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Qualité et accréditation en biologie médicale

Ann Biol Clin 2010 ; 68 (Hors série no 1) : 247-294

SG2-07

Vérification/validation des
performances d'une méthode d'analyse
A. Vassault, A. Hulin, E. Chapuzet, J. Arnaud, C. Giroud et les membres
du sous-groupe 2 analytique de la SFBC*
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Groupe de travail SFBC « Accréditation des laboratoires de biologie médicale »


(coordonnateur M. Vaubourdolle)

RÉSUMÉ
La vérification/validation d'une technique consiste à évaluer les performances du processus
analytique (fidélité, justesse, exactitude, domaine de mesure, sensibilité aux interférences,
limite de détection s'il y a lieu), à les quantifier en suivant un protocole opératoire standardisé
puis à les juger, par rapport à des critères définis. Une adaptation du protocole proposé par
la SFBC en 1986 est présentée dans cet article pour répondre aux exigences de la norme NF
EN ISO 15189. Un module est consacré à chaque évaluation, décrivant l'objectif, le protocole
opératoire, le matériel, le recueil des résultats, les calculs à effectuer ainsi que l'interprétation
des résultats illustrés par un exemple.
L'intérêt d'un protocole rationnel et standardisé est de simplifier et d'optimiser le travail
d'évaluation, d'uniformiser la présentation des données et de permettre un jugement compa-
ratif des résultats obtenus par des évaluateurs ou des laboratoires différents.

MOTS CLÉS : accréditation | ISO 15189 | fidélité | justesse | domaine de mesure | limites
d'acceptabilité

ABSTRACT Verification/validation of the performances of analytical method


The verification and validation of methods consist in evaluating the precision, the analytical
range, the accuracy, the trueness and the detection limit, if appropriate. These measurements
must follow a standardized protocol and the obtained results must be compared to defined
quality criteria. Each chapter includes, the purpose, the material used, the operating proce-
dures, the collection of results, the calculation and is illustrated by an example. This document
aims at simplifying, standardizing and optimizing the evaluation in order to allow a compa-
rison between laboratories and to facilitate method assessment.

KEY WORDS: accreditation | ISO 15189 | precision | trueness | linearity range | acceptable
limit

* Liste des membres du SG2 : Anne Vassault (coordonnateur), Valérie Adjidé, Josiane Arnaud, Pascal
Bailly, Frédéric Barbier, Bruno Baudin, Catherine Bourcier, Éric Chapuzet, Patrice Combe, Jacques de Graeve,
Jean-Louis Dhondt, Laurence Drouard, Patrice Fournier, Claude Giroud, Line Guezenec, Joseph Henny, Anne
Hulin, Guy Lalau, Christian Nourrin, Jean-Marc Pavard, Agnès Perrin, Henri Portugal, Olivier Reuilly, Jean
Pascal Siest, Anton Szymanowicz

247
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

SG2-07 Vérification/validation
des performances d'une méthode
d'analyse
Objet et domaine d'application

➥ L'objectif d'une méthode d'analyse en biologie médicale est d'identifier et/ou


quantifier, avec une incertitude connue, des molécules ou des composants
présents dans les liquides biologiques.
Le document présent constitue un guide pour la vérification et la validation des
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méthodes utilisées, conformément aux exigences de la norme NF EN ISO 15189


dans le cadre de l'accréditation des laboratoires de biologie médicale (LBM).
L'exploitation informatique des résultats est facilitée par l'utilisation de logiciels
adaptés au protocole.

1 Exigences de la norme NF EN ISO 15189


La validation préalable à l'utilisation d'une méthode d'analyse fait l'objet d'une exigence
de la norme NF EN ISO 15189 (chapitre 5.5.2) « pour s'assurer qu'elle convient à l'utili-
sation prévue » [1].
Deux cas peuvent être facilement distingués :
• le cas où les dispositifs médicaux de diagnostic in vitro (DMDIV) utilisés
dans les LBM ont fait l'objet d'un marquage CE garantissant leur conformité
aux exigences de la directive européenne 98/79 CE [2].
L'une des exigences de la directive porte sur la vérification des performances
annoncées. L'utilisation de tels dispositifs par les LBM apporte donc la garantie
que les performances annoncées dans la documentation produite par le fournis-
seur résultent d'essais préalables. Les résultats de ces évaluations peuvent être
réclamés aux fournisseurs par les autorités compétentes en cas d'anomalie
constatée. Dans ce cas, l'évaluation au laboratoire se limitera à vérifier que les
performances annoncées sont satisfaites dans les conditions réelles
d'utilisation ;
• les cas suivants : il n'existe pas de DMDIV ou ils ne sont pas applicables
dans le laboratoire ou il a été procédé à une modification critique des
conditions d'utilisation. Il s'agit alors d'une méthode développée par le labo-
ratoire qui nécessitera une validation des performances plus approfondie.

248
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

2 Introduction
Le document préparé par les membres du groupe de la SFBC est présenté par module. La
nature et le nombre de modules à mettre en oeuvre dépendent du contexte et du type de
méthode analytique considéré. Un guide des modules à déployer en fonction du type de
méthode adopté est donné dans le chapitre 4, relatif au domaine d'application
[Tableau I].
Pour chaque module sont présentés : les définitions à connaître, l'objectif de la vérifica-
tion/validation, le matériel à utiliser, les modalités opératoires, le recueil des données,
l'interprétation des résultats et les enregistrements et documents à produire. Une illustra-
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tion par un exemple y est associée.


Avant chaque validation/vérification analytique, un ensemble d'informations doit être
recueilli et analysé afin de caractériser au mieux le type de méthode, la nature du projet
de validation/vérification et de justifier les choix et les critères d'acceptabilité (cf. modèle
de formulaire en annexe I). Il est conseillé de renseigner ce type de formulaire pour
chaque projet de validation/vérification analytique. En fonction des informations recueil-
lies, la démarche de validation est proposée et décrite dans un protocole de validation
(modules à déployer, plan expérimental, etc.).
Lors de l'acquisition d'un nouveau système analytique, la vérification des performances
peut faire partie du cahier des charges accepté et être pratiquée avant le procès verbal
de réception.

3 Terminologie
➜ Méthode de mesure
Description générique de l'organisation logique des opérations mises en oeuvre dans
un mesurage [3].

➜ Système de mesure
Ensemble technique comprenant analyseur, réactif et protocole d'adaptation [3].

➜ Méthode qualitative
Méthode générant un résultat n'apportant pas d'information sur la quantité de l'ana-
lyte, mais seulement sur sa présence ou son absence (positif/négatif), voire sur
une présence ou une activité supérieure à celle d'un témoin donné [4].
Elle peut également résulter d'une observation par un opérateur. On classe dans
cette catégorie toutes les méthodes pour lesquelles aucune mesure d'une donnée
quantifiable n'est disponible.

➜ Méthode quantitative
Méthode fournissant un résultat chiffré, sur une échelle continue, dont les limites
basses et hautes sont connues, en relation directe avec une quantité ou une activité
donnée de l'analyte à mesurer [4].

249
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

➜ Méthode semi-quantitative
Méthode fournissant un résultat de type qualitatif (positif/négatif) extrapolé à partir
de la mesure d'une donnée quantifiable (signal continu) [4]. Ce type de méthode
est assimilable à une méthode quantitative.

➜ Série
Conditions expérimentales aussi représentatives que possible de la variabilité de
l'utilisation de la méthode en routine (jour, opérateur, appareillage, etc.) [5].

➜ Valeur assignée
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Valeur attribuée à une grandeur particulière et reconnue, parfois par convention,


comme ayant une incertitude appropriée à un usage donné [3].

➜ Validation
Confirmation par examen et apport de preuves objectives du fait que les prescrip-
tions particulières en vue d'une utilisation prévue déterminée sont remplies [6].
Validation de méthode : c'est l'ensemble des procédures à mettre en oeuvre pour
s'assurer qu'une méthode présente la fiabilité requise pour répondre aux exigences
de qualité dans l'état actuel de l'art [7].

➜ Vérification


Confirmation par examen et établissement des preuves que les exigences spécifiées
ont été satisfaites [3].

Les définitions de chaque critère de la vérification/validation


sont données dans chaque module.

4 Domaine d'application
Le domaine d'application du document concerne le cadre spécifique de la vérification/
validation des performances des méthodes utilisées en biologie médicale. Il ne s'attache
qu'à la phase analytique et concerne des analyses effectuées dans les milieux biologi-
ques (plasma, urine, liquide céphalorachidien, etc.) par différentes méthodes (immuno-
logiques, colorimétriques, électrochimiques, séparatives, etc.) à l'exclusion des techni-
ques de biologie moléculaire qui feront l'objet de recommandations spécifiques.

250
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

En fonction du contexte, six stratégies de vérification/validation pourront être suivies :

➜ Cas de l'utilisation d'une méthode DMDIV marqué CE [2], qu'elle soit quan-
titative, semi-quantitative ou normalisée :
•Stratégie 1 ou portée A : vérification des performances annoncées par les four-
nisseurs ou souhaitées par le laboratoire lors de la mise en application d'une
nouvelle méthode d'analyse utilisant notamment des analyseurs automatiques
et des trousses de réactifs prêts à l'emploi. L'objectif de cette démarche est
d'apporter au biologiste une confirmation in situ et la preuve de la validité des
résultats rendus par rapport aux besoins définis.
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•Stratégie 2 : vérification rétrospective des performances (portée A) dans le cas


d'une méthode déjà utilisée par le laboratoire.
• Stratégie 3 (portée B) : validation partielle dans le cas de modifications effec-
tuées : changement des conditions d'utilisation, pré-analytiques ou analytiques
(par ex., changement de matrice biologique, d'anticoagulant, d'équipement, de
volume d'échantillon pour une adaptation à la pédiatrie, etc.).

➜ Cas de l'utilisation d'une méthode mise au point (développée) au


laboratoire
• Stratégie 4 : vérification ou validation d'une méthode qualitative réalisée pour
les méthodes développées au laboratoire.
• Stratégie 5 : validation d'une méthode semi-quantitative pour les méthodes
développées au laboratoire (portée B).
• Stratégie 6 : validation d'une méthode quantitative (portée B) réalisée pour les
méthodes développées au laboratoire (immunologique, séparative, spectromé-
trique, etc.).
Ainsi, les différentes étapes d'une vérification/validation de méthode par le bio-
logiste sont :
• d'évaluer de façon détaillée le contexte de la méthode afin de :
– choisir le(s) module(s) correspondant(s),
– définir les prérequis nécessaires ;
• de définir le protocole de validation en justifiant les critères évalués et ceux
qui ne sont pas jugés nécessaires (en tenant compte des objectifs de la méthode
en routine et des décisions prises à partir des résultats générés) ;
• de choisir le plan expérimental ;
• d'exploiter et d'analyser les résultats (graphes et statistiques) ;
• d'effectuer le rapport de validation/vérification.
Les différents modules à programmer en fonction des stratégies à déployer [4, 5] sont
décrits dans le tableau I.

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SG2

➜ TABLEAU I. DIFFÉRENTS MODULES À PROGRAMMER EN FONCTION DES STRATÉGIES À DÉPLOYER

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Stratégie 1 : vérification 2 : vérification 3 : validation 4 : vérification 5 : validation 6 : validation
des performances rétrospective partielle* /validation méthode méthode
méthode semi-quantitative quantitative
Méthode quantitative qualitative
Modules ou semi-quantitative
Module 1. Fidélité
Répétabilité B et E B, R ou E E – B et E E
Fidélité B et E B, R ou E E – B et E E
PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

intermédiaire
Module 2. Justesse
Justesse B et E si possible B et R ou E si B et E si possible – – E si possible
possible
Module 3. Limite de détection et seuil de positivité
Limite de détection B ou E si intérêt B ou R si intérêt B et E si intérêt – – E si intérêt
Seuil de positivité – – – – E –
Module 4. Limites de linéarité
Intervalle B B E si intérêt – – E
de mesure
Limite inférieure B ou E B ou R E si intérêt – B et E si intérêt E
de quantification
Effet dilution B ou E si intérêt B, R ou E si intérêt B ou E si intérêt – – B ou E si intérêt
Module 5. Comparaison avec une autre méthode
Comparaison avec B ou E si possible R si disponible B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si possible
une autre méthode
Module 6. Contamination inter-échantillons
Contamination B ou E si intérêt R ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt E si intérêt
inter-échantillons
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➜ TABLEAU I. DIFFÉRENTS MODULES À PROGRAMMER EN FONCTION DES STRATÉGIES À DÉPLOYER (SUITE)

Stratégie 1 : vérification 2 : vérification 3 : validation 4 : vérification 5 : validation 6 : validation


des performances rétrospective partielle* /validation méthode méthode
méthode semi-quantitative quantitative
Méthode quantitative qualitative
Modules ou semi-quantitative
Module 7. Évaluation de l'influence de l'hémolyse, de la bilirubine et de la turbidité des échantillons
Évaluation B si intérêt B si intérêt B si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt
de l'influence
de l'hémolyse,
de la bilirubine
et de la turbidité
des échantillons
Module 8. Autres critères
Fonction – – – – – B et E si intérêt
de réponse
Choix de la matrice B et E si intérêt – – B et E si intérêt
Spécificité B B B B B B et E si intérêt
analytique
Sélectivité B B B B B B et E si intérêt
Stabilités B et E si intérêt
– Réactifs B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt E si intérêt
– Étalons B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt E si intérêt
– Échantillons B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt B ou E si intérêt E si intérêt
biologiques
Rendement – E si besoin E si besoin
d'extraction
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale

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Exactitude B si possible B si possible B si possible – – E si possible
* Dispositif médical de diagnostic in vitro (DMDIV) marqué CE, utilisation hors spécifications fournisseur.
E : essai à programmer ; B : vérification bibliographique ; R : données rétrospectives.
1
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Module 1 : fidélité


Définitions
La fidélité (precision) exprime l'étroitesse de l'accord entre les
indications d'une valeur mesurée obtenues par des mesures
répétées du même échantillon dans des conditions spécifiées
[3]. La fidélité fournit une indication sur les erreurs dues au
hasard. L'étude de la fidélité peut inclure celle de :
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– la répétabilité ;
– la fidélité intermédiaire (reproductibilité intra-laboratoire) ;
– et la reproductibilité (inter-laboratoire) : non applicable
dans ce contexte.
La fidélité traduit uniquement la distribution des erreurs
aléatoires et n'a aucune relation avec la valeur vraie ou
spécifiée.

Répétabilité (repeatability, within run precision)


➜ Définition
La fidélité est mesurée dans les conditions suivantes : même procédure de mesure,
même opérateur, même système de mesure, mêmes conditions de fonctionnement,
même milieu, même objet de mesure pendant une courte période de temps.

➜ Objectif
Cette évaluation a pour objet de vérifier, dans les conditions réelles d'utilisation, le bon
fonctionnement du système analytique. Les données acquises peuvent être ultérieu-
rement utilisées pour mettre en évidence un dysfonctionnement au cours du temps
[5, 7].

➜ Matériaux
Utiliser soit des échantillons biologiques « anonymisés » provenant de patients, à condi-
tion d'avoir l'assurance de leur stabilité pendant la durée de l'évaluation, soit des échan-
tillons de contrôle.
Niveau(x) de concentration : il est préférable d'effectuer l'évaluation à deux niveaux de
concentration différents. Un seul niveau peut être suffisant mais cela doit être justifié.
Les niveaux sont choisis en fonction des zones de décision médicale.
Dans le cas des méthodes semi-quantitatives, la fidélité sera évaluée en utilisant des
échantillons de contrôle négatif, positif et un niveau choisi proche du « seuil de positi-
vité » (cut-off).

254
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

➜ Protocole expérimental
Les essais sont effectués en suivant la procédure d'analyse conformément aux indica-
tions de la notice d'utilisation du fournisseur (stratégies 1 et 2) ou au mode opératoire
défini par le laboratoire (stratégies 3, 5 et 6).
Si les données rétrospectives sont disponibles (stratégie 2), elles seront utilisées pour
l'analyse statistique. Si elles ne sont pas disponibles, les essais sont effectués en suivant
la procédure d'analyse conformément aux indications de la fiche technique du
fournisseur.
Les conditions sont standardisées dans la mesure du possible : même opérateur, même
instrument, même lot de réactifs, même étalonnage.
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Le nombre optimal de déterminations à effectuer est de 20. Il peut être réduit à 6 dans
certains cas en fonction de la difficulté de mise en oeuvre de certaines méthodes ou de
leur coût élevé.

➜ Recueil des données


Les données individuelles sont recueillies et enregistrées (voir feuille de résultats no 1).

➜ Exploitation des résultats


Déterminer la moyenne (m), l'écart type (s) et le coefficient de variation (CV) des résul-
tats obtenus pour chaque niveau de concentration.
Le CV calculé est évalué (en tenant compte de l'intervalle de confiance) par rapport au
CV limite annoncé dans la notice d'utilisation du dispositif produit par le fournisseur
(stratégies 1 et 2). Il peut également être comparé aux CV limites acceptables [8] définis
en fonction de la méthode et du contexte physiopathologique (stratégies 1, 2, 3, 5 et 6).
Dans le cas où le CV est calculé avec moins de 20 échantillons, il convient de tenir
compte de l'intervalle de confiance du CV [7].
L'opération peut également être effectuée à partir de données obtenues dans des séries
différentes.

• Cas des mesures effectuées dans une même série Série x : (n = 20)
La dispersion des valeurs (xi) autour de la moyenne (m) est estimée par le calcul
de l'écart type (s) et du CV.

m=
Σx
n
i
s=
√ Σ(x – m)
i
n–1
2
s
CV = × 100
m

• Cas des mesures effectuées dans des séries différentes


Série y : IIIIIIII (n1)
Série z : IIIIIIIIIIIIIIIII (n2) n = n1 + n2 = 20

255
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

• Calculer les variances V1 et V2 de chaque série de mesure, puis la variance V


intra-série et l'écart type s, en utilisant les formules suivantes :

V1(n – 1) + V2(n2 – 1)
V= s = √V
(n – 1) + (n2 – 1)

Fidélité intermédiaire (intermediate precision)


➜ Définition
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Conditions où les résultats d'essais indépendants sont obtenus par la même méthode
en utilisant des échantillons identiques dans le même laboratoire et des conditions
opératoires différentes (opérateur, étalonnage, lot de réactifs, etc.) pendant un intervalle
de temps donné.

➜ Objectif
Cette évaluation permet de connaître la variabilité analytique d'une méthode. Ces don-
nées sont exploitées pour le calcul de l'incertitude de mesure utile à l'interprétation des
résultats de patients.

➜ Matériaux
Utiliser soit des échantillons biologiques « anonymisés » provenant de patients (échan-
tillons non titrés), à condition d'avoir l'assurance de leur stabilité pendant la durée de
l'évaluation, soit des échantillons de contrôle (titrés ou non titrés).
Niveau(x) de concentration : les niveaux de concentration sont choisis en fonction des
zones de décision médicale et en fonction du recrutement du laboratoire. Il est préférable
d'effectuer l'évaluation à au moins deux niveaux de concentration différents choisis dans
une zone proche des seuils de décision clinique.
Si la valeur assignée est connue, ces matériaux peuvent être également utilisés pour
évaluer la justesse de la méthode : moyenne des valeurs obtenues par plusieurs labo-
ratoires ou valeur obtenue par titrage avec une méthode de référence

➜ Protocole expérimental
Les essais sont effectués en suivant la procédure d'analyse conformément aux indica-
tions de la fiche technique du fournisseur (stratégies 1 et 2) ou au mode opératoire du
laboratoire (stratégies 3, 5 et 6). Les conditions opératoires (série) sont le reflet de l'uti-
lisation habituelle de la méthode. Les résultats obtenus dans la pratique quotidienne du
contrôle interne de qualité (CIQ) peuvent également être exploités (stratégie 2). Si ces
données rétrospectives ne sont pas disponibles (stratégie 2), les essais sont effectués
en suivant la procédure d'analyse conformément aux indications de la fiche technique
du fournisseur.

256
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

L'analyse de chacun des échantillons en double dans 15 séries différentes 15 jours diffé-
rents au minimum est nécessaire en privilégiant à chaque série de façon indépendante le
changement de plusieurs conditions opératoires « critiques » en fonction des conditions
d'application de la méthode en routine (manipulateur, lot de réactif, lot d'étalons, etc.).

➜ Recueil des données


Un exemple de formulaire d'enregistrement est présenté (voir feuille de résultats no 2).

➜ Exploitation des résultats


Déterminer la moyenne (mfi), l'écart type (sfi) et le coefficient de variation (CVfi) des
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valeurs obtenues pour chaque niveau de concentration au cours des 15 séries indépen-
damment effectuées en exploitant les formules suivantes :

mfi =
Σx
n
i
sfi =
√ Σ(x – m)
i
n–1
2
CVfi =
sfi
m
× 100

Le CVfi calculé est évalué par rapport au CV limite annoncé dans la notice d'utilisation
(compte tenu de l'intervalle de confiance) du dispositif produit par le fournisseur (straté-
gies 1 et 2). Il peut également être comparé aux CV limites acceptables [8] ou aux CVfi
préalablement définis en fonction de la technique et du contexte physiopathologique
(stratégies 3 et 6).
L'analyse statistique des résultats est enregistrée. Les conclusions de l'essai sont formulées
en fonction des critères définis dans les prérequis (voir feuille de résultats no 2).
La répétabilité moyenne au cours de l'essai peut être estimée à partir des différences
obtenues dans une même série pour les 2 mesures effectuées du même échantillon [7].
L'intervalle de confiance de l'écart type est calculé en utilisant la formule suivante :

s
ICs = s ± t –
√ 2n
t = facteur fonction du nombre de degré de liberté et du risque retenu, en général 5 %,
défini dans la table de Student
(http://www.agro-montpellier.fr/cnam-lr/statnet/tables.htm).

257
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Exemple

Évaluation de la répétabilité et de la fidélité intermédiaire d'une technique


de dosage de la créatininémie
La répétabilité est estimée à partir de la mesure répétée du même échantillon dans
des conditions identiques (n = 20).
Au cours de 15 séries de dosages, l'écart type et le coefficient de variation (CV) des
valeurs observées de créatinine de 2 spécimens de contrôle (B, E) de niveaux de
concentration différents (respectivement 73 et 569 μmol/L) sont calculés pour
estimer la fidélité intermédiaire et la répétabilité moyenne de la technique. Les CV
observés pour la répétabilité moyenne d'une part et la fidélité intermédiaire sont
comparés aux limites d'acceptabilité choisies par le LBM. Les résultats sont satisfai-
sants par rapport aux limites établies dans le protocole de la SFBC [8].
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Feuille de résultats no 1. Recueil de données : dosage de la créatininémie,


évaluation de la répétabilité

B (niveau bas) E (niveau élevé)


1 71 571
2 71 571
3 74 558
4 72 572
5 74 561
6 76 566
7 72 582
8 73 565
9 72 558
10 71 561
11 74 570
12 75 560
13 73 583
14 73 572
15 74 574
16 71 561
17 74 570
18 75 560
19 73 583
20 73 572
n 20 20
m (μmol/L) 73,1 568,5
Écart type (s) 1,5 8,1
Coefficient de variation (CV) % 2,0 1,4
Valeur annoncée par le fournisseur <4% <3%
CV limite [8] 4,5 % 2,6 %
Conclusions Validé Validé

258
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Feuille de résultats no 2. Dosage de la créatininémie : évaluation de la fidélité


intermédiaire et de la répétabilité moyenne

B B' (B-B') E E' (E-E'')


Série 1 71 72 1 571 564 7
Série 2 71 69 2 571 575 4
Série 3 74 73 1 558 564 6
Série 4 72 75 3 572 565 7
Série 5 74 73 1 561 561 0
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Série 6 76 73 3 566 578 12


Série 7 72 74 1 582 582 0
Série 8 73 71 2 565 574 9
Série 9 72 73 1 558 569 11
Série 10 71 71 0 561 572 11
Série 11 74 74 0 570 572 4
Série 12 75 74 1 560 569 9
Série 13 73 73 0 583 581 2
Série 14 73 76 3 572 582 10
Série 15 74 72 2 574 556 18
n 15 15 15 15
m 73 72,9 568 570
Variance (V) 2,3 3,0 63,2 63,2
Moyenne des V 2,65 63,2
n 30 15 30 15
m 73 73 570 570
s 1,62 1,22 7,95 6,14
ICs ± 0,42 ± 0,44 ± 2,5 ± 2,5
CV 2,2 1,7 1,4 1,1
ICCV ± 0,5 % ± 0,6 ± 0,45 ± 0,44
Valeur annoncée <5% <4% <4% <3%
par le fournisseur
CV limite [8] 5,2 % (fidélité 4,5 % 3,1 % (fidélité 2,6 %
intermédiaire) (répéta- intermédiaire) (répéta-
bilité) bilité)
Conclusions Validé Validé Validé Validé Validé
IC : intervalle de confiance ; CV : coefficient de variation.

259
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07
f:\2000\image\130591\vassault3\1

➜ FIGURE 1 : RÉPÉTABILITÉ ET FIDÉLITÉ INTERMÉDIAIRE POUR DEUX NIVEAUX


DE CONCENTRATION (LOGICIEL MAC VALTEC)
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Un plan expérimental alternatif [5] peut être également utilisé pour réduire la durée
de l'évaluation. Le nombre de séries peut être réduit à 5, incluant chacune 6 fois le
dosage de chacun des échantillons de contrôle choisis au moins à deux niveaux de
concentration différents à condition que les facteurs d'influence « sensibles » soient iden-
tifiés et varient d'une série à l'autre. Le schéma suivant peut être utilisé :

Niveau 1 Niveau 2
Série 1 6 déterminations 6 déterminations
Série 2 6 déterminations 6 déterminations
Série 3 6 déterminations 6 déterminations
Série 4 6 déterminations 6 déterminations
Série 5 6 déterminations 6 déterminations

À partir de ces données, la fidélité intermédiaire et la répétabilité moyenne peuvent


être calculées [9].

Stratégie 1 : vérifi- 2 : vérifi- 3 : vali- 4 : vali- 5 : validation 6 : vali-


cation des cation dation dation méthode dation
perfor- rétro- partielle méthode semi-quanti- méthode
mances spective qualitative tative quanti-
Critères tative
Répéta- B et E B, R ou E E – B et E E
bilité
Fidélité B et E B, R ou E E – B et E E
inter-
médiaire
E : essai à programmer ; B : vérification bibliographique ; R : données rétrospectives.

260
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Module 2 : justesse (trueness)


Définition
La justesse exprime l'étroitesse de l'accord entre la valeur
moyenne obtenue à partir d'une série de résultats d'essai
et une valeur qui est acceptée soit comme une valeur
conventionnellement vraie, soit comme une valeur de
référence acceptée. La justesse fournit une indication
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sur les erreurs systématiques.

➜ Objectif et domaine d'application


Cette évaluation permet de mettre en évidence le biais d'une méthode ou une différence
systématique entre deux méthodes et de la quantifier à condition de s'assurer que les
échantillons de contrôle utilisés se comportent comme les échantillons biologiques.
Cet essai ne pourra pas être effectué :
• si aucun matériau de référence certifié n'existe ;
• s'il n'existe pas de programme de comparaison inter-laboratoires (CIL).
Cette évaluation n'est pas pratiquée dans le cas de méthodes qualitatives ou semi-
quantitatives (stratégies 4 et 5).

➜ Matériaux
Les échantillons retenus peuvent être ceux utilisés pour l'évaluation de la fidélité.
Utiliser au moins 2 échantillons de contrôle de 2 niveaux de concentration différents
dont les valeurs cibles sont connues : moyenne des valeurs obtenues par plusieurs labo-
ratoires (voir CIL) ou valeur obtenue par titrage avec une méthode de référence.
Ces niveaux sont choisis en fonction des zones de décision médicale.
Des échantillons préparés par surcharge d'une matrice équivalente à celle de l'échan-
tillon analysé, par des concentrations connues de la substance à doser peuvent égale-
ment être utilisés.

➜ Protocole expérimental
Les conditions opératoires sont le reflet de l'utilisation habituelle de la méthode. Les
résultats obtenus dans le cadre du CIQ peuvent être exploités si l'on dispose de valeurs
cibles pour le(s) échantillon(s) correspondant(s).

261
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

➜ Recueil des données


Un exemple de formulaire d'enregistrement est présenté (voir feuille de résultats no 3).

➜ Exploitation des résultats


La justesse est quantifiée par le biais relatif estimé en comparant la moyenne obtenue
(m) lors de l'étude de fidélité intermédiaire à la valeur cible attendue assimilée à la
valeur vraie (v) de l'échantillon testé.

Biais relatif (%) = 100 × ((m-v)/v)


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La valeur du biais relatif exprimée en pourcentage ou en unité de concentration doit


être inférieure à celle annoncée dans les fiches techniques produites par le fournisseur
(stratégies 1 et 2).
Il peut également être comparé aux valeurs limites d'erreur de justesse acceptables
préalablement définis en fonction de la technique et du contexte physiopathologique
(stratégies 1, 2, 3 et 6).
L'analyse statistique des résultats est enregistrée. Les conclusions de l'essai sont formu-
lées (voir feuille de résultats no 3).
Si le nombre de valeurs utilisées pour calculer la moyenne est faible, il convient de tenir
compte de l'intervalle de confiance de la moyenne qui dépend du nombre de valeurs
utilisées dans le calcul de la moyenne (nombre de degrés de liberté et risque α). Cette
différence peut être exprimée en pourcentage de la moyenne, ce qui permet une appré-
ciation de la nature de l'erreur (systématique proportionnelle ou constante).

Intervalle de confiance de la moyenne : ICm = m ± t s


√n
t = facteur fonction du nombre de degré de liberté et du risque retenu, en général 5 %,
défini dans la table de Student
(http://www.agro-montpellier.fr/cnam-lr/statnet/tables.htm).

262
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Exemple

Évaluation de la justesse
Évaluation de la justesse d'une méthode de dosage de l'antigène spécifique de
la prostate (PSA) par l'étude d'échantillons de contrôle dont les valeurs cibles
sont fournies par comparaison inter-laboratoires (CIL) : le biais est calculé pour
3 échantillons de contrôle choisis à des niveaux de décision clinique (B, M et E).
La moyenne des valeurs observées est rapportée dans la feuille de résultats no 3 et
comparée à la valeur cible. Le biais calculé exprimé en concentration et en pourcen-
tage est comparé aux limites d'erreur de justesse en tenant compte de l'intervalle
de confiance de la moyenne.
Les résultats font apparaître une différence systématique proportionnelle de + 20 %
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de la technique testée.

Feuille de résultat no 3. Évaluation de la justesse d'une méthode de dosage


du PSA en utilisant les résultats d'une CIL.

B M E

Valeur de référence cible μg/L 2,5 5,8 9,1

Méthode testée moyenne (n = 30) μg/L 3 7,1 10,7

IC de la moyenne μg/L ± 0,04 ± 0,07 0,12

Biais (biais relatif) μg/L + 0,5 + 1,3 + 1,6


% + 20 % + 22 % + 17 %

Limite acceptable de justesse % ±6% ±6% ±6%


μg/L ± 0,18 ± 0,42 % ± 0,60

Conclusion NV NV NV
IC : intervalle de confiance ; NV : non validé par rapport au critère (présence d'une erreur systématique pro-
portionnelle à la concentration).

Stratégie 1 : vérifi- 2 : vérifi- 3 : vali- 4, 5 : vali- 6 : vali-


cation des cation rétro- dation dation dation
perfor- spective partielle méthode méthode
mances qualitative ou quantitative
semi-
Critères quantitative

Justesse B et E si B et R ou E si B et E si – E si possible
possible possible possible –
B : bibliographie ; E : Essai à effectuer ; R : données rétrospectives.

263
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Module 3 : limite de détection et seuil de positivité


Limite de détection (limit of detection)


Définition
La limite de détection d'une méthode d'analyse est la plus petite
quantité à examiner dans un échantillon pouvant être détectée,
mais non quantifiée comme une valeur exacte [7, 10, 11].
Dans le cas d'une vérification (stratégie 1) ou d'une
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vérification partielle (stratégies 2 et 3), elle peut être


définie à partir de données bibliographiques.
Dans le cas de méthodes semi-quantitatives (stratégie 5),
c'est le seuil de positivité qu'il convient de considérer.

➜ Objectif
Cette évaluation permet de connaître la valeur à partir de laquelle on peut affirmer avec
un risque donné que la substance est présente dans l'échantillon, et de ne pas commu-
niquer une valeur qui n'est pas significative sur le plan analytique. Cette détermination
ne présente un intérêt que dans le cas des marqueurs qui sont normalement non quan-
tifiables (troponine, hCG, PSA, après prostatectomie, etc.).
➜ Matériaux
Blanc de la réaction, matrice vierge ou calibrateur zéro de la gamme d'étalonnage.
➜ Protocole expérimental
La méthode la plus utilisée consiste à effectuer des mesures répétées de l'échantillon
« blanc » soit dans une même série (30 mesures), soit en double dans 15 séries diffé-
rentes. Les résultats sont exprimés en signal (absorbance, cpm, aire, etc.).
➜ Recueil des données
Un exemple de formulaire d'enregistrement est présenté (voir feuille de résultats no 4).
➜ Exploitation des résultats
Calculer la moyenne obtenue (m) et l'écart type (s) des valeurs exprimées en signal
puis transformer l'écart type ainsi calculé en concentration à partir du point zéro et du
premier point de la gamme étalon. La limite de détection est définie pour un risque
évalué à 5 % par la formule :

Limite de détection = 3s

L'analyse statistique des résultats est enregistrée. Les conclusions de l'essai sont formu-
lées par le biologiste médical (voir feuille de résultats no 4).
Les valeurs inférieures à cette limite n'ont pas de signification biologique et doivent se
traduire sur le compte rendu d'examen par « inférieur à la limite de détection » (< LD).

264
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Exemple

Évaluation de la limite de détection


Dosage du PSA sérique par une méthode par immunoluminescence
Feuille de résultats no 4. Résultats observés pour le point zéro et le premier
point de la gamme au cours de 15 séries de dosage
Point zéro 1er point = 20 μg/L
1 2 d2 1 2
Série 1 1 240 1 230 100 503 090 523 020
Série 2 1 420 1 310 12 100 566 650 539 880
Série 3 1 170 1 160 100 525 980 528 760
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Série 4 2 110 1 950 25 600 579 490 584 780


Série 5 1 580 1 490 8 100 570 670 560 400
Série 6 1 210 1 400 36 100 524 780 545 640
Série 7 1 570 1 670 10 000 516 070 493 650
Série 8 1 390 1 360 900 517 710 543 450
Série 9 1 700 1 690 100 610 680 603 570
Série 10 1 540 1 760 48 400 570 140 567 620
Série 11 1 710 1 150 313 600 492 420 463 840
Série 12 1 630 1 630 0 503 500 504 610
Série 13 910 1 060 22 500 477 420 483 790
Série 14 1 370 1 480 12 100 403 620 388 930
Série 15 1 320 1 400 6 400 503 200 498 570
n 30 15 30
m 1 453 – 523 198
ssi – 83 –

Le point zéro de la gamme est dosé en double dans 15 séries différentes. L'écart type
(ssi) des différences observées entre les doublets est calculé à l'aide de la formule :

Σ √
d2 416 200
ssi = 2n
= = 128 RLU (relative light units)
30

L'écart type Ssi est transformé en concentration (μg/L) en fonction des valeurs
moyennes observées au cours des 15 séries effectuées pour le point zéro et le premier
point de la gamme (20 μg/L) en supposant par approximation que la zone est linéaire :
(C1 – C0)
Soit LD = 3 × sc avec sc = × ssi
Δ signal
où (C1 – C0) correspond à la différence obtenue entre les concentrations du premier
point de gamme et celle du point zéro.
20 × 128
sc = = 0,005 μg/L
(523 198 – 1 453)
Soit LD = 3 × 0,005 = 0,015 μg/L

265
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Seuil de positivité


Définition
Le seuil de positivité est la plus petite quantité à examiner
dans un échantillon pouvant être détectée dans les conditions
expérimentales décrites.

➜ Objectif
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Cette détermination permet de définir à partir de quel signal la positivité d'un test
semi-quantitatif peut être établie (ex. : IgM toxoplasmose).

➜ Matériaux
Matrice vierge que l'on peut surcharger si l'analyte à examiner est disponible ou un
échantillon de contrôle positif.

➜ Protocole expérimental

• Réaliser des dilutions successives, dans la matrice biologique, d'un échantillon


de contrôle positif que l'on mesure 10 fois de suite.
• Le contrôle négatif est traité dans les mêmes conditions.
• Lorsqu'il est possible d'effectuer des surcharges de l'analyte dans une matrice
biologique, le seuil de positivité peut être évalué par des mesures répétées
d'échantillons surchargés pour des concentrations de plus en plus faibles.
• Le seuil de positivité correspond à la dilution ou la concentration conduisant à
un signal significativement différent de celui du contrôle négatif ou de la matrice
non surchargée.

➜ Recueil des données


Un exemple de formulaire est proposé (voir feuille de résultats no 5).

➜ Exploitation des résultats


Déterminer l'écart type (s) et le CV du signal de chaque dilution.
Aucune valeur quantitative inférieure au seuil de positivité n'a de signification biologique
et doit se traduire sur le compte rendu d'examen par « inférieur au seuil de positivité ».
Dans l'exemple présenté figure 2, le seuil de positivité est de 8.

266
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Exemple

Évaluation du seuil de positivité


Feuille de résultats no 5. Évaluation du seuil de positivité pour la recherche
des anticorps IgM toxoplasmose
f:\2000\image\130591\vassault3\2

Négatif 1/64 1/32 1/16 1/8 1/4 1/2


m (signal) 130 120 120 150 350 450 600
s (signal) 50 45 60 40 30 25 20
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➜ FIGURE 2 : TOXOPLASMOSE IGM : DÉTERMINATION DU SEUIL DE POSITIVITÉ

Stratégie 1 : vérifi- 2 : vérifi- 3 : vali- 4 : vali- 5 : vali- 6 : vali-


cation des cation dation dation dation dation
perfor- rétro- partielle méthode méthode méthode
mances spective qualitative semi- quantitative
Critères quantitative

Limite de B ou E B ou R B et E – – E si intérêt
détection si intérêt si intérêt si intérêt

Seuil de – – – – E –
positivité
B : bibliographie ; E : Essai à effectuer ; R : données rétrospectives.

267
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Module 4 : limites de linéarité (linearity interval)


Limites de linéarité


Définition
L'évaluation consiste à déterminer les limites de validité de la
relation linéaire existant entre les concentrations observées
et les concentrations théoriques des dilutions d'un spécimen.
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Les limites de linéarité définissent l'intervalle de mesure


(exprimé en concentration) à l'intérieur duquel les mesures
peuvent être effectuées avec fiabilité [7, 11].
Les limites de linéarité (limite inférieure ou limite de
quantification et limite supérieure) sont une caractéristique
de la méthode et des conditions dans lesquelles elle est mise
en oeuvre. Elle peut varier avec la stabilité des réactifs utilisés.
Cette évaluation est relative aux résultats [concentration
calculée = f(concentration introduite)] et non aux réponses
[signal = f(concentration introduite)]. C'est un prérequis à
l'estimation de la justesse. À l'inverse, l'existence d'une
relation linéaire entre la concentration estimée et la
concentration introduite n'implique pas que la méthode soit
juste (exemple : biais).

➜ Objectif
L'évaluation des limites de linéarité permet de déterminer l'intervalle de concentrations à
l'intérieur duquel les mesures peuvent être effectuées avec fidélité et justesse. Au-delà de la
limite supérieure, une dilution de l'échantillon dans un solvant approprié doit être pratiquée.
La limite de quantification est la plus petite quantité à examiner dans un échantillon
pouvant être dosée dans les conditions expérimentales décrites avec une fidélité et une
justesse définies. Elle correspond généralement à la limite inférieure de linéarité de la
méthode (voir feuille de résultats no 6).

➜ Matériaux
Solutions contenant l'analyte à doser à partir desquelles des dilutions sont effectuées.
Il peut s'agir d'échantillons de matrice équivalente à celle de l'échantillon à doser, sur-
chargés avec le composé à mesurer. Choisir :
• une solution de concentration supérieure à celle attendue pour la limite supé-
rieure (E) ;
• et une solution ne contenant pas l'analyte à doser ou une concentration infé-
rieure à la limite basse attendue (B).

268
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Le schéma suivant peut être utilisé :

Expression 0 10 % 20 % 30 % 40 % 50 % 60 % 70 % 80 % 90 % 100 %
en % de E

B (mL) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

E (mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

➜ Protocole expérimental
Analyser chaque dilution en triple. Répéter l'essai, le cas échéant dans d'autres condi-
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tions de temps (par ex. : pour évaluer la stabilité d'un réactif, la réponse d'une électrode,
etc.).

➜ Recueil des données


Un exemple de formulaire d'enregistrement est présenté (voir feuille de résultats no 6).

➜ Exploitation des résultats


Reporter les résultats sur un graphe yi = f(xi) en portant en abscisse les concentrations
théoriques des solutions analysées ou de la dilution (xi) effectuée et en ordonnée les
valeurs observées pour chaque dilution yi. Tracer la droite correspondante (voir feuille
de résultats no 6).
Calculer la pente et l'ordonnée à l'origine de la droite de régression traduisant cette
relation.
•L'examen visuel de cette relation permet une appréciation satisfaisante des
limites de linéarité haute et basse de la technique étudiée.
Exprimer en pourcentage de la valeur de la solution E (obtenue par une technique
de référence ou sélectionnée) les résultats observés pour chaque point de la
gamme et les reporter sur un graphe en fonction de la dilution effectuée. La partie
rectiligne de la courbe correspond à la zone de linéarité à l'intérieur de laquelle
les résultats sont validés.
•Tracer les limites d'acceptabilité (en fonction des données propres à l'analyte).

Lorsque cela est possible, une analyse statistique peut compléter la représentation gra-
phique. Les valeurs observées (xi) sont évaluées par rapport aux valeurs théoriques (yi)
en tenant compte de l'intervalle de confiance de la moyenne de chaque dilution [7].
La droite de régression y/x est calculée avec l'ensemble des dilutions effectuées. La
pente est comparée à 1 et l'ordonnée à l'origine à 0. Si les paramètres de la droite ainsi
calculée diffèrent significativement respectivement de 1 et 0, elle est recalculée en
éliminant les valeurs des dilutions extrêmes jusqu'à l'obtention d'une droite y = bx + a
proche de y = x. On définit ainsi la zone de linéarité de la méthode.

269
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Exemple

Évaluation des limites de linéarité


Étude du domaine d'analyse d'une technique de dosage de la CRP
(C Reactive Protein).
Des dilutions successives d'un spécimen de concentration élevée de CRP dans une
solution d'albumine ne contenant pas de CRP sont dosées par la technique évaluée.
La limite inférieure de linéarité (ou limite de quantification) est atteinte lorsque la
concentration de CRP est inférieure à 20 mg/L, la limite haute de linéarité supérieure
à 80 mg/L.

Feuille de résultat no 6. Évaluation des limites de linéarité d'une technique de


dosage de la CRP
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DILUTIONS 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Valeurs observées 6,0 7,0 17,8 26,6 35,2 45,0 54,5 61,5 70,8 79,6 82,0
(m) mg/L

Valeurs théoriques 0 9 18 27 36 45 54 63 72 81 90
mg/L
f:\2000\image\130591\vassault3\3

% de la valeur 77,8 98,9 98,5 97,8100,0100,9 97,6 98,3 98,3 91,1


théorique

➜ FIGURE 3 : EN ABSCISSE SONT REPORTÉES LES DILUTIONS


ET EN ORDONNÉE LES VALEURS OBSERVÉES

270
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1
f:\2000\image\130591\vassault3\4

➜ FIGURE 4 : EN ABSCISSE SONT REPORTÉES LES DILUTIONS ET EN ORDONNÉE


LE RAPPORT (EXPRIMÉ EN %) DES VALEURS OBTENUES AVEC LA TECHNIQUE ÉVALUÉE (Y)
ET LES VALEURS THÉORIQUES (X)
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Limite de quantification
Lorsqu'il est nécessaire de déterminer précisément la limite de quantification, le proto-
cole suivant peut être déployé :
➜ Protocole expérimental
• Effectuer des dilutions de l'étalon le plus bas, d'un échantillon de valeur basse
dans un liquide approprié (n = 6 dilutions).
• Mesurer 10 fois de suite chacune des dilutions.
Si cela est possible, des surcharges de l'analyte à doser dans une matrice appropriée
peuvent être utilisées, en choisissant des concentrations de plus en plus faibles.
➜ Exploitation des résultats
Calculer l'écart type (s), le coefficient de variation (CV) et l'écart de la moyenne (m) à
la valeur théorique si elle est disponible. La valeur pour laquelle on obtient un CV infé-
rieur ou égal à la limite acceptable définie pour ce niveau de concentration (10 % le
plus souvent) correspond à la limite de quantification.

Effet dilution (dilution effect)


➜ Définition
L'effet dilution résulte de la modification de la matrice par dilution du milieu biologique
dans un diluant de composition différente du milieu biologique et peut être à l'origine
de résultats erronés.
➜ Objectif
L'effet de dilution doit être testé dans le cas où des valeurs physiopathologiques peuvent
être supérieures au dernier point de la gamme (stratégies 1, 2, 3 et 6). La fidélité et la
justesse de la dilution doivent être évaluées, et la matrice de dilution définie.

271
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

➜ Matériaux
Échantillon surchargé par une concentration supérieure ou égale à l'étalon le plus élevé.


Utiliser l'étalon de concentration élevée ou de préférence un échantillon surchargé d'une
concentration supérieure ou égale au dernier point de la gamme.

Attention : le choix du solvant à utiliser pour effectuer


ces dilutions doit être évalué ou argumenté et en cas
de contre-indication formelle (ex. : eau pour méthodes
immunologiques), largement signalé auprès des utilisateurs.
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➜ Protocole expérimental
Réaliser 6 mesures après dilutions indépendantes au facteur 1/2, 1/3 voire plus si néces-
sité en pratique quotidienne.

➜ Exploitation des résultats


Évaluer la fidélité et la justesse de la dilution selon les mêmes calculs que précédemment
(CV, biais).

Stratégie 1 : vérifi- 2 : vérifi- 3 : vali- 4: 5: 6 : vali-


cation des cation dation validation validation dation
perfor- rétro- partielle qualitative semi- méthode
mances spective quanti- quanti-
tative tative
Critères

Limites de linéarité :
Limite B ou E B ou R E si intérêt – B et E si E
inférieure intérêt
de quanti-
fication

Limite B ou E B ou R E si intérêt – B E
supérieure
de linéarité

Intervalle B B E si intérêt – – E
de mesure

Effet B ou E B, R ou E B ou E – – B ou E
dilution si intérêt si intérêt si intérêt si intérêt

272
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Module 5 : comparaison avec une autre méthode


Définition
Elle consiste à évaluer les résultats obtenus avec une
méthode par rapport à ceux d'une autre méthode. Si cette
dernière est une méthode de référence, des conclusions sur la
justesse de la méthode testée peuvent être formulées. Sinon
cette évaluation est destinée à mettre en évidence des
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différences qui peuvent nuire à l'interprétation des résultats.

➜ Objectif
La comparaison de deux méthodes permet d'estimer la comparabilité des résultats
obtenus par ces méthodes et de définir s'il existe un biais entre elles.
En cas de discordance entre les deux méthodes, il conviendra d'en évaluer les causes et
d'informer les prescripteurs et les patients.
Cette évaluation permet de maîtriser d'éventuelles discordances entre deux systèmes
analytiques parallèlement disponibles dans un laboratoire.

➜ Matériaux
Une cohorte de 40 échantillons au minimum est constituée. Ils sont choisis pour couvrir
l'étendue du domaine physiopathologique rencontré et répartis si possible selon les
recommandations de la SFBC [7, 12, 14].
Les conditions de stabilité des échantillons sont définies.

➜ Protocole expérimental
Les échantillons sont analysés par les deux techniques dans des conditions de temps
maîtrisées en utilisant les systèmes analytiques dans les conditions définies et décrites
par le fournisseur.
Dans le cas de vérification rétrospective d'une méthode (stratégie 2), il n'est pas possible
d'effectuer sa comparaison avec une autre méthode si elle n'a pas été prévue au moment
de l'installation, sauf si l'examen est effectué dans le laboratoire au moyen de deux
méthodes différentes.

➜ Recueil des données


Un exemple de formulaire d'enregistrement est présenté (voir feuille de résultats no 7).

273
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

➜ Exploitation des résultats


La comparaison des deux méthodes selon les recommandations de Bland-Altman [7, 12,
13, 14] permet d'estimer les relatives différences entre les deux méthodes en fonction
des moyennes des concentrations mesurées par chaque méthode. Cela permet de définir
le biais entre les deux techniques, son écart type et son intervalle de confiance 95 %.

➜ 1. Calculer les différences observées entre les résultats de la technique A (xi) et


ceux de la technique B (yi). Les différences sont reportées sur un graphe et la valeur
correspondante de xi en abscisse [7, 12] ou la moyenne des valeurs de xi et yi [13].
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➜ 2. Calculer les rapports (yi/xi) pour chaque résultat en fonction de xi.

➜ 3. Représenter sur un graphe les différences et/ou les rapports en fonction


des valeurs de x. Faire figurer sur le graphe les limites données dans le protocole
[7] ou calculées en fonction de la fidélité intermédiaire des deux méthodes. Les
résultats discordants sont infirmés ou confirmés par vérification avec les deux
techniques. L'examen du graphe des différences ou du graphe des rapports
permet de mettre en évidence les échantillons « déviants » pour lesquels une
vérification s'impose (le nombre de déviants est noté).
Ces représentations graphiques permettront également de mettre en évidence
d'éventuelles différences systématiques.

➜ 4. Noter le nombre de spécimens discordants ainsi vérifié.

➜ 5. Identifier les spécimens pour lesquels la discordance subsiste après vérifi-


cation et rechercher l'origine de la discordance (aspect du spécimen, présence
de fibrine, nature de l'anticoagulant, prise de médicaments, etc.).

➜ 6. Analyser visuellement ce type de graphe pour vérifier l'homogénéité de la


répartition des spécimens en fonction de la concentration, reconnaître l'existence
d'une erreur systématique et l'identifier en termes d'erreur proportionnelle ou
constante, étudier le comportement des spécimens en fonction de leurs carac-
téristiques (par ex., sérum ictérique).

➜ 7. Calculer la droite de régression la mieux adaptée pour définir la relation


statistique liant les résultats de la technique A avec ceux de la technique B.
La relation qui traduit le lien entre les deux techniques peut être déterminée
par la droite de régression linéaire non paramétrique de la méthode B versus
méthode A (Passing Bablock) ou la droite des moindres rectangles [7, 12] : définir
la pente, l'ordonnée à l'origine et les intervalles de confiance 95 %. Un test de
pente est à effectuer. La droite des moindres rectangles permet une exploitation
facile et efficace.

274
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Il existe plusieurs types de droite de régression. Le modèle idéal, dans le cadre


de la comparaison des techniques, correspondrait à une droite unique, tenant
compte des erreurs aléatoires de xi et yi, accessible aux moyens de calcul adaptés
aux utilisateurs, et robuste vis-à-vis de la répartition des valeurs en fonction du
niveau de concentration et des déviants.
Cela nécessite des moyens de calculs informatiques « puissants », il convient,
pour éviter cet écueil, d'avoir choisi des spécimens variés présentant des niveaux
de concentration répartis de façon homogène dans toute l'étendue du domaine
d'analyse.


La droite des moindres carrés, de 1re espèce, la plus utilisée, ne répond pas à la
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première partie de la proposition.

Droite de régression des moindres rectangles


y = bx + a
a = my – b.mx
Sy
b=
Sx

➜ 8. Interprétation : elle correspond à la réponse aux questions suivantes :


•Existe-t-il des différences entre les résultats de la technique A et ceux de la
technique B « significatives » en fonction de la précision des deux techniques ?
Il convient de tester la pente de la droite de régression à 1 et l'ordonnée à
l'origine à zéro.
•Quelle est la nature des différences constatées :
■ erreurs systématiques (constante ou proportionnelle) ;

■ erreurs aléatoires affectant certains spécimens ;

■ erreurs grossières.

•Les différences ainsi quantifiées influencent-elles l'interprétation des résultats ?


•Comment y remédier le cas échéant ?

➜ 9. Présentation et interprétation standardisées


Grâce à des logiciels de traitement des résultats existants, adaptés à différents
micro-ordinateurs, il est possible d'effectuer les calculs statistiques et de présenter
les résultats d'une comparaison de technique de façon tout à fait facile et
standardisée.

275
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Exemple

Comparaison de méthode
f:\2000\image\130591\vassault3\5

Feuille de résultats no 7. Comparaison d'une technique A (référence)


et d'une technique B (testée) destinée au dosage de l'acide urique
[Figures 5, 6 et 7].

➜ FIGURE 5 : REPRÉSENTATION GRAPHIQUE DE LA DROITE DES MOINDRES RECTANGLES


(LOGICIEL MAC VALTEC)
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f:\2000\image\130591\vassault3\6

➜ FIGURE 6 : REPRÉSENTATION GRAPHIQUE DES DIFFÉRENCES (YI – XI)


ENTRE LES DEUX MÉTHODES EN FONCTION DE LA CONCENTRATION

276
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1
f:\2000\image\130591\vassault3\7

➜ FIGURE 7 : REPRÉSENTATION GRAPHIQUE DES RAPPORTS (YI/XI) EN POURCENTAGE


ENTRE LES DEUX MÉTHODES EN FONCTION DE LA CONCENTRATION
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Conclusion : il existe un biais systématique proportionnel à la concentration entre les


deux méthodes qu'il convient de comparer aux normes d'acceptabilité, d'en rechercher
la cause pour y apporter une mesure corrective et, si nécessaire, d'en évaluer l'impact
sur l'intervalle de référence (cf. article SG2-10) et d'en informer les prescripteurs.

Méthodes qualitatives (stratégie 4) : dans la mesure du possible, le pourcentage


d'échantillons faux négatifs et faux positifs est déterminé par l'examen d'échantillons
dont le nombre est à déterminer en fonction des objectifs à atteindre. Ces échantillons
auront préalablement été caractérisés par une méthode reconnue ou celle précédem-
ment utilisée au laboratoire.
Méthodes semi-quantitatives (stratégie 5) : les valeurs chiffrées obtenues par une
méthode A ne sont en général pas comparables à celles d'une méthode B, la compa-
raison ne peut donc être effectuée que sur les résultats qualitatifs. Dans ce cas, les
différences entre réactifs seront difficilement mises en évidence si les échantillons uti-
lisés pour la comparaison sont étalés sur l'ensemble du domaine physiopathologique
rencontré. En effet, il est peu probable qu'un réactif ne décèle pas la positivité d'un
échantillon fortement ou très fortement chargé en analyte, il devra donc être utilisé, en
plus d'une gamme d'échantillon couvrant l'ensemble du domaine physiopathologique,
une gamme d'échantillons évalués « limite » par la technique de référence ou par la
technique déjà utilisée au laboratoire. Pour les réactifs de la liste A de la directive euro-
péenne 98/79 [système ABO, rhésus (C, c, D, E, e) anti-Kell ; réactifs et produits réactifs,
y compris les matériaux associés d'étalonnage et de contrôle, pour la détection, la confir-
mation et la quantification dans des spécimens humains de marqueurs de l'infection HIV

277
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

(HIV 1 et 2), HTLV I et II et hépatite B, C et D], lorsque cela est possible, il est recom-
mandé d'utiliser des panels commerciaux comprenant 10 à 20 sérums. Pour les réactifs
de la liste B, des échantillons provenant de la sérothèque du laboratoire correctement
caractérisés seront suffisants (voir feuille de résultats no 8).

Exemple

Comparaison de méthodes. Méthode semi-quantitative


Feuille de résultats no 8. Dosage IgG toxoplasmose (effectif n = 40).
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Technique B (nouvelle) Positifs Négatifs

Technique A (ancienne)

Positifs 20 (50 %) 1 (2,5 %)


Négatifs 2 (5 %) 17 (42,5 %)

• Vérifier les échantillons pour lesquels on observe une discordance.


• En rechercher la cause.

Stratégie 1: 2: 3: 4: 5: 6:
vérification vérification validation validation validation validation
des perfor- rétros- partielle qualitative semi- méthode
mances pective quanti- quantitative
Critères tative

Compa- B ou E si R si B ou E B ou E B ou E B ou E
raison avec possible disponible si intérêt si intérêt si intérêt si possible
une autre
méthode

278
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Module 6 : contamination inter-échantillons


(carry-over)


Définition
C'est un phénomène qui résulte du transfert d'une partie
d'un échantillon dans un autre tel qu'il produit une
modification dont l'effet peut être évalué et quantifié.
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➜ Objectif
L'étude de la contamination d'un échantillon de concentration élevée de l'analyte à un
autre échantillon de niveau faible (carry-over ou « effet mémoire ») est importante car
la contamination des échantillons altère l'exactitude des mesures [15].
Cette évaluation est programmée si le mode opératoire (stratégies 1, 2, 4, 5, 6) ou ses
modifications (stratégie 3) sont susceptibles d'avoir un effet sur la contamination
inter-échantillons.

➜ Matériaux
Échantillons de concentration la plus élevée possible pour un examen pour lequel il
existe un différentiel de concentration important en physiopathologie (par ex. : hCG) et
échantillons de concentration faible ou nulle (stratégies 1, 2, 3 et 6).
Étalons positif et négatif (stratégies 4 et 5).

➜ Protocole expérimental
Après rinçage de l'appareil, l'échantillon de concentration élevée ou positif fort est ana-
lysé 3 fois consécutivement (H1, H2, H3 de moyenne H) suivi d'un échantillon bas éga-
lement dosé 3 fois (B1, B2, B3). La séquence est répétée 3 fois.
Si les données rétrospectives sont disponibles, elles seront utilisées pour l'analyse sta-
tistique (stratégie 2). Si elles ne sont pas disponibles, des essais seront effectués (cf.
ci-dessus).

➜ Recueil des données


Un exemple de formulaire d'enregistrement est présenté (voir feuille de résultats no 9).

➜ Exploitation des résultats


Un test t en série appariée est effectué entre les résultats des échantillons susceptibles
d'être contaminés (B1 des séquences A, B et C) et ceux qui ne sont pas contaminés (B3
des séries A, B et C). S'il existe une différence significative, le pourcentage de contami-
nation entre les échantillons est quantifié selon la formule :

279
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

(B1m – B3m)
Contamination % = 100 ×
(Hm – B3m)
B1m = moyenne des B1
B3m = moyenne des B3
Hm = moyenne des H

Le niveau de contamination doit être maintenu à zéro ou entraîner des règles de réanalyse
argumentées. Cette méthode de calcul ne s'applique pas en général aux méthodes utilisant
des microplaques mais il est possible de vérifier que les valeurs des signaux des échantillons
négatifs sont bien négatives, de même pour les échantillons positifs. L'analyse des résultats
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est enregistrée. Les conclusions de l'essai sont formulées (voir feuille de résultats no 9).

Exemple

Évaluation de la contamination inter-échantillons


Feuille de résultats no 9. Contamination inter-échantillon : exemple de l'hCG.

HCG élevé HCG normal


H1 100 000 B1 <1
H2 100 200 B2 <1
H3 101 000 B3 <1
H1 100 500 B1 <1
H2 100 200 B2 <1
H3 100 700 B3 <1
H1 100 255 B1 <1
H2 100 350 B2 <1
H3 100 340 B3 <1
Moyenne H 100 394 Moyenne B1 <1
Moyenne B3 <1

Conclusion : absence de contamination inter-échantillons.

Stratégie 1 : vérifi- 2 : vérifi- 3 : vali- 4 : vali- 5 : vali- 6 : vali-


cation des cation dation dation dation dation
perfor- rétro- partielle méthode méthode méthode
mances spective qualitative semi- quantitative
Critères quantitative

Contami- B ou E si R ou E si B ou E si B ou E si B ou E si E si intérêt
nation intérêt intérêt intérêt intérêt intérêt

280
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Module 7 : évaluation de l'influence


de l'hémolyse, de la bilirubine et de la turbidité
des échantillons


Définition
La présence, dans les liquides biologiques de certaines
substances endogènes, parmi lesquelles la bilirubine,
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l'hémoglobine ou des lipoprotéines peut être à l'origine


d'anomalies et conduire à des résultats erronés. L'influence
de ces substances varie avec la nature de l'examen et la
méthode de mesure ou de recherche mise en oeuvre. Un
protocole d'évaluation de cette influence est proposé pour les
tests de validation.

➜ Objectif
Les défauts de spécificité ou la sensibilité aux interférences peuvent être évalués par sur-
charge d'un spécimen biologique [7] par un composé dont la présence est susceptible
d'entraîner un résultat inexact, soit par excès, soit par défaut. Le protocole se propose
d'appréhender de façon quantitative l'influence de certains composés d'origine endogène
(hémoglobine, bilirubine, colorant, etc.) ou exogène (médicaments, aliments, toxiques, etc.).
➜ Matériaux
Un spécimen de concentration connue de l'analyte à doser (niveau moyen) est surchargé
par une solution concentrée de la substance susceptible d'interférer pour obtenir plusieurs
niveaux de concentration.

➜ Étude de l'influence de l'hémolyse



Hémolysat : préparer une solution d'hémoglobine à partir d'hématies lavées,
hémolysées et diluées pour obtenir une concentration d'environ 50 g/L
(3 mmol/L) d'hémoglobine. Les surcharges du spécimen contenant l'analyte
étudié (pool) sont effectuées par dilution en suivant les indications du tableau II.

➜ TABLEAU II. SOLUTIONS SURCHARGÉES AVEC UN HÉMOLYSAT

Tube no 1 2 3 4 5 6 7
Pool (μL) 900 900 900 900 900 900 900
Hémolysat (μL) 0 5 10 20 40 60 80
NaCl 150 mmol/L (μL) 100 95 90 80 60 40 20
Taux de surcharge en hémoglobine (μmol/L)* 0 15 30 60 120 180 240
* À vérifier par dosage.

281
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

➜ Étude de l'influence de la bilirubine



Solution de bilirubine (5,1 mmol/L)

Bilirubine 30 mg
NaOH 0,1 mol/L 2,5 mL
Eau distillée 7,5 mL

• Préparer des dilutions comme indiquées dans le tableau III.


➜ TABLEAU III. SOLUTIONS SURCHARGÉES AVEC DE LA BILIRUBINE
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Tube no 1 2 3 4 5 6 7

Pool (μL) 900 900 900 900 900 900 900

Solution de bilirubine (μL) 0 5 10 20 50 75 100

NaCl 150 mmol/L (μL) 100 95 90 80 50 25 0

Surcharge de bilirubine (μmol/L)* 0 25 50 100 250 375 500


* À vérifier par dosage.

➜ Étude de l'influence de la turbidité


Solution d'Intralipide® à 20 % (émulsion destinée à l'alimentation parentérale à

base d'huile de soja). La diluer au 1/10, 1/20, 1/40 et 1/80.

Préparer les solutions comme l'indique le tableau IV.

➜ TABLEAU IV. SOLUTIONS SURCHARGÉES AVEC DE L'INTRALIPIDE®

1 2 3 4 5

Dilution Intralipide® / 1/80 1/40 1/20 1/10

Volume (μL) / 100 100 100 100

NaCl 150 mmol/L 100 / / / /

Pool de sérum ou plasma (μL) 900 900 900 900 900

Aspect Clair Opalescent Lactescent Lactescent Lactescent

Équivalent triglycérides (mmol/L)* 2,00 3,00 4,60 5,00 7,00

Absorbance à 600 nm 0,020 0,040 0,080 0,120 0,240


* À vérifier par dosage.

282
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

➜ Étude de l'influence d'autres substances


La solution la plus concentrée doit correspondre à une concentration maximale
observée en physiopathologie ou, pour un médicament, à une dose compatible avec
celles observées en thérapeutique (ou limitée par sa solubilité).

➜ Protocole expérimental
Effectuer le dosage en double de chacune des dilutions préparées.

➜ Recueil des données


Un exemple de formulaire d'enregistrement est présenté (voir feuille de résultats no 10).
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➜ Exploitation des résultats

• La valeur moyenne observée pour le spécimen non surchargé est soustraite de la


valeur moyenne observée pour chaque spécimen. Les différences observées
(négatives ou positives) sont reportées sur un graphe en fonction de la concen-
tration de la substance susceptible d'interférer et comparées à des limites.
• Les normes utilisées correspondent à la norme d'interprétation (valeur moyenne)
du protocole de validation de techniques.

Exemple

Évaluation de l'influence de la bilirubine


f:\2000\image\130591\vassault3\8

Feuille de résultats no 10. Étude de l'influence de la bilirubine sur le dosage


de l'acide urique.

➜ FIGURE 8 : REPRÉSENTATION GRAPHIQUE DE L'INFLUENCE DE LA BILIRUBINE


SUR LE DOSAGE DE L'ACIDE URIQUE PAR DEUX TECHNIQUES (PAP ET UV)

PAP : uricase peroxydase/chromogène ; UV : uricase/mesure en ultraviolets ; LA : limites acceptables.

Les conclusions de ces essais in vitro doivent être confirmées par l'étude de spécimens
de patients présentant des caractéristiques ou des traitements équivalents.

283
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Stratégie 1 : vérifi- 2 : vérifi- 3 : vali- 4 : vali- 5 : vali- 6 : vali-


cation des cation dation dation dation dation
perfor- rétro- partielle méthode méthode méthode
mances spective qualitative semi- quantitative
Critères quantitative

Évaluation B B B B ou E B ou E B ou E
de l'influence si intérêt si intérêt si intérêt
de l'hémolyse, (examen
de la bilirubine sensible)
et de la turbidité
des échantillons
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284
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Module 8 : autres critères


Les autres critères seront évalués si cela est jugé nécessaire par le biologiste :
• fonction de réponse : peut être évaluée au moyen des données d'étalonnage ;
• choix de la matrice : si nécessaire ;
• stabilités : à envisager selon les données disponibles du fournisseur (délai
maximum d'acheminement, d'attente dans l'analyseur ou le système de prépa-
ration des échantillons, de conservation à différentes températures, etc.) ;
• rendement (d'extraction, d'ionisation, etc.) si applicable ;
• spécificité analytique, sélectivité ;
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• exactitude.

Fonction de réponse


Définition
La fonction de réponse d'une méthode d'analyse traduit, à
l'intérieur de l'intervalle de mesure, la relation existante entre la
réponse (signal) et la concentration (quantité) de la substance à
examiner dans l'échantillon. La fonction de réponse monotone
la plus simple qui exprime cette relation est appelée « courbe
d'étalonnage ».
La fonction de réponse peut être linéaire (droite), mais il n'y a
aucune raison de la rattacher obligatoirement à ce type de
modèle. En effet, il existe des situations de non-linéarité, liées
notamment à certains systèmes de détection ou à l'étendue de
l'intervalle de mesure. En revanche, il est nécessaire que la
fonction de réponse soit strictement croissante ou décroissante,
c'est-à-dire monotone. Signalons encore que l'estimation d'une
telle fonction par les méthodes habituelles d'ajustement (par
ex. : méthode des moindres carrés) postule la constance de la
variabilité (variance) de la réponse à toutes les concentrations
(homoscédasticité) ; or, cette hypothèse ne se vérifie pas
toujours. La fonction répondant à ces prérequis et ajustée aux
réponses est la courbe d'étalonnage qui est utilisée pour
calculer les concentrations à partir des signaux, c'est-à-dire les
résultats.

285
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

➜ Matériaux
Étalons (au moins 4) fournis par un fournisseur ou préparés au laboratoire. En général, un
des étalons est choisi à une concentration proche de la limite de quantification.

➜ Protocole expérimental
Si les étalons sont prêts à l'emploi fournis dans une trousse marquée CE, effectuer au moins
5 étalonnages de façon indépendante, le même jour ou à des jours différents.
Si aucun étalon n'est disponible (dosage de médicaments, métabolites, toxiques ou
métaux), les gammes d'étalons doivent être préparées manuellement à partir d'une même
solution mère mais de 5 solutions filles préparées de façon indépendantes afin de réaliser
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5 gammes différentes. Chaque gamme doit être analysée de manière indépendante le


même jour ou à des jours différents. Les mêmes critères d'acceptabilité et l'analyse sta-
tistique sont à envisager.

➜ Exploitation des résultats

• Vérifier la fidélité intermédiaire des 5 gammes de mesure.


• Calculer les erreurs relatives pour chaque point de gamme (CV et écart à la valeur
théorique) et les comparer aux limites préalablement définies. Si le 1er point de
gamme est dans une zone de concentration proche de la limite de quantification,
le CV est comparé à celui défini pour celle-ci (en général 20 %). Pour les autres
points de gamme, les limites acceptables varient en général entre 5 à 15 % en
fonction du niveau de concentration.
• Vérifier l'acceptabilité des étalonnages.

Choix de la matrice
➜ Définition
Pour les matrices biologiques qu'il est difficile d'obtenir en quantité suffisante pour une
validation (LCR, cellules, biopsies, sang pour nouveau-nés, etc.), une matrice de rempla-
cement, de composition proche de celle à étudier, peut être utilisée.
Dans ce cas, la validation est réalisée dans la matrice de remplacement puis une validation
croisée est réalisée avec la matrice à étudier. Celle-ci consiste à effectuer des surcharges,
si cela est possible, dans la matrice de remplacement et la matrice à étudier. Les résultats
obtenus sont alors comparés en suivant le protocole d'évaluation des limites de linéarité.
La fidélité et la justesse sont également évaluées pour les deux matrices surchargées (6 à
10 mesures).
Lorsqu'il n'est pas possible d'effectuer des surcharges, il est recommandé d'évaluer la
fidélité et, si possible, la justesse avec deux matrices synthétiques dont les concen-
trations couvrent le domaine des valeurs rencontrées en physiopathologie ou en suivi
thérapeutique.

286
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Étude de la stabilité des échantillons des réactifs et des étalons


(stabilities)


Définition
La stabilité d'un produit est caractérisée par le maintien des
mêmes propriétés dans le temps pour des conditions
strictement définies.
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➜ Objectif
Établir les critères de stabilité du ou des analytes à chaque étape du mode opératoire.
Différentes études de stabilité sont à envisager selon qu'il s'agit des réactifs utilisés, des
solutions étalons ou de l'analyte dans les échantillons pendant les étapes pré-analytique,
analytique et post-analytiques.
Plusieurs types d'étude de stabilité peuvent être conduits :
• stabilité des réactifs et des étalons ;
• stabilité de l'analyte au cours des différentes étapes du prétraitement ;
• stabilité de l'analyte dans l'échantillon biologique à différentes étapes du pro-
cessus (acheminement, conservation à différentes températures, etc.).

➜ Matériaux
Choisir des échantillons à deux niveaux de concentrations (un faible et un fort).

➜ Protocole expérimental
Analyser chaque niveau de concentration en triple. Renouveler cette expérimentation
après avoir fait subir aux échantillons la condition à évaluer (par ex. : évaluation du délai
d'attente dans l'automate, comparer 2 échantillons immédiatement puis après x heures
d'attente dans l'automate).

➜ Exploitation des résultats


Calculer les pourcentages d'écart :

Écart = [(conc théorique – conc mesurée)/conc théorique] × 100

Des limites de stabilité théoriques (Lst en %, par ex. 10 à 15 %) adaptées à chaque


analyte à l'aide des résultats de répétabilité permettent de valider on non la stabilité
des réactifs et/ou analyte dans différentes conditions.

287
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

➜ La limite de stabilité correspond à la dernière valeur comprise dans l'inter-


valle [v-Lst % ; v + Lst %] : dans le cas où les réactifs, les étalons sont fabriqués
par le laboratoire (stratégie 6), il est recommandé de réaliser une étude de
stabilité pour les solutions mères et filles permettant de préparer les gammes
et l'étalon interne dans des conditions normales de température, d'humidité et
de lumière. Celle-ci permet de définir la stabilité des solutions mères et filles
(« stock ») à température 20-25 oC pendant 6 à 8 heures, à + 4 oC, à – 20 oC et,
éventuellement, à – 80 oC.

➜ Stabilité de l'analyte au cours des différentes étapes du prétraitement : la


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stabilité au cours des différentes étapes du prétraitement (au cours de la cen-


trifugation, dans le solvant organique, dans les extraits secs, sur le passeur
d'échantillons, etc.) et pour les méthodes chromatographiques phase liquide (LC)
lors de réinjection doit être étudiée lorsque cela est jugé utile.

➜ Stabilité de l'analyte dans les milieux biologiques : les délais seront choisis
par le biologiste médical en fonction de la technique et du contexte
physiopathologique.
•Stabilité dans le sang total et/ou dans la fraction d'intérêt (sérum, plasma,
érythrocytes, plaquettes, leucocytes) pour tous les dosages sanguins.
•Stabilité à court terme :
■ par exemple, toutes les 8 heures durant 24 heures à température ambiante ;
o
■ tous les jours pendant 5 jours à + 4 C ;
o
■ toutes les semaines pendant 1 mois à – 20 C.

• Stabilité à long terme :


■ une fois par mois pendant 12 mois à – 20 oC ;
o
■ si instabilité idem à – 80 C ou dans l'azote liquide.

• Cycles de congélation/décongélation : tester par exemple 3 cycles.

Rendement (d'extraction, d'ionisation, etc.)


Définition
Le rendement d'extraction absolu peut être défini comme
étant le rapport des signaux mesurés, d'une part après
traitement de l'échantillon chargé avec une quantité connue
et, d'autre part, après l'injection directe dans le système
analytique d'une gamme non biologique (par ex. : solution
aqueuse) de référence contenant une concentration
équivalente de substance à examiner.

288
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Le rendement d'extraction absolu doit être préféré au rendement d'extraction relatif, où


la gamme non biologique de référence subit le même traitement que l'échantillon ; mais
il n'est pas toujours possible de l'obtenir. C'est notamment le cas lorsqu'une étape de
dérivation est introduite dans le processus de préparation de l'échantillon biologique.
Dans ces conditions, seul le rendement d'extraction relatif peut être évalué.
Le rendement d'extraction absolu est un critère important pour les méthodes nécessitant une
extraction préalable du principe actif. Si le rendement d'extraction est faible, il conviendra donc
de poursuivre le développement de la méthode. En effet, ce critère intervient directement
dans l'évaluation du seuil de quantification de la méthode. Néanmoins, lorsqu'un seuil de
quantification faible n'est pas requis ou que l'on dispose d'un système de détection particuliè-
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rement sensible, il est acceptable de se contenter d'un rendement d'extraction relativement


faible, pour autant que sa constance ait été démontrée sur la totalité de l'intervalle de mesure.
Un faible rendement se traduit en général par une fidélité peu performante.

➜ Matériaux

• Échantillons à 3 niveaux de concentration : bas, moyen, élevé


• Témoins aux mêmes concentrations
➜ Protocole expérimental
Effectuer l'analyse répétée 6 fois de 3 niveaux de concentration différents d'échantillons
de contrôle : « bas », « moyen », « élevé » extraits selon le mode opératoire de l'ana-
lyse. Préparer des solutions témoins correspondant aux concentrations de ces 3 niveaux
après extraction et analyser 6 fois chaque niveau.
➜ Exploitation des résultats
Comparer les quantités des échantillons extraits aux quantités des échantillons témoins.
Le rendement d'extraction (%) correspond à la formule suivante :

Rendement d'extraction = 100 × (quantité extraite/quantité témoin)

Les valeurs pour chaque niveau de concentration doivent être comprises dans un inter-
valle prédéfini.
Le rendement précédemment défini peut, pour les méthodes utilisant la spectrométrie de
masse couplée à la chromatographie liquide (LCMSMS), inclure le rendement d'ionisation de la
molécule additionné du rendement d'extraction absolu ou relatif de la molécule. Le rendement
d'ionisation est effectué sur 6 matrices biologiques vierges extraites surchargées en 2 concen-
trations de molécule à doser. Le rendement d'ionisation (%) correspond à la formule :

Rendement d'ionisation = 100 × (quantité mesurée après surcharge


matrice extraite/quantité témoin)

Le rendement d'extraction est défini en LCMSMS par la différence du rendement précé-


demment appelé rendement d'extraction – rendement d'ionisation.

289
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Spécificité analytique (specificity)/sélectivité (selectivity)


Définition
Une méthode d'analyse est dite « spécifique » lorsqu'elle
permet de garantir que le signal mesuré provient seulement
de la substance à analyser et de mesurer quantitativement un
paramètre physicochimique ou un groupement fonctionnel
d'une ou de plusieurs substance(s) dans l'échantillon.
La sélectivité d'une méthode analytique est sa capacité à
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établir de manière univoque l'existence de la substance à


analyser en présence d'autres composés potentiellement
présents.

➜ Matériaux
• Échantillons de sérothèque sans l'analyte et anonymisés.
• Substances susceptibles d'interférer.

➜ Protocole expérimental

• Sélectivité : l'essai de sélectivité consiste à effectuer, lorsque cela est possible,


l'analyse d'échantillons d'au moins 12 matrices biologiques différentes de
même nature (sang, sérum, plasma, etc.) que celle dans laquelle est dosé l'ana-
lyte mais qui ne contiennent pas l'analyte. Cela permet d'étudier les éventuelles
interférences avec des substances endogènes de la matrice.
Dans le cas de prélèvements sanguins, l'utilisation de l'ensemble des anticoa-
gulants acceptables doit être évaluée à partir d'un minimum de 6 échantillons
pour chaque anticoagulant.
• Spécificité : l'essai de spécificité consiste à évaluer les éventuelles interférences
avec un étalon interne si applicable, des produits de dégradation si connus, des
métabolites si connus, des médicaments éventuellement administrés concomi-
tamment aux patients.

290
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

Exactitude (accuracy)


Définition
L'exactitude exprime l'étroitesse de l'accord entre le résultat
d'un essai et la valeur de référence acceptée, aussi appelée
« valeur conventionnellement vraie ». L'étroitesse de l'accord
ainsi observée est la résultante de la somme des erreurs
systématique et aléatoire, en d'autres termes l'erreur totale
liée au résultat [2].
Par conséquent, l'exactitude résulte des erreurs de justesse et
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de fidélité. En biologie médicale, il n'existe pas, à de rares


exceptions près, d'échantillons de contrôle raccordés sur le
plan métrologique à des étalons internationaux. Il est donc
impossible de parler de « valeur vraie ».
Cette exactitude peut s'exprimer sous la forme d'un
graphique nommé « profil d'exactitude » [5, 9].

➜ Objectif
Dans le cas où l'évaluation de la justesse n'est pas possible, une évaluation de l'exac-
titude utilisant les résultats obtenus lors d'évaluations externes de la qualité (EEQ) pourra
être effectuée.
➜ Matériaux
Cette évaluation est pratiquée pour un minimum de 4 échantillons provenant d'évalua-
tions externes de la qualité.
➜ Protocole expérimental
Les échantillons de contrôle sont analysés dans des conditions similaires aux échantillons
provenant des patients.
➜ Recueil des données
Elles sont reportées sur un tableau (voir feuille de résultats no 11).

➜ Exploitation des résultats


L'exactitude est quantifiée pour chaque échantillon. La différence observée entre la
valeur observée et la valeur cible est comparée à une limite d'inexactitude [8] corres-
pondant à une limite d'erreur totale prenant en compte l'erreur de fidélité systématique.

291
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Exemple
Évaluation de l'exactitude
Évaluation de l'exactitude d'une méthode de dosage de l'antigène spécifique
de la prostate (PSA) par l'étude d'échantillons de contrôle dont les valeurs cibles
sont fournies par les résultats obtenus dans un programme d'évaluation externe
de la qualité (EEQ) : la différence est calculée pour 4 échantillons de contrôle choisis
à des niveaux de décision clinique.
Les valeurs observées sont rapportées dans la feuille de résultats no 11 et comparées
à la valeur cible. La différence exprimée en concentration et en pourcentage est
comparée aux limites d'inexactitude.
Les résultats font apparaître une erreur systématique proportionnelle de 20 % de la
technique testée.
Feuille de résultat no 11. Évaluation de l'exactitude d'une méthode de dosage
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du PSA en utilisant les résultats d'une EEQ.

1 2 3 4
Valeur de référence cible μg/L 2,5 5,8 9,1 15
Méthode testée (valeur) μg/L 2 5 8 13
Différence μg/L - 0,5 - 0,8 - 1,1 -2
% - 20 % - 14 % - 12 % - 13 %
Limite acceptable de
justesse % ± 20 % ± 15 % ± 15 % ± 15 %
Conclusion V V V V
V : validé par rapport au critère d'exactitude.

Stratégie 1 : vérifi- 2 : vérifi- 3 : vali- 4 : vali- 5 : vali- 6 : vali-


cation des cation dation dation dation dation
perfor- rétro- partielle méthode méthode méthode
mances spective qualitative semi- quantitative
Critères quantitative
Fonction – – – – – B et E si
de réponse intérêt
Choix – – B et E si – – B et E si
matrice intérêt intérêt
Stabilités
– réactifs B ou E si B ou E si B ou E si B ou E si B ou E si B ou E si
– étalon intérêt intérêt intérêt intérêt intérêt intérêt
– échan- B ou E si B ou E si B ou E si B ou E si B ou E si B ou E si
tillons intérêt intérêt intérêt intérêt intérêt intérêt
biologiques B ou E si B ou E si B ou E si B ou E si B ou E si B ou E si
intérêt intérêt intérêt intérêt intérêt intérêt
Rendement – – – – E si intérêt E si intérêt
d'extraction
Exactitude B si possible B si possible B si possible – – E si possible
Spécificité B B B B B B et E
analytique – si intérêt
sélectivité

Conflits d'intérêts : aucun

292
Recommandations pour l'accréditation des laboratoires de biologie médicale 1

• Références
1. ISO 15189-2007 standard. Medical laboratories – Particular requirements for quality and compe-
tence. Saint-Denis : AFNOR, 2007 (www.afnor.fr).
2. Directive 98/79 of the European Parliament and of the council of 27 October on in vitro diagnostic
medical devices. Official Journal of the European Communities 1998 (Dec 7) ; L 331 : 1-37.7.
3. Bureau international des poids et mesures (BIPM). International vocabulary of metrology – Basic
and general concepts and associated terms (VIM, 3rd edition). JCGM 200 :2008 (www.BIPM.org).
4. LAB GTA 04, 2004. Guide de validation des méthodes en biologie médicale. COFRAC, 2004.
5. Hubert P, Nguyen-Huu JJ, Boulanger B, et al. Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches – rapport d'une commission SFSTP. STP Pharma Pratiques 2003 ; 13
(3) : partie I.
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6. ISO 9000 :2005. Quality management system. Fundamentals and vocabulary. Systèmes de mana-
gement de la qualité. Principes essentiels et vocabulaire. Genève, ISO, 2005.
7. Vassault A, Grafmeyer D, Naudin C, et al. ; et les membres de la commission « validation de
techniques » de la SFBC. Protocole de validation de techniques (Documents A et B). Ann Biol Clin
1986 ; 46 : 679-745.
8. Vassault A, Grafmeyer D, de Graeve J, Cohen R, Beaudonnet A, Bienvenu J. Spécifications et normes
d'acceptabilité pour la validation des méthodes utilisées en biologie clinique. Ann Biol Clin 1999 ; 57 :
685-95.
9. Hubert P, Nguyen-Huu JJ, Boulanger B, et al. Validation des procédures analytiques quantitatives :
harmonisation des démarches – rapport d'une commission SFSTP. STP Pharma Pratiques 2006 ; 16
(1) : partie II (Statistiques).
10. Baud M, Cohen R, Dumont G, Mercier M, Naudin C, Vassault A. Évaluation de la limite de détection.
Inf Sci Biol 1989 ; 15 : 157-63.
11. Vassault A, Dumont G, Labbé D. Définitions des critères de qualité d'une méthode d'analyse. Le
Moniteur Internat 1992 ; 26, 20-3312.
12. Vassault A, Baud M, Castagnier M, et al. (Commission « validation de techniques » de la SFBC et
groupe de travail SFBC/Corata « comparaison de techniques »). Recommandations pour la compa-
raison de techniques (Document F). Ann Biol Clin 1992 ; 50 : 727-30.
13. Bland JM, Altman DG. Comparing methods of measurement : Why plotting difference against
standard method is misleading. Lancet 1995 ; 346 : 1085-87.
14. CLSI Document EP9-A2 : 2002 : Method comparison and bias estimation using patient samples ;
Approved Guideline (2nd edition). Wayne, PA, 2002 ; 22 (19) : 5515.
15. Naudin C, Vassault A, Truchaud A, et les membres de la commission « instrumentation » de la
SFBC. Protocole d'étude de la contamination dans les analyseurs biochimiques. Ann Biol Clin 1988 ;
46 : 213-19.

293
SG2 PHASE ANALYTIQUE – SG2-07

Annexe I. Modèle de formulaire


(projet de validation/vérification analytique)

Type de méthode (principe) :


Composant(s) recherché(s), mesuré(s) :
Milieu(x) biologique(s) (matrice(s) :
Critères d'acceptation retenus (de dispersion et de biais)
Spécifications du fournisseur
Limites d'acceptabilité (SFBC)
Variations intra-individuelles et inter-individuelles
Expérience interne sur le type de méthode
Bibliographie disponible
Enjeux de la validation
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DMDIV marqué CE
DMDIV marqué CE avec modification
Méthode développée en interne
Nature du projet de validation/vérification
Mise à jour d'un dossier avec modification de la méthode
Mise à jour d'un dossier sans modification de la méthode
Développement intégral et validation de la méthode
Historique de la méthode (si la méthode est déjà utilisée)
Connaissance initiale des performances
Dossier de validation formel existant
Éléments de performance de la méthode existants formalisés (inclus dans un rapport)
et origine/provenance de ces informations
Éléments de performance de la méthode existants mais non formalisés (non inclus
dans un rapport) et origine/provenance de ces informations
Documentation existante (préliminaire à la validation)
Procédure, mode opératoire, instruction
Rapport de mise au point
Démarche de validation envisagée
Vérification des performances
Validation méthode quantitative
Validation méthode semi-quantitative
Validation méthode qualitative
Validation partielle
Critères à vérifier/valider
Critère(s) de validation à démontrer (module fidélité, module justesse, module limites
de linéarité, etc.)
Plan expérimental envisagé
Nombre de séries
Nombre et niveaux des échantillons de contrôle
Niveau de qualification des équipements
Sur la base des documents « fournisseur »
Contraintes liées au produit ou aux échantillons :
Possibilité d'avoir des matériaux de référence pour l'estimation de la justesse
Méthode de référence
Possibilité d'avoir une matrice sans l'analyte
Stabilité
Interférences connues
Préparation de l'échantillon avant analyse

DMDIV : dispositifs médicaux de diagnostic in vitro.

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