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INTRODUCCIÓN
Salto de sección (Continua)
Una planta que se ha originado in vitro, difiere en muchos aspectos de las que se
forman in vivo (PIERIK, 1990), ya que sus condiciones tanto ambientales como del
sustrato, la luz, nutrición, son muy diferentes. Además es importante señalar que el
crecimiento in vitro es heterótrofo e in vivo autótrofo.
El ambiente in vitro, con una alta humedad relativa, bajo o nulo intercambio
gaseoso, escasez de CO2 durante casi todo el período, producción de etileno y baja
densidad fotosintética, induce perturbaciones en las plantas desarrolladas bajo esa
condición. Después de transferir las plantas al ambiente ex vitro, las plantas tienen
que corregir todas esas anormalidades para aclimatizarse al nuevo ambiente, ya
sea en invernadero o campo (KADLECEK et al., 2001). Por otra parte, la anatomía
de la hoja es influenciada por la luz y la humedad, diferenciándose anatómicamente
de las originadas in vivo (BRAINERD et al., 1981).
Existen varios informes que detallan las etapas in vitro de las vides, pero se ha dado
una escasa atención a la etapa de la aclimatación. Comparado con otras especies
leñosas, la sobrevivencia de las vides micropropagadas es relativamente baja
(THOMAS, 1998).
Objetivos:
El término cultivo in vitro se aplica a todo cultivo bajo cristal en medio aséptico, pero
incluye diversas técnicas cuyos métodos y fines son muy diferentes. La técnica
general consiste en tomar un fragmento de tejido vegetal, colocarlo en un medio
nutritivo y provocar (gracias a un equilibrio adecuado de los elementos del medio)
directamente o tras manipulación el desarrollo de una plántula. El conjunto de estas
operaciones se desarrolla en condiciones estériles y se seguirá por una
aclimatación en medio tradicional (BOUTHERIN y BRON, 1994).
2.2. Micropropagación:
Por su parte, BOUTHERIN y BRON (1994), señalan otras ventajas como mejorar la
selección, ya que a partir de un individuo notable, se puede comercializar
rápidamente un clon interesante, garantía de homogeneidad, además limita o
suprime los pies madre y por consiguiente libera superficies de invernadero y
permite la programación de cultivos a lo largo de todo el año, o la producción en
períodos muy precisos, sin que el número de pies madre o su estado por reposo
vegetativo tengan influencia y por último, la formación de un “banco de genes” que
podrán conservar especies o cultivares que ofrezcan un interés agronómico,
hortícola, industrial, ecológico, etc.
2.3.1. Establecimiento
Con respecto al cerezo, MUNA et al. (1999), DAL ZOTTO y DOCAMPO (1997),
MILLER et al. (1982) y SNIR (1982), y utilizaron ápices de yemas obteniendo muy
buenos resultados en el establecimiento y las fases sucesivas de la propagación in
vitro de cerezos. Por otro lado DRADI, VITO y STANDARDI (1996) usaron
segmentos nodales que se comportaron satisfactoriamente.
2.3.2. Proliferación
2.3.3. Enraizamiento
PIERIK (1990) indica que un desarrollo pobre del sistema radical hace que el
crecimiento in vivo se haga muy difícil, especialmente cuando hay una elevada
transpiración. Es de vital importancia que las plantas in vitro pierdan la menor
cantidad de agua posible, cuando pasan a condiciones in vivo.
El suministro de agua también podría estar limitado desde que estudios histológicos
han demostrado una anatomía anormal de la raíz en plantas crecidas in vitro (FILA
et al., 1998).
2.4. Aclimatización:
Los frascos, tubos de ensayo y matraces necesitan ser cerrados para impedir su
deshidratación e infección, pero por otro lado, tiene que ser posible el intercambio
gaseoso con el exterior, para evitar una falta de oxígeno o el exceso de gases
producidos como el CO2 y el etileno (PIERIK, 1990). ZOBAYED, ARMSTRONG y
ARMSTRONG (2001) explican que la principal característica del ambiente gaseoso
in vitro, en un sistema convencional de cultivo de tejido es la alta humedad relativa,
gran fluctuación diurna de la concentración de CO2 y la acumulación de etileno y de
otras sustancias tóxicas, esto debido al restringido intercambio aéreo entre el tubo
de cultivo y el ambiente.
Por otra parte, PIERIK (1990) señala que las hojas de una planta producida in vitro,
son frecuentemente finas, blandas y fotosintéticamente poco activas, además tienen
las células en empalizada que son las que deben utilizar la luz, más pequeñas y en
menor cantidad. Indica además que los estomas pueden no ser suficientemente
operativos, y permanecer abiertos al trasplantarse al suelo, originando un importante
estrés hídrico en las primeras horas de aclimatación.
FILA et al. (1998) señalan que la aclimatación puede ser mejorada modificando el
microambiente durante el desarrollo in vitro, por ejemplo reduciendo la humedad
relativa que causa un endurecimiento de la planta, mejorando los resultados durante
el trasplante. También con el aumento de la tasa de CO2 en los tubos de cultivo o
aumentando las intensidades de luz, para producir el establecimiento autotrófico in
vitro.
Por su parte RITCHIE, SHORT y DAVEY (1991) indican que las plantas
micropropagadas son cultivadas bajo altos niveles de humedad relativa, causando
anormalidades morfológicas, particularmente en el estoma y la cutícula, produciendo
un alto porcentaje de mortalidad en la transferencia al invernadero.
Los factores limitantes para la fotosíntesis de plantas cultivadas in vitro, son la baja
concentración de CO2 en la atmósfera del tubo de cultivo y la baja intensidad de luz.
El aumento simultáneo de estos factores generalmente hace posible mejorar la
actividad de la fotosíntesis in vitro. Sin embargo, las investigaciones de este tipo
para vides, no son muy abundantes. La tasa de fotosíntesis aumenta con la
intensidad de la luz, pero hay variantes entre cultivares, es así como bajo varias
intensidades de luz la fotosíntesis es baja en Riesling italiana, comparada con
Dimiat. (SLAVTCHEVA y DIMITROVA, 2000).
La captación de CO2 neto por parte de las plantas in vitro, es pequeña debido a la
baja tasa de éste dentro del tubo de crecimiento. Es más, los azúcares que se
suplementan al medio de crecimiento pueden causar una inhibición extensa de la
fotosíntesis. Al aumentar la tasa de CO2 y/o las intensidades de iluminación en el
tubo de cultivo, se produce un establecimiento autotrófico en las plantas in vitro. Sin
embargo estas técnicas son de poco uso comercial debido a su alto costo (FILA et
al., 1998).
2.4.1.2. Cutícula
2.4.1.3. Estomas
2.4.1.4. Raíces
Con la ventilación se reduce la humedad relativa dentro del vaso, pero también la
acumulación de gases como CO2 y etileno.
MURPHY et al. (1998) demostraron que con la inclusión de aperturas en los tubos
de cultivo, redujeron la frecuencia estomática y la apertura del estoma en
Delphinium. Se estableció un beneficio positivo de la ventilación en el crecimiento
de esta especie, pero es claramente importante determinar si el factor crítico es el
aumento en el movimiento del agua a través de la planta, o si es la reducción en la
concentración de algún componente gaseoso por debajo de una concentración de
estrés.
Los ensayos se realizaron entre agosto del 2003 y agosto del 2004, en el
Laboratorio de Propagación “Profesor Gregorio Rosenberg” de la Facultad de
Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, ubicada en la calle
San Francisco s/n, La Palma, Provincia de Quillota, V región.
El material utilizado correspondió a brotes de vid (Vitis vinifera L.), de los que se
extrajo segmentos nodales de la región apical y media obtenidas en febrero del
2004, desarrolladas al aire libre en la Estación Experimental ubicada en La Palma,
Quillota.
En este ensayo se evaluaron el uso de tres sellos para el cierre de los frascos de
cultivo, para reducir la humedad relativa al interior de éstos.
Altura de la planta, diámetro de la planta, número de hojas con una lámina superior
a 8 mm, número total de hojas (n), color de hojas, altura del medio de cultivo (mm)
para determinar su agotamiento, vitrificación, y porcentaje de enraizamiento, se
consideró raíz aquella que presentara como mínimo 3 mm de largo.
Para la evaluación del color del explante en vid, se utilizó la tabla Munsell
(MUNSELL, 1998), asignando un número a cada color de explante:
Para evaluar el grado de vitrificación, fue utilizada una escala, asignando una
calificación a cada estado del explante:
Para el trasplante se utilizó como contenedores, vasos de plumavit de 230 ml, los
cuales fueron lavados y asperjados con una solución de hipoclorito de sodio a 1%.
En la base de estos contenedores se realizó cuatro perforaciones, para con ello
favorecer el drenaje. Posteriormente, se procedió a llenar los contenedores a dos
tercios de su capacidad con una mezcla de sustrato, previamente esterilizado en
autoclave durante 1 hora con 1,1 bar de presión y 121 ºC. El sustrato correspondió a
40% de tierra de hoja, 14% de tierra y 46% de arena.
6. Montaje en un portaobjeto.
8. Observación al microscopio.
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esto concuerda con CASSELS y ROCHE (1994) y JACKSON et al. (1991), ya que
bajo condiciones de ventilación en los tubos de cultivo, no obtuvieron un aumento en
el crecimiento en S. tuberosum, Rosa, Dianthus sp, Gerbera y Ficus. Por su parte
WARDLE, DOBBS y SHORT (1983) señalan que las plantas de Brassica oleracea,
cultivadas en tubos ventilados, mostraron un reducido crecimiento. Además, SHORT
y ROBERTS (1987) indican que al reducir la humedad relativa en tubos ventilados
en plantas micropropagadas de crisantemo, se redujo notoriamente el crecimiento
de las plantas.
Esto no concuerda con lo señalado por COURNAC et al. (1991) y BLAZCOVÁ et al.
(1989), y que demostraron el aumento del crecimiento de las plantas, como
resultado de la mejora de la ventilación dentro de los vasos de cultivo en
Chenopodium rubrum y Solanum tuberosum.
CUADRO 1. Efecto de las cubiertas, sobre la altura de las plantas (mm) in vitro de
vid, a los cinco días de enraizamiento in vitro.
CUADRO 2. Efecto de las cubiertas, sobre la altura de las plantas (mm) in vitro de
cerezo Gisela 5, a los cinco y 10 días de enraizamiento in vitro.
CUADRO 4. Efecto de las cubiertas, sobre el diámetro (mm) de las plantas in vitro
de cerezo Gisela 5, a los cinco y 10 días de enraizamiento in vitro.
El análisis de varianza en vid, realizado a los cinco días de enraizamiento para las
variables número de hojas con una lámina superior a 8 mm y número total de hojas,
determinó que no existe diferencia significativa entre los tratamientos (CUADRO 5).
Por su parte SANTAMARÍA et al. (2000), señalan que en Delphinium se obtuvo una
menor área foliar en tubos con mayor ventilación. Por el contrario RITCHIE, SHORT
y DAVEY (1991), demostraron que en tubos de cultivo ventilados, se promovió un
incremento en el número de hojas y en la superficie foliar de plantas crecidas in
vitro. Esto coincide con SMITH (1991), quién indicó que al disminuir la humedad
relativa al interior del tubo de cultivo, observó una disminución en la longitud del
tallo, y un aumento en el área de la hoja en crisantemo, rosa y vid.
CUADRO 5. Efecto de las cubiertas, sobre el número de hojas con una lámina
superior a 8 mm, y número total de hojas, en las plantas in vitro de
vid, a los cinco días de enraizamiento in vitro.
Día 5
N° hojas con lámina
Tratamiento N° total de hojas
superior a 8 mm
T0 Control 2,7 a* 4,4 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno 3,05 a 4,15 a
T2 Cubierta con papel filtro 2,2 a 3,35 a
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
CUADRO 6. Efecto de las cubiertas, sobre el número de hojas con una lámina
superior a 8 mm, y número total de hojas, en las plantas in vitro de
cerezo Gisela 5, a los cinco y 10 días de enraizamiento in vitro.
Día 5 Día 10
N° hojas con N° hojas con
lámina N° total de lámina N° total de
Tratamiento
superior a 8 hojas superior a 8 hojas
mm mm
T0 Control 9,17 a* 9,97 a* 9,33 a* 9,97 a*
T1 Cubierta con sello de
9,53 a 10,63 a 9,63 a 10,93 a
polipropileno
T2 Cubierta con papel filtro 8,0 a 9,67 a 7,97 a 9,53 a
* Promedios con letras iguales, indican que no existe diferencia significativa entre
los tratamientos, según Test de Tukey (P=0,05).
El test de Tukey (P=0,05), realizado para la variable altura del medio de cultivo, en
vid a los cinco días de enraizamiento, demostró que existen diferencias significativas
entre los tratamientos. En el CUADRO 7, se puede observar que el mayor
agotamiento ocurrió en los tubos con mayor ventilación, en los tratamientos con
cubierta con sello de polipropileno y con cubierta de papel filtro.
CUADRO 7. Efecto de las cubiertas, sobre la altura del medio de cultivo (mm), en
las plantas in vitro de vid, a los cinco días de enraizamiento in vitro.
CUADRO 8. Efecto de las cubiertas, sobre la altura del medio de cultivo (mm), en
las plantas in vitro de cerezo Gisela 5, en el día cinco y 10 de
enraizamiento in vitro.
MURPHY et al. (1998) observaron que la pérdida de peso del medio, se debía a la
ganancia en peso de la planta, y a la evapotranspiración, pero en tubos más
ventilados, la ganancia en peso por parte de la planta era reducida y la pérdida en
peso del medio era casi cinco veces mayor, que en tubos sellados con papel
aluminio.
La variable color, a los cinco días de enraizamiento en vid, al ser analizada con el
test no paramétrico de Kruskal-Wallis (P=0,05) demostró diferencias estadísticas
significativas. El número asignado a cada color de explante correspondió a 1: 7,5
GY 4/4 (color verde oscuro), 2: 7,5 GY 5/8 (color verde característico de la especie),
3: 5 GY 7/10 (color verde amarillo), y 4: 5 GY 8/6 (color amarillo café). En el
tratamiento control, las plantas presentaron el color verde característico de la
especie (7,5 GY 5/8), según la tabla MUNSELL (1998), representado por el valor
2,45. Los otros tratamientos presentaron un color verde amarillo (5 GY 7/10), muy
cercano al amarillo café (5 Y 8/6), representados por el valor 3,7 en el tratamiento
con cubierta de sello de polipropileno y 3.95 en las plantas con cubierta de papel
filtro, debido a que estas plantas se vieron fuertemente estresadas por el cambio en
la ventilación de los frascos (CUADRO 10).
CUADRO 10. Efecto de las cubiertas sobre el color, en las plantas in vitro de vid, en
el día cinco de enraizamiento in vitro.
CUADRO 11. Efecto de las cubiertas sobre el color, en las plantas in vitro de cerezo
Gisela 5, en el día cinco y 10 de enraizamiento in vitro.
Sobrevivencia (%)
Enraizamiento (%)
Tratamiento (21 días después de
a los 5 días
aclimatización en sustrato)
T0 Control 45 a* 25 a*
T1 Cubierta con sello de polipropileno 15 b 10 a
T2 Cubierta con papel filtro 15 b 30 a
* Letras iguales indican que no existe diferencia significativa entre los tratamientos,
según Test de Comparación de Proporciones (P=0,05).
Se puede inferir de manera preliminar, que una planta enraizada in vitro, tendría un
mayor éxito ex vitro, ya que el mayor porcentaje de enraizamiento en cerezo influyó
positivamente en la mayor sobrevivencia de las plantas después de ser
trasplantadas a sustrato, a diferencia de vid, en que un bajo porcentaje de
enraizamiento, significó una baja sobrevivencia de las plantas.
CUADRO 13. Efecto de las cubiertas sobre el porcentaje de enraizamiento a los
cinco y 10 días, en las plantas de cerezo Gisela 5 in vitro, y la
sobrevivencia, a los 21 días después de la aclimatización en sustrato.
Sobrevivencia (%)
Enraizamiento Enraizamiento
(21 días después
Tratamiento a los 5 días a los 10 días
de aclimatización
(%) (%)
en sustrato)
Con respecto al número de hojas con una lámina mayor a 8 mm, y el número total
de hojas en plantas micropropagadas de cerezo, no se determinó diferencia
estadística significativa entre los tratamientos (CUADRO 16).
CUADRO 17. Efecto de los tratamientos en el color de cerezo Gisela 5, a los 21 días
de aclimatización en sustrato.
En los cortes histológicos obtenidos del material vegetal colectado y fijado en esta
condición, se pudo observar estomas abiertos, completamente desarrollados, pero
también se apreció una gran cantidad de estomas más pequeños y cerrados
(FIGURA 5). Esto pareciera contraponerse a lo propuesto por diversos autores, que
menciona que en la condición in vitro, los estomas de las hojas permanecen
abiertos, pero es claro que el estoma pasa por un período de formación o
maduración que finaliza con un estoma completamente desarrollado. Son WARDLE,
DOBBS y SHORT (1983) quienes proponen una categorización de estas etapas en:
a) aparición de la célula madre de las de guarda, b) célula madre dividida pero sin
poro evidente, c) formación evidente del poro y d) estoma completamente
desarrollado.
Siendo ésta la primera etapa de la propagación in vitro, era muy probable encontrar
estomas inmaduros en los cortes histológicos, siendo éstos los que se observaron
de menor tamaño y cerrados. Estos posteriormente se desarrollan y se mantienen
durante las etapas siguientes de la propagación.
Los estomas observados en los cortes histológicos, en las plantas de vid, en esta
etapa, muestran la misma condición que presentaba en proliferación, dado que se
encuentran en las mismas condiciones anteriormente descritas, es decir, estomas
completamente maduros y abiertos (FIGURA 5).
Por último, si bien es cierto que los programas de análisis de imágenes permiten,
luego de un ajuste de la escala realizar mediciones muy precisas, pudiendo
fácilmente entregar mediciones en micrones (µm), la gran variación entre los
tamaños y formas de los estomas, hacen que la precisión no sea útil para efectos de
análisis de una muestra fijada, sino que sería necesario hacer un seguimiento de
cómo van madurando y desarrollándose individualmente los estomas en el tiempo.
C D
E F
En el ensayo para ambas especies por igual, se realizó tres tratamientos, el primero
correspondiente al control con papel de aluminio, el segundo con sellos de
polipropileno en tres capas y el tercero con un sello de papel filtro Whatman 1 o
MFS N°2, posteriormente los frascos se sellaron por la parte lateral con vitafilm,
para afirmar las cubiertas.
As an explant, in the establishment stage, nodal segments were used, which were
later divided in the micropropagation stages. The preacclimation tests were carried
out during the in vitro rooting stage. As a rooting medium for the grapevine, an MS
(MURASHIGE and SKOOG, 1962) was used, with the salt NH4NO3 reduced to one
half strength and the rest of the salts reduced to three quarters of their original
strength, additional thyamine (0,4%), IAA (0,2 mg/l), NaH2PO4 (150 mg/l),
Myoinositol (25 mg/l), and sacarose (1%), all adjusted to a pH of 5,7 (MESA, 2001).
For cherry, the rooting medium was also made based on the MURASHIGE and
SKOOG (1962) salts, with a mineral concentration reduced by half and adding 1 mg/l
of IBA (CÁCERES, 2004).
For experiments on both species, there were 3 treatments: the first was a control,
with aluminium foil, the second used polypropylene seals, and the third one used
Whatman 1 or MFS Nº2 filter paper seals. Later on the jars were sealed, on the side,
with vitafilm, in order to secure the covers.
In both cases, there was no significant statistical difference on the plant survival after
application of the treatments.
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