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Microscope à fluorescence verticale (Olympus BX61), équipé de filtres et d'un appareil photo

numérique.
https://fr.wikipedia.org/wiki/Microscopie_
%C3%A0_fluorescence.10/01/2021.22.36H

Figure 2: Dispositif de Filtrage Optique de Base pour la Microscopie à Fluorescence


https://www.edmundoptics.fr/knowledge-center/application-
notes/microscopy/fluorescence-microscopy-in-line-illumination-with-imaging-
filters/10/01/2021.22.38H

Molecular Probes™ Handbook. A Guide to Fluorescent Probes and Labeling.


Technologies 11th Edition (2010). Introduction to Fluorescence Techniques.
Thermofisher scientific. 08/01/2021.22.30h

Introduction aux techniques de fluorescence

Les sondes fluorescentes permettent aux chercheurs de détecter des composants


particuliers d'assemblages biomoléculaires complexes, tels que des cellules vivantes,
avec une sensibilité et une sélectivité exquise. Le but de cette introduction est de
présenter brièvement les principes et les techniques de fluorescence

‫مقدمة لتقنيات التألق‬

‫ مثل الخاليا‬، ‫تسمح المجسات الفلورية للباحثين باكتشاف مكونات معينة للتجمعات الجزيئية الحيوية المعقدة‬
‫ الغرض من هذه المقدمة هو تقديم موجز لمبادئ وتقنيات التألق‬.‫ بحساسية وانتقائية رائعة‬، ‫الحية‬

Le processus de fluorescence

La fluorescence est le résultat d'un processus en trois étapes qui se produit dans
certaines molécules (généralement des hydrocarbures poly aromatiques ou
hétérocycles) appelées fluorophores ou colorants fluorescents. Une sonde fluorescente
est un fluorophore conçu pour répondre à un stimulus spécifique ou pour se localiser
dans une région spécifique d'un échantillon biologique. Le processus responsable de
la fluorescence des sondes fluorescentes et autres fluorophores est illustré par le
simple diagramme d'état électronique (diagramme de Jablonski) illustré à la figure 1.

‫عملية التألق‬

‫اإلسفار هو نتيجة عملية من ثالث خطوات تحدث في جزيئات معينة (عادةً هيدروكربونات متعددة الحلقات أو‬
‫ مسبار الفلوريسنت هو فلوروفور مصمم لالستجابة لحافز‬.‫غير متجانسة) تسمى الفلور أو األصباغ الفلورية‬
‫ يتم توضيح العملية المسؤولة عن تألق المجسات‬.‫معين أو للتوطين في منطقة معينة من عينة بيولوجية‬
‫) الموضح‬Jablonski ‫الفلورية وغيرها من الفلوروفورات من خالل مخطط الحالة اإللكترونية البسيط (مخطط‬
1 ‫في الشكل‬

Figure 1 Diagramme de Jablonski illustrant les processus impliqués dans la création


d'un état singulet électronique excité par absorption optique et émission ultérieure de
fluorescence.

‫ مخطط جابلونسكي يوضح العمليات المتضمنة في إنشاء حالة القميص اإللكترونية المثارة عن طريق‬1 ‫شكل‬
.‫االمتصاص البصري وانبعاث التألق الالحق‬

Étape 1: Excitation

Un photon d'énergie hνEX est fourni par une source externe telle qu'une lampe à
incandescence ou un laser et absorbé par le fluorophore, créant un état singulet
électronique excité (S1´). Ce processus distingue la fluorescence de la
chimioluminescence, dans laquelle l'état excité est peuplé par une réaction chimique.

‫ اإلثارة‬:‫الخطوة األولى‬
‫ من خالل مصدر خارجي مثل المصباح المتوهج أو الليزر ويمتصه‬hνEX ‫يتم توفير فوتون من طاقة‬
‫ تميز هذه العملية التألق عن اللمعان‬.)´S1( ‫ مما يؤدي إلى إنشاء قبة متحمس إلكترونيًا‬، ‫الفلوروفور‬
‫ حيث يتم ملء الحالة المثارة بواسطة تفاعل كيميائي‬، ‫الكيميائي‬

Étape 2: Durée de vie de l'état excité

L'état excité existe pendant un temps fini (généralement 1 à 10 nanosecondes).


Pendant ce temps, le fluorophore subit des changements conformationnels et est
également soumis à une multitude d'interactions possibles avec son environnement
moléculaire. Ces processus ont deux conséquences importantes. Premièrement,
l'énergie de S1´ est partiellement dissipée, ce qui donne un état excité singulet relâché
(S1) d'où provient l'émission de fluorescence. Deuxièmement, toutes les molécules
initialement excitées par absorption (stage retour à l'état fondamental (S0) par
émission de fluorescence. Autre processus

Des es telles que l'extinction collisionnelle, le transfert d'énergie de résonance de


fluorescence (FRET) (Fluorescence Résonance Energy Transfer (FRET) - Note 1.2) et
le croisement inter système peuvent également dépeupler S1. La fluorescence

le rendement quantique, qui est le rapport du nombre de photons de fluorescence émis


(étape 3) au nombre de photons absorbés (étape 1), est une mesure de l'étendue
relative de ces processus.

‫ عمر الحالة المثيرة‬:2 ‫المرحلة‬

‫ يخضع‬، ‫ خالل هذا الوقت‬.)‫ نانو ثانية‬10 ‫ إلى‬1 ‫الحالة المثارة موجودة لفترة زمنية محدودة (عادة من‬
‫ هذه العمليات لها‬.‫ضا للعديد من التفاعالت الممكنة مع بيئته الجزيئية‬
ً ‫الفلوروفور لتغييرات توافقية ويخضع أي‬
‫) تنبعث منها‬S1( ‫ مما يؤدي إلى حالة استرخاء مفرغة‬، ‫´ جزئيًا‬S1 ‫ يتم تبديد طاقة‬، ً‫ أوال‬.‫نتيجتان مهمتان‬
( ‫ يتم تحفيز جميع الجزيئات في البداية عن طريق االمتصاص (العودة إلى الحالة األرضية‬، ‫ ثانيًا‬.‫انبعاث التألق‬
.‫) عن طريق االنبعاث الفلوري‬S0

.S1 ‫ضا أن يفرغ‬


ً ‫) والعبور بين األنظمة يمكن أي‬FRET( ‫ مثل التبريد االصطدام ونقل طاقة الرنين الفلوري‬Es
‫ضوئي‬

)1 ‫) إلى عدد الفوتونات الممتصة (الخطوة‬3 ‫ وهي نسبة عدد فوتونات التألق المنبعثة (الخطوة‬، ‫الكفاءة الكمية‬
‫ هي مقياس للمدى النسبي لهذه العمليات‬،

Étape 3: émission de fluorescence


Un photon d'énergie hνEM est émis, ramenant le fluorophore à son état fondamental
S0. En raison de la dissipation d'énergie pendant la durée de vie de l'état excité,
l'énergie de ce photon est inférieure, et donc de longueur d'onde plus longue, que le
photon d'excitation hνEX. La différence d'énergie ou de longueur d'onde représentée
par (hνEX - hνEM) est appelée décalage de Stokes. Le décalage de Stokes est
fondamental pour la sensibilité des techniques de fluorescence car il permet de
détecter les photons d'émission contre un fond bas, isolé des photons d'excitation. En
revanche, la spectrophotométrie d'absorption nécessite la mesure de la lumière
transmise par rapport à des niveaux de lumière incidente élevés à la même longueur
d'onde.

‫ انبعاث الفلورة‬:3 ‫خطوة‬

‫ بسبب تبديد الطاقة خالل عمر‬.S0 ‫ ويعيد الفلوروفور إلى حالته األرضية‬، hνEM ‫ينبعث فوتون من طاقة‬
.hνEX ‫ من فوتون اإلثارة‬، ‫ وبالتالي ذات طول موجي أطول‬، ‫ تكون طاقة هذا الفوتون أقل‬، ‫الحالة المثارة‬
‫ يعتبر تحول‬.‫) بإزاحة ستوكس‬hνEX - hνEM( ‫يسمى الفرق في الطاقة أو الطول الموجي الذي يمثله‬
‫ستوكس أم ًرا أساسيًا لحساسية تقنيات التألق ألنه يجعل من الممكن اكتشاف فوتونات االنبعاث على خلفية‬
‫ يتطلب قياس الطيف الضوئي االمتصاص قياس الضوء‬، ‫ في المقابل‬.‫ معزولة عن فوتونات اإلثارة‬، ‫منخفضة‬
‫المرسل مقابل مستويات عالية من الضوء الساقط بنفس الطول الموجي‬

Spectres de fluorescence

L'ensemble du processus de fluorescence est cyclique. À moins que le fluorophore ne


soit détruit de manière irréversible à l'état excité (un phénomène important connu sous
le nom de photoblanchiment), le même fluorophore peut être excité et détecté à
plusieurs reprises. Le fait qu'un seul fluorophore puisse générer plusieurs milliers de
photons détectables est fondamental pour la haute sensibilité des techniques de
détection par fluorescence. Pour les molécules polyatomiques en solution, les
transitions électroniques discrètes représentées par hνEX et hνEM sur la figure 1 sont
remplacées par des spectres d'énergie plutôt larges appelés spectre d'excitation de
fluorescence et spectre d'émission de fluorescence, respectivement (tableau 1). Les
largeurs de bande de ces spectres sont des paramètres d'une importance particulière
‫‪pour les applications dans lesquelles deux fluorophores différents ou plus sont‬‬
‫‪détectés simultanément. Le spectre d'excitation de fluorescence d'une seule espèce de‬‬
‫‪fluorophore en solution diluée est généralement identique à son spectre d'absorption.‬‬
‫‪Le spectre d'absorption peut donc être utilisé comme un ensemble de données de‬‬
‫‪spectre d'excitation de substitution. Dans les mêmes conditions, le spectre d'émission‬‬
‫‪de fluorescence est indépendant de la longueur d'onde d'excitation, en raison de la‬‬
‫‪dissipation partielle de l'énergie d'excitation pendant la durée de vie à l'état excité,‬‬
‫‪comme illustré sur la figure 1. L'intensité d'émission est proportionnelle à l'amplitude‬‬
‫‪du spectre d'excitation de fluorescence à la longueur d'onde d'excitation (figure 2).‬‬

‫اطياف اإلسفار‬

‫عملية التألق بأكملها دورية‪ .‬ما لم يتم تدمير الفلوروفور بشكل ال رجعة فيه في حالة اإلثارة (ظاهرة مهمة‬
‫تعرف باسم التبييض الضوئي) ‪ ،‬يمكن إثارة نفس الفلوروفور واكتشافه بشكل متكرر‪ .‬حقيقة أن فلوروفور‬
‫واحد يمكن أن يولد عدة آالف من الفوتونات القابلة لالكتشاف أمر أساسي للحساسية العالية لتقنيات الكشف‬
‫عن التألق‪ .‬بالنسبة للجزيئات المتعددة الذرات في المحلول ‪ ،‬يتم استبدال التحوالت اإللكترونية المنفصلة التي‬
‫يمثلها ‪ hνEX‬و ‪ hνEM‬في الشكل ‪ 1‬بأطياف طاقة واسعة إلى حد ما تسمى طيف اإلثارة الفلورية وطيف‬
‫انبعاث التألق ‪ ،‬على التوالي (الجدول ‪ . .)1‬عرض النطاق الترددي لهذه األطياف معلمات ذات أهمية خاصة‬
‫للتطبيقات التي يتم فيها اكتشاف اثنين أو أكثر من الفلوروفورات المختلفة في وقت واحد‪ .‬إن طيف اإلثارة‬
‫الفلورية لنوع واحد من الفلوروفور في محلول مخفف هو عمو ًما نفس طيف االمتصاص‪ .‬لذلك يمكن استخدام‬
‫طيف االمتصاص كمجموعة من بيانات طيف اإلثارة البديلة‪ .‬في ظل نفس الظروف ‪ ،‬يكون طيف انبعاث التألق‬
‫مستقالً عن الطول الموجي لإلثارة ‪ ،‬بسبب التبديد الجزئي لطاقة اإلثارة خالل العمر في الحالة المثارة ‪ ،‬كما هو‬
‫موضح في الشكل ‪ .1‬تتناسب شدة االنبعاث مع سعة طيف اإلثارة الفلورية عند طول موجة اإلثارة (الشكل ‪)2‬‬
Figure 2 L'excitation d'un fluorophore à trois longueurs d'onde différentes (EX 1, EX
2, EX 3) ne modifie pas le profil d'émission mais produit des variations d'intensité
d'émission de fluorescence (EM 1, EM 2, EM 3) qui correspondent à l'amplitude du
spectre d'excitation.

‫) ال يغير ملف االنبعاث‬EX 1 ، EX 2 ، EX 3( ‫ إن إثارة حامل الفلور بثالثة أطوال موجية مختلفة‬2 ‫شكل‬
‫) التي تتوافق مع سعة طيف اإلثارة‬EM 1 ، EM 2 ، EM 3( ‫ولكنه ينتج اختالفات في شدة انبعاث الفلورة‬

Détection de fluorescence

Instrumentation de fluorescence

Quatre éléments essentiels des systèmes de détection de fluorescence peuvent être


identifiés à partir de la discussion précédente :

1) une source d'excitation,

2) un fluorophore,

3) des filtres de longueur d'onde pour isoler les photons d'émission des photons
d'excitation,

4) un détecteur qui enregistre les photons d'émission et produit un enregistrable


sortie, généralement sous forme de signal électrique.
Quelle que soit l'application, la compatibilité de ces quatre éléments est essentielle
pour optimiser la détection de fluorescence.

Les instruments de fluorescence sont principalement de quatre types, chacun


fournissant des informations distinctement différentes :

Les spectrofluoromètres et les lecteurs de microplaques mesurent les propriétés


moyennes des échantillons en vrac (µL à mL).

Les microscopes à fluorescence résolvent la fluorescence en fonction du spatial


coordonnées en deux ou trois dimensions pour les objets microscopiques (diamètre
inférieur à ~ 0,1 mm).

Les scanners à fluorescence, y compris les lecteurs de puces à ADN, résolvent


fluorescence en fonction de coordonnées spatiales en deux dimensions pour des objets
macroscopiques tels que des gels d'électrophorèse, des blots et des chromatogrammes.

Les cytomètres en flux mesurent la fluorescence par cellule dans un flux fluide,
permettant d'identifier et de quantifier les sous-populations d'un large échantillon.

Autres types d'instrumentation utilisant la détection de fluorescence comprennent un


appareil d'électrophorèse capillaire, des séquenceurs d'ADN 1 et des dispositifs micro
fluidiques. Chaque type d'instrument produit différents artefacts de mesure et fait des
demandes différentes sur la sonde fluorescente. Par exemple, bien que le
photoblanchiment soit souvent un problème important en microscopie à fluorescence,
ce n'est pas un obstacle majeur à la cyrtométrie en flux car le temps de séjour des
cellules individuelles dans le faisceau d'excitation est court.

‫كشف األسفار‬

‫أجهزة اإلسفار‬

:‫يمكن تحديد أربعة عناصر أساسية ألنظمة الكشف عن التألق من المناقشة السابقة‬

، ‫) مصدر اإلثارة‬1

، ‫) فلوروفور‬2

، ‫) مرشحات الطول الموجي لعزل فوتونات االنبعاث من فوتونات اإلثارة‬3


‫‪ )4‬كاشف يسجل فوتونات االنبعاث وينتج مخرجات قابلة للتسجيل ‪ ،‬عادة في شكل إشارة كهربائية‪.‬‬

‫أيا كان التطبيق ‪ ،‬فإن توافق هذه العناصر األربعة ضروري لتحسين اكتشاف التألق‪.‬‬

‫تتكون أدوات اإلسفار بشكل أساسي من أربعة أنواع ‪ ،‬يقدم كل منها معلومات مختلفة بشكل واضح‪:‬‬

‫تقيس أجهزة قياس الطيف الضوئي وقارئات الصفيحة الدقيقة متوسط خصائص العينات السائبة (‪ µL‬إلى‬
‫‪.)mL‬‬

‫تحل مجاهر اإلسفار الفلورة بنا ًء على إحداثيات مكانية ثنائية أو ثالثية األبعاد لألجسام المجهرية (قطر أقل من‬
‫‪ 0.1‬مم تقريبًا)‬

‫تعمل الماسحات الضوئية الفلورية ‪ ،‬بما في ذلك قارئات المصفوفات الدقيقة ‪ ،‬على حل التألق بنا ًء على‬
‫إحداثيات مكانية ثنائية األبعاد لألشياء العيانية مثل المواد الهالمية والبقع والكروماتوجرام‪.‬‬

‫تقيس مقاييس التدفق الخلوي التألق لكل خلية في تدفق السوائل ‪ ،‬مما يسمح بتحديد وقياس المجموعات‬
‫السكانية الفرعية لعينة كبيرة‪.‬‬

‫تشمل األنواع األخرى من األجهزة التي تستخدم الكشف عن التألق جهاز الرحالن الكهربائي الشعري ‪،‬‬
‫ومسلسالت الحمض النووي ‪ ، 1‬وأجهزة ميكروفلويديك‪ .‬ينتج كل نوع من األدوات أدوات قياس مختلفة ويضع‬
‫متطلبات مختلفة على مسبار الفلورسنت‪ .‬على سبيل المثال ‪ ،‬على الرغم من أن التبييض الضوئي غالبًا ما‬
‫يكون مشكلة كبيرة في الفحص المجهري الفلوري ‪ ،‬إال أنه ال يمثل عقبة رئيسية أمام قياس التدفق بسبب قصر‬
‫وقت بقاء الخاليا المفردة في حزمة اإلثارة‬

‫‪Signaux de fluorescence‬‬

‫‪L'intensité de fluorescence dépend quantitativement des mêmes paramètres que‬‬


‫‪l'absorbance - définie par la loi de Beer-Lambert comme le produit du coefficient‬‬
‫‪d'extinction molaire, de la longueur du chemin optique et de la concentration en soluté‬‬
‫‪- ainsi que du rendement quantique de fluorescence du colorant et l'intensité de la‬‬
‫‪source d'excitation et l'efficacité de collecte de fluorescence de l'instrument (tableau‬‬
‫‪1).‬‬

‫‪Dans les solutions ou suspensions diluées, l'intensité de fluorescence est linéairement‬‬


‫‪proportionnelle à ces paramètres. Lorsque l'absorbance de l'échantillon dépasse‬‬
‫‪environ 0,05 sur une longueur de trajet de 1 cm, la relation devient non linéaire et les‬‬
‫‪mesures peuvent être déformées par des artefacts tels que l'auto-absorption et l'effet‬‬
‫‪de filtre interne.‬‬
Étant donné que la quantification de la fluorescence dépend de l'instrument, les
étalons de référence fluorescents sont essentiels pour l'étalonnage des mesures
effectuées à différents moments ou en utilisant différentes configurations
d'instrument.6–8 Pour répondre à ces exigences, nous proposons des étalons de
référence de microsphères fluorescentes de haute précision pour la microscopie à
fluorescence et la cyrtométrie en flux et un ensemble de solutions étalons
fluorescentes prêtes à l'emploi pour la spectrofluoromètres (section 23.1, section
23.2).

Un spectrofluoromètres est extrêmement flexible, fournissant des gammes continues


de longueurs d'onde d'excitation et d'émission. Les microscopes à balayage laser et les
cytomètres en flux nécessitent cependant des sondes excitables à une seule longueur
d'onde fixe. Dans les instruments contemporains, la source d'excitation est
généralement la raie spectrale à 488 nm du laser argon-ion.

Comme le montre la figure 3, la séparation du signal d'émission de fluorescence (S1)


de la lumière d'excitation diffusée par Rayleigh (EX) est facilitée par un grand
décalage de Stokes de fluorescence (c'est-à-dire, séparation de A1 et E1). Les
échantillons biologiques marqués avec des sondes fluorescentes contiennent
généralement plus d'une espèce fluorescente, ce qui rend les problèmes d'isolement du
signal plus complexes. Des signaux optiques supplémentaires, représentés sur la
figure 3 par S2, peuvent être dus à une fluorescence de fond ou à une seconde sonde
fluorescente.

‫اشارات اإلسفار‬

‫ على أنها ناتج‬Beer-Lambert ‫ التي يحددها قانون‬- ‫تعتمد شدة التألق كميًا على نفس معايير االمتصاص‬
‫ باإلضافة إلى المحصول كم اإلسفار للصبغة‬- ‫ وطول المسار البصري وتركيز الذائبة‬، ‫معامل االنقراض المولي‬
.)1 ‫وشدة مصدر اإلثارة وكفاءة جمع األسفار لألداة (الجدول‬

‫ عندما يتجاوز امتصاص العينة‬.‫ تتناسب شدة التألق خطيًا مع هذه المعلمات‬، ‫في المحاليل أو المعلقات المخففة‬
‫ تصبح العالقة غير خطية ويمكن أن تتشوه القياسات بالقطع األثرية‬، ‫ سم‬1 ‫ على طول مسار يبلغ‬0.05 ‫حوالي‬
. .‫مثل االمتصاص الذاتي وتأثير الترشيح الداخلي‬

‫ فإن المعايير المرجعية للفلوريسنت ضرورية لمعايرة‬، ‫نظ ًر ا ألن التقدير الكمي للفلورة يعتمد على األداة‬
‫ لتلبية هذه‬8-6. ‫القياسات التي تم إجراؤها في نقاط زمنية مختلفة أو باستخدام تكوينات مختلفة لألجهزة‬
‫ نحن تقدم معايير مرجعية عالية الدقة للفلوريسنت المجهري للفحص المجهري الفلوري وقياس‬، ‫المتطلبات‬
، 23.1 ‫التدفق ومجموعة من الحلول المعيارية الفلورية الجاهزة لالستخدام لمقاييس الطيف الضوئي (القسم‬
)23.2 ‫القسم‬

‫ ومع ذلك‬.‫ حيث يوفر نطاقات مستمرة من اإلثارة وأطوال موجات االنبعاث‬، ‫مقياس الطيف الضوئي مرن للغاية‬
‫ في‬.‫ فإن مسح المجاهر الليزرية ومقاييس التدفق الخلوي تتطلب مجسات مثيرة ذات طول موجي واحد‬،
.‫ نانومتر لليزر األرجون أيون‬488 ‫ يكون مصدر اإلثارة عمو ًما هو الخط الطيفي‬، ‫األدوات المعاصرة‬

‫) عن ضوء اإلثارة المبعثر بواسطة‬S1( ‫ يتم تسهيل فصل إشارة انبعاث التألق‬، 3 ‫كما هو مبين في الشكل‬
‫ تحتوي العينات البيولوجية‬.)E1 ‫ و‬A1 ‫ فصل‬، ‫ كبير للفلورة (أي‬Stokes ‫ من خالل تحول‬Rayleigh (EX)
‫ مما يجعل مشاكل عزل اإلشارة‬، ‫الموصوفة بمجسات الفلورسنت عمو ًما على أكثر من نوع فلورسنت واحد‬
‫ بسبب تألق الخلفية أو‬، S2 ‫ كـ‬3 ‫ الموضحة في الشكل‬، ‫ قد تكون اإلشارات الضوئية اإلضافية‬.‫أكثر تعقيدًا‬
‫مسبار الفلورسنت الثاني‬

Fluorescence de fond

La sensibilité de détection de fluorescence est gravement compromise par les signaux


de fond, qui peuvent provenir de constituants d'échantillons endogènes (appelés auto
fluorescence) ou de sondes non liées ou non spécifiquement liées (appelées fond de
réactif). La détection de l'auto fluorescence peut être minimisée soit en sélectionnant
des filtres qui réduisent la transmission de E2 par rapport à E1, soit en sélectionnant
des sondes qui absorbent et émettent à des longueurs d'onde plus longues. Bien que le
rétrécissement de la bande passante de détection de fluorescence augmente la
résolution de E1 et E2, il compromet également l'intensité de fluorescence globale
détectée. La distorsion du signal causée par l'auto fluorescence des cellules, des tissus
et des fluides biologiques est le plus facilement minimisée en utilisant des sondes qui
peuvent être excitées à> 500 nm. De plus, à des longueurs d'onde plus longues, la
diffusion de la lumière par les milieux denses tels que les tissus est beaucoup plus
réduite, ce qui entraîne une plus grande pénétration de la lumière d'excitation
A2 ‫ و‬A1 ‫) في نطاقي االمتصاص المتداخلين‬EX( ‫ اإلثارة‬.‫ كشف األسفار لألنواع المختلطة‬3 ‫ الشكل‬3 ‫شكل‬
S1 ‫ المرشحات الضوئية إشارات االنبعاث الكمي المتأخرة‬.E2 ‫ و‬E1 ‫تنتج نوعين من الفلورسنت مع األطياف‬
S2 ‫و‬

Figure 3 Détection par fluorescence d'espèces mixtes. L'excitation (EX) dans les
bandes d'absorption se chevauchant A1 et A2 produit deux espèces fluorescentes avec
les spectres E1 et E2. Filtres optiques signaux d'émission quantitatifs iso-tardifs S1 et
S2.

‫تألق الخلفية‬

‫ والتي يمكن أن تأتي من مكونات العينات‬، ‫تتأثر حساسية الكشف عن التألق بشدة من خالل إشارات الخلفية‬
‫الداخلية (تسمى التألق التلقائي) أو من مجسات غير منضمة أو غير مرتبطة بشكل خاص (تسمى خلفية‬
‫ عبر‬E2 ‫ يمكن التقليل من الكشف عن التألق الذاتي إما عن طريق اختيار المرشحات التي تقلل انتقال‬.)‫الكاشف‬
‫ على الرغم من أن تضييق‬.‫ أو عن طريق اختيار المجسات التي تمتص وتنبعث بأطوال موجية أطول‬، E1
‫ضا بكثافة التألق اإلجمالية‬
ً ‫ إال أنه يضر أي‬، E2 ‫ و‬E1 ‫عرض النطاق الترددي للكشف عن التألق يزيد من دقة‬
‫ يتم تقليل تشوه اإلشارة الناجم عن التألق التلقائي للخاليا واألنسجة وسوائل الجسم إلى أدنى حد‬.‫المكتشفة‬
‫ في األطوال الموجية‬، ‫ باإلضافة إلى ذلك‬.‫ نانومتر‬500 >‫ممكن باستخدام المجسات التي يمكن تحفيزها عند‬
‫ مما يؤدي إلى اختراق أكبر لضوء اإلثارة‬، ‫ يتم تقليل تشتت الضوء من الوسائط الكثيفة مثل األنسجة‬، ‫األطول‬

Expériences d'étiquetage multicolore

Une expérience de marquage multicolore implique l'introduction délibérée de deux


sondes ou plus pour surveiller simultanément différentes fonctions biochimiques.
Cette technique a des applications majeures dans la cyrtométrie en flux, le séquençage
d'ADN 10–12, 1 hybridation in situ par fluorescence 13,14 et la microscopie à
fluorescence.15–17 L'isolement des signaux et l'analyse des données sont facilités en
maximisant la séparation spectrale des multiples émissions (E1 et E2 sur la figure 3).
Par conséquent, les fluorophores à bande passante spectrale d'émission étroite, tels
que les colorants BODIPY® (section 1.4) et les nanocristaux Qdot® (section 6.6),
sont particulièrement utiles dans les applications multicolores. Une combinaison
idéale de colorants pour le marquage multicolore présenterait une forte absorption à
une longueur d'onde d'excitation coïncidente et des spectres d'émission bien séparés
(figure 3). Malheureusement, il n'est pas facile de trouver des colorants uniques avec
la combinaison requise d'un grand coefficient d'extinction pour l'absorption et d'un
grand décalage de Stokes. Qdot® nanocristal (section 6.6) et conjugués en tandem de
phycobiliprotéine (section 6.4)

ont été développés pour répondre à ces exigences et se sont avérés efficaces dans les
expériences de marquage multicolore.

‫تجارب وضع العالمات متعددة األلوان‬

‫تتضمن تجربة وضع العالمات متعددة األلوان إدخااًل متعمدًا لمسبارين أو أكثر لمراقبة الوظائف البيوكيميائية‬
-10 ‫ وتسلسل الحمض النووي‬، ‫ هذه التقنية لها تطبيقات رئيسية في قياس التدفق‬.‫المختلفة في وقت واحد‬
‫ عزل اإلشارة وتحليل‬17-15 .‫ والفحص المجهري الفلوري‬13،14 ‫ مضان في التهجين في الموقع‬1 ، 12
‫ فإن‬، ‫ لذلك‬.)3 ‫ في الشكل‬E2 ‫ و‬E1( ‫البيانات عن طريق تعظيم الفصل الطيفي لالنبعاثات المتعددة‬
‫) وبلورات‬1.4 ‫® (القسم‬BODIPY ‫ مثل أصباغ‬، ‫الفلوروفورات ذات النطاق الترددي الضيق لالنبعاث‬
‫ مزيج مثالي من األصباغ‬.‫ مفيدة بشكل خاص في التطبيقات متعددة األلوان‬، )6.6 ‫® النانوية (القسم‬Qdot
‫صا قويًا بطول موجة اإلثارة المتزامنة وأطياف‬
ً ‫لوضع العالمات متعددة األلوان من شأنه أن يُظهر امتصا‬
‫ ليس من السهل العثور على أصباغ فريدة مع التركيبة‬، ‫ لسوء الحظ‬.)3 ‫االنبعاث المنفصلة جيدًا (الشكل‬
‫ (القسم‬Qdot® nanocrystal .‫المطلوبة من معامل االنقراض الكبير لالمتصاص وتحول ستوكس الكبير‬
)6.4 ‫) وتقارن البروتينات الترادفية (القسم‬6.6

‫تم تطويرها لتلبية هذه المتطلبات وأثبتت فعاليتها في تجارب وضع العالمات متعددة األلوان‬

Mesures radiométriques

Dans certains cas - par exemple les indicateurs de Ca2 + fura-2 et indo-1 (section
19.2) et les indicateurs de pH BCECF et SNARF® (section 20.2) - les formes libres et
liées aux ions des indicateurs fluorescents d'ions ont des spectres d'émission ou
d'excitation différents. Avec ce type d'indicateur, le rapport des signaux optiques (S1
et S2 sur la figure 3) peut être utilisé pour surveiller l'équilibre d'association et pour
calculer les concentrations ioniques. Les mesures radiométriques éliminent les
distorsions des données causées par le photoblanchiment et les variations de charge et
de rétention de la sonde, ainsi que par des facteurs instrumentaux tels que la stabilité
de l'éclairage.20,21 (Chargement et étalonnage des indicateurs d'ions intracellulaires -
Note 19.1).

‫قياسات اإلشعاعية‬
‫) ومؤشرات األس‬19.2 ‫ (القسم‬indo-1 ‫ و‬fura-2 ‫ مؤشرات‬+ Ca2 ‫ على سبيل المثال‬- ‫في بعض الحاالت‬
‫ تحتوي األشكال المجانية والمحددة لأليونات‬- )20.2 ‫® (القسم‬SNARF ‫ و‬BCECF ‫الهيدروجيني‬
‫ يمكن‬، ‫ باستخدام هذا النوع من المؤشرات‬.‫لمؤشرات أيونات الفلورسنت أطياف انبعاث أو إثارة مختلفة‬
‫) لمراقبة توازن االرتباط ولحساب تركيزات‬3 ‫ في الشكل‬S2 ‫ و‬S1( ‫استخدام نسبة اإلشارات الضوئية‬
‫ تقضي القياسات اإلشعاعية على تشوهات البيانات الناتجة عن التبييض الضوئي واالختالفات في‬.‫األيونات‬
‫ (التحميل والمعايرة األيونات‬20،21 .‫ فضالً عن العوامل اآللية مثل ثبات الضوء‬، ‫شحن المسبار واالحتفاظ به‬
.)19.1 ‫ المالحظة‬- ‫داخل الخاليا‬

Sortie de fluorescence des fluorophores

Comparaison de différents colorants

Les fluorophores actuellement utilisés comme sondes fluorescentes offrent des


permutations suffisantes de la gamme de longueurs d'onde, du décalage de Stokes et
de la largeur de bande spectrale pour répondre aux exigences imposées par
l'instrumentation (par exemple, excitation à 488 nm), tout en permettant une flexibilité
dans la conception des expériences d'étiquetage multicolore. Notre Fluorescence
SpectraViewer en ligne (www.invitrogen. Com / handbook / spectraviewer) fournit un
utilitaire interactif pour évaluer ces facteurs pendant le processus de conception
expérimentale (Utilisation du Fluorescence SpectraViewer — Note 23.1). La sortie de
fluorescence d'un colorant donné dépend de l'efficacité avec laquelle il absorbe et
émet des photons, et de sa capacité à subir des cycles d'excitation / émission répétés.
Les efficacités d'absorption et d'émission sont le plus utilement quantifiées en termes
de coefficient d'extinction molaire (CE) pour l'absorption et le rendement quantique
(QY) pour la fluorescence. Les deux sont des constantes dans des conditions
environnementales spécifiques. La valeur de EC est spécifiée à une seule longueur
d'onde (généralement le maximum d'absorption), tandis que QY est une mesure de
l'émission totale de photon sur l'ensemble du profil spectral de fluorescence.
L'intensité de fluorescence par molécule de colorant est proportionnelle au produit de
EC et QY (tableau 1). La gamme de ces paramètres parmi les fluorophores de
colorants organiques et de protéines auto fluorescentes est d'environ 5 000 à 200 000
cm – 1M – 1 pour EC et de 0,05 à 1,0 pour QY. Les phycobiliprotéines telles que la
‫‪R-phycoérythrine (section 6.4) ont plusieurs fluorophores sur chaque protéine et ont‬‬
‫× ‪par conséquent des coefficients d'extinction beaucoup plus élevés (de l'ordre de 2‬‬
‫‪106 cm – 1M – 1) que les fluorophores de faible poids moléculaire. Les nanocristaux‬‬
‫‪Qdot® ont des coefficients d'extinction encore plus élevés (> 2 × 106 cm – 1M – 1),‬‬
‫‪en particulier dans les régions de longueurs d'onde bleu visible et ultraviolet (section‬‬
‫‪6.6).‬‬

‫اخراج الفلورية من الفلور‬

‫مقارنة األصباغ المختلفة‬

‫توفر الفلوروفورات المستخدمة حاليًا كمجسات الفلورسنت تبادياًل كافيًا لنطاق الطول الموجي ‪ ،‬وتحول‬
‫ستوكس وعرض النطاق الترددي الطيفي لتلبية المتطلبات التي تفرضها األجهزة (مثل اإلثارة عند ‪488‬‬
‫نانومتر) ‪ ،‬مع السماح بالمرونة في تصميم تجارب وضع العالمات متعددة األلوان‪ .‬يوفر ‪SpectraViewer‬‬
‫)‪ (www.invitrogen. Com / handbook / SpectraViewer‬أداة تفاعلية لتقييم هذه العوامل أثناء‬
‫عملية التصميم التجريبية (باستخدام ‪ - Fluorescence SpectraViewer‬المالحظة ‪ .)23.1‬يعتمد ناتج‬
‫الفلورة لصبغة معينة على الكفاءة التي تمتص بها وتصدر الفوتونات ‪ ،‬وقدرتها على الخضوع لدورات‬
‫اإلثارة ‪ /‬االنبعاث المتكررة‪ .‬يتم تحديد كفاءات االمتصاص واالنبعاث بشكل أكثر فائدة من حيث معامل االنقراض‬
‫المولي (‪ )CE‬لالمتصاص والعائد الكمي (‪ )QY‬للتألق‪ .‬كالهما ثوابت في ظل ظروف بيئية محددة‪ .‬يتم تحديد‬
‫قيمة ‪ EC‬عند طول موجي واحد (عادةً الحد األقصى لالمتصاص) ‪ ،‬بينما ‪ QY‬هو قياس إجمالي انبعاث‬
‫الفوتون على كامل الملف الطيفي الفلوري‪ .‬تتناسب شدة التألق لكل جزيء صبغ مع منتج ‪ EC‬و ‪QY‬‬
‫(الجدول ‪ .) 1‬يتراوح نطاق هذه المعلمات بين الفلور لألصباغ العضوية والبروتينات الفلورية الذاتية حوالي‬
‫‪ 5000‬إلى ‪ 200000‬سم ‪ 1M - 1 -‬لـ ‪ EC‬و ‪ 0.05‬إلى ‪ 1.0‬لـ ‪ .QY‬تحتوي البروتينات‬
‫‪ Phycobiliproteins‬مثل ‪( R-phycoerythrin‬القسم ‪ )6.4‬على العديد من الفلوروفور على كل‬
‫بروتين ‪ ،‬وبالتالي لها معامالت انقراض أعلى بكثير (بترتيب ‪ 106 × 2‬سم ‪ )1M - 1 -‬من الفلوروفورات‬
‫منخفضة الوزن الجزيئي الغرامي‪ .‬تتمتع البلورات النانوية ‪ ®Qdot‬بمعامالت انقراض أعلى (> ‪106 × 2‬‬
‫سم ‪ 1 -‬م ‪ ، )1 -‬خاصة في مناطق الطول الموجي المرئية الزرقاء واألشعة فوق البنفسجية (القسم ‪)6.6‬‬

‫‪Photoblanchiment‬‬

‫‪Dans des conditions d'éclairage à haute intensité, la destruction irréversible ou le‬‬


‫‪photoblanchiment du fluorophore excité devient le principal facteur limitant la‬‬
‫‪détectabilité de fluorescence. Les multiples voies de réaction photochimique‬‬
‫‪responsables du photoblanchiment ont été étudiées et décrites de manière très‬‬
détaillée.22–24 Certaines voies incluent des réactions entre des molécules de colorant
adjacentes, ce qui rend le processus considérablement plus complexe dans les
échantillons biologiques marqués que dans les solutions diluées de colorant libre.
Dans tous les cas, le photoblanchiment provient de l'état excité du triplet, qui est créé
à partir de l'état singulet (S1, figure 1) via un processus d'état excité appelé croisement
inter système.

Le remède le plus efficace pour le photoblanchiment est de maximiser la sensibilité de


détection, ce qui permet de réduire l'intensité d'excitation. La sensibilité de détection
est améliorée par des dispositifs de détection à faible luminosité tels que les caméras
CCD, ainsi que par des objectifs à ouverture numérique élevée et les filtres d'émission
passe-bande les plus larges compatibles avec une isolation de signal satisfaisante.
Alternativement, un fluorophore moins photo labile peut être remplacé dans
l'expérience.26 Le colorant Alexa Fluor® 488 est un substitut important de la
fluorescéine qui offre une photo stabilité significativement plus grande que la
fluorescéine (Figure 4, Figure 5, Figure 6), tout en étant compatible avec les filtres
optiques à fluorescéine standard. Les réactifs anti fade tels que les réactifs SlowFade®
et ProLong® (section 23.1) peuvent également être appliqués pour réduire le
photoblanchiment ; cependant, ils sont généralement incompatibles avec les cellules
vivantes. En général, il est difficile de prévoir la nécessité et l’efficacité de telles
contre-mesures car les taux de photoblanchiment dépendent dans une certaine mesure
de l’environnement du fluorophore.

‫ يصبح التدمير الذي ال رجعة فيه أو التبييض الضوئي للفلوروفور‬، ‫في ظل ظروف اإلضاءة عالية الكثافة‬
‫ تمت دراسة مسارات التفاعل الكيميائي‬.‫المتحمس العامل الرئيسي الذي يحد من إمكانية اكتشاف الفلورة‬
‫ تتضمن بعض المسارات‬24-22. ‫الضوئي المتعددة المسؤولة عن التبييض الضوئي ووصفها بتفصيل كبير‬
‫ مما يجعل العملية أكثر تعقيدًا في العينات البيولوجية ذات العالمات‬، ‫تفاعالت بين جزيئات الصبغة المجاورة‬
‫ ينشأ التبييض الضوئي‬، ‫ في جميع الحاالت‬.‫ تمييع محاليل الصبغة الحرة‬.‫أكثر من العينات البيولوجية المسمى‬
‫) عبر عملية الحالة المثارة‬1 ‫ الشكل‬، S1( ‫ والتي يتم إنشاؤها من حالة القميص‬، ‫من الحالة المثارة للثالثية‬
.‫التي تسمى العبور بين األنظمة‬

‫ يتم‬.‫ مما يساعد على تقليل شدة اإلثارة‬، ‫العالج األكثر فعالية لتبييض الصور هو تعظيم حساسية الكشف‬
‫ باإلضافة إلى‬، CCD ‫تحسين حساسية الكشف عن طريق أجهزة الكشف عن اإلضاءة المنخفضة مثل كاميرات‬
‫عدسات الفتحة الرقمية العالية ومرشحات انبعاث ممر النطاق األوسع المتوافقة مع عزل إشارة مرضي بدالً من‬
‫ هي بديل‬Alexa Fluor® 488 ‫ صبغة‬26. ‫ يمكن استبدال الفلوروفور األقل قابلية للصور في التجربة‬، ‫ذلك‬
‫ مع كونها‬، )6 ‫ الشكل‬، 5 ‫ الشكل‬، 4 ‫مهم للفلورسين الذي يوفر ثباتًا أكبر للصور مقارنة بالفلورسين (الشكل‬
‫ضا استخدام الكواشف المضادة للبهتان مثل‬
ً ‫ يمكن أي‬.‫متوافقة مع المرشحات الضوئية القياسية من الفلوريسين‬
‫ فهي غير‬، ‫) لتقليل التبييض الضوئي ؛ ومع ذلك‬23.1 ‫® (القسم‬ProLong ‫® و‬SlowFade ‫كواشف‬
‫ من الصعب التنبؤ بضرورة وفعالية مثل هذه اإلجراءات‬، ‫ بشكل عام‬.‫متوافقة بشكل عام مع الخاليا الحية‬
‫المضادة ألن معدالت التبييض الضوئي تعتمد إلى حد ما على بيئة الفلوروفور‬

Figure 4 Comparaison de la photo stabilité des conjugués d'anticorps fluorescents


verts. Les conjugués d'anticorps anti-IgG de souris fluorescents de chèvre suivants ont
été utilisés pour détecter le marquage d'anticorps anti-IgG humains de souris
d'anticorps anti-nucléaires humains dans des cellules HEp-2 sur des lames de test
préfixées (INOVA Diagnostics Corp.): Alexa Fluor® 488 (A11001, s), Oregon
Green® 514 (O6383, j), BODIPY® FL (B2752, n), Oregon Green® 488 (O6380, h)
ou fluorescéine (F2761, d). Les échantillons ont été éclairés en continu et observés sur
un microscope à fluorescence en utilisant un ensemble de filtres passe-long à
fluorescéine. Les images ont été acquises toutes les 5 secondes. Pour chaque
conjugué, trois ensembles de données, représentant différents champs de vision, ont
été moyennés puis normalisés à la même valeur d'intensité de fluorescence initiale
pour faciliter la comparaison.

‫ تم استخدام اتحادات‬.‫ مقارنة استقرار الصورة من اتحادات األجسام المضادة الفلورية الخضراء‬4 ‫الشكل‬
IgG ‫ المضادة للفأر الماعز التالية للكشف عن وضع العالمات على األجسام المضادة‬IgG ‫األجسام المضادة‬
‫ على شرائح االختبار المرفقة‬HEp-2 ‫للفأر البشري المضادة لألجسام المضادة للنووية البشرية في خاليا‬
Alexa Fluor® 488 (A11001، s)، Oregon :).INOVA Diagnostics Corp ( ‫مسبقًا‬
Green® 514 (O6383، j)، BODIPY® FL (B2752، n)، Oregon Green® 488 (O6380،
‫ تم إلقاء الضوء على العينات بشكل مستمر وتم مالحظتها على مجهر‬.fluorescein (F2761، d ) ‫ أو‬h)
.‫ ثوان‬5 ‫ تم الحصول على الصور كل‬.‫مضان باستخدام مجموعة من مرشحات التمرير الطويلة من الفلوريسين‬
‫ ثم تطبيعها إلى‬، ‫ تمثل مجاالت رؤية مختلفة‬، ‫ تم حساب متوسط ثالث مجموعات من البيانات‬، ‫لكل متقارن‬
‫نفس قيمة شدة التألق األولية لتسهيل المقارنة‬

Figure 5 Résistance au
photoblanchiment des colorants à fluorescence verte Alexa Fluor® 488, Oregon
Green® 488 et fluorescéine, déterminée par cyrtométrie à balayage laser. Les cellules
EL4 ont été marquées avec un anticorps anti-CD44 conjugué à la biotine et détectées
par Alexa Fluor® 488 (S11223; S32354), Oregon Green® 488 (S6368) ou
fluorescéine (S869) streptavidine. Les cellules ont ensuite été fixées dans 1% de
formaldéhyde, lavées et montées à l'eau. Après le montage, les cellules ont été
scannées 10 fois sur un cytomètre à balayage laser; les niveaux de puissance laser
étaient de 25 mW pour la raie spectrale à 488 nm du laser argon-ion. Les durées de
scan duraient environ 5 minutes, et chaque répétition commençait immédiatement
après la fin du scan précédent. Les données sont exprimées en pourcentages dérivés
de l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) de chaque balayage divisé par le MFI
du premier balayage. Données fournies par Bill Telford, Direction de la
transplantation expérimentale et de l'immunologie, Institut national du cancer.

‫ واألصباغ الفلورية‬Oregon Green® 488 ‫ و‬Alexa Fluor® 488 ‫ مقاومة التبييض الضوئي لـ‬5 ‫شكل‬
‫ بجسم‬EL4 ‫ تم تمييز خاليا‬.‫ والتي يتم تحديدها بواسطة قياس الليزر بالمسح الضوئي‬، ‫الخضراء الفلورية‬
Oregon ‫) أو‬S32354 ‫ ؛‬S11223( Alexa Fluor® 488 ‫ مترافق مع البيوتين واكتشفه‬CD44 ‫مضاد لـ‬
٪1 ‫ تم بعد ذلك تثبيت الخاليا في‬.fluorescein (S869) streptavidin ‫ أو‬Green® 488 (S6368)
‫ مرات على مقياس خلوي مسح‬10 ‫ تم فحص الخاليا‬، ‫ بعد التركيب‬.‫ وغسلها وتركيبها في الماء‬، ‫فورمالدهيد‬
‫ استغرقت‬.‫ نانومتر لليزر األرجون أيون‬488 ‫ ميجاوات للخط الطيفي‬25 ‫بالليزر ؛ كانت مستويات طاقة الليزر‬
‫ يتم التعبير عن البيانات‬.‫ وبدأ كل تكرار على الفور بعد اكتمال الفحص السابق‬، ‫ دقائق‬5 ‫أوقات الفحص حوالي‬
‫ البيانات‬.‫ للمسح األول‬MFI ‫) لكل مسح مقسو ًما على‬MFI( ‫كنسب مئوية مشتقة من متوسط كثافة التألق‬
‫ المعهد الوطني للسرطان‬، ‫ مديرية زرع األعضاء التجريبية والمناعة‬، ‫مقدمة من بيل تيلفورد‬

Figure 6 Comparaison des taux de photoblanchiment des colorants Alexa Fluor® 488
et Alexa Fluor® 546 et les fluorophores bien connus fluorescéine et Cy®3. Le
cytosquelette des cellules endothéliales de l'artère pulmonaire bovine (BPAEC) a été
marqué avec (série supérieure) Alexa Fluor® 488 phalloïdines (A12379) et un
anticorps monoclonal de souris anti – α-tubuline (A11126) en association avec Alexa
Fluor® 546 chèvre anti – IgG de souris anticorps (A11003) ou (série inférieure)
fluorescéine phalloïdine (F432) et l'anticorps anti – α-tubuline en combinaison avec
un anticorps IgG de chèvre anti – souris Cy®3 disponible dans le commerce. Les
images pseudo-colorées ont été prises à des intervalles de 30 secondes (0, 30, 90 et
210 secondes d'exposition de gauche à droite). Les images ont été acquises avec des
ensembles de filtres passe-bande appropriés pour la fluorescéine et la rhodamine.

‫ و‬Alexa Fluor® 546 ‫ و‬Alexa Fluor® 488 ‫ مقارنة بين معدالت التبييض الضوئي ألصباغ‬6 ‫شكل‬
‫ تم تصنيف الهيكل الخلوي للخلية البطانية للشريان‬.‫ المعروفين‬Cy®3 ‫ و‬fluorophores fluorescein
Alexa Fluor® 488 phalloidins (A12379) )‫) مع (سلسلة متفوقة‬BPAEC( ‫الرئوي البقري‬
Alexa Fluor® 546 ‫ باالشتراك مع‬α-tubulin (A11126) ‫والجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد لـ‬
)‫ (السلسلة السفلية‬phalloidin (F432) ‫) أو فلورسين‬A11003( ‫ مضاد للفأر من الماعز‬IgG ‫جسم مضاد‬
‫ المضاد للفأر الماعز المتاح‬IgG Cy®3 ‫ باالشتراك مع الجسم المضاد‬α-tubulin - ‫واألجسام المضادة‬
‫ ثانية من اليسار إلى‬210 ‫ و‬90 ، 30 ، 0( ‫ ثانية‬30 ‫ تم التقاط صور ذات ألوان زائفة على فترات‬.‫تجاريًا‬
‫ تم الحصول على الصور بمجموعات من مرشحات ممر النطاق المناسبة للفلوريسين والرودامين‬.)‫اليمين‬

Amplification du signal

Le moyen le plus simple d'améliorer les signaux de fluorescence est d'augmenter le


nombre de fluorophores disponibles pour la détection.30 Les signaux fluorescents
peuvent être amplifiés en utilisant 1) des techniques de détection secondaire avidine-
bio-étain ou anticorps-haptène, 2) des réactifs de détection secondaire marqués par
enzyme en conjonction avec des substrats fluor gènes 31–33 ou 3) des sondes
contenant plusieurs fluorophores tels que des phycobiliprotéines ou des microsphères
fluorescentes Fluo Sphères®. Nos réactifs et méthodes d'amplification du signal les
plus sensibles sont présentés au chapitre 6.

Le simple fait d’augmenter la concentration de la sonde peut être contre-productif et


produit souvent des changements marqués dans les caractéristiques chimiques et
optiques de la sonde. Il est important de noter que la concentration intracellulaire
efficace des sondes chargées par les méthodes de perméabilisation en vrac
(Chargement et étalonnage d'indicateurs d'ions intracellulaires - Note 19.1) est
généralement beaucoup plus élevée (> 10 fois) que la concentration d'incubation
extracellulaire. En outre, un marquage accru des protéines ou des membranes conduit
finalement à la précipitation de la protéine ou à des changements importants dans la
perméabilité de la membrane. Les anticorps marqués avec plus de quatre à six
fluorophores par protéine peuvent présenter une spécificité réduite et une affinité de
liaison réduite. En outre, à des degrés de substitution élevés, la fluorescence
supplémentaire obtenue par fluorophore ajouté diminue généralement en raison de
l'auto-extinction (Figure 7)

‫تضخيم اإلشارة‬

‫ إشارة‬30 ‫يمكن تضخيم‬.‫إن أبسط طريقة لتحسين إشارات التألق هي زيادة عدد الفلوروفورات المتاحة للكشف‬
‫) كواشف الكشف‬2 ، .‫ أو تقنيات الكشف الثانوي عن األجسام المضادة‬avidin-bio-tin )1 ‫فلورية باستخدام‬
‫الثانوية التي تحمل عالمات اإلنزيم باالشتراك مع ركائز الجين الفلور ‪ 33-31‬أو ‪ )3‬مجسات تحتوي على‬
‫مركبات فلورية متعددة مثل البروتينات النباتية أو الكرات المجهرية ‪ .®Fluo Spheres‬يتم عرض الكواشف‬
‫األكثر حساسية وطرق تضخيم اإلشارة في الفصل ‪.6‬‬

‫يمكن أن تؤدي مجرد زيادة تركيز المجس إلى نتائج عكسية وغالبًا ما ينتج عنها تغييرات ملحوظة في‬
‫الخصائص الكيميائية والبصرية للمسبار‪ .‬من المهم مالحظة أن التركيز الفعال داخل الخاليا للمسبارات المحملة‬
‫بأساليب نفاذية الكتلة (تحميل ومعايرة مؤشرات األيونات داخل الخاليا ‪ -‬المالحظة ‪ )19.1‬يكون بشكل عام‬
‫أعلى بكثير (> ‪ 10‬مرات) من تركيز حضانة خارج الخلية‪ .‬باإلضافة إلى ذلك ‪ ،‬تؤدي زيادة وضع العالمات‬
‫على البروتينات أو األغشية في النهاية إلى ترسيب البروتين أو تغييرات كبيرة في نفاذية الغشاء‪ .‬قد تُظهر‬
‫األجسام المضادة الموصوفة بأكثر من أربعة إلى ستة فلوروفور لكل بروتين خصوصية منخفضة وتقارب‬
‫ارتباط منخفض‪ .‬عالوة على ذلك ‪ ،‬عند درجات االستبدال العالية ‪ ،‬ينخفض التألق اإلضافي الذي تم الحصول‬
‫عليه عن طريق الفلوروفور المضاف بشكل عام بسبب التبريد الذاتي (الشكل ‪)7‬‬

‫‪Sensibilité environnementale de la fluorescence‬‬

‫‪Les spectres de fluorescence et les rendements quantiques dépendent généralement‬‬


‫‪plus de l'environnement que les spectres d'absorption et les coefficients d'extinction.‬‬
‫‪Par exemple, le couplage d'un seul marqueur fluorescéine à une protéine réduit‬‬
‫‪généralement le QY de la fluorescéine d'environ 60% mais ne diminue sa CE que‬‬
‫‪d'environ 10%. Les interactions entre deux fluorophores adjacents ou entre un‬‬
‫‪fluorophore et d'autres espèces dans l'environnement environnant peuvent produire‬‬
‫‪une fluorescence sensible à l'environnement.‬‬

‫حساسية البيئية للوميض‬

‫تعتمد أطياف اإلسفار وعوائد الكم عمو ًما على البيئة أكثر من أطياف االمتصاص ومعامالت االنقراض‪ .‬على‬
‫سبيل المثال ‪ ،‬فإن اقتران ملصق فلوريسئين واحد ببروتين يقلل بشكل عام من ‪ QY‬للفلورسين بحوالي ‪٪60‬‬
‫ولكنه يقلل ‪ EC‬بنحو ‪ ٪ 10‬فقط‪ .‬يمكن للتفاعالت بين اثنين من الفلوروفور المتجاورين أو بين الفلوروفور‬
‫واألنواع األخرى في البيئة المحيطة أن تنتج تألقًا حسا ً‬
‫سا بيئيًا‬

‫‪Interactions fluorophore-fluorophore‬‬

‫‪La désactivation de fluorescence peut être définie comme un processus bimoléculaire‬‬


‫‪qui réduit le rendement quantique de fluorescence sans changer le spectre d'émission‬‬
‫‪de fluorescence (tableau 1); il peut résulter d'interactions transitoires à l'état excité‬‬
‫‪(extinction par collision) ou de la formation d'espèces à l'état fondamental non‬‬
‫‪fluorescent. L'auto-extinction est l'extinction d'un fluorophore par un autre; 34 il a‬‬
donc tendance à se produire lorsque des concentrations de charge ou des densités de
marquage élevées sont utilisées (Figure 7, Figure 8). Les substrats DQ ™ (section
10.4) sont des biopolymères fortement marqués et donc fortement trempés qui
présentent une amélioration spectaculaire de la fluorescence lors du clivage
enzymatique de 35 ans (figure 9).

Le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) (Fluorescence Resonance


Energy Transfer (FRET) - Note 1.2) est une interaction à l'état excité fortement
dépendant de la distance dans laquelle l'émission d'un fluorophore est couplée à
l'excitation d'un autre. Certains fluorophores excités interagissent pour former des
excimères, qui sont des dimères à l'état excité qui présentent des spectres d'émission
modifiés. La formation d'excimère par le pyrène hydrocarboné polyaromatique est
décrite dans la section 13.2 (figure 10).

Parce qu'ils dépendent tous de l'interaction des fluorophores adjacents, l'auto-


extinction, la formation de FRET et d'excimère peuvent être exploités pour surveiller
un large éventail de processus d'assemblage moléculaire ou de fragmentation tels que
la fusion membranaire (essais de changement de volume, fusion membranaire et
perméabilité membranaire — Remarque 14.3), hybridation d'acide nucléique, liaison
ligand-récepteur et hydrolyse polypeptidique.

‫تفاعالت الفلوروفور والفلوروفور‬

‫يمكن تعريف التبريد الفلوري بأنه عملية ثنائية الجزيئات تقلل من العائد الكمي للتألق دون تغيير طيف انبعاث‬
‫) ؛ يمكن أن ينتج عن تفاعالت عابرة في الحالة المثارة (اإلخماد بالتصادم) أو من تكوين‬1 ‫التألق (الجدول‬
.‫ االنقراض الذاتي هو انقراض أحد حاملي الفلور من قبل شخص آخر‬.‫األنواع في حالة األرض غير الفلورية‬
‫ الشكل‬، 7 ‫ لذلك تميل إلى الحدوث عند استخدام تركيزات عالية من مواد الحشو أو كثافات العالمات (الشكل‬34
‫) مصنفة بدرجة عالية وبالتالي البوليمرات الحيوية المروية بقوة والتي‬10.4 ‫ ™ (القسم‬DQ ‫ ركائز‬.)8
.)9 ‫ عا ًما (الشكل‬35 ‫تظهر تحسنًا كبي ًرا في التألق أثناء االنقسام األنزيمي لمدة‬

‫) هو تفاعل حالة متحمس يعتمد بشدة على المسافة التي‬1.2 ‫ المالحظة‬- )FRET( ‫نقل طاقة الرنين الفلوري‬
، excimers ‫ تتفاعل بعض الفلوروفورات المتحمسة لتشكيل‬.‫يقترن فيها انبعاث الفلوروفور بـ إثارة آخر‬
‫ تم وصف تكوين اإلكسيمر بواسطة‬.‫وهي ثنائيات في الحالة المثارة التي تعرض أطياف انبعاث متغيرة‬
.)10 ‫ (الشكل‬13.2 ‫الهيدروكربون متعدد الحلقات البيرين في القسم‬

‫ يمكن استغالل التبريد الذاتي وتشكيل الحنق‬، ‫نظ ًرا ألنهم يعتمدون جمي ًع ا على تفاعل الفلوروفورات المجاورة‬
.‫واإلكسيمر لمراقبة مجموعة واسعة من عمليات التجميع الجزيئي أو عمليات التجزئة مثل اندماج الغشاء‬
‫ ارتباط‬، ‫ تهجين الحمض النووي‬، )14.3 ‫ المالحظة‬- ‫ اندماج الغشاء ونفاذية الغشاء‬، ‫(فحوصات لتغيير الحجم‬
‫مستقبالت اللجند والتحلل المائي متعدد الببتيد‬

Figure 7 Comparaison de la
fluorescence relative en fonction du nombre de fluorophores attachés par protéine
pour les conjugués d'anticorps IgG anti-souris de chèvre préparés à l'aide de l'ester
succinimidylique d'acide carboxylique Oregon Green® 514 (O6139, j), acide
carboxylique Oregon Green® 488 suc l'ester de -cinimidyle (O6147, d), l'ester
succinimidylique de fluorescéine-5-EX (F6130, s) et l'isothiocyanate de fluorescéine
(FITC; F143, F1906, F1907; h). La fluorescence conjuguée est déterminée en
mesurant le rendement quantique de fluorescence du colorant conjugué par rapport à
celui du colorant libre et en multipliant par le nombre de fluorophores par protéine.

‫ مقارنة بين التألق النسبي كدالة لعدد الفلوروفورات المرتبطة لكل بروتين من أجل اتحادات األجسام‬7 ‫شكل‬
Oregon Green® 514 carboxylic acid ‫ المضادة للفأر الماعز المحضرة باستخدام‬IgG ‫المضادة‬
succinimidyl ester (O6139، j ) ، Oregon Green® 488 carboxylic acid juice
-cinimidyl ester (O6147، d)، fluorescein-5-EX succinimidyl ester (F6130، s)
‫ يتم تحديد‬.)‫ ؛ ح‬F143، F1906، F1907 ‫؛‬FITC ‫؛‬FITC( and fluorescein isothiocyanate
‫التألق المتقارن عن طريق قياس العائد الكمومي للوميض للصبغة المترافقة بالنسبة إلى الصبغة الحرة وضربه‬
.‫في عدد الفلوروفورات لكل بروتين‬
Figure 8 Comparaison de la fluorescence relative des conjugués d'anticorps IgG de
chèvre anti-souris de l'ester succinimidylique de Rhodamine Red ™ -X (R6160, d) et
du chlorure de sulfonyle de Lissamine rhodamine B (L20, L1908; s). La fluorescence
conjuguée est déterminée en mesurant le rendement quantique de fluorescence du
colorant conjugué par rapport à celui du colorant libre et en multipliant par le nombre
de fluorophores par protéine. Des nombres plus élevés de fluorophores attachés par
protéine peuvent être atteints avec le colorant Rhodamine Red ™ -X en raison de la
moindre tendance de ce colorant à induire la précipitation des protéines.

Rhodamine ‫ الماعز المضادة للفأر من‬IgG ‫ مقارنة بين مضان نسبي لمقترن األجسام المضادة‬8 ‫شكل‬
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl ‫ و‬Red ™ -X Succinimidyl Ester (R6160، d)
‫ يتم تحديد التألق المتقارن عن طريق قياس العائد الكمومي للوميض‬. )s ‫؛‬L20، L1908( Chloride
‫ يمكن تحقيق أعداد‬.‫للصبغة المترافقة بالنسبة إلى الصبغة الحرة وضربه في عدد الفلوروفورات لكل بروتين‬
‫ نظ ًرا‬Rhodamine Red ™ -X ‫أكبر من مركبات الفلوروفور المرتبطة بالبروتين باستخدام صبغة‬
‫النخفاض ميل هذه الصبغة للحث على ترسيب البروتين‬
Figure 9 Principe de la détection enzymatique via la perturbation de l'auto-extinction
intramoléculaire. L'hy-drolyse catalysée par une enzyme des substrats fortement
marqués et presque totalement désactivés fournis dans les kits de test EnzChek®
soulage l'auto-extinction intramoléculaire, produisant des produits de réaction
brillamment fluorescents.

‫ إن التحلل المائي المحفز‬.‫ مبدأ الكشف األنزيمي عن طريق اضطراب االنقراض الذاتي داخل الجزيء‬9 ‫شكل‬
®EnzChek ‫باإلنزيم للركائز ذات العالمات الشديدة والمعطلة بالكامل تقريبًا المتوفرة في مجموعات اختبار‬
.‫ مما ينتج عنه منتجات تفاعل فلورية زاهية‬، ‫يخفف االنقراض الذاتي داخل الجزيء‬

Figure 10 Formation d'excimère par pyrène dans l'éthanol. Les spectres sont
normalisés au pic de 371,5 nm du monomère. Tous les spectres sont essentiellement
identiques en dessous de 400 nm après normalisation. Les spectres sont les suivants:
1) pyrène 2 mM, purgé avec de l'argon pour éliminer l'oxygène; 2) pyrène 2 mM,
équilibré à l'air

0,5 mM de pyrène (purgé à l'argon); et 4) 2 µM de pyrène (argon-

purgé). Le rapport monomère sur excimère (371,5 / 470 nm) dépend à la fois de la
concentration en pyrène et de la durée de vie à l'état excité, qui est variable en raison
de la trempe par l'oxygène.
‫شكل ‪ 10‬تشكيل اإلكسيمر بالبيرين في اإليثانول‪ .‬يتم تطبيع األطياف إلى ذروة ‪ 371.5‬نانومتر للمونومر‪ .‬جميع‬
‫األطياف متطابقة بشكل أساسي أقل من ‪ 400‬نانومتر بعد التطبيع‪ .‬األطياف هي كما يلي‪ 2 )1 :‬ملي بيرين ‪،‬‬
‫تطهير باألرجون إلزالة األكسجين ؛ ‪ 2 )2‬ملي بيرين ‪ ،‬هواء متوازن‬

‫‪ 0.5‬ملي بيرين (تطهير باألرجون) ؛ و ‪ 2 )4‬ميكرومتر بيرين (أرجون‪-‬‬

‫تطهير)‪ .‬تعتمد نسبة المونومر إلى اإلكسيمر (‪ 470 / 371.5‬نانومتر) على كل من تركيز البيرين وحياة الحالة‬
‫المثارة ‪ ،‬والتي تكون متغيرة بسبب التبريد باألكسجين‬

‫‪Figure 11 Spectres d'émission de fluorescence de l'adduit 2-mercaptoéthanol de‬‬


‫‪badan (B6057) dans: 1) le toluène, 2) le chloroforme, l'acétonitrile, 4) l'éthanol, 5) le‬‬
‫‪méthanol et 6) l'eau. Chaque solution contient la même concentration d'adduit.‬‬
‫‪L'excitation de tous les échantillons est à 380 nm.‬‬

‫شكل ‪ 11‬أطياف انبعاث اإلسفار لعقار ‪-2‬مركابتوإيثانول من بادان (‪ )B6057‬في‪ )1 :‬التولوين ‪)2 ،‬‬
‫الكلوروفورم ‪ ،‬األسيتونيتريل ‪ )4 ،‬اإليثانول ‪ )5 ،‬الميثانول و ‪ )6‬لتر 'ماء‪ .‬يحتوي كل محلول على نفس تركيز‬
‫المقربة‪ .‬اإلثارة لجميع العينات عند ‪ 380‬نانومتر‪.‬‬

‫‪Autres facteurs environnementaux‬‬

‫‪De nombreux autres facteurs environnementaux exercent une influence sur les‬‬
‫‪propriétés de fluorescence. Les trois plus courants sont:‬‬

‫‪Polarité du solvant (le solvant dans ce contexte comprend les régions intérieures des‬‬
‫)‪cellules, des protéines, des membranes et d'autres structures biomoléculaires‬‬
Proximité et concentrations des espèces d'extinction

pH du milieu aqueux

Les spectres de fluorescence peuvent dépendre fortement du solvant. Cette


caractéristique est le plus souvent observée avec les fluorophores qui ont de grands
moments dipolaires à l'état excité, ce qui entraîne des décalages spectraux de
fluorescence vers des longueurs d'onde plus longues dans les solvants polaires. Les
fluorophores représentatifs comprennent les aminonaphtalènes tels que le prolan, le
badan (figure 11) et le dansyl, qui sont des sondes efficaces de polarité
environnementale dans, par exemple, l'intérieur d'une protéine.

La liaison d'une sonde à sa cible peut affecter considérablement son rendement


quantique de fluorescence (Surveillance des processus de pliage des protéines avec
des colorants sensibles à l'environnement - Note 9.1). Les sondes qui ont un
rendement quantique de fluorescence élevé lorsqu'elles sont liées à une cible
particulière mais qui sont par ailleurs effectivement non fluorescentes produisent des
signaux de fond de réactif extrêmement faibles. Les colorants d'acide nucléique
ultrasensibles SYBR®, SYTO®, PicoGreen®, RiboGreen® et OliGreen® (chapitre
8) sont des exemples parfaits de cette stratégie. De même, les substrats enzymatiques
fluorogéniques, qui ne sont pas fluorescents ou n'ont qu'une émission de courte
longueur d'onde jusqu'à ce qu'ils soient convertis en produits fluorescents par clivage
enzymatique, permettent une détection sensible de l'activité enzymatique (chapitre
10).

Les extincteurs extrinsèques, dont les plus omniprésents sont les espèces
paramagnétiques telles que l'O2 et les atomes lourds tels que l'iodure, réduisent les
rendements quantiques de fluorescence d'une manière dépendante de la concentration.
Si l'extinction est causée par des interactions collisionnelles, comme c'est
généralement le cas, des informations sur la proximité du fluorophore et de
l'extincteur et leur vitesse de diffusion mutuelle peuvent être dérivées. Cet effet
d'extinction a été utilisé de manière productive pour mesurer le flux d'ions chlorure
dans les cellules (section 21.2). De nombreux fluorophores sont également désactivés
par des protéines. Des exemples sont les colorants NBD, fluorescéine et BODIPY®,
‫‪dans lesquels l'effet est apparemment dû à des interactions de transfert de charge avec‬‬
‫‪des résidus d'acides aminés aromatiques.37,38 Par conséquent, les anticorps dirigés‬‬
‫‪contre ces fluorophores sont des agents d'extinction de fluorescence efficaces et‬‬
‫‪hautement spécifiques 38 (Section 7.4).‬‬

‫‪Les fluorophores tels que le BCECF et le carboxy SNARF®-1 qui ont des‬‬
‫‪caractéristiques d'absorption et de fluorescence fortement dépendantes du pH peuvent‬‬
‫‪être utilisés comme indicateurs de pH physiologiques. La fluorescéine et les‬‬
‫‪hydroxycoumarines (ombelliférones) sont d'autres exemples de ce type de‬‬
‫‪fluorophore. Structurellement, la sensibilité au pH est due à une reconfiguration du‬‬
‫‪système d'électrons π du fluorophore qui se produit lors de la protonation. Les‬‬
‫‪fluorophores BODIPY® FL et Alexa Fluor® 488, tous deux dépourvus de‬‬
‫‪substituants proto lytiquement ionisables, offrent des alternatives spectralement‬‬
‫‪équivalentes à la fluorescéine pour les applications nécessitant une sonde insensible‬‬
‫‪au pH (section 1.3, section 1.4).‬‬

‫عوامل بيئية أخرى‬

‫تؤثر العديد من العوامل البيئية األخرى على خصائص التألق‪ .‬الثالثة األكثر شيوعًا هي‪:‬‬

‫قطبية المذيب (يشمل المذيب في هذا السياق المناطق الداخلية للخاليا والبروتينات واألغشية والتركيبات‬
‫الجزيئية الحيوية األخرى)‬

‫القرب من األنواع المنقرضة وتركيزاتها‬

‫الرقم الهيدروجيني للوسط المائي‬

‫يمكن أن تكون أطياف اإلسفار شديدة االعتماد على المذيبات‪ .‬غالبًا ما تُالحظ هذه الخاصية مع الفلوروفورات‬
‫التي لها لحظات ثنائية القطب كبيرة في الحالة المثارة ‪ ،‬مما يؤدي إلى تحوالت طيفية مضان إلى أطوال موجية‬
‫أطول في المذيبات القطبية‪ .‬تشتمل الفلوروفورات التمثيلية على ‪ aminonaphthalenes‬مثل ‪Prolan‬‬
‫و ‪( badan‬الشكل ‪ )11‬و ‪ ، dansyl‬وهي تحقيقات فعالة للقطبية البيئية في ‪ ،‬على سبيل المثال ‪ ،‬الجزء‬
‫الداخلي من البروتين‬

‫يمكن أن يؤثر ربط المسبار بهدفه بشكل كبير على إنتاجيته الكمومية الفلورية (مراقبة عمليات طي البروتين‬
‫باستخدام األصباغ الحساسة بيئيًا ‪ -‬المالحظة ‪ .)9.1‬المجسات التي لها عائد كمي عالي الفلورة عند ربطها‬
‫بهدف معين ولكنها غير الفلورية بشكل فعال تنتج إشارات خلفية كاشف منخفضة للغاية‪ .‬تعد أصباغ‬
‫‪ ®SYBR‬و ‪ ®SYTO‬و ‪ ®PicoGreen‬و ‪ ®RiboGreen‬و ‪ ®OliGreen‬عالية الحساسية (الفصل‬
‫‪ ) 8‬أمثلة رئيسية على هذه االستراتيجية‪ .‬وبالمثل ‪ ،‬فإن ركائز اإلنزيم الفلوروجينيك ‪ ،‬التي ليست فلورية أو لها‬
‫فقط انبعاث موجي قصير حتى يتم تحويلها إلى منتجات فلورية عن طريق االنقسام األنزيمي ‪ ،‬تسمح بالكشف‬
‫الحساس عن النشاط األنزيمي (الفصل ‪.)10‬‬
‫تقلل عمليات التبريد الخارجية ‪ ،‬األكثر انتشا ًرا في كل مكان من األنواع شبه المغناطيسية مثل ‪ O2‬والذرات‬
‫ناتجا عن تفاعالت‬
‫الثقيلة مثل اليوديد ‪ ،‬من عوائد الكم الفلورية بطريقة تعتمد على التركيز‪ .‬إذا كان التبريد ً‬
‫تصادمية ‪ ،‬كما هو الحال عادةً ‪ ،‬فيمكن استخالص معلومات حول قرب الفلوروفور والمخمد ومعدل انتشارهما‬
‫المتبادل‪ .‬تم استخدام تأثير التبريد هذا بشكل منتج لقياس تدفق أيونات الكلوريد في الخاليا (القسم ‪ .)21.2‬يتم‬
‫ض ا تعطيل العديد من الفلوروفورات بواسطة البروتينات‪ .‬ومن األمثلة على ذلك أصباغ ‪ NBD‬و‬
‫أي ً‬
‫‪ fluorescein‬و ‪ ، ®BODIPY‬حيث يرجع التأثير على ما يبدو إلى تفاعالت نقل الشحنة مع بقايا األحماض‬
‫األمينية العطرية ‪ 37،38.‬لذلك ‪ ،‬فإن األجسام المضادة لهذه الفلوروفورات هي تقطير مضان فعال وعالي‬
‫التحديد ‪( 38‬القسم ‪.)7.4‬‬

‫يمكن استخدام الفلوروفورات مثل كربوكسي ‪ BCECF‬و ‪ SNARF®-1‬والتي تتميز بخصائص امتصاص‬
‫قوية تعتمد على األس الهيدروجيني وخصائص مضان كمؤشرات فسيولوجية لدرجة الحموضة الفلورسين‬
‫والهيدروكسي كومارين (أومبيليفيرونيس) هي أمثلة أخرى لهذا النوع من الفلوروفور‪ .‬من الناحية الهيكلية ‪،‬‬
‫ترجع الحساسية تجاه األس الهيدروجيني إلى إعادة تكوين نظام اإللكترون ‪ π‬للفلوروفور الذي يحدث أثناء‬
‫البروتون‪ BODIPY® FL .‬و ‪ ، Alexa Fluor® 488 fluorophores‬كالهما خاليان من البدائل‬
‫المؤينة بروتوليتي ‪ ،‬يقدمان بدائل مكافئة طيفيًا للفلورسين للتطبيقات التي تتطلب مسبا ًرا غير حساس لألس‬

‫الهيدروجيني (القسم ‪ ، 1.3‬القسم ‪1.4‬‬

‫‪https://fr.wikipedia.org/wiki/Microanalyse‬‬

‫‪Microanalyse‬‬

‫‪La microanalyse est l'identification chimique et l'analyse quantitative de petites‬‬


‫‪quantités de matière. L'un de ses pionniers fut l'Autrichien Fritz Pregl, lauréat‬‬
‫‪d'un prix Nobel de chimie pour ses contributions à ce domaine1.‬‬

‫]‪Techniques[modifier | modifier le code‬‬

‫‪Les techniques les plus connues utilisées en microanalyse comprennent :‬‬

‫‪la plupart des techniques spectroscopiques telles que la spectroscopie ultraviolet-‬‬


‫‪visible, la spectroscopie infrarouge, la résonance magnétique nucléaire,‬‬
‫;‪la spectroscopie de rayons X à dispersion d’énergie et la spectrométrie de masse ‬‬

‫‪la plupart des techniques chromatographiques telles que la chromatographie en phase‬‬


‫;‪liquide à haute performance et la chromatographie d'exclusion stérique ‬‬
quelques techniques d'analyse thermique telles que la calorimétrie différentielle à
balayage et l'analyse thermogravimétrique ;

l'électrophorèse ;

le fractionnement par couplage flux-force ;

la diffraction des rayons X ;

l'analyse par combustion.

Avantages[modifier | modifier le code]

Par rapport aux autres techniques d'analyses, la microanalyse nécessite moins :

de temps pour la préparation ;

d'échantillon et de solvant et produit ainsi moins de déchets et est plus rentable.

Inconvénients[modifier | modifier le code]

Par rapport aux autres techniques d'analyses, la microanalyse nécessite :

la manipulation de petites quantités, ce qui n'est pas toujours simple ;

une plus grande précision de pesée en utilisant par exemple une balance précise.

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