfonctionnements de la DUOX1-2 (pour dual oxydase). Le rôle des NOX
Chapitre 6. Tests cellulaires 137

et des DUOX fait l'objet de multiples études, produit par les phagocytes stimulés réduit le
notamment dans le domaine des maladies NBT, jaune à l'état basal, alors transformé en
inflammatoires. précipité bleu nuit/noir de formazan à l'intérieur
de la cellule. Le pourcentage de cellules rédui-
sant le NBT est décompté au microscope. Cette
Méthodologie
technique peut être transformée en mesure
Le principe général des tests utilisés repose sur la quantitative après extraction du bleu de forma-
réduction ou l'oxydation d'une molécule par les zan intracellulaire.
FRO produites par les NADPH oxydases activées. Certaines méthodes permettent de mesurer à la
Certaines techniques mesurent la quantité totale fois la production totale et le pourcentage de cel-
de FRO produite par les cellules, d'autres évaluent lules productrices de FRO, à l'aide de molécules
le pourcentage de cellules les produisant. Ceci est fluorogènes – dichlorofluorescéine-diacétate
particulièrement intéressant dans la recherche (DCFH-DA), dihydrorhodamine 123 (DHR123),
d'une mosaïque fonctionnelle caractérisée par une hydroéthidine (HE) – qui pénètrent dans la cel-
double population de neutrophiles chez les vec- lule. Elles n'émettent pas de fluorescence à l'état
trices de la CGD liée au chromosome X. Selon la basal mais, après oxydation par les FRO, donnent
méthode utilisée, une production extra- et/ou naissance à un dérivé émettant une fluorescence
intracellulaire de FRO est mesurée. après excitation à une longueur d'onde appro-
Parmi les techniques évaluant la quantité totale priée. Ces molécules sont peu spécifiques des dif-
produite, la technique de référence spécifique de férentes espèces de FRO produites.
la production de l'anion superoxyde (O2•−) La transfection de vecteurs codant pour des
repose sur la réduction du cytochrome c mesurée molécules oxydées spécifiquement par certaines
par spectrophotométrie à 550 nm et inhibée par la FRO conduisant ainsi à la formation d'un fluoro-
superoxyde dismutase, reflétant l'O2•− libéré dans gène a également été développée (sonde HyPer et
le milieu extracellulaire par la cellule stimulée. Il H2O2). Grâce à des molécules d'adressage, cette
s'agit d'une technique quantitative dont les résul- transfection permet également de déterminer le
tats sont exprimés en nanomoles d'O2•−/unité de compartiment cellulaire où sont produites les
temps/nombre de cellules. FRO. La fluorescence peut être mesurée globale-
La chimioluminescence évalue l'oxydation de ment dans un fluorimètre ou évaluée par cyto­
certaines molécules (luminol, lucigénine…) métrie en flux. Dans ce cas, on mesure à la fois la
conduisant à une émission de photons corrélée quantité de fluorescence, le pourcentage et les
à la quantité de FRO les ayant oxydées. Les caractéristiques des cellules produisant cette fluo-
résultats, mesurés par un luminomètre, sont rescence. Cette technique permet ainsi de détecter
exprimés en unité arbitraire/nombre de cel- l'existence de sous-populations cellulaires produi-
lules. Il existe différentes sondes pénétrant ou sant plus ou moins de FRO. L'intensité de fluo-
non à l'intérieur de la cellule. La production rescence émise est proportionnelle à l'intensité de
extracellulaire peut être amplifiée par l'addition production de FRO. Ces sondes sont également
de peroxydase. Il s'agit d'une technique quanti- utilisées en microscopie confocale pour identifier
tative très sensible mais peu spécifique des les cellules productrices et éventuellement le com-
espèces de FRO produites. partiment cellulaire impliqué.
Une autre technique utilise une sonde fluoro- Les différents composants des NADPH oxy-
gène, l'amplex red, oxydée en présence de peroxy- dases peuvent être étudiés par western-blot avec
dase et d'H2O2. La production totale d'H2O2 dans des anticorps spécifiques. En ce qui concerne la
le milieu extracellulaire est ainsi évaluée. NADPH oxydase phagocytaire, l'absence d'un
Parmi les techniques appréciant le pourcentage des composants oriente le diagnostic génétique
de cellules produisant des FRO, la technique de la granulomatose septique chronique. Des
cytologique classique est la réduction du nitro- anticorps spécifiques des différentes sous-unités
bleu de tétrazolium (NBT). L'anion superoxyde des NOX et de leurs sites phosphorylés après
138 Techniques immunologiques

activation peuvent être utilisés en immunohis- Exemples d'applications


tochimie pour localiser ces enzymes, au repos • En recherche : de nombreux travaux fondamen-
ou sous leur forme activée, dans différents taux explorent les fonctions des phagocytes.
tissus. • En clinique :
– dans le domaine des déficits immunitaires,
Recommandations de mise en œuvre l'indication majeure est la recherche d'un
déficit de la production des FRO par la
La mesure de la production cellulaire de FRO est
NADPH oxydase phagocytaire dans un
effectuée avec différents stimuli, par exemple lipo-
contexte d'infections bactériennes et fun-
polysaccharide (LPS), N-formyl peptides d'ori-
giques répétées chez le jeune enfant, mais
gine bactérienne, bactéries opsonisées, phorbol
aussi plus tard dans la vie. Une absence de
myristate acétate (PMA), permettant d'évaluer la
production de FRO suggère l'existence d'une
fonctionnalité des différentes voies transduction-
granulomatose septique chronique à confir-
nelles susceptibles d'activer la NADPH oxydase et
mer par une étude en génétique moléculaire.
d'en détecter un éventuel déficit. Au moins deux
Une diminution non franche liée à des inter-
tests différents sont utilisés pour conforter les
férences (e.g. médicaments) peut être obser-
résultats. Le choix de la méthode dépend de l'ob-
vée et doit toujours être contrôlée à
jectif de la mesure, espèce particulière de FRO ou
distance ;
conséquences de l'ensemble des FRO produites
– une hyperproduction de FRO peut être
sur la sonde utilisée, détection intra- et/ou extra-
observée dans le cadre de maladies inflamma-
cellulaire, niveau de sensibilité souhaité. Ainsi, la
toires aiguës ou chroniques.
cytométrie en flux est moins sensible que la
chimioluminescence ou l'amplex red mais permet
de déterminer le pourcentage de cellules produi-
sant des FRO et la quantité totale produite. Elle
Dégranulation
peut être réalisée à partir de sang total évitant des
artefacts liés à l'isolement des phagocytes. Les tests de dégranulation, longtemps réalisés
L'interprétation doit être critique car les molé- avec des techniques de coloration en microsco-
cules tests peuvent être oxydées ou réduites de pie, se sont considérablement développés grâce à
façon non spécifique par d'autres molécules que la cytométrie en flux. Ils permettent de mesurer
les FRO, imposant la réalisation de contrôles en l'activité fonctionnelle de cellules qui, lors de
parallèle. La mise en évidence d'une production leur activation, libèrent le contenu de granules
de FRO par une NADPH oxydase doit être abro- cytoplasmiques dans leur micro-environnement.
gée par un inhibiteur sélectif des NADPH La détection de cette dégranulation repose sur
oxydases. l'identification de molécules caractéristiques des
granules. Il peut s'agir de leur contenu déversé
Avantages/inconvénients dans le milieu extracellulaire, ou de molécules
apparaissant à la surface de la membrane plas-
Avantages Inconvénients mique. Ces techniques sont applicables, avec des
Mesure globale ou spécifique Oxydation ou réduction par stimuli adaptés, aux basophiles, aux mastocytes,
d'une cellule ou d'un d'autres systèmes enzymatiques aux granulocytes (ou « polynucléaires ») neutro-
compartiment cellulaire Appareillage spécifique pour les philes et éosinophiles, aux lymphocytes T cyto-
Possibilité de travailler en sang tests de fluorescence toxiques et aux cellules natural killer (NK). Pour
total Interprétation spécialisée
Technique au NBT simple à mémoire, plusieurs de ces cellules possèdent
mettre en œuvre deux types majeurs de granules, des granules
Dissection fine possible des sécrétoires contenant des médiateurs préformés,
sites de production des FRO
qui sont relargués brutalement (dégranulation
Chapitre 6. Tests cellulaires 139

des ­mastocytes, des basophiles, des lymphocytes de la famille LAMP (LAMP-1 et LAMP-2). La
cytotoxiques), et des vésicules de plus petite dégranulation peut être initiée pour les cellules
taille, contenant des cytokines et des chimio- NK par une co-culture avec la lignée K562, et
kines, dont l'exocytose est régulée par des voies pour les lymphocytes T par le mélange PMA–
moléculaires distinctes. ionomycine, par des anticorps dirigés contre CD3,
par des cytokines activatrices, ou encore par des
Méthodologie antigènes.
Le marqueur de dégranulation des basophiles le
plus fréquemment utilisé est CD63 ou LAMP-3 Recommandations de mise en œuvre
(Lysosomal-Associated Membrane GlycoProtein 3), La dégranulation étant un phénomène pouvant
situé sur la membrane des granules sécrétoires, qui se déclencher rapidement, des précautions expé-
apparaît transitoirement sur la membrane plas- rimentales sont à respecter. Il faut éviter les chocs
mique des basophiles lors de leur dégranulation. thermiques des lignées ou des cultures primaires
Cette dernière peut être provoquée par des frac- et tester rapidement les prélèvements frais.
tions du complément (C5a), des peptides bacté- L'expression des résultats rend compte généra-
riens (fMLP) ou des allergènes vis-à-vis desquels le lement de l'intensité d'expression du ou des mar-
patient est sensibilisé (fig. 6.12). queurs considérés et de la proportion de cellules
Les tests d'activation des lymphocytes T et NK activées par un stimulus donné, à une concentra-
sont relativement similaires. Dans la majorité des tion donnée. Dans certains cas, des algorithmes
cas, le marqueur de dégranulation utilisé est prenant en compte plusieurs marqueurs peuvent
CD107a et/ou CD107b, deux autres molécules être développés.

2. Pontage des récepteurs


FcεRI par l’allergène
(via les IgE spécifiques
de celui-ci)

3. Libération
des médiateurs
et modifications
1. Incubation du phénotype
des basophiles du basophile
sensibilisés
avec l’allergène
ayant provoqué
la réaction

Expression de
CD63 à la surface

Relargage de
médiateurs
solubles

Fig. 6.12  Dégranulation des basophiles par contact avec l'allergène dont les IgE fixées sur les récepteurs FcεRI de
ces cellules sont spécifiques.
140 Techniques immunologiques

Chaque évaluation est à encadrer par un leucocytes dans les ganglions ou les tissus inflam-
contrôle négatif correspondant à la dégranulation matoires, d'autre part les communications inter­
spontanée et un contrôle positif correspondant à ­cellulaires.
la dégranulation maximale.
Méthodologie
Avantages/inconvénients Le test d'adhésion classique est une technique
statique en plaque à puits. Elle consiste à déposer
Avantages Inconvénients un nombre connu de cellules au fond d'une
Pour les mastocytes et les Nécessité de travailler sur des plaque recouverte d'une culture de cellules
lymphocytes T, confirmation de cellules vivantes endothéliales ou de molécules d'adhésion d'inté-
sensibilisations spécifiques Difficultés d'acheminement du rêt. Après lavage, le nombre de cellules ayant
Tests spécifiques de chaque prélèvement au laboratoire
type cellulaire Dégranulation spontanée adhéré est compté en microscopie inversée. Cette
Réalisation rapide possible technique ne permet pas de quantifier les aspects
Variabilité interindividuelle dynamiques de l'adhésion cellulaire, car ni la
Technologie complexe (gammes durée pendant laquelle la cellule mobile interagit
de stimuli) et interprétation
spécialisée avec le substrat ni la durée pendant laquelle la
cellule adhère ne sont mesurées. Enfin, la force
appliquée au moment du lavage est mal contrô-
Exemples d'applications lée, ce qui ne permet pas de tester la résistance
des liaisons.
• En recherche : les travaux fondamentaux sur
L'utilisation d'une chambre à flux laminaire
l'activation cellulaire sont amenés à explorer les
permet de mimer un écoulement à proximité
mécanismes de dégranulation.
d'une surface (fig.  6.13). La chambre elle-
• En clinique :
même est creusée dans un matériau transparent,
– le test de dégranulation des basophiles est uti-
dont la face inférieure est une lamelle amovible,
lisé en pratique courante pour le diagnostic
sur laquelle on peut cultiver un endothélium ou
d'hypersensibilité allergique immédiate, en
fixer des molécules d'adhésion. La chambre est
complément des tests cutanés et de la mise en
perfusée grâce à un canal d'entrée et un canal de
évidence d'IgE spécifiques sériques. Il pré-
sortie (en général à l'aide d'un pousse-seringue),
sente un intérêt majeur dans le diagnostic des
ce qui induit un cisaillement près de la surface.
hypersensibilités médicamenteuses pour les-
Les cellules circulantes d'intérêt sont injectées
quelles peu de tests de détection des IgE spé-
dans la chambre et se déplacent dans le flux.
cifiques de médicaments sont disponibles ;
Elles sédimentent et peuvent interagir avec la
– les tests de dégranulation des lymphocytes
paroi inférieure et s'arrêter. La chambre est pla-
cytotoxiques sont utiles dans le diagnostic des
cée sur un microscope inversé, une caméra CCD
lymphohistiocytoses hémophagocytaires
filme les déplacements des cellules. L'utilisation
familiales, dans lesquels des déficits de molé-
classique consiste à mimer un écoulement vas-
cules impliquées dans la dégranulation ont
culaire en utilisant des cellules endothéliales sur
été rapportés.
la surface inférieure de la chambre. Les cellules
endothéliales et circulantes peuvent être stimu-
lées à volonté. Une seconde application de cette
Migration cellulaire/ chambre consiste à utiliser une surface recou-
adhérence verte de molécules d'adhésion, pour quantifier
spécifiquement les interactions entre des molé-
L'adhésion cellulaire est un phénomène ubiqui- cules particulières et leurs récepteurs sur la cel-
taire qui présente deux fonctions différentes en lule circulante. Si la densité de molécules sur la
immunologie, d'une part le recrutement des surface est suffisamment faible, il est possible

a b

Chapitre 6. Tests cellulaires 141


TCR (T-cell receptor) Molécule CMH de classe I chargée en peptide
à la surface des lymphocytes T

Lame recouverte de sérum albumine bovine (BSA) c


Fig. 6.13  Fonctionnement d'une chambre à flux laminaire appliquée à la mesure dynamique d'une migration cellulaire.
a. Capture d'écran d'un film de chambre à flux laminaire (monocytes sur verre recouvert d'ICAM-1). La barre noire mesure 50 μm.
b. Montage en pratique (en rouge) : pousse-seringue (A) ; seringue pour injecter les cellules (B) ; vanne 3 voies (C) ; tuyau d'amont (D) ; chambre (E) ; tuyau d'aval (F) ; microscope
inversé (G).
c. Schéma de principe montrant le gradient de vitesse dû au cisaillement, un lymphocyte T sédimentant vers une surface de verre recouverte de BSA (jaune) et de molécules du
CMH (vert foncé) présentant un peptide (rouge). Les lymphocytes T sont arrêtés du fait d'une liaison entre leur TCR et le CMH/peptide.
142 Techniques immunologiques

d'observer des liaisons individuelles, dans les- interférence (fig.  6.14). Ces interférences
quelles une seule liaison entre une molécule de dépendent de la différence de marche des deux
la cellule circulante et une molécule de la sur- rayons réfléchis, liée à la distance entre la mem-
face arrête la cellule. La durée de l'arrêt est alors brane et la lamelle (modulo ½ longueur d'onde,
une mesure directe de la durée de vie de cette soit environ 200 nm). L'interférence est des-
liaison. Deux types de débits peuvent être envi- tructrice lorsque la membrane est très proche de
sagés, soit mimant les cisaillements physio­ la surface (environ 20 nm). Cette technique
logiques des écoulements artériels, veineux ou permet donc de quantifier l'aire de contact
capillaires, soit réalisant des cisaillements très étroit entre la cellule et la surface sous-jacente,
faibles permettant de gagner en sensibilité. Ces qui apparaît sombre (voir fig. 6.14). Cette aire
débits faibles sont quasi indispensables pour de contact semble être un bon témoin de l'acti-
détecter des liaisons individuelles. Le cisaille- vation cellulaire en réponse à un substrat, en
ment exerce une force calculable sur une liaison particulier lors de la réponse d'un lymphocyte T
et l'utilisation de différents taux de cisaillement à la présence de ligands du TCR.
permet de tester l'effet de forces différentes sur
les liaisons. Des logiciels dédiés détectent les Recommandations de mise en œuvre
trajectoires des cellules à partir des enregistre- Ces techniques très spécialisées nécessitent un
ments vidéo et mesurent le nombre et la durée équipement et un environnement spécifiques. Les
des arrêts. conditions de maintien de la viabilité des cellules
La migration cellulaire en vidéomicroscopie pendant l'observation sont cruciales.
peut être utilisée avec un dispositif proche des flux
laminaires mais sans flux liquidien. Une applica- Avantages/inconvénients
tion est l'étude du chimiotactisme, en ajoutant
une source de molécules chémo-attractantes.
Cette source peut être une micropipette injectant Avantages Inconvénients
le chémo-attractant dans la chambre. Les cellules Mesures très fines et très Appareillage sophistiqué
se dirigent alors vers la pointe de la micropipette. spécifiques d'interactions et dédié
moléculaires à l'échelon
Par comparaison avec les chambres de Boyden, la cellulaire
migration se fait ici sur un substrat contrôlé cellu-
laire ou moléculaire. Il est également possible de
mesurer la migration chimiotactique en ajoutant Exemples d'applications
un flux, le système expérimental étant alors iden-
tique à une chambre à flux laminaire, afin de Ces tests n'ont pas d'applications en routine cli-
mimer l'étape de migration sur l'endothélium sui- nique. Ils offrent par contre beaucoup d'applica-
vant l'étape d'arrêt des leucocytes. tions potentielles en recherche fondamentale.
Le contraste interférentiel en réflexion per- Par exemple, il a été montré que la stimulation
met de quantifier l'aire d'une cellule sur la sur- d'un endothélium par le TNF-α provoque l'ap-
face d'adhésion. La cellule est filmée alors parition d'arrêts nombreux et de longue durée,
qu'elle sédimente sur une lamelle de verre voire définitifs, de leucocytes, du fait de l'expres-
recouverte des molécules d'adhésion étudiées. sion de molécules d'adhésion. La figure  6.14
À l'aide d'un objectif spécial, la cellule est illu- montre les étapes de l'étalement d'un lympho-
minée, et les rayons lumineux réfléchis à l'inter- cyte T sur une surface recouverte d'anticorps
face verre–milieu et milieu–cellule entrent en anti-CD3.
Chapitre 6. Tests cellulaires 143

1 2 3

a b 4 5 6

c
Fig. 6.14  Illustration des étapes et de la mesure de l'adhésion d'un lymphocyte T par microscopie de contraste
interférentiel en réflexion.
a. Schéma de principe de la microscopie de contraste interférentiel en réflexion : un rayon incident I1 illumine la cellule ; un
rayon I2 est réfléchi à l'interface verre–milieu ; un rayon I3 est réfléchi à l'interface milieu–cellule. Les rayons I2 et I3 entrent
en interférence lorsqu'ils forment l'image. Cette interférence dépend de la différence de marche des deux rayons, donc de
la distance membrane–verre H.
b. Séquence d'images d'un lymphocyte T s'étalant sur une surface de verre couverte de CD3. L'aire de contact correspond
aux zones les plus sombres ; le diamètre réel de la cellule est sensiblement égal au diamètre de l'aire de contact visible à
l'image 6 (d'après A. Pierres).
c. Représentation de trajectoires détectées automatiquement de lymphocytes T activés migrant sur une surface de verre
couvert d'ICAM-1 migrant spontanément (le fond de l'image est une image en microscopie en transmission).
Chaque serpentin coloré est la trajectoire d'une cellule (d'après M.P. Valignat et O. Theodoly).
Chapitre 7
Tests in vivo

Pertinence des l'homme. Enfin, le modèle doit répondre de la


modèles animaux même manière que l'homme aux différents traite-
ments pour pouvoir être qualifié de prédictif. Dans
un modèle parfait, ces trois critères seraient rem-
La plupart de nos connaissances en immunologie plis. Toutefois, du fait des différences entre les
sont issues d'études initiales dans des modèles ani- espèces, un compromis doit le plus souvent être
maux, essentiellement murins. Beaucoup de ces trouvé et la priorité est mise sur l'un ou l'autre des
études n'auraient pas pu être menées chez critères en fonction de la problématique envisagée.
l'homme pour des raisons d'éthique évidentes. On distingue plusieurs catégories de modèles
Les différences entre les systèmes immunitaires de animaux. Dans les modèles spontanés, l'affection
l'homme et de la souris sont cependant impor- d'origine naturelle est identique à celle que l'on
tantes et toutes les observations murines ne sont observe chez l'homme. Dans les modèles induits,
pas transposables à l'espèce humaine. Toutefois, la l'affection ou la maladie est reproduite expérimen-
présence chez la souris de gènes équivalents à ceux talement. Les modèles génétiquement modifiés
de l'homme et la possibilité de manipuler facile- utilisent des animaux dont le code génétique a été
ment le génome ont conduit à une multiplication manipulé pour provoquer la maladie à étudier. Les
des modèles murins qui ont permis le développe- modèles négatifs sont résistants à une affection où
ment de nouvelles approches fondamentales et une maladie donnée et l'étude des causes de cet
thérapeutiques. L'American National Research état peut donner des indices sur les fondements
Council Committee on Animal Models for Research physiopathologiques de la maladie. Les modèles
and Aging propose la définition suivante : « En orphelins caractérisent des affections apparaissant
recherche biomédicale, un modèle animal est un naturellement chez les animaux pour lesquelles il
modèle permettant l'étude de données de réfé- n'existe pas d'équivalent chez l'homme. Enfin,
rence sur la biologie ou le comportement, ou chez l'animal peut être utilisé pour produire des anti-
lequel on peut étudier un processus pathologique corps, à visée scientifique, diagnostique ou théra-
spontané ou induit, celui-ci ayant un ou plusieurs peutique, selon des protocoles très maîtrisés.
aspects communs avec un phénomène équivalent
chez l'humain ou d'autres espèces animales. »
Le recours à un modèle doit être décidé selon Les différentes espèces utilisées
trois critères. Le modèle doit présenter des méca-
nismes et des causes identiques à ceux observés La souris est le modèle de choix dans la plupart
chez l'homme, on parle d'homologie. L'isomor- des études en immunologie. Sa petite taille auto-
phisme qualifie la similitude entre les symptômes rise des coûts d'élevage raisonnables et la rend
survenant chez l'animal et ceux observés chez facile à manipuler. De plus le taux de reproduction

Méthodes en immunologie
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146 Techniques immunologiques

Tableau 7.1  Quelques chiffres clés sur la biologie de la gènes spécifiques (EOPS). Il est également pos-
souris (Mus musculus) sible d'élever des animaux axéniques (dépourvus
Durée de vie 1–3 ans de micro-organismes) ou gnotoxéniques (dont
Duré de gestation 19–21 jours l'inventaire de la flore est connu).
Sevrage 3 semaines L'histoire individuelle et les modifications
Maturité sexuelle 4 (F) ou 6 (M) semaines
acquises au cours de la vie de chaque individu sont
identiques, ou presque, et peuvent même être com-
Durée cycle œstral 4–5 jours
parées entre laboratoires. Cette reproductibilité
Poids adulte 18–35 g (F), 20–30 g (M) ainsi que la possibilité de contrôler les paramètres
Poids naissance 1–2 g environnementaux et individuels ont fait le succès
Poids sevrage 10–12 g de la souris comme modèle animal. Indépendamment
Rythme cardiaque 310–840 par minute des considérations éthiques à prendre en compte en
Rythme respiratoire 80–230 par minute expérimentation humaine, de telles conditions de
Température 36,8–38 °C
reproductibilité seraient impossibles à obtenir,
chaque être humain restant unique par son patri-
Volume sanguin 1,5–2,5 mL, 7–8 % poids
moine génétique, son environnement et son vécu.

est rapide et élevé (tableau 7.1). À partir des souris Inconvénients


sauvages, des centaines de souches différentes ont
été développées et entretenues. De nouveaux ani- La souris reste un animal et donc un organisme
maux ont de plus été créés avec la mise en place de complexe. Beaucoup de questions scientifiques
lignées transgéniques. peuvent être abordées dans des modèles plus
Le recours à d'autres animaux se fait soit pour la simples in  vitro (e.g. lignées cellulaires, prélève-
production d'anticorps (e.g. lapins, chevaux, ments biopsiques, organes isolés), qui peuvent
chèvres, ânes), soit pour des études sur l'évolution être plus pertinents. Le recours à l'animal, même
du système immunitaire dans les espèces. à la souris, est coûteux et chronophage, et, sans
préjuger des contraintes législatives et des ques-
tions éthiques, reste réservé aux questions qui ne
Points clés des modèles souris peuvent être résolues par d'autres moyens.

Avantages
Différents types
Le recours à la souris permet d'étudier un système
immunitaire complet, ce qui n'est pas possible
de lignées de souris
in  vitro. La variabilité génétique entre individus La diversité génétique de la souris d'expérimenta-
peut être maîtrisée, elle est quasiment nulle dans tion constitue la variable biologique majeure qui
les lignées consanguines et reste faible dans les justifie l'utilisation de cette espèce dans le domaine
autres lignées. Elle peut être mise à profit entre de la recherche. Les lignées de souris choisies le
différentes lignées. sont en fonction de leurs caractéristiques immuni-
Par ailleurs, les conditions d'élevage permettent taires ou génétiques.
de contrôler de nombreux paramètres environne-
mentaux tels que la température, l'hygrométrie,
l'éclairage et le cycle nycthéméral, l'approvision- Souris non consanguines
nement en eau et en nourriture. De plus, le micro- Une colonie non consanguine (outbred) est une
biome ambiant peut être maîtrisé, ce qui constitue population dans laquelle on cherche à maintenir
un élément clé pour les études immunologiques. une hétérogénéité constante et maîtrisée. Cette
En appliquant des contrôles réguliers et des hétérogénéité génétique implique l'utilisation
mesures de confinement précises, il est possible de d'un grand nombre d'animaux et de nombreux
réaliser des zones exemptes d'organismes patho- contrôles. Les colonies outbred sont généralement
Chapitre 7. Tests in vivo 147

produites par des entreprises internationales dont Souris immunodéficientes


le savoir-faire est centré sur l'élevage d'animaux de La découverte de lignées de souris athymiques
laboratoire. Maintenir sur plusieurs générations (souris nude) présentant un déficit en lympho-
ces animaux dans un laboratoire, avec un faible cytes T a permis de réaliser les premières études
effectif et sans programme de croisement, entraî- d'hétérotransplantation de tissus ou xénogreffes.
nerait une dérive de cette variabilité génétique et Ces modèles reposent sur l'établissement et la
du phénotype à étudier. croissance continue d'hétérotransplants de tissu
humain, néoplasique par exemple, chez des souris
immunodéficientes. La croissance progressive de
Lignées consanguines
tumeurs xénogénétiques chez les souris athy-
Une souche consanguine (inbred) est une popula- miques dépend des propriétés tumorales, comme
tion de souris qui montre des variations géné- l'origine et le type de la tumeur transplantée, et du
tiques minimales à la suite d'accouplements site d'implantation de la tumeur chez la souris
frère–sœur pendant au moins vingt générations hôte (tableau 7.2).
successives. La consanguinité est contrôlée par
sélection afin d'éliminer les mutations délétères et
empêcher les aberrations génétiques. Un certain Tableau 7.2  Exemples de souris immunodéficientes
nombre de marqueurs sérologiques et génétiques fréquemment utilisées
sont utilisés dans les établissements de référence Souche Mutation et/ou Phénotype
détenteurs de ces lignées, pour contrôler les phénotype de l'immuno­
déficience
souches consanguines afin de prévenir la dérive au
cours des générations suivantes. Du fait de la Souris athymique Gène FOXN1, Absence de
nude absence de thymus lymphocytes T
consanguinité, les individus d'une telle lignée sont thymo-dépendants
homozygotes pour tous leurs gènes. En théorie,
Souris SCID Gène PRKDC, Absence de
ils ont moins de 1 % d'hétérozygotie et sont histo- (Severe Combined protéine kinase lymphocytes B et T
compatibles comme de vrais jumeaux humains. ImmunoDeficiency) impliquée dans le matures, présence
Ainsi, pour citer deux des lignées les plus utilisées réarrangement des de cellules NK
en immunologie, toutes les souris C57BL/6 ont gènes du TCR et des fonctionnelles
immunoglobulines
un haplotype MHC de type H2b, alors que celles
Souris NOD Souris SCID avec en Absence de
de la lignée BALB/c sont H2d.
(Non-Obese plus des déficits de lymphocytes B et T,
Diabetic)-SCID l'immunité innée activité NK altérée
Souches fermées ou isogéniques Souris NOD-SCID Souris NOD-SCID Absence de
β2 m−/− avec en plus lymphocytes B, T et
Les techniques de transgenèse imposent d'utiliser un déficit en NK, absence de C5.
des souris dont le fonds génétique est mixte (utili- β2-microglobuline Pas de restriction
sation d'hybrides issus du croisement de deux de classe I
lignées consanguines), pour des raisons empi- Souris NOD-SCID Souris NOD-SCID Absence de lym-
riques et techniques. Pour étudier l'effet de la IL2Rγc−/− (NOG) avec en plus phocytes B, T et NK,
un déficit pour absence de cellules
mutation créée, il peut être nécessaire de procéder la chaîne γ du dendritiques
à une série d'accouplements en retour (backcross) récepteur à l'IL2
avec une lignée consanguine, afin d'obtenir des Souris beige ou Homozygotes pour Anomalies
animaux porteurs de la mutation sur un fonds BNX les régions bg, nu fonctionnelles des
génétique défini. Afin de raccourcir le délai théo- et Xid macrophages, des
rique de dix croisements pour obtenir un fonds granulocytes (ou
« polynucléaires »)
génétique homogène, l'usage de marqueurs géné- neutrophiles, des
tiques polymorphes (speed congenic) entre les cellules NK et des
souches d'origine permet d'obtenir ce résultat lymphocytes T
après environ six générations. cytotoxiques
148 Techniques immunologiques

Souris humanisées male dans l'année suivant sa prise de poste. Tout


Une souris humanisée exprime un ou plusieurs projet de recherche doit avoir été autorisé par un
gènes humains, ou a été greffée avec des cellules, comité d'éthique. Les expérimentations sont réali-
tissus et/ou organes d'origine humaine. Ces sou- sées dans des locaux agréés par des représentants
ris sont de plus en plus utilisées comme modèles départementaux du ministère de l'Agriculture.
animaux en recherche biologique et médicale
pour la thérapeutique humaine. Les souches de
souris immunodéficientes sont souvent utilisées
Transgenèse, KO-KI
pour obtenir des souris humanisées, car en l'ab-
sence d'un système immunitaire pleinement fonc-
Transgenèse additionnelle
tionnel, elles peuvent assez facilement accepter La transgenèse additionnelle consiste en l'ajout
des cellules d'origine hétérologue. La souris à d'un gène au génome d'une souris. Ce gène com-
immunodéficience combinée sévère (SCID) a été prend un ADNc codant pour la protéine d'intérêt
le plus souvent utilisée à cette fin, après greffe par et un promoteur qui pilote l'expression de ce gène
des cellules mononuclées périphériques (PBMC) dans les tissus ciblés (fig.  7.1). La construction
humaines ou par des tissus hémato- ou lympho- d'ADN est introduite par micro-injection dans
poïétiques fœtaux. Les modèles les plus aboutis des ovocytes fécondés de souris, qui sont ensuite
actuellement sont les Humice. Ce sont des souris réimplantés sur des mères porteuses. Il faut comp-
NOD-SCID β2m−/− ou NOD-SCID IL2Rγc−/− ter 3  semaines pour avoir la première naissance
(NOG), irradiées et dont le système immunitaire d'un « fondateur » présent à un taux de 1 à 4 % des
est reconstitué par injection de cellules progéni- naissances, et 3  mois, soit une génération, pour
trices hématopoïétiques (CD34+) humaines, pro- utiliser les premiers animaux.
venant le plus souvent de cordons ombilicaux, ce
qui permet in vivo la reconstitution d'un système Points techniques
immunitaire humain inné et adaptatif.
L'insertion de l'ADN est aléatoire, donc le phéno-
type observé peut être dû à la mutation dominante
Aspects éthiques et législatifs ou récessive d'un gène éventuellement présent au
site d'insertion. Le promoteur n'est pas toujours
Éthique complet, ni autonome au point de gouverner la
structure de la chromatine autour du point d'in-
Les animaux sont capables de souffrir. Utiliser des
sertion. Par conséquent, le niveau d'expression du
animaux à des fins scientifiques ou médicales pose
transgène est influencé par l'environnement du
des problèmes éthiques qu'il faut examiner au cas
site d'insertion. Comme le transgène s'insère sous
par cas. La manipulation des animaux de labora-
forme de répétition en tandem, le niveau d'expres-
toire pose des problèmes techniques ou méthodo-
sion est aussi partiellement influencé par le nombre
logiques qui peuvent nuire à l'animal et que
de copies (entre 10 et 200). C'est pourquoi il est
l'expérimentateur doit chercher à réduire, tant dans
recommandé, lors des premières études, de com-
l'intérêt de l'animal que dans un but scientifique.
parer au moins trois lignées indépendantes issues
C'est ainsi que l'environnement microbien des sou-
de leur propre fondateur afin d'établir l'effet du
ris immunodéficientes doit être contrôlé de façon à
transgène. Par la suite, les laboratoires poursuivent
s'assurer que leur handicap n'en soit plus un.
les études uniquement avec la lignée qui a donné
les meilleurs résultats.
Législatif Les ovocytes dans lesquels sont injectés les ADN
Selon la directive UE 2010/63 et son décret d'ap- sont le plus souvent issus de croisements C57BL/6
plication du 1er février 2013 en France, toute per- × DBA2 pour la recherche en immunologie. Il
sonne travaillant sur des animaux doit avoir reçu existe en effet des anticorps anti-CMH reconnais-
une formation spécialisée en expérimentation ani- sant ces fonds génétiques et de ­nombreuses don-
Chapitre 7. Tests in vivo 149

1. Transgenèse additionnelle
Transgène : allèle
transgénique ; noté « tg »
promoteur ADNc
Transgène : allèle
sauvage indétectable
Ce promoteur permet car locus d’insertion
l’expression de l’ADNc dans un inconnu
Deux prélèvements, mêmes résultats
organe et un seul, noté en vert pour l’analyse de l’ADN
(thymus, lignée de thymocyte,
Transgène : tg / ?
ou autre…)

2. KO ou KI
Exon muté Gène X : allèle muté
noté « - »

Exon wt Gène X : allèle Gène X : - / wt


sauvage, noté « wt »

3. cKO
Cre recombinase :
présence de l’ADNc,
promoteur Cre noté « Cre+ »
Allèle sauvage du
locus correspondant
indétectable car locus
d’insertion inconnu

Exon cKO Gène X : allèle cKO ou Prélèvement dans l’organe ciblé, après
conditionnel ou « floxé », induction si la Cre était inductible :
fonctionnel, noté fl Recombinase : Cre+ / ? ; Gène X : -/-

Exon wt Gène X : allèle


sauvage, noté wt

Gène X : allèle KO ou « - »

Prélèvement dans l’organe non ciblé,


ou avant induction si la Cre était
inductible :
Recombinase : Cre+ / ? ; Gène X : fl/fl

Définition des allèles


Le(s) transgène(s) Lieu du Génome de la cellule et
à génotyper
prélèvement résultats de la PCR

Fig. 7.1  Modèles de transgenèse.


150 Techniques immunologiques

nées bibliographiques sur leur comportement. Il niveau du gène ciblé. Ce minigène est maintenant
peut être nécessaire d'avoir le transgène sur un éliminé en utilisant des recombinases.
fonds génétique pur (lignée syngénique), ce qui Les cellules ES sont souvent de fonds génétique
implique que les fondateurs soient croisés en 129/Sv, non syngéniques, peu utilisées en immu-
retour sur six à dix générations avec une des nologie. Il est parfois nécessaire d'effectuer des
lignées pures parentales. croisements en retour sur une lignée plus utilisée
comme les C57BL/6 afin d'avoir des lignées
Exemples syngéniques.
La lignée de souris DO11.10 qui exprime les Il faut comprendre que le phénotype d'une sou-
chaînes α et β du récepteur TCR d'un hybridome ris mutée pour un gène donné ne se résume pas à
reconnaissant l'ovalbumine a été utilisée pour étu- la situation sauvage plus ou moins le produit du
dier la différenciation des lymphocytes T. gène muté. Ces animaux sont des organismes qui
se sont adaptés, au cours de leur développement
et/ou de leur vie adulte, aux conséquences parfois
Le KO ou KI multiples de la mutation du gène.
Les souris KO (knock-out) ou KI (knock-in) ont un Exemples
de leurs gènes inactivé (KO) ou remplacé par une
version fonctionnelle portant une mutation à étu- Les souris KO pour la chaîne alpha du TCR pré-
dier, voire la version humaine du gène (KI) (voir sentent plus de lymphocytes TCRγδ que les souris
fig. 7.1). La substitution des allèles a été faite dans sauvages. Les souris KO pour le gène TCF-1, cru-
des cellules en culture dans lesquelles a été électro- cial dans le développement de la lignée T, pos-
porée une construction d'ADN comprenant la sèdent néanmoins des lymphocytes T car le facteur
mutation. Les clones de cellules porteuses de la LEF-1 est surexprimé et compense dans une cer-
mutation d'intérêt sont sélectionnés ultérieure- taine mesure le déficit chez les souris mutantes.
ment. Si les cellules utilisées sont des cellules ES
(embryonic stem cells) de souris, elles peuvent Les cKO
ensuite être injectées dans des blastocystes rece-
veurs, pour donner des animaux chimériques per- Les souris KO conditionnelles (cKO) sont basées
mettant d'établir une colonie porteuse de la sur l'utilisation de recombinases d'ADN, Cre ou
mutation. Si d'autres cellules sont transfectées, la FLP, issues respectivement du bactériophage P1
technique de transfert nucléaire permet d'isoler les ou de levures, reconnaissant des séquences spéci-
noyaux de ces cellules et de les injecter dans un fiques (LoxP ou FRT respectivement), naturelle-
ovocyte receveur permettant de nouveau d'obtenir ment absentes dans le génome de la souris. En
des animaux porteurs de la mutation voulue. Le utilisant la même technologie que pour les KO ou
délai d'obtention est de l'ordre de 6 mois à 2 ans. les KI, une lignée de souris est créée dont l'allèle
fonctionnel (sauvage ou muté) est encadré par
Points techniques deux séquences LoxP. Les séquences FRT sont
utilisées pour exciser le minigène de sélection. Ces
La mutation est ponctuelle. Certains transcrits
souris sont ensuite croisées avec des lignées trans-
issus d'épissage alternatif peuvent ne pas porter la
géniques (transgenèse additionnelle) qui expri-
mutation si un exon clé de la fonctionnalité du
ment la Cre recombinase dans le tissu voulu et/ou
gène n'a pas été ciblé. L'absence de la protéine
au moment voulu (voir fig. 7.1).
d'intérêt, ou son remplacement par la version
mutée pour les KI, doit être vérifiée avant la pour-
Points techniques
suite de l'étude du phénotype. Sur les premières
versions des KO, il subsistait dans le génome un Le point clé est la lignée de souris transgéniques
minigène de sélection, qui pouvait éventuellement qui expriment la Cre recombinase dans le tissu ou
perturber la régulation de la transcription au la lignée cellulaire ciblée, avec un taux suffisant
Chapitre 7. Tests in vivo 151

pour recombiner tous les sites présents dans topes antigéniques aux lymphocytes T. L'activation
l'ADN de ces cellules, mais sans « fuite » d'expres- et la prolifération cellulaire qui en résulte abou-
sion dans d'autres lignages cellulaires. Une bonne tissent à la formation d'une réaction inflammatoire
recherche bibliographique et une discussion avec localisée, visible au bout de 48 heures. Ces tests
les auteurs des précédentes études sont requises. permettent de mettre en évidence une sensibilisa-
Certaines lignées de souris expriment dans un tion cellulaire, de type hypersensibilité retardée,
tissu choisi une Cre inductible par le tamoxifen, ce c'est-à-dire la présence de lymphocytes T spéci-
qui permet de contrôler à la fois le lieu et le fiques d'antigène, à activité pro-inflammatoire.
moment de l'expression de la recombinase. Les prick-tests comportent une petite piqûre de
Pour contrôler l'efficacité de l'excision du cKO, la peau permettant à la substance testée de péné-
il existe des transgènes rapporteurs, où l'expres- trer sous l'épiderme. Son contact avec les masto-
sion de la β-galactosidase (ou d'une protéine fluo- cytes de la peau permet de détecter rapidement
rescente) nécessite une excision par la Cre. Cela une hypersensibilité immédiate dépendante des
implique une troisième souris transgénique, donc IgE spécifiques fixées sur ces cellules. La réaction
encore plus de temps pour les croisements. cutanée se développe très rapidement, dans les
Le point pratique est le temps pour ces croise- 20 minutes suivant le test.
ments : outre le délai pour obtenir les lignées à Les intradermoréactions consistent à introduire
croiser, il y a le temps de franchir les barrières sani- une petite quantité d'antigène directement dans le
taires propres à chaque animalerie, et celui des derme. Elles sont utilisées aussi bien pour la détection
croisements pour obtenir des animaux homo- des hypersensibilités immédiates, en complément des
zygotes pour le cKO et hétérozygotes pour le prick-tests, que pour la détection des hypersensibili-
transgène d'expression de la Cre. tés retardées, en complément des patch-tests.

Exemple Méthodologie
La lignée Mx1-Cre, où l'expression de la Cre peut Les patch-tests sont généralement effectués à
être induite par l'IFN-α, l'IFN-β, ou l'ARN l'aide de cupules en aluminium, de 8 à 12 mm de
double brin, a été utilisée pour étudier la différen- diamètre, dans lesquelles la substance à tester est
ciation T. déposée, soit directement, soit après imbibition
d'un disque de papier. Ces cupules permettent
d'isoler les différents antigènes testés. L'ensemble
Tests cutanés des tests réalisés, en général sur la partie haute du
dos, est recouvert d'un adhésif maintenu en place
Les réponses immunitaires induisent une mémoire jusqu'à la lecture du test. La position de chaque
qui est aussi désignée sous le terme de sensibilisa- substance, ainsi que d'un témoin négatif sans anti-
tion. La mise en évidence d'une sensibilisation à gène, doit être soigneusement notée, le plus sou-
un antigène ou à un allergène est le plus souvent vent directement à même la peau du sujet. Chez
recherchée in vitro, mais elle peut également être l'animal, ce type de test est classiquement réalisé
détectée par des tests cutanés réalisés in vivo, chez sur l'oreille.
l'animal ou chez l'homme. Selon le type de test Les prick-tests sont réservés à l'exploration de
réalisé, différents compartiments de l'immunité l'allergie immédiate chez l'homme. Ils sont réalisés
de l'individu testé sont explorés. en consultation ou en hôpital de jour. La réaction
Les tests cutanés les moins invasifs sont les patch- se résout spontanément en quelques heures. Là
tests (tests épicutanés) qui consistent à déposer une encore, une identification précise des substances
petite quantité d'antigène ou d'allergène sur la testées est nécessaire. Un témoin positif de la dégra-
peau, sans effraction. Les cellules dendritiques nulation des mastocytes est réalisé par un prick-test
cutanées de l'épiderme (cellules de Langerhans) et à la codéine, un témoin positif de vasodilatation et
du derme captent, apprêtent et présentent les épi- vasoperméation est réalisé par un prick-test à
152 Techniques immunologiques

l­'histamine. De l'eau distillée ou du sérum physio- Les tests cutanés, et en particulier les intradermo-
logique sont utilisés pour le témoin négatif, qui ne réactions, doivent donc être réalisés chez l'homme
doit montrer aucune réaction et permet de détecter dans un environnement médical approprié, apte à
les sujets présentant un dermographisme caracté- gérer les situations d'urgence allergologique.
risé par une dégranulation spontanée des masto-
cytes. Une réaction observée sur le témoin négatif
Avantages/inconvénients
complique l'interprétation des tests spécifiques.
Les intradermoréactions nécessitent de bien
Test Avantages Inconvénients
connaître la technique d'injection, qui ne doit pas
Patch-tests Hypersensibilité Réponses
franchir le derme. Elle s'effectue en plaçant l'ai-
retardée différentes aux
guille de la seringue à un angle d'environ 15° par Réponses substances pures ou
rapport à la surface de la peau tendue. L'apparition cellulaires T sous leur forme
d'une tuméfaction (en peau d'orange), correspon- Multiples antigènes galénique
testés Lipo/hydrosolubilité
dant à l'accumulation de la substance injectée simultanément Délai de lecture :
dans le derme, témoigne d'une intradermoréac- Simple contact 48 à 72 h
tion bien conduite. Si aucune tuméfaction n'appa- cutané Risque de
raît, c'est que l'injection a été sous-cutanée et sera réactivation de
l'hypersensibilité
ininterprétable. À l'inverse des patch-tests, aucune
protection de la zone d'injection n'est nécessaire. Prick-tests Hypersensibilité Sensibilité modérée
immédiate à cause des très
Pour l'ensemble de ces tests, il est classique Multiples allergènes faibles doses
d'utiliser plusieurs dilutions des substances exami- testés d'antigène
nées. La concentration la plus forte possible doit simultanément administrées
Spécificité extrême,
être employée, tout en évitant les réactions pure-
même à des traces
ment toxiques, irritantes et non immunologiques. d'allergène
Intradermoréactions Hypersensibilité Difficultés de
(IDR) immédiate et réalisation
Recommandations de mise en œuvre retardée Délai de lecture pour
En dehors de la série de dilutions mentionnée ci- Réponses l'hypersensibilité
cellulaires T retardée
dessus, il convient d'utiliser le bon excipient pour Risque de réactivation
les substances testées. Pour les patch-tests, un vec- de l'hypersensibilité
teur liposoluble comme la vaseline est souvent pré- immédiate ou
retardée
férable car la majorité des allergènes testés sont
lipophiles. De plus, l'épiderme constitue une bar-
rière efficace empêchant le passage des antigènes Exemples d'applications
hydrosolubles. Des solutions alcooliques peuvent • En recherche : les tests cutanés sont très pré-
également être employées. Les réactions d'hyper- cieux pour étudier les réponses cellulaires d'un
sensibilité peuvent dépendre du principe actif d'une animal. L'application de l'antigène sur l'oreille
drogue ou d'un allergène majeur, mais peuvent éga- d'une souris ou d'un cobaye est un excellent
lement être liées à sa combinaison avec un excipient moyen de mesurer la réponse cellulaire générée
ou ses conditions de préparation. Il est donc utile de ou modulée expérimentalement.
tester les produits suspectés à la fois dans des condi- • En clinique :
tions de pureté optimale et dans leur forme usuelle. – les tests cutanés font partie de l'arsenal dia-
Un des problèmes majeurs de l'utilisation des tests gnostique des allergologues. Leur mise en
cutanés est le risque de réactivation d'une réponse œuvre est guidée par les éléments cliniques
systémique. C'est en particulier le cas des réponses observés par le médecin et rapportés par le
d'hypersensibilité immédiate, pour lesquelles un patient. L'interrogatoire est un élément
choc anaphylactique peut être induit suite à la réin- majeur pour décider des tests à réaliser, au
troduction d'une très petite quantité d'allergène. cours d'une enquête détaillée ;
Chapitre 7. Tests in vivo 153

– les patch-tests sont très utilisés pour le dia- Ils sont employés pour le diagnostic en aller-
gnostic des eczémas de contact et des toxider- gologie respiratoire (asthme, rhinite, conjonc-
mies (hypersensibilités retardées aux tivite), alimentaire, médicamenteuse et aux
médicaments). Ces affections peuvent cepen- venins d'hyménoptères (anaphylaxie). Là
dant concerner toutes sortes de produits encore, le produit natif est privilégié par rap-
comme le nickel des bijoux ou d'objets usuels port à des antigènes purifiés ou recombinants.
ou encore les colorants capillaires (paraphé- L'existence de réactions croisées (e.g. kiwi et
nylènediamine) utilisés par les coiffeurs et les latex) doit être prise en considération ;
conservateurs (méthylisothiazolinone). Dans – les intradermoréactions ont surtout été utili-
le cas des toxidermies, l'utilisation de la forme sées pour mettre en évidence l'efficacité d'une
galénique de la drogue est importante car la vaccination antituberculeuse ou un contact
sensibilisation cellulaire peut être liée à la for- avec Mycobacterium bovis. Elles tendent à être
mation de néo-épitopes entre la substance remplacées par les IGRA8. Leur utilisation
active et son excipient. Les patch-tests ont pour le diagnostic d'hypersensibilité retardée
également été longtemps utilisés pour vérifier à un autre antigène, en particulier médica-
l'efficacité d'une vaccination contre la tuber- ment, est plus dangereuse que la réalisation
culose, sous forme de « cuti-réaction » ; de patch-tests, qui leur sont préférés.
– les prick-tests sont préférentiellement utilisés
pour le diagnostic des allergies immédiates.

8
 IGRA (interferon gamma release assay) testé en mesu-
rant la production plasmatique d'interféron ou en recher-
chant les cellules productrices d'interféron en ELISpot.
Chapitre 8
Exploration du complément

Complément hémolytique d'attaque membranaire. Des globules rouges de


mouton recouverts d'anticorps anti-globules
rouges de mouton sont utilisés comme cible pour
Le complément représente un élément essentiel
le CH50 qui mesure l'activité de la voie classique.
de l'immunité innée dont l'activation se déclenche
Des globules rouges de lapin ou d'oiseau dont la
spontanément en réponse à une agression. La
membrane est pauvre en acide sialique et directe-
fonction générale du complément peut être éva-
ment activatrice sont utilisés pour la VA50 qui
luée par des tests d'hémolyse mettant en jeu des
mesure l'activité de la voie alterne. Un tampon de
globules rouges non humains.
faible force ionique (e.g. DGVB++ pour Dextrose
Méthodologie (fig. 8.1) Gelatin Veronal Buffer supplémenté en cations
divalents) ajusté pour son contenu en calcium
Les examens fonctionnels évaluent la capacité de
(0,15 mM) et en magnésium (0,5 mM) est utilisé.
développement des activités enzymatiques portées
Les tests s'effectuent à une température de 37 °C.
par les convertases et l'assemblage du complexe
L'hémolyse résultant de l'activation du complé-
ment de l'échantillon est mesurée par comparai-
CH50 VA50 son à un témoin d'hémolyse à 100 % (eau distillée)
(voie classique) (voie alterne) et à un témoin négatif (tampon seul). Les unités
CH50 et VA50 correspondent au volume d'échan-
tillon nécessaire pour lyser 50 % des érythrocytes
cibles.
Hématies de mouton Hématies de lapin
sensibilisées par des anticorps ou d’oiseau
Recommandations de mise en œuvre
Pour éviter l'activation in vitro du complément, le
Ca++, Mg++ Mg++
plasma hépariné est à proscrire et il est préférable
d'examiner le plasma citraté ou EDTA. Le prélè-
Incubation à 37 °C en présence
vement de sang total doit être acheminé rapide-
du sérum ou du plasma ment du fait de la labilité des protéines et des
enzymes du complément.

Mesure de l’hémolyse Exemples d'applications


Fig. 8.1  Principe méthodologique des tests L'hypocomplémentémie se définit comme la
hémolytiques du complément. baisse de la fonction hémolytique du complément
Méthodes en immunologie
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158 Exemples d'applications

sérique et plasmatique, estimée par les tests CH50 tions récidivantes. Ainsi, chez les patients dévelop-
et VA50. pant des infections récurrentes à Neisseria
L'hypocomplémentémie par activation est le (sérotypes rares W135 et Y), l'incidence des défi-
fait de la mise en jeu intensive d'une convertase. cits en complément est estimée à 20 %.
Ce phénomène pathologique est contrôlé et tran- Les stratégies d'exploitation des tests hémolytiques
sitoire ; la disparition du processus activateur sont illustrées sur la figure 8.2.
pathologique s'accompagne d'un retour à la nor-
male. Une diminution du CH50 est associée à la
baisse fonctionnelle des composants de la conver- Dosage des fractions,
tase classique, par exemple C2 ou C4. Dans la expression des récepteurs
situation particulière des cryoglobulinémies de
type II, l'hypocomplémentémie est associée à la Les évaluations quantitatives des protéines du
baisse de C4 par fixation de C4b à la cryoglobu- complément sont basées sur le principe de la réac-
line, sans engagement associé de la convertase tion antigène–anticorps. Pour que cette réaction
classique. Le plus souvent, l'antigénémie de C3 soit mesurable, il suffit donc de disposer de la pro-
reste subnormale, exceptionnellement effondrée. téine antigène cible en quantité suffisante (e.g.
L'hypocomplémentémie par activation de la voie sérum à tester contenant la fraction recherchée) et
classique est retrouvée dans des vascularites, le d'un anticorps d'affinité élevée pour sa cible pour
lupus érythémateux systémique, les cryoglobuli- former un complexe stable capable de précipiter à
némies mixtes et les glomérulonéphrites post- l'équivalence.
infectieuses. Une diminution du VA50 est associée
à une baisse de C3, rarement du facteur B. Méthodologies
L'activation de la seule convertase alterne est un
Techniques quantitatives
événement rare, observé dans des chocs septiques
et les glomérulonéphrites avec présence de facteur La précipitation en milieu liquide investiguée par
néphritique (C3nef). néphélémétrie mesure la dispersion de la lumière
Une forte mise en jeu de la convertase classique qu'entraîne la formation de complexes immuns.
peut être conjointe au ou entraîner le développe- Une gamme permet de tracer et de mémoriser la
ment de la convertase alterne, avec consommation courbe du signal électrique en fonction de la
de facteur B. Cette situation est retrouvée au concentration d'antigène. Le suivi du résultat
cours des glomérulonéphrites, des infections d'un contrôle journalier permet de valider la stabi-
sévères, de la vascularite urticarienne hypocom- lité de cet étalonnage. On peut également utiliser
plémentémique de Mac Duffie (inconstant) ou la turbidimétrie, toujours en présence d'un stan-
des connectivites en période active, notamment le dard en plusieurs dilutions pour tracer une courbe
lupus érythémateux systémique. d'étalonnage. La précipitation en milieu gélifié par
Il existe également des hypocomplémentémies immunodiffusion radiale peut être employée pour
par déficit héréditaire. La forte baisse d'un com- les protéines du complément ne pouvant pas être
posant évoque une anomalie ou un polymor- examinées sur un automate. Dans ce cas, la frac-
phisme génétique. Il est estimé que 0,05 % de la tion recherchée contenue dans le sérum testé dif-
population occidentale est affectée par un déficit fuse au sein d'un gel d'agarose contenant un
primaire complet du complément porté par l'hé- anticorps précipitant polyclonal qui lui est spéci-
rédité (affectant les deux allèles). Les hypocom- fique. La concentration d'antigène est propor-
plémentémies par déficit s'associent, pour les tionnelle au diamètre au carré de l'anneau de
composants de la convertase classique, à des mala- précipitation. Cette technique est longue, de sen-
dies à complexes immuns et à des connectivites. sibilité moyenne et nécessite des quantités impor-
Les déficits en composants de la convertase tantes d'antisérum.
alterne, de la voie des lectines et du complexe Des ELISA sont disponibles pour doser les pro-
d'attaque membranaire se traduisent par des infec- téines du complexe d'attaque membranaire, les

CH 50 , C3 N ou , C4 N ou

• Syndrome inflammatoire
• Cancers et hémopathies malignes
Hypercomplémentémies • Hépatites aiguës
• Infarctus du myocarde à la phase
aiguë

CH 50 - C3 - C4

Hypocomplémentémies

CH 50 C3 C4
CH 50 C4 CH 50 C4 N

Chapitre 8. Exploration du complément 159


C3 N C3 N
Déficit C4 hétérozygote Déficit en C2
Déficit en C1Inh Déficit en complexe
d’attaque membranaire
• Activation de la convertase classique
Déficit en C1 q,r,s
Infections
Maladies auto-immunes : LED, PR avec
C3 N ou vascularites C3
• Activation modérée de la voie classique Cryoglobuline mixte essentielle ou de type II Activation de la convertase alterne
Infection VIH, Lupus hors poussées Hémopathies malignes (Kahler…) Glomérulonéphrite membrano-
• Activation par une cryoglobuline Glomérulonéphrite post-streptoccique proliférative
(hépatite C) • Déficit acquis C3nef
C1 C4 C2 C3N Dénutrition, grands brûlés, insuffisance Septicémies à Gram négatif
• Activation in vitro par des complexes hépatique Glomérulonéphrites post-infectieuses
immuns Lipodystrophie partielle
CH 50, C3, C4 normaux dans le plasma

Fig. 8.2  Données issues de l'exploration du complément.


160 Exemples d'applications

protéines de contrôle et les anaphylatoxines ou les immunoglobulines à haute concentration peuvent


auto-anticorps dirigés contre des fractions du précipiter de façon non spécifique. Les automates
complément, par exemple : anticorps anti-C1q, recueillant des mesures cinétiques pourront pallier
anti-C1 inhibiteur (C1Inh), anti-facteur H. les limites d'un excès d'antigènes.

Techniques semi-quantitatives
Exemples d'applications (tableau 8.1)
La détection de fragments de clivage, de chaînes
polypeptidiques issues d'une protéine ou d'associa- La néphélémétrie est couramment utilisée pour
tion de protéines du complément sous forme de doser les fractions C3, C4, C1q, C1Inh, le facteur
complexes peut être réalisée par séparation électro- B et C5. L'immunodiffusion radiale est réservée
phorétique et révélation immunologique par un aux protéines de concentration supérieure à
anticorps spécifique. Des techniques d'immuno- 20  mg/L avec un anticorps polyclonal d'affinité
électrophorèse en agarose permettent de mettre en suffisante. Cette technique n'est pas applicable
évidence des fragments de C3, le facteur néphritique pour C2 et le facteur D. Des ELISA sont appli-
C3nef et les polymorphismes de C4. Des espèces cables pour toutes les protéines à condition de
moléculaires circulantes (e.g. C1Inh, C8) peuvent disposer d'au moins deux types d'anticorps pour
être détectées par une technique de western-blot. mettre en œuvre la technique sandwich.

Recommandations de mise en œuvre Récepteurs du complément


La néphélémétrie nécessite des échantillons rigou- (tableau 8.2)
reusement limpides. Les sérums troubles ou lipé- L'expression des récepteurs du complément sur
miques sont centrifugés (12 000 × g) ou filtrés les leucocytes est évaluée par cytométrie en flux.
(0,4 μ). La lecture néphélémétrique peut aussi Des tests fonctionnels spécifiques peuvent être mis
être perturbée par des sérums ictériques ou hémo- en œuvre comme la phagocytose de particules
lysés et une lecture (blanc) doit être effectuée opsonisées par le complément. Les anomalies
avant addition des anticorps pour éliminer cette d'expression des récepteurs du complément sont
interférence. Les facteurs rhumatoïdes et les identifiées par examen génétique.

Tableau 8.1  Synopsis du bilan du complément*


CH50 C3 Ag C4 Ag C4 Facteur B Examens Pathologies associées
fonctionnel complémentaires
Activation de la ↓ N ou ↓ ↓ ↓ N C1q Connectivite (lupus)
convertase classique Ac anti-C1q Infections à répétition
Exploration de C1Inh Angiœdème
Activation de la N ou ↓↓ ↓↓ N N ↓ VA50** Syndrome hémolytique et
convertase alterne Parfois N Facteur H urémique (SHU) atypique
Facteur I Dégénérescence maculaire
C3nef liée à l'âge (DMLA)
Infections à pyogènes
Glomérulonéphrite mem-
brano-proliférative (GNMP)
Activation des ↓↓ ↓↓ ↓↓ ↓↓ ↓ VA50** C3nef Glomérulopathie à C3, infec-
convertases classique Complexe d'attaque tions récurrentes à Neisseria
et alterne membranaire (C5 à C9) meningitidis
Activation (ou poly- N N N ou ↓ N ou ↓ N Mannan binding lectin Infections à pyogènes
morphisme génétique) (MBL) pondéral et Pathologies auto-immunes et
de la voie des lectines fonctionnel maladies vasculaires
* Les valeurs abaissées, normales ou élevées sont identifiées respectivement par les caractères ↓, N ou ↑.
** VA50, test hémolytique évaluant la fonctionnalité de la convertase alterne.
Chapitre 8. Exploration du complément 161

Tableau 8.2  Les récepteurs du complément


Protéine Structure et masse Ligand Distribution cellulaire Rôles
CR1 Glycoprotéine, 1 chaîne C3b, C4b, iC3b, C3c Érythrocytes, neutrophiles, Fixation et transport complexes
(CD35) Type A : 190 kDa éosinophiles, monocytes, immuns, cofacteur du facteur I,
Type B : 220 kDa lymphocytes B et T, cellules NK, régulation des C3 convertases,
Type C : 160 kDa cellules folliculaires dendri- opsonisation
Type D : 250 kDa tiques, cellules épithéliales
CR2 Glycoprotéine, 1 chaîne, C3d, C3dg, iC3b, C3b Lymphocytes B, cellules NK, cel- Récepteur de l'EBV, régulation
(CD21) 140 kDa Virus d'Epstein-Barr lules folliculaires dendritiques, des fonctions des lymphocytes B
(EBV) cellules épithéliales, plaquettes
CR3 Glycoprotéine, 2 chaînes iC3b, C3dg, LPS, Neutrophiles, éosinophiles, Adhésion cellulaire
(CD11b/18) α : 165 kDa, β : 95 kDa Fibrinogène monocytes, lymphocytes T, et phagocytose
cellules NK, cellules folliculaires
dendritiques
CR4 Glycoprotéine, 2 chaînes iC3b Neutrophiles, monocytes, Adhésion cellulaire
(CD11c/18) α : 150 kDa, β : 95 kDa lymphocytes T, cellules NK et phagocytose
C5aR Glycoprotéine trans- C5a, C5a-desArg Mastocytes, monocytes, neu- Activation non immune du mas-
(CD88) membranaire intégrale, 1 trophiles, basophiles, cellules tocyte, chimiotaxie, perméabilité
chaîne, 42 kDa endothéliales vasculaire
C5L2 Glycoprotéine trans- C5a, C5a-desArg, Mastocytes, neutrophiles, Modulation de l'activité de C5a
membranaire intégrale, 1 C3a, C3a-desArg, C4a, macrophages, cellules
chaîne, 36 kDa C4a-desArg dendritiques
C3aR Glycoprotéine trans- C3a Mastocytes, monocytes, neutro- Activation non immune
membranaire intégrale, 1 philes, basophiles, éosinophiles, du mastocyte, chimiotaxie,
chaîne, 54 kDa lymphocytes T contraction des muscles lisses
C1qRp Glycoprotéine polymé- C1q : région collagène Monocytes, fibroblastes, lympho- Opsonisation
rique (monomère 65–70 Mannan binding lectin cytes B, neutrophiles, plaquettes,
kDa) (MBL), surfactant (SPA) cellules endothéliales
CRIg Glycoprotéine, 1 chaîne, iC3b, C3b Macrophages tissulaires Phagocytose
45/55 kDa superfamille
des Ig
MCP (CD46) Glycoprotéine, 1 chaîne, C3b, C4b Toutes les cellules nucléées Immunorégulation, récepteur
46 kDa de plusieurs pathogènes
DAF (CD55) Glycoprotéine, 1 chaîne, C4b2a, C4b2a3b, Ubiquitaire à la surface des Régulateur des convertases,
70 kDa C3bBb, C3bBbC3b cellules sanguines et tissulaires récepteur des virus Coxsackie
(ancre GPI)
Protectine Glycoprotéine, 1 chaîne, C5b678 Ubiquitaire à la surface des Contrôle du complexe d'attaque
(CD59) 18 kDa cellules sanguines et tissulaires
(ancre GPI)

Ligands du complément Ces petits ligands solubles de faible masse molé-


culaire sont les anaphylatoxines C3a, C5a et C4a,
douées de propriétés chimiotactiques et anaphyla-
Au cours de l'activation du complément, les
toxiques (perméabilité endothéliale, contraction
convertases (C4b2a pour les voies classiques ou
des bronchioles). Les anaphylatoxines et/ou leurs
des lectines et C3bBb pour la voie alterne)
produits de dégradation (C3a-desArg, C5a-
assurent la protéolyse limitée de C3. Cette réac-
desArg, C4a-desArg) peuvent être quantifiés par
tion permet à C3, C4 et C5 d'effectuer la transi-
des techniques ELISA avec des anticorps
tion d'une forme soluble à une forme associée à
spécifiques.
l'accepteur en libérant un petit ligand diffusible.
162 Exemples d'applications

Les gros fragments présentent après clivage un après électrophorèse bidimensionnelle (fig. 8.3b)
site leur permettant de se fixer à un groupement ou par un test hémolytique.
hydroxyle (ou aminé pour C4) de l'accepteur par Le tableau  8.3 récapitule les récepteurs et les
liaison ester covalente. Ces ligands bifonction- fonctions des différentes fractions du complément
nels, C3b, C3bi, C3dg/C3d et C4b, interagissent et de leurs fragments.
ainsi à la fois avec la cible de l'activation du com-
plément et avec des récepteurs cellulaires spéci-
fiques des cellules effectrices du système Exploration de l'angiœdème
immunitaire. La détection de ces ligands dans les
liquides biologiques est possible par immunoblot L'angiœdème à kinines se traduit cliniquement
(C3, C3bi et C4b, fig. 8.3a) ou par ELISA (C3b, par des œdèmes blancs, généralement non pruri-
C3bi et C3d). gineux et sans urticaire, spontanés et récurrents
La recherche des fragments de coupure de C3 affectant les tissus sous-muqueux et sous-cutanés.
concerne aussi l'activité du facteur néphritique Ils sont la conséquence de l'accumulation des
(C3nef), auto-anticorps stabilisant la C3 conver- kinines, bradykinine et desArg9-bradykinine sur les
tase, retrouvé chez environ 10 % des patients récepteurs endothéliaux. La figure  8.4 décrit le
atteints de glomérulonéphrite membrano-prolifé- processus de production et de catabolisme de ces
rative. C3nef est recherché par immunofixation deux ligands.

1 2 3
C3 C3b iC3b C3 C3b iC3b C3d
α
chaîne α 100 α’ chaîne α
chaîne α’ 98
75 chaîne β
α’1
50
chaîne β
chaîne α1 71
C3dg
37 chaîne γ
C3d

a anti-C3 + anti-C3d anti-C3 (Clone 3d11) anti-C4

C3 natif C3 converti

Sérum témoin

Sérum patient

Sérum patient + sérum témoin + EDTA

Sérum patient + sérum témoin + Mg++


b
Fig. 8.3  Fragments de C3 et de C4 sériques.
a. Western-blot : ① et ② protéines humaines purifiées (fragments de C3), ③ fragments de C4 (sérum humain normal).
b. Électrophorèse bidimensionnelle du sérum montrant une activité facteur néphritique C3 (C3nef).
Chapitre 8. Exploration du complément 163

Tableau 8.3  Ligands du complément, ses récepteurs et ses fonctions


Ligand Récepteur Durée de vie du Fonction induite
ligand
Ligands diffusibles
MBL* cC1qR Opsonisation
C1qRp
Ficolines cC1qR Opsonisation
C1q cC1qR Élimination des complexes immuns
C1qRp Effet antiprolifératif sur les lymphocytes B in vitro
gC1qR
Ligands bifonctionnels à fixation covalente à l'accepteur
C3b CR1 (CD35) 10 minutes Opsonisation
MCP2 (CD46) Adhérence immune
C3bi CR1 (CD35) Quelques heures Opsonisation
CR2 (CD21)
CR3 (CD11b/CD18)
CR4 (CD11c/CD18)
MCP** (CD46)
C3d (C3d,g) CR1 (CD35) > 24 heures CR2 : modulation de la réponse des cellules B
CR2 (CD21) CD46 : orientation des cellules T naïves
CR3 (CD11b/CD18) CR1, CR3 : opsonisation
MCP2 (CD46)
C4b CR1 (CD35) 10 minutes Opsonisation
MCP** (CD46)
Anaphylatoxines
C3a C3aR 7 minutes Chimiotactisme, immunorégulation des lymphocytes B et T,
C3a-desArg C3aR (faible affinité) 2 heures augmentation de la perméabilité vasculaire
C5a C5aR (CD88) 2–3 minutes Chimiotactisme, régulation de la réponse immunitaire
C5a-desArg C5aR (CD88) 2 heures des lymphocytes B et T, augmentation de la perméabilité vasculaire
C4a C3aR 2–3 minutes Chimiotactisme, augmentation de la perméabilité vasculaire
* MBL = Mannan Binding Lectin.
** MCP = Membrane Cofactor Protein.

L'exploration biologique des angiœdèmes à • l'exploration génétique des gènes de causalité


kinines repose sur l'examen de plusieurs para- ou de susceptibilité ;
mètres décisionnels : Le tableau 8.4 décrit les analyses enzymatiques
• la kininoformation, ou capacité de production de l'exploration des angiœdèmes à kinines.
des kinines, par la mesure de l'activité kinino­
génase spontanée du plasma et de l'activabilité Méthodologie
des pro-enzymes ;
• l'efficacité des systèmes de contrôle de la kinino- La concentration en C1Inh est déterminée par
formation par C1Inh, avec les mesures de l'anti- néphélémétrie, ce qui discrimine les situations
génémie et de l'activité de contrôle de C1Inh d'angiœdème avec défaut quantitatif de C1Inh
vis-à-vis de sa cible analytique, la protéase C1s ; (angiœdème de type I) des situations de défaut
• l'activité des enzymes du catabolisme des qualitatif (type II). La fonction de C1Inh est éva-
kinines : aminopeptidase P, carboxypeptidase N, luée par l'activité résiduelle de la protéase C1s
enzyme de conversion de l'angiotensine-I, après incubation avec le plasma. Les espèces molé-
dipeptidyl peptidase IV ; culaires de C1Inh et du kininogène de haut poids
164 Exemples d'applications

Endothélium
HK FXII
pKK

FXIIa
KK
Sang C1Inh
HK

Bradykinine Arg1 Pro2 Pro3 Gly4 Phe5 Ser6 Pro7 Phe8 Arg9 COOH

APP ECA ECA

Métabolites inactifs CPN

APP ECA

desArg9-bradykinine Arg1 Pro2 Pro3 Gly4 Phe5 Ser6 Pro7 Phe8 COOH

Fig. 8.4  Métabolisme des kinines bradykinine et desArg9-bradykinine.


APP : aminopeptidase P ; C1Inh : C1 inhibiteur ; CPN : carboxypeptidase N : ECA : enzyme de conversion
de l'angiotensine-I ; FXII : facteur XII ou facteur Hageman ; FXIIa : facteur XII activé ; HK : kininogène de haut
poids moléculaire ; KK : kallicréine ; pKK : prékallicréine.

Tableau 8.4  Analyses enzymatiques de l'exploration de l'angiœdème


Paramètre Échantillon Activité mesurée Principe Signification Substrat Type de méthode
C1 inhibiteur
C1 inhibiteur Plasma citrate Protéase C1s Activité C1s Capacité de Benzoyl-L-Arg-ethyl ester Cinétique
fonctionnel ou EDTA résiduelle après contrôle par Ethyl-Lys-Gly-Arg-pNA spectrophotométrique
inhibition par C1Inh C1Inh Meoc-Lys-Gly-Arg-pNA
Kininoformation
Activité kininogé- Plasma citrate Enzymes clivant HK Capacité du plasma Activité HD-Pro-Phe-Arg-pNA Cinétique
nase spontanée (principalement : à cliver HK spontanée du spectrophoto­
kallicréine) plasma métrique
Activité des Plasma citrate Réserve de Activation
proenzymes pro-enzymes chronique
(activation par le
dextran sulfate)
Chapitre 8. Exploration du complément 165

Tableau 8.4 Suite

Paramètre Échantillon Activité mesurée Principe Signification Substrat Type de méthode


Catabolisme des kinines
Aminopeptidase Plasma citrate Activités enzyma- Catabolisme de BK Dégradation Lys-(Dnp)-Pro2-Gly-Lys- Cinétique
P (APP) tiques spécifiques (2e rang) et desArg9- de BK et (Abz)-NH2 spectrofluorimétrique
BK (1re rang) desArg9-BK
Carboxypeptidase Plasma citrate Transformation de Dns-Ala-Arg Fluorimétrie en point
N (CPN) BK en desArg9-BK final avec extraction
chloroformique du
produit
Enzyme de Plasma citrate Catabolisme de BK Furylacryloyl-Phe-glycyl- Cinétique spectro-
conversion de (1re rang) et desArg9- Gly photométrique
l'angiotensine-I BK (2e rang)
(ECA)
Dipeptidyl pepti- Plasma citrate Catabolisme de L-Gly-Pro-pNA Cinétique
dase IV (DPPIV) BK, desArg9-BK et spectrofluorimétrique
substance P
BK : bradykinine ; C1Inh : C1 inhibiteur ; desArg9-BK : desArg9-bradykinine ; HK : kininogène de haut poids moléculaire.

moléculaire s'examinent par électrophorèse suivie F12 a été identifiée comme causale, elle est retrouvée
d'une révélation par immunoblot (tableau 8.5). à l'état hétérozygote chez moins de 10 % des patients.
Les quantités de bradykinine et de desArg9-bra- La baisse de l'activité aminopeptidase P s'associe fré-
dykinine produites lors d'une crise ne sont pas quemment au polymorphisme -2399A dans le gène
accessibles directement en raison de leur demi-vie XPNPEP2, porté par le chromosome X.
très courte. Par contre, il est possible d'activer
in vitro le plasma par le sulfate de dextran et de
Recommandations de mise en œuvre
suivre la cinétique de production des kinines pro-
duites, proportionnelle à la quantité résiduelle de La fonction de C1Inh est peu soumise à variabilité
kininogène natif, accédant par défaut à la part dans le temps ; on note seulement une discrète
ayant donné lieu à production des kinines. Cette consommation par la forte activité protéolytique en
estimation est aussi possible par l'appréciation cas de crise, cet examen est possible à distance d'un
relative des espèces moléculaires du kininogène événement clinique, sauf dans les conditions d'an-
par immunoblot. giœdème avec fonction de C1Inh normale si la
Dans le cadre des angiœdèmes avec déficit en coupure protéolytique de C1Inh est recherchée.
C1Inh, plus de 400 anomalies du gène SERPING1 L'activité kininogénase spontanée est augmen-
ont été inventoriées. La mutation familiale est tée de façon constante dans les angiœdèmes asso-
portée à l'état hétérozygote chez les patients, elle ciés à un déficit en C1Inh. Elle augmente
est identifiée par séquençage des exons et des périodiquement lors des phases actives de la
séquences 5′ et 3′ bordantes, exceptionnellement pathologie dans les angiœdèmes avec fonction
par MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe normale de C1Inh. Dans cette seconde situation,
Amplification). le moment du recueil de l'échantillon est critique,
Dans les angiœdèmes avec fonction de C1Inh nor- au plus proche de la crise, idéalement moins de
male, seule la mutation faux-sens 983A/G du gène 24  heures après le début des symptômes et en
166 Exemples d'applications

Tableau 8.5  Immunoblot de C1 inhibiteur et du kininogène de haut poids moléculaire


C1 inhibiteur (C1Inh) Kininogène de haut poids moléculaire (HK)
Échantillon Plasma + protéase C1s Plasma natif
Masse moléculaire – C1Inh natif : 105 kDa – HK natif : 110 kDa
– C1Inh complexé à C1s : 180 kDa – HK clivé, chaîne H : 60 kDa
– C1Inh clivé : 95 kDa – HK clivé, chaîne L : 54 kDa et 45 kDa
Séparation Électrophorèse en milieu dénaturant (SDS-PAGE)
Révélation Antisérum polyclonal anti-C1Inh Antisérum polyclonal anti-chaîne légère du HK
Interprétation Qualitative : Quantitative : évaluation de la consommation du
– capacité de C1Inh à lier la protéase cible HK, avec estimation de la production de BK
– coupure de C1Inh en condition de forte activité protéolytique
Validité Indépendante des périodes de crise – Temps de demi-reconstitution du HK : 60 h
– L'échantillon doit être recueilli dans un délai
maximum de 2 jours après une crise

l'absence de traitement interférant avec les Les activités du catabolisme des kinines sont
mesures enzymatiques (e.g. acide tranexamique). stables au cours du temps, sauf dans les situations
La conversion proenzymes–enzymes est un para- d'angiœdèmes iatrogènes déclenchés par un inhi-
mètre critique et sensible, et les conditions de biteur de l'enzyme de conversion de l'angioten-
transport de l'échantillon sanguin doivent égale- sine (IEC), ou un inhibiteur de la dipeptidyl
ment être respectées, avec température contrôlée peptidase IV (gliptine). Dans ce cas, il est préfé-
comprise entre 20 et 25 °C, dans un délai inférieur rable d'investiguer l'échantillon au moins
à 48 h. 2 semaines après l'arrêt du traitement.
Chapitre 9
Exploration des immunoglobulines

Immunoglobulines légère, classe, voire sous-classe de chaîne lourde)


monoclonales : identifiée par une technique spécifique. Toute sus­
picion de gammapathie monoclonale impose de
méthodes diagnostiques plus l'analyse concomitante du sérum et des urines.
Quatre méthodes diagnostiques qualitatives per­
Les gammapathies monoclonales correspondent à mettent la mise en évidence d'une immunoglobuline
l'apparition de clones, malins ou non, de lympho­ monoclonale : l'immuno-électrophorèse, l'immuno­
cytes B. Elles sont caractérisées par la sécrétion en fixation, l'immuno-empreinte et l'immunosoustrac­
excès d'immunoglobulines complètes ou de tion par électrophorèse capillaire. Ces techniques ont
chaînes légères présentant une grande homogé­ peu d'intérêt dans le suivi tant que le pic ne se modi­
néité liée à leur clonalité. Elles sont détectées chez fie pas sur le tracé électrophorétique. Le dosage
un peu plus de 3 % des sujets après 50 ans, et quantitatif des chaînes légères libres sériques se vou­
jusqu'à 7 % après 70 ans. Ce sont, dans environ la drait un marqueur de clonalité, de mise en évidence
moitié des cas, des gammapathies monoclonales et de suivi d'une immunoglobuline monoclonale. Il
de signification indéterminée (Monoclonal est cependant dangereux de vouloir tirer une conclu­
Gammapathy of Undetermined Significance ou sion qualitative quant à la nature monoclonale d'une
MGUS). Toute hypogammaglobulinémie, chez immunoglobuline à partir de données volontaire­
un sujet de 45 ans ou plus, doit faire rechercher ment amplifiées par le calcul du rapport entre les
une immunoglobuline monoclonale, qu'il y ait ou quantités de chaînes légères kappa et lambda.
non un pic à l'électrophorèse, afin de ne pas
méconnaître un myélome à chaîne légère.
Méthodologies qualitatives
La présence d'une immunoglobuline mono­
clonale se caractérise par l'augmentation sélective L'immuno-électrophorèse (fig. 9.1) reste la tech­
d'une seule espèce moléculaire d'immunoglobu­ nique de référence pour la détection des immuno­
lines sériques causée par la prolifération incontrôlée globulines monoclonales. Cette technique est un
d'un clone unique de lymphocytes B. Elle est prérequis pour la réalisation de l'immunosélec­
constituée soit d'une seule classe de chaîne lourde tion, qui accède au diagnostic positif de maladie
et d'un seul type de chaîne légère, soit de chaînes des chaînes lourdes. Les techniques d'immuno-
légères isolées d'un seul type, ou encore, beaucoup électrophorèse et d'immunofixation ont été
plus rarement, de fragments de chaînes lourdes décrites dans le chapitre 3.
d'une seule classe. Sa mise en évidence et sa carac­ En immuno-électrophorèse, l'utilisation d'anti­
térisation dans les liquides biologiques consistent à sérums globaux, reconnaissant toutes les protéines
affirmer son homogénéité de charge par sa mobilité du sérum humain, permet de démembrer chaque
à l'électrophorèse et son isotypie (type de chaîne groupe en visualisant les arcs respectifs de

Méthodes en immunologie
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168 Exemples d’applications

Dépôt de l’échantillon à
analyser
urines, sérum Migration anodique

Pistes n° 1 2 3 4 5 6

Gel d’agarose

3 4 Sérum normal

Application sur le
Lavage et
gel des antisérums
coloration des
Précipitation des protéines totales
complexes immuns (piste 1) ou des IgG IgA IgM κ λ
complexes immuns
précipités
Tampon IgG IgA IgM κ λ (pistes 2 à 6) Sérum
acide pathologique :
de Antisérums
précipitation présence d’une
des protéines IgG λ
monoclonale

IgG IgA IgM κ λ

Fig. 9.1  Principe de l'immunofixation, application à l'identification d'une immunoglobuline monoclonale.


Les échantillons sont chargés sur le gel d'agarose (1), puis soumis à une migration électrophorétique (2). La piste 1 est
soumise à une précipitation acide. Les autres pistes du gel sont recouvertes d'antisérums qui précipitent les protéines
reconnues (3). Après lavage, les protéines du gel sont colorées (4).

p­ récipitation. L'analyse peut être poursuivie, si un deuxième étape, immunologique, est différente.
pic a été détecté à l'électrophorèse, en appliquant L'anticorps spécifique (anti-chaîne légère ou anti-
des antisérums spécifiques des chaînes lourdes (G, chaîne lourde) est déposé à la surface du gel, y
A, M) et des chaînes légères des immunoglobu­ diffuse et forme un précipité avec son antigène.
lines (kappa et lambda), affirmant ainsi la nature Les complexes antigène–anticorps sont piégés
monoclonale de l'immunoglobuline produite en directement dans le gel. Après lavage, le précipité
quantité telle qu'elle est responsable du pic. S'il est coloré par un colorant spécifique des protéines.
s'agit d'un premier diagnostic, le sérum du patient Il n'y a pas, comme dans l'immuno-électrophorèse,
est comparé à un sérum humain normal. S'il s'agit d'effet « parapluie » (masquage des arcs de précipi­
d'une gammapathie monoclonale connue, le tation par les immunoglobulines polyclonales), ce
sérum du patient est analysé en comparaison avec qui peut faciliter le typage des IgM. Les dilutions
sa dernière antériorité. de l'échantillon peuvent être adaptées pour
L'immunofixation est une variante méthodo­ atteindre la gamme de 0,5 à 2 g/L d'immunoglo­
logique de l'immuno-électrophorèse qui a l'avan­ buline monoclonale suspectée. Il est aussi possible
tage d'être plus rapide en permettant une réponse de modifier la dilution des antisérums afin d'être
en 3 heures. Elle est également un peu plus sen­ dans la zone d'équivalence. Ceci évite les phéno­
sible avec un seuil de 0,5 à 1 g/L. Surtout, elle est mènes de zone en condition d'excès d'antigène,
en partie automatisable. La première étape ou au contraire de typer un faible renforcement au
consiste toujours en une migration électrophoré­ sein d'une hypogammaglobulinémie. La pré-incu­
tique du sérum dans un gel d'agarose, mais la bation de l'échantillon avec un volume adapté
Chapitre 9. Exploration des immunoglobulines 169

Électrophorèse

Albumine Pic de
gammaglobulines

Immuno-électrophorèse

Sérum
pathologique
Sérum
normal

Immunofixation

Antisérum G A M K L
pentavalent Antisérums spécifiques
Fig. 9.2  Analyse combinée immuno-électrophorèse/immunofixation.
L'existence d'un pic à l'électrophorèse se traduit par la déformation sur l'arc des IgG à l'immuno-électrophorèse avec un
antisérum polyvalent anti-protéines humaines (flèche). L'immunofixation à l'aide d'un antisérum pentavalent (mélange de
cinq antisérums spécifiques dirigés contre les trois isotypes de chaîne lourde [α, γ et μ] et les deux isotypes de chaînes
légères [κ et λ]) ou d'antisérums spécifiques séparément affirme l'existence d'une immunoglobuline de classe G et de type λ.

d'antisérum anti-chaîne légère permet, dans cer­ d'être peu discriminante sur des sérums totaux où
tains cas de gammapathies biclonales de migration les bandes sont difficiles à distinguer sur le fond
identique, d'affirmer l'existence de deux immuno­ polyclonal.
globulines monoclonales de même classe si les iso­ L'électrophorèse capillaire de zone est une
types de chaînes légères diffèrent (fig. 9.2). microméthode automatisée qui permet d'analy­
La technique d'immuno-empreinte nécessite la ser jusqu'à cinquante échantillons de sérum à
parfaite maîtrise du western-blot. Elle est plus sen­ l'heure. Il s'agit d'une séparation électrociné­
sible que l'immuno-électrophorèse et que l'immu­ tique effectuée dans un tube de diamètre interne
nofixation grâce à la révélation immuno-enzymatique inférieur à 100 microns et rempli d'un milieu et
des immunoglobulines, condition adaptée à l'étude d'électrolytes. Elle assure la séparation rapide de
des urines ou du liquide céphalo-rachidien sans très faibles quantités de protéines avec une haute
concentration préalable. Elle présente également résolution. La lecture de l'absorbance à une lon­
l'avantage d'appliquer l'utilisation d'anticorps gueur d'onde proche de l'ultraviolet (206 ou
non précipitants, tels que les anticorps monoclo­ 214 nm) mesure les liaisons peptidiques et per­
naux, d'éviter les phénomènes de zone, d'être met d'intégrer directement l'abondance de
réversible et ainsi de permettre plusieurs typages chaque fraction protéique. En raison de la charge
sur une même membrane. Son inconvénient est ­négative des parois du tube capillaire, généralement
170 Exemples d’applications

à base de silice, et des propriétés des tampons de lourdes monoclonales, il faut penser à éliminer
migration, les protéines se déplacent sous l'effet l'existence d'une IgD ou d'exceptionnelles IgE
du courant d'électro-endosmose et non plus monoclonales avant d'affirmer qu'il s'agit d'un
sous l'effet de leur charge comme dans les élec­ myélome à chaînes légères.
trophorèses en gel. En conséquence, le déplace­ Le typage de la chaîne légère d'une IgA mono­
ment des fractions protéiques se fait dans l'ordre clonale est parfois difficile en raison de l'accès
inverse, la fraction des gammaglobulines étant la des antisérums aux épitopes de chaîne légère
plus rapide. Le phénotypage d'une immunoglo­ dans la molécule entière d'immunoglobuline. Il
buline monoclonale est possible par immuno­ peut être nécessaire d'utiliser une méthode plus
soustraction en développant l'électrophorèse sensible, comme l'immunofixation adaptée pour
capillaire avant et après incubation du sérum à les urines.
tester avec des billes de sépharose couplées à des Les immunoglobulines monoclonales cryopré­
antisérums anti-chaînes lourdes ou anti-chaînes cipitantes imposent de respecter des conditions
légères d'immunoglobuline. La disparition du pré-analytiques particulières, notamment un
pic après incubation affirme la monotypie par maintien à 37 °C tout au long de la manipulation.
comparaison au sérum initial uniquement incubé L'immunofixation a comme principal inconvé­
avec des billes non couplées. Le prérequis est la nient, par rapport à l'immuno-électrophorèse,
capacité de l'électrophorèse capillaire à mettre d'ignorer totalement l'exploration des autres pro­
en évidence le pic en cas de gammapathie téines sériques.
monoclonale. L'immuno-empreinte, du fait de sa plus grande
sensibilité, détecte de petits pics chez des sujets
Recommandations de mise en œuvre sains âgés de plus de 70 ans avec une fréquence
Pour l'immuno-électrophorèse et l'immunofixa­ proche de 60 %, dont la pertinence clinique reste
tion, il est nécessaire d'utiliser des antisérums poly­ à établir.
clonaux précipitants. Il convient de s'assurer de la Les limites de l'électrophorèse capillaire sont
spécificité des antisérums à chaque changement de inscrites dans son principe. La lecture dynamique
lot par typage vis-à-vis d'immunoglobulines mono­ du passage des protéines devant la fenêtre de
clonales connues et de déterminer la dilution opti­ détection n'explore plus exhaustivement la migra­
male d'utilisation. Il faut respecter, voire modifier tion des protéines anormales et supprime le
les dilutions standard de l'échantillon et des antisé­ contrôle visuel de la lecture du gel en générant un
rums pour rester dans la zone d'équivalence. électrophorégramme reconstruit. Certaines pro­
Dans le cadre d'un myélome à chaînes téines peuvent ainsi ne pas être détectées, soit
légères, une chaîne légère libre monoclonale parce qu'elles migrent avant le début du signal,
sérique, appelée autrefois protéine de Bence- soit parce qu'elles restent immobiles dans le tube
Jones, peut être indétectable par électropho­ capillaire. Certaines substances adsorbant dans les
rèse, voire même par les techniques spécifiques ultraviolets proches, comme le fibrinogène et cer­
mentionnées ci-dessus, et prendre en défaut les tains produits de contraste, sont par ailleurs sus­
dosages néphélémétriques. Dans ce cas, c'est ceptibles de générer de faux pics. Il existe un
l'analyse des urines qui permet de poser le dia­ consensus pour admettre la moindre sensibilité de
gnostic. L'analyse des urines non concentrées l'électrophorèse capillaire pour identifier certaines
par immunofixation est désormais réalisée sur gammapathies monoclonales, notamment les
des gels commerciaux, mais il peut être néces­ petites immunoglobulines monoclonales noyées
saire d'avoir recours à l'immuno-électropho­ dans une importante hypergammaglobulinémie.
rèse après concentration. À noter que les Les gammapathies monoclonales non détectées
chaînes légères peuvent être quantifiables dans par l'électrophorèse capillaire sont typiquement
le sérum en néphélémétrie ou turbidimétrie. Si de faible quantité, ont souvent un point isoélec­
les méthodes classiques détectent des chaînes trique élevé et migrent en position gamma lente.
légères monoclonales en l'absence de chaînes Le seuil de détection par électrophorèse capillaire
Chapitre 9. Exploration des immunoglobulines 171

des gammapathies monoclonales a été évalué à Particularités des recherches


0,5 g/L, avec un succès garanti du phénotypage ­d'immunoglobulines monoclonales
par immunosoustraction au-dessus de 10 g/L.
Problèmes rencontrés Solutions
Son utilisation en première intention nécessite
une reprise par immunofixation pour un nombre Bande au niveau du dépôt sur Présence de fibrinogène (plasma,
le gel d'électrophorèse patient sous héparine)
non négligeable de sérums. IgM monoclonale :
Contrairement aux autres immunoglobulines traiter l'échantillon
monoclonales, les molécules retrouvées au cours au β-mercaptoéthanol
des maladies des chaînes lourdes ont une structure Chaîne légère monoclonale Penser à un myélome à IgD
anormale. Ces chaînes lourdes sont délétées en en l'absence de chaîne lourde ou IgE
général au niveau du premier domaine constant, monoclonale Sinon, myélome à chaîne légère
ce qui explique leur expression sans chaînes Difficulté du typage Utiliser une méthode plus
légères. Leur taux est le plus souvent faible, de de la chaîne légère sensible (immunofixation,
d'une IgA ou d'une IgG immunosélection)
l'ordre du g/L ou moins, et leur présence peut Penser à une maladie
passer inaperçue à l'électrophorèse. En raison de des chaînes lourdes
leur structure, ces protéines ont une grande hété­ Présence de deux IgG Immunosoustraction pour
rogénéité de charge et s'il existe une bande à avec des chaînes légères éliminer une des deux
l'électrophorèse, celle-ci est plus souvent large différentes immunoglobulines monoclonales
qu'étroite. De plus leur migration peut être très Immunoglobuline monoclo- Électrophorèse
rapide, notamment pour les chaînes μ. Dans le nale précipitant au froid : et immunofixation à 37 °C
cryoglobuline de type I Analyse spécifique de la
sérum, l'immuno-électrophorèse met en évidence cryoglobuline
un constituant qui précipite avec un seul antisé­
rum anti-chaîne lourde (α, γ et μ par ordre de fré­
quence) sans réagir avec les antisérums anti-chaînes Méthodologies quantitatives
légères. Cette absence de précipitation avec les Le dosage néphélémétrique des immunoglobu­
antisérums anti-κ et anti-λ n'est cependant pas un lines concerne les trois isotypes principaux, à savoir
critère suffisant pour affirmer une maladie des IgG, IgA et IgM et parfois les IgD. Ces dosages
chaînes lourdes. En effet, comme mentionné représentent un critère du diagnostic différentiel
ci-dessus, il est parfois difficile de mettre en évi­ entre gammapathie monoclonale de signification
dence les chaînes légères λ des IgA monoclonales. indéterminée ou MGUS (Monoclonal Gammopathy
Le recours à une technique spéciale d'immunosé­ of Unknown Significance), la plus fréquente des
lection combinée à l'immuno-électrophorèse per­ étiologies, et prolifération lymphoïde B avérée (e.g.
met de poser le diagnostic. Cette méthode consiste myélome, maladie de Waldenström, leucémie lym­
à incorporer dans la gélose des antisérums anti- phoïde chronique, amylose). Ils renseignent égale­
chaînes légères de forte affinité afin de faire préci­ ment sur les risques infectieux potentiels en
piter toutes les molécules d'immunoglobulines quantifiant l'hypogammaglobulinémie résiduelle.
entières, monoclonales ou polyclonales, ne lais­ L'interprétation des dosages des immunoglobu­
sant plus persister que l'arc de la chaîne lourde lines par néphélémétrie chez un patient ayant une
pathologique (fig.  9.3). Dans ces maladies, les immunoglobuline monoclonale doit être faite avec
taux sériques des immunoglobulines résiduelles prudence. Il peut arriver, en cas de pic important
sont le plus souvent abaissés. Dans les urines, la ou en raison du caractère polyclonal des antisérums
mobilité électrophorétique de la protéine est habi­ utilisés, que le dosage de l'isotype correspondant à
tuellement la même que dans le sérum. L'excrétion l'immunoglobuline monoclonale soit exagérément
urinaire est exceptionnelle dans la maladie des minoré, parce qu'il est réalisé en excès d'antigène
chaînes lourdes γ, minime dans celle des chaînes ou que les épitopes spécifiques de cette immuno­
lourdes α. Dans deux tiers des cas de maladie des globuline particulière ne sont pas reconnus par
chaînes lourdes μ, il existe une excrétion urinaire l'antisérum. Ceci s'observe plutôt en cas d'IgM
de chaînes légères monotypiques. monoclonale. Il est donc préférable d'utiliser les
172 Exemples d’applications

Electrophorèse

Albumine Gammaglobulines

Immunoélectrophorèse

Sérum
pathologique
Sérum
normal
Immunofixation

Ig G A M K L
totales Antisérums spécifiques

Immunoprécipitation
K M L K M L Fig. 9.3  Gammapathie biclonale de migration
unique.
L'électrophorèse et l'immuno-électrophorèse mettent
en évidence un pic de gammaglobulines.
L'observation d'une bande de même migration
avec les deux antisérums antichaînes légères
conduit à renouveler l'immunofixation après
immunoprécipitation du sérum par chaque
antisérum. Après précipitation par l'antisérum anti-κ,
on individualise une immunoglobuline de classe M
et de type λ, et après précipitation par l'antisérum
Précipitation Précipitation anti-λ, on individualise une immunoglobuline
anti-kappa anti-lambda de classe M et de type κ.

dosages issus de l'intégration de la courbe d'élec­ d'apprécier une gammapathie monoclonale. Les
trophorèse pour suivre l'évolution d'un pic et de chaînes légères libres monoclonales sont produites
réserver les dosages pondéraux à l'évaluation des en très grandes quantités dans les myélomes à
immunoglobulines résiduelles. À l'inverse, l'exis­ chaînes légères. De plus, il y a très souvent un
tence d'une immunoglobuline monoclonale, le excès, même faible, de chaînes légères libres en
plus souvent de classe IgM, peut perturber le présence d'une immunoglobuline monoclonale
dosage néphélémétrique d'autres protéines telles complète. Deux industriels (Binding Site et
que les IgA, la ferritine ou la protéine C réactive. Siemens) ont initialement développé des antisé­
Le dosage des chaînes légères libres d'immuno­ rums polyclonaux spécifiques capables de quanti­
globulines est une autre manière quantitative fier les chaînes légères libres d'immunoglobulines.
Chapitre 9. Exploration des immunoglobulines 173

Ces dosages reposent sur des anticorps reconnais­ suivi de la réponse au traitement, le groupe n'a
sant des épitopes habituellement masqués par validé l'intérêt du dosage des chaînes légères libres
l'association des chaînes légères aux chaînes que pour les proliférations lymphoïdes pauci-
lourdes dans les immunoglobulines entières. Ces sécrétantes : amylose, myélome non sécrétant et
dosages restent toutefois imprécis, car les antisé­ maladie de dépôt de chaînes légères. Le même
rums polyclonaux ont des spécificités variables groupe a validé plus tard ces algorithmes de strati­
d'un lot à l'autre pour la distinction entre les fication pronostique au diagnostic pour les MGUS
chaînes légères libres et liées et mesurent parfois et les myélomes asymptomatiques (Smoldering
une partie des immunoglobulines entières. De Multiple Myeloma ou SMM), recommandant de
plus, le taux de chaînes légères excédentaires varie ne pas pratiquer de dosages systématiques de
d'un clone plasmocytaire à l'autre et la fonction chaînes légères libres dans le suivi des MGUS.
rénale du patient peut influencer le dosage et alté­
rer le rapport kappa/lambda conduisant aussi bien Cryoglobulines
à des faux négatifs qu'à des faux positifs. Le dosage Le froid entraîne des signes cliniques chez certains
des chaînes légères libres doit être couplé à sujets du fait de la précipitation de protéines
l'immuno-électrophorèse ou à l'immunofixation sériques ou plasmatiques dans les vaisseaux de petit
des urines. L'apport diagnostique du dosage des et moyen calibre, telles que les cryoglobulines et le
chaînes légères libres est patent dans les situations cryofibrinogène. Les cryoglobulines sont secon­
cliniques où l'absence de marqueur monoclonal daires à des pathologies immunoprolifératives,
peut être un handicap (myélomes à chaîne légère, auto-immunes ou infectieuses. Les signes cliniques
myélomes apparemment non sécrétants, amyloses associés sont des vascularites, se traduisant par des
et maladie de dépôt de chaînes légères d'immuno­ signes cutanés (purpura, phénomène de Raynaud),
globulines). Dans les myélomes à immunoglobu­ des arthralgies, une insuffisance rénale et des
lines intactes et les MGUS, l'apport du dosage des neuro­ pathies périphériques. Le cryofibrinogène
chaînes légères libres comme marqueur diagnos­ est impliqué dans des phénomènes thrombotiques
tique ou comme indicateur de pronostic ou de liés au froid (purpura, livedo, ulcération, nécrose).
suivi thérapeutique reste à prouver. Les demandes doivent être initiées dans un
En février 2009, le groupe de consensus inter­ contexte clinique évocateur, cependant les cryoglo­
national sur le myélome a publié une mise au bulines sont parfois présentes chez des sujets asymp­
point reprenant les acquis sur les avantages et les tomatiques. La concentration des cryoglobulines
inconvénients de ces nouveaux réactifs ainsi que n'est par ailleurs pas toujours proportionnelle à la
sur les indications validées et rappelant les biais sévérité des signes cliniques. La quantification des
méthodologiques mentionnés ci-dessus. Suite à cryoglobulines est importante pour le suivi et les
l'absence de corrélation entre les dosages sériques décisions thérapeutiques chez les patients sympto­
et urinaires de chaînes légères libres, ce groupe a matiques. Les cryoglobulines sont classées en trois
recommandé de ne pas pratiquer les dosages de types. Les cryoglobulines de type I sont constituées
chaînes légères libres dans les urines. Pour le par une immunoglobuline monoclonale, de type
dépistage des syndromes lymphoprolifératifs B, la IgM ou IgG, plus rarement IgA. Les cryoglobulines
réalisation concomitante, sur le sérum de l'élec­ de type II associent des immunoglobulines poly­
trophorèse, de l'immunofixation et des dosages de clonales à une immunoglobuline monoclonale
chaînes légères libres apparaît suffisante. Seule (sous-type IIa), ou à des immunoglobulines oligo­
l'amylose nécessite encore l'analyse des urines. clonales (sous-type IIb). Les cryoglobulines de type
Une fois le diagnostic de syndrome lymphoproli­ III sont constituées d'immunoglobulines polyclo­
fératif établi, le groupe estime que l'analyse des nales. Les plus fréquentes, cryoglobulines de type II
urines par immunofixation est indispensable. et III, dites mixtes, contiennent des anticorps
Différents algorithmes de stratification pronos­ monoc­lonaux ou polyclonaux de spécificité anti-
tique ont été validés, incluant, au diagnostic, le IgG et correspondent en pratique à la présence de
dosage des chaînes légères libres sériques. Pour le complexes immuns. Elles sont observées dans des
174 Exemples d’applications

atteintes infectieuses, dont l'hépatite C, où elles Lors de la recherche des auto-anticorps par
sont responsables des cryoglobulinémies dites immunofluorescence indirecte avec un antisérum
essentielles et dans des maladies auto-immunes dont dirigé contre les chaînes lourdes G, A et M, un titre
le lupus érythémateux systémique. Dans cette der­ élevé, conséquence de l'importance du pic, mais
nière pathologie, il y a fréquemment un parallèle surtout l'aspect restreint de la fluorescence, consé­
entre concentration, expression clinique et consom­ quence de sa nature monoclonale, doit faire suspec­
mation du complément. Le suivi des cryoglobulines ter l'existence d'une gammapathie monoclonale à
de type I est une façon très satisfaisante d'évaluer activité auto-anticorps. La confrontation des résul­
l'évolution d'une immunoglobuline monoclonale. tats d'immunofluorescence avec ceux de l'immuno-
La recherche des cryoglobulines exige des électrophorèse/immunofixation identifie trois
conditions pré-analytiques très strictes, prélève­ situations possibles qui s'expliquent par le seuil de
ment, transport et coagulation à 37 °C. Le sérum sensibilité de l'immunofluorescence, inférieur d'un
est décanté et conservé 7 jours à + 4 °C. La détec­ facteur cent à celui de l'immunoprécipitation en
tion d'une cryoglobuline peut être réalisée par milieu gélifié. Un auto-anticorps monoclonal donne
observation visuelle d'un cryoprécipité dans le une cohérence d'isotype en immunofluorescence et
sérum. Un aliquote de sérum permet de tester la en immuno-électrophorèse/immunofixation. Un
redissolution de ce précipité à 37 °C. Le cryopré­ auto-anticorps monotypique isolé est seulement
cipité est ensuite isolé et lavé à froid puis remis à détectable en immunofluorescence. Enfin, un auto-
37 °C pour quantification et typage. La quantifi­ anticorps monotypique associé à une gammapathie
cation historique est la mesure du cryocrite monoclonale d'isotype différent en immuno-élec­
(volume du cryoprécipité dans le sérum après cen­ trophorèse/immunofixation caractérise l'existence
trifugation) et manque de sensibilité. Il est préfé­ de deux clones plasmocytaires. Ces auto-anticorps
rable de doser dans le cryoprécipité redissous à monotypiques ou monoclonaux sont relativement
37 °C les protéines, les immunoglobulines totales fréquents, ce qui souligne l'intérêt de l'immuno­
ou encore l'isotype préalablement identifié par fluorescence indirecte comme technique de pre­
immunofixation (fig. 9.4). mière intention pour le dépistage des auto-anticorps,
à condition d'utiliser comme conjugué un antisé­
rum polyvalent capable d'identifier les trois classes
Gammapathies monoclonales majeures d'immunoglobulines. Ceci permet de
à activité auto-anticorps dépister plus précocement des MGUS.
Le plus souvent, la cible antigénique des gammapa­
thies monoclonales est inconnue. Ces anticorps
peuvent aussi bien reconnaître des exo-antigènes Recherche d'anticorps
que des endo-antigènes (allogéniques ou auto­ spécifiques
logues). Plusieurs types d'activités auto-anticorps
sont fréquemment rapportés pour des immunoglo­ La détection d'anticorps spécifiques d'un antigène
bulines monoclonales. Lorsqu'elles sont dirigées particulier dans un but diagnostique peut utiliser
contre des antigènes érythrocytaires, elles sont res­ de nombreuses méthodes immunologiques. La
ponsables de maladie des agglutinines froides. Elles technique ELISA indirecte est la plus couram­
reconnaissent le fragment Fc des IgG dans les cryo­ ment employée. Les champs d'application les plus
globulines mixtes de type II. Des neuropathies larges sont représentés par l'auto-immunité et les
périphériques sont associées à la présence d'immu­ sérologies anti-infectieuses. Ces dosages sont
noglobulines monoclonales dirigées contre une d'abord à visée qualitative pour identifier une spé­
protéine associée à la myéline (MAG), contre des cificité. Ils peuvent être rendus quantitatifs, par
gangliosides ou contre des sulfatides. Dans la majo­ titration ou par comparaison à une gamme d'éta­
rité des cas, ces immunoglobulines monoclonales lonnage. À noter qu'en pathologie infectieuse, le
sont des IgM, fréquemment associées à la maladie diagnostic peut également comporter l'identifica­
de Waldenström. tion de l'antigène chez le malade, qui peut égale­
Chapitre 9. Exploration des immunoglobulines 175

II

III

Fig. 9.4  Étude des cryoglobulines.


A. Cryoprécipités.
B. Typage par immunofixation de cryoprécipités redissous à 37 °C :
I : cryoglobuline de type I composée d'une immunoglobuline G, λ
monoclonale ;
B II : cryoglobuline de type II associant une immunoglobuline M, κ
AS G A M K L monoclonale et des immunoglobulines G polyclonales ;
III : cryoglobuline de type III composée d'immunoglobuline G et
I d'immunoglobuline M polyclonales.
C. Typage par western-blot de cryoprécipités redissous à 37 °C :
I : cryoglobuline de type I composée d'une immunoglobuline M, κ
monoclonale ;
IIa IIa : cryoglobuline de type II associant une immunoglobuline M, λ
monoclonale et des immunoglobulines G polyclonales ;
IIb IIb : cryoglobuline de type II associant des bandes oligoclonales
immunoglobulines M, κ et immunoglobulines M, λ et des
immunoglobulines G polyclonales ;
III : cryoglobuline de type III composée d'immunoglobulines G,
III
immunoglobulines A et immunoglobulines M polyclonales.
C AS : antisérum total ; G : anticorps anti-γ ; A : anticorps anti-α ; M :
G A M K L anticorps anti-μ ; K : anticorps anti-κ ; L : anticorps anti-λ.

ment faire appel à des méthodes immunologiques. lui-même, mais la réaction immunitaire qu'il a
L'ELISA est la méthode de référence du dépistage induite. Ainsi, il existe une fenêtre sérologique
de l'infection par le virus de l'immunodéficience d'environ 3  semaines correspondant à la période
humaine (VIH), exemple développé ici, mais elle comprise entre le début de l'infection par le VIH et
s'inscrit dans une stratégie diagnostique faisant l'apparition d'anticorps spécifiques détectables
intervenir d'autres tests. (séroconversion). De nombreuses variantes de tests
Le sérodiagnostic de l'infection à VIH est fondé ELISA sont utilisées dans le dépistage de l'infection
sur un dépistage des anticorps anti-VIH produits VIH, comme les tests de capture et les tests compé­
par l'individu infecté. Il ne détecte donc pas le virus titifs qui possèdent une meilleure sensibilité. La
176 Exemples d’applications

méthode la plus courante est un ELISA de capture VIH-1 et anti-VIH-2, dont au moins une tech­
des anticorps du patient, fixés sur des antigènes des nique ELISA (arrêté du 28 avril 2003). Depuis
virus VIH-1 et VIH-2 fixés au fond de plaques de 2010 (arrêté du 28 mai 2010), la législation fran­
microtitration, et révélés par une anti-globuline çaise impose le recours aux tests ELISA combinés
conjuguée à une enzyme. L'intensité de la colora­ détectant les IgG et IgM anti-VIH-1 et anti-
tion développée est mesurée par spectrophotomé­ VIH-2, ainsi que l'antigène p24 du VIH-1 pré­
trie. La densité optique des échantillons testés est sent dans le sérum de l'individu testé. Ces tests
proportionnelle à la quantité d'anticorps anti-VIH combinés (anticorps et antigène) réduisent la
recherchée et permet d'objectiver la séronégativité fenêtre sérologique et permettent de déceler une
ou la séropositivité du patient. La positivité est éva­ infection dès le 15e jour post-contage (fig. 9.5).
luée relativement à une valeur seuil de densité En cas de dépistage négatif, un deuxième test
optique correspondant généralement à la moyenne ELISA est réalisé 6 semaines après l'exposition au
de valeurs obtenues avec des sérums de sujets sains, virus afin d'attester de l'absence de contamination.
plus deux déviations standard. Pour un dosage De même, afin d'éliminer tout risque de résultat
quantitatif, une courbe d'étalonnage est établie à faussement positif lié à des interférences possibles
partir de dilutions d'un sérum standard. Le résultat avec les facteurs rhumatoïdes ou certains auto-
est exprimé en unités internationales (UI). anticorps, tout résultat positif ou indéterminé
Des tests rapides à orientation diagnostique nécessite une confirmation par une autre technique,
(TROD) permettent d'obtenir un résultat en western-blot ou un immunoblot. Le western-blot
quelques minutes (inférieur à 1 h). Ils sont généra­ utilise des protéines virales natives purifiées, séparées
lement basés sur des principes d'immunochroma­ par électrophorèse puis transférées sur membrane
tographie ou d'immunofiltration sur membrane. de nitrocellulose, alors que l'immunoblot est com­
La sensibilité de ces tests reste cependant inférieure posé de protéines recombinantes spécifiques de
à celle des tests ELISA notamment lors d'une VIH-1 et VIH-2 et/ou de peptides synthétiques
primo-infection. Ils sont réservés aux situations déposés en ligne sur une bandelette. Un test est
d'urgence et le résultat, négatif ou positif, doit déclaré positif pour le VIH-1 s'il détecte des anti­
être confirmé sur un échantillon indépendant corps contre au moins deux des trois glycoprotéines
obtenu lors d'un prélèvement ultérieur. virales du VIH-1 (gp160, gp120 ou gp41). La sen­
Le dépistage a évolué avec les générations successives sibilité de ces deux techniques est comparable mais
des tests ELISA commerciaux. Les tests de 1re et de bien inférieure à celle des tests ELISA. Une discor­
2e génération ne détectent que des anticorps de classe dance entre les résultats obtenus par ELISA et par
IgG, alors que les tests de 3e et de 4e génération ces tests peut donc exister lorsque la séroconversion
détectent à la fois des IgG et des IgM. Les antigènes est trop récente. Ces tests permettent néanmoins de
viraux déposés dans les plaques sont issus du VIH-1 et valider la positivité du résultat obtenu en ELISA et
également du VIH-2. La sensibilité de ces techniques également de préciser la spécificité des anticorps
est élevée, de l'ordre de 99,2 à 99,8 %. présents dans l'échantillon.
Jusqu'en 2009, le dépistage de l'infection à Des logigrammes illustrent la stratégie du dia­
VIH en France reposait sur l'utilisation de deux gnostic biologique et les recommandations émises
techniques mixtes détectant les anticorps anti- par la Haute Autorité de santé (fig. 9.6).

Anticorps détectés en ELISA

Niveau des marqueurs


1re génération

2e génération

4e génération

ARN VIH plasmatique


3e génération

Chapitre 9. Exploration des immunoglobulines 177


Seuil de détection

Antigène p24

Contage J11 J15 J21 J29

Fenêtre virologique
Antigénémie p24

Fenêtre sérologique Anticorps anti-VIH en ELISA

Anticorps anti-VIH en
western-blot

Fig. 9.5  Cinétique des marqueurs de l'infection à VIH et place des différents tests de sérodiagnostic.
Test ELISA combiné*

178
(anticorps antigène)
- de 4e génération +
Notion CONFIRMATION

Exemples d’applications
d’exposition au western-blot ou
VIH < 6 semaines immunoblot
non oui
ABSENCE
D’INFECTION 2e PRÉLÈVEMENT à 6 +
semaines Spécificité anti-VIH-1 anti-VIH-2
Test ELISA combiné
de 4e génération -
+ ou
indéterminé
-
Erreur INFECTION VIH DIAGNOSTIC DIRECT
d’identification ? CONFIRMÉE ARN-VIH
Nouveau test plasmatique
Absence d’infection ou antigène p24
+ -

PRIMO-INFECTION ABSENCE
PROBABLE D’INFECTION
Réaction non spécifique

CONTRÔLE
CONTRÔLE
SÉROLOGIQUE
SÉROLOGIQUE 1 à 2 semaines plus tard
1 à 2 semaines plus tard
*Recherche d’anticorps anti-VIH1 et VIH-2 et de l’antigène p24 Explorations complémentaires
si suspicion de variants

Fig. 9.6  Algorithme de la conduite à tenir en cas de suspicion d'infection à VIH.


Chapitre 10
Détection/dosage des cytokines
et de leurs récepteurs

Les cytokines sont impliquées dans la régulation de cellules cibles. Leur périmètre d'action est très
des réponses immunitaires innées et adaptatives. Il variable. La majorité d'entre elles agissent dans le
est nécessaire de bien connaître leur physiologie micro-environnement où elles sont produites,
avant d'entreprendre leur exploration. Ce sont des selon un mode dit paracrine (environnement
protéines ou des glycoprotéines essentiellement direct) ou juxtacrine (cellule adjacente à la cellule
sécrétées, mais parfois membranaires, de faible productrice). L'action d'une cytokine sur la cel-
masse moléculaire. Elles peuvent être monomé- lule qui la produit constitue l'autocrinie qui peut
riques, homodimériques (e.g. IL-5, IL-8, IL-10), même aller jusqu'à l'intracrinie, en l'absence de
hétérodimériques (e.g. IL-12), voire trimériques sécrétion de la cytokine et en cas de fixation
(e.g. TNF-α). Elles peuvent présenter des degrés immédiate à son récepteur. À l'opposé, certaines
divers de glycosylation conduisant parfois à une cytokines ont des effets de type endocrine, c'est-à-
grande hétérogénéité moléculaire (e.g. IL-6 qui dire qu'elles agissent à distance de leur lieu de
varie de 19 à 26 kDa). La phase d'expression production. Les concentrations circulantes de
membranaire de certaines d'entre elles (e.g. IL-1, cytokines sont dans la majorité des cas extrême-
TNF-α) leur permet d'agir par contact direct ment faibles (< 5 pg/mL) et leur dosage dans le
intercellulaire. Les cytokines sont parfois pro- sang périphérique est peu informatif sur les pro-
duites sous forme de précurseurs (e.g. IL-1, IL-18) ductions locales.
qui ne deviennent actifs biologiquement qu'après La production des cytokines est en règle géné-
action d'une enzyme (e.g. caspase 1). D'autres rale dépendante de l'activation cellulaire, soit
(e.g. TGF-β) subissent des étapes de maturation directement en réponse à un facteur déclenchant
extracellulaire, au cours desquelles leur fixation à (e.g. activation par le récepteur d'antigène ou un
des molécules de la matrice extracellulaire module ligand de Toll-like receptor ou TLR), soit secondai-
leur état fonctionnel ou leur catabolisme. Enfin, rement en réponse à une autre cytokine. Les inter­
les cytokines sont susceptibles d'être dégradées actions entre cytokines modulent ces réponses via
par des protéases, en particulier lors des processus des effets synergiques ou, au contraire, antago-
inflammatoires. nistes. Les cytokines pro-inflammatoires (e.g. IL-1,
Les cytokines sont capables de stimuler ou d'in- TNF-α, IL-6, chimiokines) se distinguent des
hiber la prolifération ou la survie cellulaire, cytokines immunorégulatrices parmi lesquelles on
d'orienter la différenciation cellulaire, plus spécia- retrouve les interleukines, les interférons, le TGF-
lement celle des lymphocytes T (fig.  10.1), ou β et les cytokines de l'hématopoïèse ou facteurs de
d'activer les fonctions ou les capacités migratoires croissance (e.g. GM-CSF, IL-3, M-CSF). Les

Méthodes en immunologie
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180
Immunité cellulaire
Inflammation
STAT1 T-bet IFN
Lutte contre les
Th1 TNF
pathogènes

Exemples d'applications
IL-2
intracellulaires

IL-1R
CXCR3
IL-4 Immunité humorale
STAT6 GATA3 IL-5 Allergie
Th2 IL-10 Défense
IL-13 antiparasitaire

IL-17Rβ

IL-6+ IL-17(A)
TGF STAT3 RORs IL-17F Auto-immunité
Th17
IL-21 Lutte anti-infectieuse
IL-23 IL-22
IL-23R
Lymphocyte CCR6
T naïf
CCR7+
Foxp3
Treg TGF Immunosuppression

CD4+CD25hi

Maturation des
STAT3 Bcl6 lymphocytes B
Tfh IL-21 Auto-immunité
Opsonisation par
anticorps
CXCR5
Fig. 10.1  Cytokines et lymphocytes T.
Chapitre 10. Détection/dosage des cytokines et de leurs récepteurs 181

c­ytokines ont, en fait, de multiples cibles et, par génicité et à leur échappement à la réponse
conséquent, des effets pléiotropes. Les propriétés immune (e.g. IL-10, TNF-α).
biologiques sont, par ailleurs, souvent partagées
par plusieurs cytokines et cette redondance limite Méthodologie
les risques de défaillance. Enfin, certaines cyto-
kines présentent des homologues se comportant Dosages de cytokines ou de leurs récepteurs
comme des antagonistes spécifiques (e.g. IL-1ra, solubles
IL-36ra) qui entrent en compétition avec la cyto- Les conditions de prélèvement et de conservation
kine correspondante en se liant au même récep- des échantillons biologiques sont très importantes
teur, mais sans transduire de signal d'activation. pour le dosage des cytokines et doivent prendre
Les chimiokines sont impliquées dans les phéno- en compte ce qui peut se passer après le prélève-
mènes d'adressage pour le recrutement cellulaire ment. Ainsi, une surestimation de la concentra-
lors de processus inflammatoires. Elles peuvent tion in  vivo peut résulter d'une production
aussi intervenir dans la différenciation cellulaire. cellulaire liée à la présence d'endotoxines ou du
L'action des cytokines sur leurs cellules cibles relargage de cytokines intracytoplasmiques. À l'in-
se fait par fixation à des récepteurs constitués de verse, la liaison de cytokines à leurs récepteurs
deux ou trois sous-unités. Dans ces complexes membranaires ou leur dégradation sous l'action
multimériques, la chaîne α assure la spécificité de protéases ou de la température peuvent
de la fixation, tandis que la chaîne β est respon- conduire à une sous-estimation.
sable de la transmission du signal. Cette dernière Le prélèvement de sang sur tube EDTA stérile
est souvent partagée par plusieurs cytokines (e.g. permet d'éviter la production potentielle de cyto-
gp130 pour les cytokines de la famille de ­l'IL-6). kines par les cellules sanguines grâce au pouvoir
Pour la famille des récepteurs de l'IL-2, une chélateur de l'EDTA. L'héparine, souvent conta-
chaîne γ assure la signalisation. La fixation de la minée par des endotoxines, est à éviter. Des inhi-
cytokine permet l'assemblage des sous-unités et biteurs de protéases (trasylol) ou de l'agrégation
l'organisation optimale des domaines partici- plaquettaire (indométacine) peuvent être ajoutés
pant à la transduction du signal. Les chimiokines dans les tubes. Le plasma doit être décanté très
se fixent sur des récepteurs particuliers, couplés rapidement pour éviter toute dégradation ou
aux protéines G et possédant sept domaines adsorption des cytokines. Pour les méthodes bio-
transmembranaires, capables de reconnaître plu- logiques cellulaires9, le sérum est utilisé, mais il
sieurs chimiokines. doit être recueilli dans des conditions assurant
Des récepteurs solubles des cytokines sont l'absence d'endotoxines. Il est préférable de
générés par l'action de protéases libérant la par- congeler les échantillons à très basse température
tie extramembranaire des récepteurs cellulaires (−80 °C) et sous forme d'aliquotes pour éviter les
ou par épissage alternatif et sécrétion directe. cycles de congélation/décongélation si plusieurs
Ces récepteurs solubles conservent la capacité cytokines sont dosées sur un même prélèvement.
de fixer leur ligand et possèdent ainsi une action À noter que pour certaines cytokines (e.g. TGF-β),
inhibitrice sur l'activité biologique des cyto- un prétraitement peut être nécessaire.
kines (e.g. IL-1, TNF-α). Certains récepteurs Les méthodes biologiques testant la fonction
solubles restent, à l'inverse, capables de déclen- d'une cytokine vis-à-vis d'une lignée cellulaire ne
cher un signal d'activation avec des cytokines gardent qu'une valeur historique (e.g. prolifération
membranaires (e.g. IL-6). Des protéines de liai- de thymocytes murins mesurant l'activité IL-1),
son différentes des récepteurs peuvent égale- notamment eu égard à la complexité des interac-
ment se fixer spécifiquement à certaines tions et redondances des systèmes cytokiniques.
cytokines et les neutraliser (e.g. IL-18). Enfin, il
faut tenir compte de multiples homologues tant
des cytokines que de leurs récepteurs, exprimés 9
Des ions divalents sont nécessaires pour ces méthodes et
par certains virus, qui concourent à leur patho- le pouvoir chélateur de l'EDTA peut interférer.
182 Exemples d'applications

Les méthodes immunologiques ont, en tats est liée aux différents modes d'expression pour
revanche, toute leur valeur, car il est relativement une même cytokine (e.g. pg/mL, UI/mL, pM).
aisé de produire des anticorps de grande spécificité Une approche quantitative du nombre de molé-
dirigés contre des cytokines recombinantes, per- cules de récepteurs de cytokine exprimées par cel-
mettant de distinguer des cytokines ayant une lule peut être réalisée en utilisant des billes de
même activité biologique (e.g. IL-1α et IL-1β). calibration de fluorescence en cytométrie en flux,
Les anticorps utilisés sont le plus souvent mono- mais la méthode de référence reste celle de
clonaux. Les méthodes commerciales les plus Scatchard qui utilise des anticorps radiomarqués
répandues pour le dosage des cytokines dans les accédant à la mesure des constantes d'affinité.
milieux biologiques sont des ELISA sandwich. Les
techniques multiplex utilisant la fluorescence ou la
chimiluminescence, en microarray ou en cytomé- Détection in situ ou au niveau cellulaire
trie en flux, sont mieux adaptées aux dosages Il est possible de mettre en évidence la présence de
ponctuels et permettent la mesure simultanée de cytokines ou de leurs récepteurs dans les tissus par
plusieurs cytokines afin d'obtenir un profil cytoki- des techniques d'immunohistochimie ou d'immu-
nique (e.g. profil pro-inflammatoire, réponse Th1/ nofluorescence directe ou amplifiée.
Th2/Th17), parfois même avec un système auto- L'utilisation de coupes à la congélation pose
matisé. Ceci peut être particulièrement intéressant peu de problèmes, mais pour les tissus fixés la fixa-
pour des dosages réalisés dans le surnageant de tion peut altérer les molécules à détecter et néces-
cultures cellulaires, reflétant bien les réponses site de sélectionner des réactifs capables de
induites par les conditions expérimentales. reconnaître ces épitopes modifiés. Ces méthodes
La plupart des trousses commercialisées sont permettent d'identifier qualitativement une
adaptées au dosage des cytokines dans le plasma concentration localisée au niveau de la cellule pro-
ou le sérum et la méthodologie doit être validée, ductrice. Les méthodes d'analyse d'image peuvent
notamment par des tests de surcharge mesurant le donner une idée semi-quantitative de l'intensité
rendement du dosage, lors de l'utilisation d'autres de la réponse cytokinique. L'utilisation de co-
liquides biologiques. Pour le liquide synovial, qui marquages, voire de microscopie confocale, per-
peut présenter une forte viscosité, l'ajout de hya- met une approche affinée.
luronidase est parfois nécessaire pour fluidifier La sécrétion des cytokines par les lymphocytes
l'échantillon. Enfin, du fait des faibles dilutions peut être mise en évidence après réactivation des
effectuées sur les échantillons à analyser, il faut cellules in  vitro, de façon non spécifique (e.g.
être très vigilant sur les interférences classiques des mitogène) ou spécifique (e.g. antigène). La détec-
immunodosages : hémolyse, anticorps hétéro- tion intracellulaire en cytométrie en flux implique
philes, facteurs rhumatoïdes. Actuellement, appa- de bloquer le transport et la sécrétion de la cyto-
raissent sur le marché des techniques (e.g. Erenna® kine d'intérêt (e.g. brefeldine A), puis de fixer et
ou Simoa®) qui améliorent la limite de détection perméabiliser les cellules pour que l'anticorps ait
de manière considérable (gain de deux à trois logs accès au compartiment intracellulaire. Le dévelop-
de concentration). pement des marquages multi-couleurs permet
La standardisation des immunodosages de cyto- d'analyser simultanément de nombreux para-
kines n'est pas encore acquise et il existe parfois de mètres immunophénotypiques et/ou la produc-
fortes discordances entre différentes trousses com- tion de plusieurs cytokines par la même cellule. Il
merciales. Des préparations internationales de est ainsi possible de mettre en évidence des lym-
cytokines sont disponibles auprès du National phocytes spécifiques de type Th1, Th2 ou Th17,
Institute for Biological Standards and Control 10. mais aussi de lymphocytes dits polyfonctionnels
Une autre source de discordances entre les résul- qui produisent plusieurs cytokines (e.g. IFN-γ/
IL-2 et TNF-α). Ces derniers sont notamment
10
www.nibsc.org associés à une meilleure protection dans diverses
Chapitre 10. Détection/dosage des cytokines et de leurs récepteurs 183

pathologies infectieuses (e.g. tuberculose, Sida, La variabilité de production des cytokines chez
hépatites). La détection par ELISpot, particulière- des sujets normaux peut être élevée. Pour un indi-
ment développée pour l'interféron γ, permet de vidu donné, l'effet principal est celui des rythmes
quantifier la fréquence des cellules répondeuses et circadiens liés aux variations des corticostéroïdes
peut être plus sensible que la détection intracellu- et de la mélatonine.
laire. Les cytokines étant des substrats pour les pro-
téases générées lors des processus inflamma-
Étude des ARNm toires, certains produits de dégradation sans
activité biologique peuvent être détectés en
Alternativement à la détection des protéines, la
immuno-analyse.
production de cytokines peut être étudiée au
Leur action locale paracrine, voire autocrine, est
niveau des ARNm, in vitro dans des cultures cel-
un élément essentiel à considérer dans l'explora-
lulaires ou ex vivo sur des biopsies, en prenant les
tion des cytokines. Aussi, le résultat normal du
précautions nécessaires pour assurer la stabilité
dosage d'une cytokine circulante ne permet pas
des ARNm. Dans les tissus, la technique d'hybri-
d'exclure un foyer d'inflammation ou de stimula-
dation in situ par riboprobes détecte les cellules
tion immune locale.
contenant des transcrits de cytokines à l'aide de
Les cytokines se lient fréquemment à des protéines
traceurs enzymatiques ou fluorescents ou dans
plasmatiques (e.g. IL-6 et α2-macroglobuline), mais
des suspensions cellulaires en cytométrie en flux.
ces liaisons de faible affinité perturbent peu les
Une analyse plus large du transcriptome par RT-
dosages. À l'inverse, les récepteurs antagonistes inter-
PCR après extraction des ARN peut donner une
fèrent dans les effets fonctionnels et les dosages bio-
image plus globale. En tout état de cause, si
logiques des cytokines. Des anticorps très spécifiques
l'analyse des ARNm permet une détection de
permettent, en revanche, de distinguer les cytokines
différences rapidement induites par un stimulus,
de leurs homologues. La présence de récepteurs
elle doit être pondérée par le fait que les méca-
solubles représente une cause d'interférence dans les
nismes de régulation post-transcriptionnelle
tests biologiques et certains immunodosages si l'anti-
peuvent ensuite modifier l'expression protéique.
corps utilisé reconnaît un épitope de la cytokine
impliqué dans sa liaison à son récepteur. Il faut sélec-
Étude de l'ADN, polymorphismes tionner des anticorps se fixant sur des sites indépen-
Les gènes des cytokines et de leurs récepteurs sont dants des interactions cytokine/récepteur pour doser
concernés par des variations au niveau de l'ADN, toutes les formes de la cytokine. De manière géné-
qui peuvent être limitées à un nucléotide dans les rale, l'influence de nombreux inhibiteurs disparaît
SNP (Single Nucleotide Polymorphism), ou s'asso- après dilution d'un échantillon biologique fournis-
cier à des modifications plus importantes (e.g. sant des résultats paradoxaux (e.g. effet matrice). Les
délétions, insertions, substitutions), voire des principaux facteurs pouvant influencer le dosage des
variations dans le nombre de copies des gènes cytokines sont résumés dans la figure 10.2.
(Copy Number Variation ou CNV). Des auto-anticorps dirigés contre des cytokines
(e.g. contre le TNF-α, l'IL-6, l'IL-1) apparaissent
avec l'âge. Leur affinité peut atteindre des valeurs
Recommandations de mise en œuvre
comparables à celles des anticorps utilisés dans les
La demi-vie des cytokines est très courte (habi- immunodosages (e.g. 10−11 M). Ces auto-anti-
tuellement inférieure à une heure) et leur produc- corps peuvent constituer un élément diagnostique
tion pulsatile conduit à des pics fugaces dans la (e.g. anti-IFN-γ dans des syndromes d'immuno-
circulation impliquant la réalisation de prélève- déficience acquise non virale) ou expliquant la
ments rapprochés et multiples pour suivre ces physiopathologie (e.g. anti-IL-17 ou IL-22 et can-
variations rapides. Ceci est surtout applicable à la didoses cutanéomuqueuses dans les polyendocri-
recherche expérimentale. nopathies auto-immunes).
184
Protéines de liaison Auto-anticorps
(par ex. α2-macroglobuline) (par ex. anti-TNF-α, anti-IL-6)

Exemples d'applications
CYTOKINE

Demi-vie courte
Rythmes circadiens
Précurseurs
Cytokines membranaires
Polymères
Glycosylation
Produits de dégradation
Compartimentalisation

Antagonistes Récepteurs solubles


(par ex. IL1-RA, IL36-RA) – Antagonistes (par ex. TNF-α, IL-1)
– Agonistes (par ex.IL-6)
Récepteurs de cytokines

Fig. 10.2  Éléments de la physiologie des cytokines et de leurs récepteurs à prendre en compte pour la réalisation de leurs dosages.
Chapitre 10. Détection/dosage des cytokines et de leurs récepteurs 185

Avantages/inconvénients

Avantages Inconvénients
Cytokines ou récepteurs solubles
Dosage par ELISA Méthode quantitative Une cytokine à la fois
Grandes séries possibles Mesure globale
Attention aux formes dégradées et aux effets
de matrice
Dosage multiplex Dosages ponctuels, petites séries ou grandes Dosage global
séries Tests de surcharge nécessaires pour certains
Mesure simultanée de plusieurs cytokines : fluides biologiques
profils cytokiniques sur de faibles quantités Attention à l'effet matrice et aux interférences
d'échantillon Difficulté de standardisation
Automatisation possible
Cytokines ou récepteurs cellulaires
Immunohistochimie Identification des cellules productrices dans Épitopes altérés par la fixation
les tissus Appréciation qualitative ou semi-quantitative
Production individuelle
Cytométrie intracytoplasmique Identification concomitante de Culture cellulaire et stimulation en présence
l'immunophénotype des cellules productrices de molécules bloquant la sécrétion
Caractérisation de signatures fonctionnelles Interprétation des résultats en clinique parfois
Grande sensibilité difficile (stimulation à la PHA, par exemple)
Réponses spécifiques en fonction de la
stimulation
Mesure quantitative
ELISpot Grande sensibilité Culture cellulaire en système approprié
Réponses spécifiques en fonction de la
stimulation
Mesure quantitative
Acides nucléiques
ARN, riboprobes in situ ou intracytoplasmiques Détection plus rapide de l'activation Protection des ARN
Analyse large du transcriptome Pas forcément de correspondance protéique
Identification concomitante de
l'immunophénotype des cellules productrices
ADN Détection des polymorphismes Pas de relation systématique avec les
capacités de réponse

Exemples d'applications patients chez qui est prescrite une biothérapie


• En recherche : l'exploration des cytokines et de anti-TNF. Elle est recherchée par les tests
leurs récepteurs revêt une importance majeure IGRA11. De nombreuses approches de bio-
dans l'étude de très nombreux modèles expéri- thérapies ciblant les cytokines dans le but de
mentaux, qu'il s'agisse de lignées cellulaires, de neutraliser leurs effets pathologiques se déve-
réponses immunitaires humaines ex vivo ou de loppent utilisant des anticorps monoclonaux
modèles animaux. Comme indiqué dans ce cha- ou protéines de fusion inhibitrices ou des ana-
pitre, l'étude de ces protéines et de leur régula- logues antagonistes. Pour leur mise en œuvre
tion fait appel à de nombreuses méthodes ou leur suivi, aucun dosage n'est nécessaire.
immunologiques. Quant à l'étude des polymorphismes (voir
• En clinique : chapitre 5), celui de l'IL-28B a son indication
– en pratique clinique, la recherche d'une infec-
tion tuberculeuse latente est une recomman- IGRA (interferon gamma release assay) par ELISpot
11

dation de la Haute Autorité de Santé chez les (T-Spot TB®) ou dosage ELISA (Quantiféron®).
186 Exemples d'applications

actuellement dans la mise en œuvre d'une toires liées à des mutations de récepteurs de
bithérapie interféron–ribaravine dans le trai- cytokines (e.g. TNFRSF1A) ou à des déficits
tement de l'hépatite C ; (IL-1ra ou IL-36ra), ainsi que de pathologies
– en recherche clinique, un orage cytokinique auto-immunes comme la polyarthrite rhuma-
est caractéristique du choc septique, générant toïde ou le lupus érythémateux. Cependant,
une immunosuppression secondaire poten- ces explorations restent encore du domaine
tiellement mortelle. L'exploration de l'in- de la recherche et n'ont pas encore de retom-
flammasome peut contribuer à une meilleure bées thérapeutiques.
compréhension de maladies auto-inflamma-
Chapitre 11
Exploration du complexe majeur
d'histocompatibilité

Le premier produit du complexe immunogéné- exprimées sur toutes les cellules nucléées de
tique HLA (Human Leucocyte Antigens), HLA- l'organisme. Ces peptides provenant de la
A2, a été individualisé en 1958 par Jean Dausset dégradation de molécules du soi dans les condi-
qui a reçu le prix Nobel en 1980 pour cette tions physiologiques correspondent à des pep-
découverte. En raison de l'importance de ce tides viraux ou tumoraux en pathologie.
complexe dans la greffe d'organe, le système Ce système de reconnaissance des vertébrés
HLA a été initialement perçu comme le com- supérieurs a été progressivement identifié. Chez
plexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de la souris, le CMH est le système H-2. Les molé-
l'homme. Il s'agit d'un système multigénique, cules de classe I sont codées par les gènes H-2K,
multi-allélique et d'expression codominante. H-2D et H-2L (e.g. H2k, H2d) et les molécules
En dehors du contexte de la greffe d'organes de classe II par les gènes I-E et I-A. Il existe éga-
ou de tissus entre individus différents, la fonc- lement un CMH chez le chien (DL-A) ou le
tion majeure des produits du CMH, décou- cheval (EL-A), par exemple. La compatibilité ou
verte partagée entre deux autres lauréats Nobel, l'incompatibilité du CMH doit être prise en
Ralf Zinkernagel et Peter Doherty (1986), est compte dans les expérimentations impliquant
de permettre des interactions cellulaires, en des animaux de fonds génétiques différents.
tout premier lieu la reconnaissance des anti- Les produits du CMH sont des glycoprotéines
gènes par les lymphocytes T. En effet, ces cel- membranaires qui peuvent donc être identifiées à
lules reconnaissent, de manière spécifique par la surface des cellules. Elles présentent des épi-
leur récepteur T (TCR), l'association d'un pep- topes spécifiques reconnaissables par des anticorps
tide et de la molécule CMH qui le présente. qui permettent de les typer de manière générique.
Les lymphocytes T CD4+ ne reconnaissent que Du fait de leur extrême variabilité au sein d'une
des peptides, en majorité exogènes, présentés même espèce, et en particulier chez l'homme, la
par des molécules CMH de classe II exprimées caractérisation des allèles codant pour ces molé-
de façon constitutive sur les cellules présenta- cules ne peut être réalisée que par biologie
trices d'antigènes (e.g. cellules dendritiques, moléculaire.
monocytes/macrophages, lymphocytes B). Les En raison de leur implication majeure dans la
lymphocytes T CD8+ ne reconnaissent que les tolérance ou le rejet de greffe, les molécules HLA
peptides, majoritairement d'origine endogène, de l'homme sont principalement caractérisées
présentés par les molécules CMH de classe I dans le domaine de la transplantation d'organes.

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188 Exemples d’applications

Typage du HLA en sérologie y sont fixées à la surface de microsphères dont


la fluorescence intrinsèque est spécifique de la
sonde oligonucléotidique qu'elles portent.
Le typage d'un locus en sérologie repose sur la
Après fixation des amplicons, la fluorescence de
reconnaissance des molécules HLA membra-
chaque bille du mélange est mesurée et l'ana-
naires par des anticorps anti-HLA spécifiques de
lyse du profil de l'ensemble des billes permet de
familles d'allèles en présence de complément. La
déterminer l'haploytype HLA d'un individu. La
fixation des anticorps sur leur cible entraîne une
PCR-SSP utilise des amorces spécifiques d'al-
activation du complément et la lyse de la cellule
lèle ou d'un groupe d'allèles en fonction du
exprimant le CMH reconnu. Cette réaction, qui
degré de résolution de l'amorce (typage géné-
utilise du complément de lapin, est mise à profit
rique). Le séquençage nucléotidique des exons
dans la microlymphocytotoxicité utilisée pour
2 et 3 des gènes de classe I (HLA-A, HLA-B,
les typages HLA de l'homme. Les panels d'anti-
HLA-C) et de l'exon 2 des gènes de classe II
corps utilisés sont soit des anticorps polyclonaux
(HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQB1) per-
provenant de femmes multipares ou de sujets
met un typage de haute résolution. Lorsqu'il
polytransfusés, soit des anticorps monoclonaux
porte sur la totalité des exons et des introns, ce
activateurs du complément. Les cellules testées,
séquençage parvient à un véritable typage
issues de l'individu dont on cherche à connaître
allélique.
le typage HLA de classe I, sont des lymphocytes
totaux isolés sur gradient de Ficoll®, le plus sou-
vent à partir d'un prélèvement sanguin. Cette Avantages/inconvénients
technique est moins utilisée pour les molécules
Avantages Inconvénients
de classe II, car elle requiert des lymphocytes B
purifiés. Typage Atteste de l'expression Typage générique
sérologique membranaire des Allèles rares pour
Pour typer les cellules issues d'animaux, des molécules du CMH et lesquels il n'existe pas
anticorps monoclonaux spécifiques permettent lève ainsi certaines d'anticorps spécifiques
de reconnaître des motifs spécifiques des motifs ambiguïtés portant sur Le typage HLA
spécifiques d'allèles (e.g. H-2d ou H-2b chez la des allèles nuls. sérologique peut être
difficile voire impossible
souris), le plus souvent par cytométrie en flux. en cas de lymphopénie
Toutefois, les lignées syngéniques ne nécessitent sévère
pas de vérifier le CMH des animaux. Réaction croisée des
anticorps vis-à-vis de
certains allèles
Typage en Screening haut débit Résultat dépendant de la
Typage du HLA par biologie Spécificité du typage qualité et de la quantité
biologie moléculaire moléculaire allélique
Typage de haute
de l'ADN extrait
Réaction de séquençage
résolution sujette aux
Les techniques de biologie moléculaire identi- indispensable dans les contaminations
allogreffes de cellules
fiant le génotype CMH utilisent actuellement souches
la PCR-SSO (PCR using Sequence Specific hématopoïétiques avec
Oligonucleotides), la PCR-SSP (PCR using donneurs non
Sequence Specific Primers) ou le séquençage. apparentés
Typage HLA-DP
Les méthodes basées sur les fragments de res-
triction enzymatique de l'ADN (Restriction
Fragment Length Polymorphism ou RFLP) sont
Exemples d'applications
de moins en moins utilisées. La PCR-SSO est
automatisée pour le typage HLA dans le sys- • En recherche : il est important de connaître le
tème multiplex Luminex®. Des sondes oligonu- CMH des animaux d'expérimentation ou de
cléotidiques spécifiques d'amplicons biotinylés lignées cellulaires lorsque les fonctions de ces
Chapitre 11. Exploration du complexe majeur d'histocompatibilité 189

molécules peuvent être impliquées dans le Étude du chimérisme


modèle mis en place. donneur–receveur après
• En clinique, les indications principales du
typage HLA sont les suivantes :
allogreffe de cellules
– les transplantations d'organes pour lesquelles souches hématopoïétiques
un typage générique des loci HLA-A, HLA-B,
HLA-DR et HLA-DQ suffit dans la majorité L'analyse du chimérisme chez les patients allo-
des cas ; greffés consiste à quantifier la part relative des cel-
– les greffes de cellules souches hématopoïé- lules du donneur et du receveur au sein des
tiques où en dehors de greffes familiales, où populations cellulaires du sang périphérique ou de
les quatre haplotypes parentaux ont pu être la moelle osseuse. Le chimérisme est qualifié de :
établis, un typage exhaustif et de haute réso- total quand seules les cellules du donneur sont
lution des gènes HLA de classe I et de classe II détectées chez le receveur ; partiel ou mixte quand
est requis pour s'assurer du maximum de des cellules du donneur et du receveur sont pré-
compatibilité HLA entre le donneur et le sentes de façon concomitante au sein de l'échan-
receveur (idéalement 10/10 ; i.e. HLA-A, tillon étudié ; absent en cas d'absence totale de
HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DQ sur les cellules du donneur.
deux allèles en raison de la codominance qui Le principe d'analyse du chimérisme hémato-
fait que tous les gènes sont exprimés). poïétique consiste à utiliser des marqueurs géné-
– certaines pathologies dans lesquelles une tiques informatifs propres au donneur et au
liaison ou une association HLA–maladie est receveur. L'étude du chimérisme est réalisée dans
décrite. Dans ce cas, le typage HLA est ciblé les premiers mois post-greffe pour rechercher la
sur le locus HLA incriminé. prise du greffon ou le rejet de greffe, puis de façon
plus espacée pour détecter la rechute et évaluer la
maladie résiduelle en l'absence de marqueurs
Épreuves de hématologiques classiques.
compatibilité tissulaire L'analyse est fondée sur les marqueurs géné-
tiques du polymorphisme humain de type micro-
La décision de transplantation met en œuvre des satellites ou STR (courtes séquences répétées,
examens d'urgence visant à garantir la compatibi- Short Tandem Repeats) ou SNP (Single Nucleotide
lité immunologique entre le donneur et le rece- Polymorphism). La première étape est la caractéri-
veur. La préexistence chez le receveur d'anticorps sation des marqueurs génétiques spécifiques du
anti-HLA spécifiques des molécules HLA du don- donneur et du receveur les plus informatifs.
neur entraîne un risque de rejet hyperaigu (cyto- L'examen du chimérisme lui-même quantifie les
toxicité dépendant du complément). Ces anticorps marqueurs donneurs–spécifiques sélectionnés par
peuvent résulter d'une grossesse, d'une transfu- amplification quantitative qPCR.
sion sanguine ou d'une première transplantation
avec un donneur non HLA identique.
Le cross-match lymphocytaire est une épreuve Tétramères CMH–peptides
de compatibilité ultime. Toute transplantation
devient contre-indiquée lorsque n'importe La reconnaissance des antigènes peptidiques par
lequel des sérums historiques du receveur pro- les lymphocytes T repose sur leur présentation
duit une réaction positive en présence des lym- restreinte par des molécules du CMH. Le déve-
phocytes ganglionnaires ou spléniques du loppement de molécules CMH recombinantes
donneur potentiel. Le cross-match en cytométrie chargées en peptides, constituant des ligands spé-
en flux (CMF) est plus sensible et très fortement cifiques de TCR, permet d'identifier la f­réquence
recommandé en prégreffe rénale avec donneur de lymphocytes T spécifiques de l'antigène pepti-
vivant. dique au sein d'une ­ population ­lymphocytaire
190 Exemples d’applications

hétérogène. Cette technologie a essentiellement des tétramères streptavidine–CMH–peptide aux


été développée chez l'homme. En pratique, des lymphocytes T spécifiques du peptide antigène
molécules CMH de classe I recombinantes, cor- est mesurée par la fluorescence cellulaire en cyto-
respondant aux allèles les plus fréquemment métrie en flux. Le système se développe aussi
exprimés, sont biotinylées et chargées du peptide pour des peptides restreints par les produits de
cible. Ce complexe est marqué par de la streptavi- classe II. Il est applicable à des expérimentations
dine conjuguée à un fluorochrome. La fixation animales.
Chapitre 12
Hypermutations somatiques
et translocations chromosomiques

La différenciation et la maturation lymphocy- Hypermutations somatiques


taire B se produisant dans la moelle osseuse et
les organes lymphoïdes secondaires sont des
L'analyse du statut mutationnel est surtout réali-
processus qui nécessitent plusieurs cycles de
sée pour les gènes codant pour les chaînes lourdes
prolifération, ainsi que des modifications por-
des immunoglobulines, IGHV, dont en principe
tant essentiellement sur les gènes codant pour
un seul est transcrit dans un lymphocyte. L'analyse
les immunoglobulines. Des cycles de coupure/
examine quel segment du répertoire VH a été uti-
ligation de l'ADN permettent ainsi de générer
lisé par chaque cellule. Si une prolifération clonale
la diversité de spécificité du domaine variable de
existe, un signal similaire sera obtenu pour toutes
la chaîne lourde (réarrangements VDJ) et de la
les cellules du clone.
chaîne légère (réarrangements VJ). Le même
mécanisme permet de remplacer les domaines
Méthodologie
constants de la chaîne lourde traduite en même
temps que ce domaine variable (commutation Les cellules mononuclées du sang, de la moelle
de classe), modifiant ainsi la fonctionnalité des osseuse ou d'un ganglion, sont séparées sur un
immunoglobulines produites. Par ailleurs, les gradient de Ficoll®. L'ADN génomique ou l'ARN
gènes codant pour le domaine variable des peuvent être utilisés comme support pour l'ana-
chaînes lourdes et légères des immunoglobu- lyse. Travailler sur l'ARN nécessite une étape sup-
lines subissent des hypermutations somatiques plémentaire de transcription inverse en ADN
qui modulent l'affinité pour le déterminant complémentaire (ADNc) mais présente l'avan-
antigénique. Ces remodelages géniques et les tage de ne détecter que les réarrangements fonc-
cycles de prolifération nécessaires à la mise en tionnels. L'ADN/ADNc est amplifié par PCR à
place du répertoire B et à une réponse humorale l'aide d'amorces IGHV leader ou IGHV consen-
optimale sont des étapes extrêmement sensibles sus du framework 1 (FR1, fig. 12.1). Le produit
associées à un risque potentiel d'erreurs pou- d'amplification est contrôlé sur gel de polyacryla-
vant mener à un processus lymphomateux. Les mide ou, si une amorce marquée est introduite,
remaniements chromosomiques induits par les sur un analyseur de fragments, puis séquencé. La
translocations peuvent avoir le même effet. séquence obtenue est comparée avec les séquences
L'exploration des proliférations B peut ainsi VH en configuration germinale issues des bases
développer un typage à l'aide de techniques de de données et le pourcentage d'identité est cal-
biologie moléculaire. culé par rapport à la séquence du VH le plus

Méthodes en immunologie
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b. Migration sur Gel ou sur Analyseur de fragment

192
a. Amplification par PCR du réarrangement VDJ
(amorce couplée à un fluorochrome)

IGHV IGHD IGHJ IGHM

Exemples d’applications
ADN
L CH

ADN réarrangé
FR1 JH*

ARNm

L CH*

c. Séquençage du produit de PCR d. Détermination du pourcentage d’homologie

Fig. 12.1  Exploration à visée pronostique du statut mutationnel de la partie variable de la chaîne lourde de l'immunoglobuline d'un clone de lymphocytes B issus d'un
patient atteint de leucémie lymphoïde chronique.
a. Le réarrangement VDJ est amplifié par PCR.
b à d. L'amplicon est ensuite contrôlé (b) et séquencé (c) afin de comparer la séquence obtenue à celles issues de bases de données internationales (d) et calculer le
pourcentage d'homologie.
* : amorce couplée à un fluorochrome.
Chapitre 12. Hypermutations somatiques et translocations chromosomiques 193

proche. Plusieurs outils accessibles sur des sites homologues ou non, pouvant modifier les condi-
Internet permettent cette analyse. tions d'activation et de survie des cellules et conduire
à des pathologies tumorales. Dans les hémopathies
Recommandations de mise en œuvre malignes B, les translocations retrouvées sont sou-
L'utilisation d'ARN pour la production d'ADNc vent issues d'erreurs lors du processus de recombi-
nécessite de prendre les précautions nécessaires naison VDJ des gènes codant pour la partie variable
pour préserver ces acides nucléiques fragiles : des gènes IGVH ou, plus rarement, lors des recom-
transport rapide des échantillons, utilisation d'in- binaisons VJ au niveau des chaînes légères κ ou λ.
hibiteurs d'ARNases ou de milieux spécifiques, Elles entraînent le plus souvent une surexpression
travail en conditions RNAse-free. des transcrits et de la protéine de fusion si la
La mise en évidence des séquences résultant séquence ne comporte pas de codon stop.
d'hypermutations caractéristiques d'un clone Méthodologie
pathologique peut permettre de suivre la maladie
résiduelle moléculaire dans les proliférations B. L'hybridation in situ en fluorescence (Fluorescence
Ceci nécessite pour chaque point de suivi une com- In Situ Hybridization ou FISH) sur cellules en
paraison avec le matériel de diagnostic et dépend métaphase ou interphase est la technique de réfé-
donc de sa quantité et de sa qualité, ainsi que de la rence permettant de détecter les translocations
production d'amorces spécifiques pour l'amplifica- chromosomiques.
tion du matériel nucléaire des cellules malignes. L'amplification de l'ADN par PCR à l'aide
d'amorces spécifiques des gènes impliqués dans la
Exemples d'applications fusion est également possible en utilisant pour
• En recherche : la recherche des hypermutations chaque gène une région d'hybridation des
somatiques après stimulation de cellules in vitro amorces localisée à proximité du point de cassure.
permet d'évaluer les réponses des cellules Les stratégies de PCR recherchant des transloca-
mémoire ou naïves. tions impliquant les gènes des chaînes lourdes des
• En clinique : immunoglobulines utilisent une amorce consen-
– la leucémie lymphoïde chronique (LLC) est sus sur le gène JH.
une pathologie tumorale caractérisée par la L'analyse des transcrits peut être réalisée sur du
prolifération d'un clone de lymphocytes B matériel de bonne qualité, frais ou congelé, pour
défini par des caractéristiques phénotypiques lequel les ARNm ont été bien conservés. Une surex-
et moléculaires propres. Le statut mutation- pression des transcrits peut être évaluée par RT-PCR
nel VH, défini par une homologie supérieure compétitive co-amplifiant différents ARNm.
ou inférieure à 98 % aux séquences germi- Les protéines de fusion, quand elles existent,
nales, est associé à l'évolution de cette affec- peuvent être détectées par immunohistochimie
tion, plus favorable pour les patients ayant sur coupes congelées ou fixées et incluses en paraf-
une LLC mutée (< 98 %) ; fine, en utilisant des anticorps monoclonaux spéci-
– la recherche des spécificités de séquence du fiques des deux protéines concernées. Les signaux
clone malin peut être utilisée pour détecter, pourront alors colocaliser ou, au contraire, dispa-
après traitement, la maladie résiduelle dans la raître si l'épitope reconnu est altéré ou éliminé par
LLC, les leucémies aiguës lymphoblastiques la translocation. Quelques techniques détectant
et les lymphomes. des protéines de fusion dans des lysats cellulaires
par ELISA ou par une technique voisine ont été
rapportées dans la littérature.
Translocations
chromosomiques Recommandations de mise en œuvre
La ou les techniques à utiliser dépendent du
Les translocations chromosomiques sont des type d'anomalie recherchée et du contexte
échanges de matériel génétique entre chromosomes pathologique.
194 Exemples d’applications

Les précautions habituelles doivent être prises cellulaire peuvent bénéficier de ces techniques.
pour la manipulation des ARN. Ainsi, l'inactivation ou au contraire la dé-répres-
La spécificité des anticorps et l'efficacité des sion de certains gènes, résultant de ces modifi-
techniques d'immunomarquage doivent être cations chromosomiques, permettent de mieux
vérifiées en s'entourant des témoins ad hoc, comprendre leur implication dans la physiologie
notamment de lignées présentant l'anomalie des réponses immunitaires.
recherchée. • En clinique : les réarrangements BCL1-IGH et
IGH-BCL2, résultant des translocations t(11;14)
Exemples d'applications (q13;q32) et t(14;18)(q32;q21), sont les plus
• En recherche : les recherches de mutations sont couramment retrouvés respectivement dans les
appliquées à des modèles particuliers utilisant lymphomes du manteau et de Burkitt. La translo-
des agents susceptibles d'induire des cassures de cation t(11;14)(q13;q32) place le gène de la
l'ADN et des recombinaisons anormales. Les cycline D1, CCND1, sous le contrôle de la
translocations ainsi générées et leur suivi au région enhancer IGH-Eμ induisant une activa-
cours de processus tumoraux ou d'activation tion transcriptionnelle de la cycline D1 (fig. 12.2).

B normaux

Patient LM
REC1

Cycline D1
Cycline D2
BCL1 JH Cycline D3

a. Amplification du réarrangement b. Surexpression des transcrits

BCL1-JH de la cycline D1

(ADN) (ARNm)
Fig. 12.2  Recherche de l'hyperexpression de la cycline D1 consécutive à la translocation t(11 ; 14) dans les
lymphomes du manteau.
a. Sondes d'amplification BCL1 sur le chromosome 11, JH sur le chromosome 14.
b. Surexpression des transcrits de la cycline D1 dans les lymphocytes B pathologiques : analyse des transcrits ARNm dans
une lignée de lymphome du manteau (REC1), lymphocytes B normaux et ARNm d'un patient atteint de lymphome du
manteau (LM).
Chapitre 13
Immuno-hématologie

En 1900, Karl Landsteiner a introduit la notion de méthodes immunologiques actuellement complé-


groupes sanguins en montrant que les individus tées par des techniques de biologie moléculaire.
peuvent être classés en trois groupes (A, B et O) Les antigènes de groupe sanguin peuvent être de
sur la base de la survenue d'une agglutination des nature protéique (e.g. RH) ou glucidique (e.g. ABO),
hématies après mélange de leur sang. Un qua- présents sous forme isolée, ou exprimés sur des glyco-
trième groupe (AB) fut découvert par la suite. Un protéines ou des glycolipides. Leur polymorphisme
groupe sanguin érythrocytaire est un marqueur peut être dû à la présence ou à l'absence d'une
allotypique immunogène, génétiquement trans- molécule entière (e.g. RHD positif ou négatif), ou
mis, reconnu par des anticorps spécifiques. Ces à la variabilité d'une même molécule par le chan-
antigènes sont exprimés de façon potentiellement gement d'un simple acide aminé (e.g. Fya ou Fyb)
non exclusive à la surface des hématies. Leur ou d'une unité monosaccharidique (e.g. A ou B).
caractère immunogène représente un obstacle à la Les anticorps reconnaissant les antigènes éry-
transfusion sanguine, constitue un risque d'in- throcytaires sont de deux types (tableau  13.1).
compatibilité pendant la grossesse et conditionne Les anticorps naturels préexistent à toute stimula-
l'exploration de leur polymorphisme par des tion interhumaine par transfusion ou grossesse.

Tableau 13.1  Différents systèmes de groupes sanguins officiellement reconnus par la Société internationale de
transfusion sanguine (SITS), nomenclature et localisation chromosomique
Numérotation Nom du système Symbole Nombre Chromosome Locus
du système d'antigènes
A001 ABO ABO 4 9 ABO
A002 MNS MNS 46 4 GYPA/B/E
A003 P1PK P1 2 22 P1PK
A004 Rh RH 52 1 RHD/CE
A005 Lutheran LU 20 19 LU
A006 Kell KEL 32 7 KEL
A007 Lewis LE 6 19 FUT3
A008 Duffy FY 5 1 FY
A009 Kidd JK 3 18 SLC14A1
A010 Diego DI 22 17 SLC4A1
A011 Yt YT 2 7 ACHE
(Suite)
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196 Exemples d’applications

Tableau 13.1 Suite
Numérotation Nom du système Symbole Nombre Chromosome Locus
du système d'antigènes
A012 Xg XG 2 X/Y XG/MIC2
A013 Scianna SC 7 1 ERMAP
A014 Dombrock DO 7 12 DO
A015 Colton CO 4 7 AQP1
A016 Landsteiner-Wiener LW 3 19 LW
A017 Chido/Rodgers CH/RG 9 6 C4A/B
A018 H H 1 19 FUT1
A019 Kx KX 1 X/Y XK
A020 Gerbich GE 11 2 GYPC
A021 Cromer CROM 16 1 DAF
A022 Knops KN 9 1 CR1
A023 Indian IN 4 11 CD44
A024 Ok OK 3 19 BSG
A025 Raph RAPH 1 11 MER2
A026 John Milton-Hagen JMH 6 15 SEMA7A
A027 Indian IN 1 6 CGNT2
A028 Globoside GLOB 1 3 B3GALNT1
A029 Gill GIL 1 9 AQP3
A030 RHAG RHAG 3 6 RHAG
A031 Forssman FORS 1 1 A3GALNT1
A032 Junior JR 1 4 ABCG2
A033 Langeris LAN 1 2 ABCB6
A034 Vel VEL 1 1 SMIM1

Les anticorps naturels réguliers ou irréguliers sont Le système ABO est le plus important car tout
présents respectivement de façon constante (e.g. sujet présente dans son sérum des anticorps natu-
anticorps du système ABO) ou inconstante (e.g. rels réguliers (anti-A et anti-B) dirigés contre les
système Lewis). Ils sont de classe IgM et/ou IgG. antigènes érythrocytaires qu'il ne possède pas. Les
La présence des anticorps naturels réguliers antigènes de ce système sont représentés par les
impose des règles de compatibilité ABO pour les sucres terminaux des chaînes latérales glucidiques
hématies et le plasma dès la première transfusion. des glycolipides ou glycoprotéines de la mem-
Les anticorps immuns liés à une stimulation brane du globule rouge (fig.  13.1). Les phéno-
interhumaine sont surtout de classe IgG, de surve- types A et B sont codominants et dominants par
nue inconstante et font par conséquent partie des rapport à O (tableau 13.2). Les anticorps naturels
anticorps irréguliers. Ils représentent un risque de ce système sont majoritairement des IgM diri-
transfusionnel et obstétrical. Ces anticorps peuvent gées contre les antigènes absents et seuls les sujets
être des allo-anticorps ou des auto-anticorps12. AB n'ont pas d'anticorps dans ce système.
Le système Rhésus (Rh) est un système com-
12
En fonction de la fréquence dans la population de
plexe comportant une cinquantaine d'antigènes
l'antigène reconnu, on parle d'antigènes privés (< 1 %) ou
publics (> 99 %). La majorité des allo-anticorps ont une
importants car très immunogènes. Pour la pra-
fréquence distribuée entre ces deux bornes. tique courante, cinq d'entre eux (D, C, E, c et e
Chapitre 13. Immuno-hématologie 197

Disaccharide de base Gal GlcNAc R

Précurseur H
Reste en l’état Gal GlcNAc R
chez le sujet OO

Fuc

Antigène A
Ajout du sucre dominant
GalNAc Gal GlcNAc R
chez un sujet porteur
d’au moins un allèle A
Fuc

Antigène B
Ajout du sucre dominant
Gal Gal GlcNAc R
chez un sujet porteur
d’au moins un allèle B
Fuc

Fig. 13.1  Structure saccharidique des antigènes du système ABO.


Sur le polysaccharide de base (disaccharide galactose-N-acétylglucosamine), un fucose est accroché par l'activité de la
fucosyl transférase codée par le gène H produisant ainsi la substance H. Par la suite, tout dépend des allèles portés par le
locus ABO. Si le sujet est homozygote pour l'allèle O, l'antigène H reste en l'état. Si le sujet possède au moins un allèle A,
le sucre immunodominant A (GalNac) est ajouté par l'activité d'une GalNac transférase et produit l'antigène A. Si le sujet
possède au moins un allèle B, le sucre immunodominant B (Gal) est ajouté par l'activité d'une Gal transférase et produit
l'antigène A. Il est à noter que si H est absent, les antigènes A et B ne peuvent être synthétisés même si leurs allèles sont
présents. C'est ce que l'on retrouve dans un phénotype exceptionnel, le phénotype Bombay, lié à la présence en double
dose d'un allèle h non fonctionnel.

Tableau 13.2  Système ABO : relations génotype–phénotype et réactions antithétiques


Groupe Sanguin Gènes présents Génotypes Antigène Anticorps plas- Fréquence (%) en
possibles globulaire (épreuve matique (épreuve Europe
globulaire) plasmatique)
A Gène A, gène H A/A ou A/O A Anti-B 45
B Gène B, gène H B/B ou B/O B Anti-A 9
AB Gène A, gène B, A/B AB Aucun 3
gène H
O Gène H O/O O Anti-A et Anti-B 43

respectivement pour RH1, RH2, RH3, RH4, d'haplotype. Le locus RHD code l'antigène D qui
RH5) sont recherchés pour un phénotypage rhé- définit le phénotype RH1 positif. Chez les sujets
sus complet. Ils sont codés par deux loci étroite- européens, l'absence d'antigène D, c­ aractéristique
ment liés et transmis en bloc sous forme du phénotype RH1 négatif, correspond à une
198 Exemples d’applications

Tableau 13.3  Principaux allo-anticorps de groupe sanguin, nature et pouvoir pathogène


Catégorie de Cible de l'anticorps Classe d'Ig Phénotype de Risque d'accidents Risque de maladie
l'anticorps l'immunisé transfusionnels hémolytique du
nouveau-né
Naturel régulier Anti-A IgM > > IgG O, B ++++ Rare
Anti-B IgM > > IgG O, A
Anti-H IgG Bombay (Oh)
Anti-P IgM + P1k ou P2k ++++ Fausses couches
Anti-[P,P1,Pk] IgG p ou Tj(a−)
(anti-Tja)
Naturel irrégulier Anti-Lea IgM Le(a−) Non Non
Anti Leb Le(b−)
Anti-P1 IgM P2 Non Non
Anti-M IgM M− Non +
Anti-N N− Non Non
Immun irrégulier Anti-D IgG Rh− ++++ ++++
Anti-E IgG E− +++ ++
Anti-C C− ++
Anti-c c− ++++
Anti-e e− ++
Anti-K IgG K− +++ ++++
Anti-Fya IgG Fy(a−) +++ +++
Anti-Fyb Fy(b−) ++ +
Anti-Jka IgG Jk(a−) +++ +++
Anti-Jkb Jk(b−) ++ +
Anti-S IgG S− ++ ++

délétion et est désignée par la lettre d. Les sujets Kell (KEL) comporte 32 antigènes dont deux sont
RH1 négatif sont homozygotes dd pour cette recherchés en routine, K (KEL1 très immuno-
délétion. Par définition, le groupe Rh standard gène) et k (KEL2 beaucoup moins immunogène),
correspond à ces deux phénotypes13. La détermi- codés par deux allèles codominants14. Les anti-
nation de l'antigène D est indissociable du grou- corps anti-KEL1 sont des anticorps immuns irré-
page ABO. Il n'y a pas d'anticorps anti-rhésus guliers et il faut éviter l'immunisation anti-K en
naturels, ils sont tous des anticorps immuns irré- transfusion. Trois autres systèmes importants
guliers secondaires à une grossesse ou à une trans- peuvent être source d'anticorps immuns irrégu-
fusion incompatible. La compatibilité pour liers, les systèmes Kidd, Duffy et MNSs dans lequel
l'antigène D doit être impérativement respectée les antigènes S et s sont les plus immunogènes.
lors d'une transfusion d'érythrocytes. Le système Les anticorps naturels irréguliers anti-P1 et anti-
Lewis ne présentent en général aucun risque
13
En France, 85 % des sujets sont Rh positifs (RH:+1)
transfusionnel ou obstétrical. En revanche, cer-
et 15 % Rh négatifs (RH:−1). Sur un document de grou- tains anticorps naturels réguliers des systèmes P et
page, par convention et selon la nomenclature internatio- PK, présents exceptionnellement chez des sujets
nale, les antigènes présents sont représentés par le symbole dépourvus des antigènes correspondants, peuvent
du système auquel ils appartiennent, suivi du chiffre les être dangereux. Les principaux allo-anticorps anti-
désignant, précédé ou non du signe − selon qu'ils sont érythrocytes sont présentés dans le tableau 13.3.
absents ou présents. Ainsi, le phénotype Rh négatif clas-
sique, qui correspond au phénotype D−C−E−C+e+ en
nomenclature usuelle, est selon cette convention noté 14
Quatre-vingt-dix pour cent des individus sont Kell−
RH: −1,−2,−3,4,5. (kk), et 10 % sont K (KK ou Kk).
Chapitre 13. Immuno-hématologie 199

Techniques sérologiques tion). Les techniques en microplaques distinguent


par hémagglutination les réactions d'agglutination négatives (sédimen-
tation en bouton au fond de la cupule) des réac-
tions positives (sédimentation en tapis). Les
Méthodologie techniques par filtration consistent à détecter une
La détermination des antigènes de groupes san- agglutination des hématies déposées dans une
guins et des anticorps correspondants repose sur chambre de réaction au sommet d'une micro-
des méthodes immunologiques exploitant la spé- colonne de filtration (gel ou microbilles de verre).
cificité de la réaction antigène–anticorps. La colonne fonctionne comme un filtre qui retient
L'hémagglutination est la méthodologie la plus les hématies agglutinées dans la chambre de réac-
répandue, adaptée à des supports permettant une tion. Les techniques par filtration sont appliquées
automatisation et la réduction du risque d'erreurs pour la majorité des typages érythrocytaires
humaines (microplaques ou colonnes de filtra- (fig. 13.2).

+ –
Hématies

Anticorps

Colonne
de filtration

Hématies, agglutinées
Hématies non agglutinées,
par les anticorps,
sédimentées en bas de la
stoppées par la
colonne de filtration
colonne de filtration

Fig. 13.2 Hémagglutination en tube.
Cette technique est utilisée pour réaliser les groupes sanguins et les tests de Coombs recherchant des anticorps
anti-hématies fixés sur les globules rouges in vivo (Coombs direct ou Test of Direct Agglutination, TDA) ou au laboratoire
(Coombs indirect ou Test of Indirect Agglutination, TIA) par incubation d'hématies de groupe O et du sérum testé.
Le tube de gauche représente la situation initiale au cours de laquelle les réactifs sont introduits dans la chambre
supérieure. Le gel de filtration est dit actif s'il contient un anticorps de groupage ou une anti-globuline. On peut réaliser le
test de Coombs en déposant dans la chambre supérieure seulement les hématies du malade sensibilisées in vivo ou un
mélange des hématies O et du sérum du sujet à tester. Le gel peut également être passif : l'anticorps de groupage se
trouve alors dans la chambre supérieure et les hématies à tester lui sont ajoutées.
Le tube du centre représente une réaction positive où les hématies agglutinées ont été bloquées par le gel.
Le tube de droite représente une réaction négative où les hématies non agglutinées ont traversé le gel.
200 Exemples d’applications

Recommandations de mise en œuvre anticorps (e.g. maladie hémolytique du nou-


L'hémagglutination est dite directe si elle survient veau-né, incompatibilité transfusionnelle) ;
dans une suspension d'hématies en solution saline – le test de Coombs indirect appelé aujourd'hui
à 0,9 % (0,15 M NaCl), ce qui permet la distinc- test indirect à l'anti-globuline (TIA)
tion entre anticorps agglutinants (e.g. système recherche la sensibilisation in  vitro d'héma-
ABO, avec anticorps plutôt d'isotype IgM) et ties test par le sérum étudié. Le TIA est à la
anticorps non agglutinants reconnaissant des anti- base de la recherche des agglutinines irrégu-
gènes protéiques (e.g. Duffy, Kidd). Il est à noter lières (RAI) qui sont en règle générale des
que certains anticorps monoclonaux IgM dits IgG non directement agglutinantes15.
salins sont capables de provoquer une agglutina-
tion directe de systèmes antigéniques protéiques. Alternatives à
Les anticorps agglutinants sont utilisés comme
réactifs de groupage par des méthodes d'aggluti-
l'hémagglutination
nation directe.
L'hémagglutination indirecte est fondée sur La révélation des anticorps anti-érythrocytaires
l'utilisation d'artifices permettant une agglutina- peut faire appel à des méthodes en microplaques
tion dans des systèmes non directement aggluti- indépendantes de l'agglutination ou à la biologie
nants. Certains facteurs agissent sur la phase de moléculaire. L'exploration des groupes sanguins
sensibilisation permettant la reconnaissance des érythrocytaires en biologie moléculaire repose sur
hématies par les anticorps : température, temps la connaissance des formes alléliques d'un gène
d'incubation, force ionique, pH, densité et acces- responsable du polymorphisme moléculaire (e.g.
sibilité antigénique, ratio antigènes/anticorps. protéine, glycosyltranférase).
D'autres facteurs agissent sur la phase d'agglutina-
Méthodologie
tion des hématies préalablement sensibilisées. Une
réduction de la distance interglobulaire peut être L'immuno-adhérence (fig.  13.3) repose sur
obtenue par des enzymes qui réduisent les charges l'utilisation de microplaques dont les puits
électronégatives répulsives portées par les acides contiennent des hématies fixées, porteuses des
sialiques. Une anti-globuline polyclonale ou antigènes à identifier. Après addition du sérum
monoclonale (anticorps animal anti-isotype d'im- testé, la microplaque est incubée puis lavée pour
munoglobuline humaine) et/ou un anti-C3d sont éliminer les fixations non spécifiques. Les anti-
utilisés pour induire l'agglutination des hématies. corps ayant reconnu les hématies dans les puits
sont ensuite révélés par immuno-adhérence en
ajoutant des hématies révélatrices porteuses
Exemples d'applications
d'anti-globuline humaine. Ces hématies indica-
• En recherche : ces techniques sont potentielle- trices s'étalent sur toute la surface du puits en
ment applicables à la recherche des groupes cas de réaction positive. Une réaction négative
sanguins ou d'anticorps anti-érythrocytaires
­ est matérialisée, après centrifugation, par un
dans de nombreux modèles expérimentaux. bouton cellulaire au centre du puits. Des tech-
L'immunisation d'animaux de laboratoire niques similaires reposent sur la fixation préa-
contre des hématies est une technique largement lable d'anti-globuline humaine au fond du puits.
utilisée pour explorer la physiologie et la régula- Les hématies sensibilisées in  vivo (TDA) ou
tion des réponses immunitaires humorales. in  vitro (TIA) s'étalent sur toute la surface du
• En clinique : puits après centrifugation, alors que les hématies
– le test de Coombs direct appelé aujourd'hui
test direct à l'anti-globuline (TDA) permet 15
Le TIA est effectué en mélangeant dans un premier
de révéler une sensibilisation in  vivo des temps le sérum ou le plasma à tester avec des hématies O
hématies par un auto-anticorps (e.g. anémie d'un panel de dépistage et de l'anti-globuline. En cas de
hémolytique auto-immune) ou par un allo- positivité, un panel d'identification est réalisé.
Chapitre 13. Immuno-hématologie 201

Hématies de révélation (seront recouvertes d’antiglobuline)

Hématies exprimant l’antigène spécifique

Antiglobuline

Anticorps spécifiques de l’antigène d’intérêt

a b
Fig. 13.3  Immuno-adhérence à partir d'une cupule recouverte d'hématies (a) et d'une cupule recouverte d'antiglobuline (b).

non sensibilisées d'un test négatif donnent un loppent comme la spectrométrie de masse identi-
bouton cellulaire au centre du puits. Cette deu- fiant le nucléotide à chaque position polymorphe.
xième approche de l'immuno-adhérence évite les
lavages. Exemples d'applications
Le génotypage nécessite de disposer d'un Les alternatives à l'agglutination se développent
échantillon d'ADN représentatif du génome pour les typages érythrocytaires. En médecine trans-
(ADNg). Un fragment de l'ADNg est amplifié par fusionnelle et obstétricale, l'outil moléculaire per-
PCR. Les SNP sont recherchés dans les amplicons met d'envisager la détermination du génotype
par RFLP (Restriction Fragment Length érythrocytaire d'un individu et d'en déduire le phé-
Polymorphism) pour un SNP d'intérêt localisé notype lorsque l'immunohématologie fait défaut ou
dans le site de restriction d'une endonucléase, ou est confrontée à des situations complexes (e.g. trans-
par séquençage. Des techniques de PCR-AS fusions récentes, maladie hémolytique du nouveau-
(Allele-Specific) utilisent trois amorces, l'une com- né). En transfusion sanguine, la mise en œuvre de
mune et deux autres spécifiques de chacun des techniques à haut débit permettrait de résoudre le
deux allèles. La PCR en temps réel allèle spéci- problème de l'identification de génotypes délicats
fique peut être appliquée à haut débit. Les micro- ou rares. Ceci pourrait s'avérer utile pour la sécurité
puces à ADN avec une PCR multiplex permettent transfusionnelle ou pour la constitution de panels de
un génotypage à moyen débit éventuellement laboratoire. Les principales applications sont présen-
automatisable. D'autres techniques se déve- tées dans le tableau 13.4.
202 Exemples d’applications

Tableau 13.4 Applications du génotypage érythrocytaire dans le cadre de la médecine transfusionnelle et obstétricale


Contexte patient Contexte donneur
– Transfusion récente – Constitution d’une base de données de donneurs génotypés
– Hématies recouvertes d’immunoglobulines (TDA positif) – Identification des donneurs négatifs pour des antigènes publics
– Réactifs immunologiques non disponibles ou privés
(anti-Doa, Dob, −Jsa, −V/VS) – Réactifs immunologiques non disponibles (anti-Doa, Dob, −Jsa, −V/VS)
– Distinction allo-anticorps/auto-anticorps – Identification des donneurs pour les panels d’identification des
– Détection d’antigènes faiblement exprimés ou partiels anticorps
(FyX, RhD faible, DAR) – Résolution des divergences
– Aide à la résolution d’enquêtes sérologiques complexes – Identification des donneurs exprimant des antigènes faibles
– Identification des bases moléculaires de résultats sérologiques et/ou partiels
inhabituelles
– Patients ayant reçu une greffe hématopoïétique/chimérisme naturel
– Identification d’un fœtus à risque pour maladie hémolytique
néonatale
– Détermination de la zygotie, en particulier pour le gène RHD
Chapitre 13
Immuno-hématologie

En 1900, Karl Landsteiner a introduit la notion de méthodes immunologiques actuellement complé-


groupes sanguins en montrant que les individus tées par des techniques de biologie moléculaire.
peuvent être classés en trois groupes (A, B et O) Les antigènes de groupe sanguin peuvent être de
sur la base de la survenue d'une agglutination des nature protéique (e.g. RH) ou glucidique (e.g. ABO),
hématies après mélange de leur sang. Un qua- présents sous forme isolée, ou exprimés sur des glyco-
trième groupe (AB) fut découvert par la suite. Un protéines ou des glycolipides. Leur polymorphisme
groupe sanguin érythrocytaire est un marqueur peut être dû à la présence ou à l'absence d'une
allotypique immunogène, génétiquement trans- molécule entière (e.g. RHD positif ou négatif), ou
mis, reconnu par des anticorps spécifiques. Ces à la variabilité d'une même molécule par le chan-
antigènes sont exprimés de façon potentiellement gement d'un simple acide aminé (e.g. Fya ou Fyb)
non exclusive à la surface des hématies. Leur ou d'une unité monosaccharidique (e.g. A ou B).
caractère immunogène représente un obstacle à la Les anticorps reconnaissant les antigènes éry-
transfusion sanguine, constitue un risque d'in- throcytaires sont de deux types (tableau  13.1).
compatibilité pendant la grossesse et conditionne Les anticorps naturels préexistent à toute stimula-
l'exploration de leur polymorphisme par des tion interhumaine par transfusion ou grossesse.

Tableau 13.1  Différents systèmes de groupes sanguins officiellement reconnus par la Société internationale de
transfusion sanguine (SITS), nomenclature et localisation chromosomique
Numérotation Nom du système Symbole Nombre Chromosome Locus
du système d'antigènes
A001 ABO ABO 4 9 ABO
A002 MNS MNS 46 4 GYPA/B/E
A003 P1PK P1 2 22 P1PK
A004 Rh RH 52 1 RHD/CE
A005 Lutheran LU 20 19 LU
A006 Kell KEL 32 7 KEL
A007 Lewis LE 6 19 FUT3
A008 Duffy FY 5 1 FY
A009 Kidd JK 3 18 SLC14A1
A010 Diego DI 22 17 SLC4A1
A011 Yt YT 2 7 ACHE
(Suite)
Méthodes en immunologie
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196 Exemples d’applications

Tableau 13.1 Suite
Numérotation Nom du système Symbole Nombre Chromosome Locus
du système d'antigènes
A012 Xg XG 2 X/Y XG/MIC2
A013 Scianna SC 7 1 ERMAP
A014 Dombrock DO 7 12 DO
A015 Colton CO 4 7 AQP1
A016 Landsteiner-Wiener LW 3 19 LW
A017 Chido/Rodgers CH/RG 9 6 C4A/B
A018 H H 1 19 FUT1
A019 Kx KX 1 X/Y XK
A020 Gerbich GE 11 2 GYPC
A021 Cromer CROM 16 1 DAF
A022 Knops KN 9 1 CR1
A023 Indian IN 4 11 CD44
A024 Ok OK 3 19 BSG
A025 Raph RAPH 1 11 MER2
A026 John Milton-Hagen JMH 6 15 SEMA7A
A027 Indian IN 1 6 CGNT2
A028 Globoside GLOB 1 3 B3GALNT1
A029 Gill GIL 1 9 AQP3
A030 RHAG RHAG 3 6 RHAG
A031 Forssman FORS 1 1 A3GALNT1
A032 Junior JR 1 4 ABCG2
A033 Langeris LAN 1 2 ABCB6
A034 Vel VEL 1 1 SMIM1

Les anticorps naturels réguliers ou irréguliers sont Le système ABO est le plus important car tout
présents respectivement de façon constante (e.g. sujet présente dans son sérum des anticorps natu-
anticorps du système ABO) ou inconstante (e.g. rels réguliers (anti-A et anti-B) dirigés contre les
système Lewis). Ils sont de classe IgM et/ou IgG. antigènes érythrocytaires qu'il ne possède pas. Les
La présence des anticorps naturels réguliers antigènes de ce système sont représentés par les
impose des règles de compatibilité ABO pour les sucres terminaux des chaînes latérales glucidiques
hématies et le plasma dès la première transfusion. des glycolipides ou glycoprotéines de la mem-
Les anticorps immuns liés à une stimulation brane du globule rouge (fig.  13.1). Les phéno-
interhumaine sont surtout de classe IgG, de surve- types A et B sont codominants et dominants par
nue inconstante et font par conséquent partie des rapport à O (tableau 13.2). Les anticorps naturels
anticorps irréguliers. Ils représentent un risque de ce système sont majoritairement des IgM diri-
transfusionnel et obstétrical. Ces anticorps peuvent gées contre les antigènes absents et seuls les sujets
être des allo-anticorps ou des auto-anticorps12. AB n'ont pas d'anticorps dans ce système.
Le système Rhésus (Rh) est un système com-
12
En fonction de la fréquence dans la population de
plexe comportant une cinquantaine d'antigènes
l'antigène reconnu, on parle d'antigènes privés (< 1 %) ou
publics (> 99 %). La majorité des allo-anticorps ont une
importants car très immunogènes. Pour la pra-
fréquence distribuée entre ces deux bornes. tique courante, cinq d'entre eux (D, C, E, c et e
Chapitre 13. Immuno-hématologie 197

Disaccharide de base Gal GlcNAc R

Précurseur H
Reste en l’état Gal GlcNAc R
chez le sujet OO

Fuc

Antigène A
Ajout du sucre dominant
GalNAc Gal GlcNAc R
chez un sujet porteur
d’au moins un allèle A
Fuc

Antigène B
Ajout du sucre dominant
Gal Gal GlcNAc R
chez un sujet porteur
d’au moins un allèle B
Fuc

Fig. 13.1  Structure saccharidique des antigènes du système ABO.


Sur le polysaccharide de base (disaccharide galactose-N-acétylglucosamine), un fucose est accroché par l'activité de la
fucosyl transférase codée par le gène H produisant ainsi la substance H. Par la suite, tout dépend des allèles portés par le
locus ABO. Si le sujet est homozygote pour l'allèle O, l'antigène H reste en l'état. Si le sujet possède au moins un allèle A,
le sucre immunodominant A (GalNac) est ajouté par l'activité d'une GalNac transférase et produit l'antigène A. Si le sujet
possède au moins un allèle B, le sucre immunodominant B (Gal) est ajouté par l'activité d'une Gal transférase et produit
l'antigène A. Il est à noter que si H est absent, les antigènes A et B ne peuvent être synthétisés même si leurs allèles sont
présents. C'est ce que l'on retrouve dans un phénotype exceptionnel, le phénotype Bombay, lié à la présence en double
dose d'un allèle h non fonctionnel.

Tableau 13.2  Système ABO : relations génotype–phénotype et réactions antithétiques


Groupe Sanguin Gènes présents Génotypes Antigène Anticorps plas- Fréquence (%) en
possibles globulaire (épreuve matique (épreuve Europe
globulaire) plasmatique)
A Gène A, gène H A/A ou A/O A Anti-B 45
B Gène B, gène H B/B ou B/O B Anti-A 9
AB Gène A, gène B, A/B AB Aucun 3
gène H
O Gène H O/O O Anti-A et Anti-B 43

respectivement pour RH1, RH2, RH3, RH4, d'haplotype. Le locus RHD code l'antigène D qui
RH5) sont recherchés pour un phénotypage rhé- définit le phénotype RH1 positif. Chez les sujets
sus complet. Ils sont codés par deux loci étroite- européens, l'absence d'antigène D, c­ aractéristique
ment liés et transmis en bloc sous forme du phénotype RH1 négatif, correspond à une
198 Exemples d’applications

Tableau 13.3  Principaux allo-anticorps de groupe sanguin, nature et pouvoir pathogène


Catégorie de Cible de l'anticorps Classe d'Ig Phénotype de Risque d'accidents Risque de maladie
l'anticorps l'immunisé transfusionnels hémolytique du
nouveau-né
Naturel régulier Anti-A IgM > > IgG O, B ++++ Rare
Anti-B IgM > > IgG O, A
Anti-H IgG Bombay (Oh)
Anti-P IgM + P1k ou P2k ++++ Fausses couches
Anti-[P,P1,Pk] IgG p ou Tj(a−)
(anti-Tja)
Naturel irrégulier Anti-Lea IgM Le(a−) Non Non
Anti Leb Le(b−)
Anti-P1 IgM P2 Non Non
Anti-M IgM M− Non +
Anti-N N− Non Non
Immun irrégulier Anti-D IgG Rh− ++++ ++++
Anti-E IgG E− +++ ++
Anti-C C− ++
Anti-c c− ++++
Anti-e e− ++
Anti-K IgG K− +++ ++++
Anti-Fya IgG Fy(a−) +++ +++
Anti-Fyb Fy(b−) ++ +
Anti-Jka IgG Jk(a−) +++ +++
Anti-Jkb Jk(b−) ++ +
Anti-S IgG S− ++ ++

délétion et est désignée par la lettre d. Les sujets Kell (KEL) comporte 32 antigènes dont deux sont
RH1 négatif sont homozygotes dd pour cette recherchés en routine, K (KEL1 très immuno-
délétion. Par définition, le groupe Rh standard gène) et k (KEL2 beaucoup moins immunogène),
correspond à ces deux phénotypes13. La détermi- codés par deux allèles codominants14. Les anti-
nation de l'antigène D est indissociable du grou- corps anti-KEL1 sont des anticorps immuns irré-
page ABO. Il n'y a pas d'anticorps anti-rhésus guliers et il faut éviter l'immunisation anti-K en
naturels, ils sont tous des anticorps immuns irré- transfusion. Trois autres systèmes importants
guliers secondaires à une grossesse ou à une trans- peuvent être source d'anticorps immuns irrégu-
fusion incompatible. La compatibilité pour liers, les systèmes Kidd, Duffy et MNSs dans lequel
l'antigène D doit être impérativement respectée les antigènes S et s sont les plus immunogènes.
lors d'une transfusion d'érythrocytes. Le système Les anticorps naturels irréguliers anti-P1 et anti-
Lewis ne présentent en général aucun risque
13
En France, 85 % des sujets sont Rh positifs (RH:+1)