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Université Cadi Ayyad

Faculté Poly Disciplinaire


Département de Chimie
Safi

Electrophorèse Capillaire

Filière : Sciences de la Matière Chimie


Module : Méthodes d’Analyses Chimiques
Semestre : VI

AU : 2019/2020

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Electrophorèse Capillaire

I. Généralités

1. Bases
L’électrophorèse capillaire est une technique de séparation d’un mélange complexe d’espèces
chimiques ionisables. Il repose sur les remarques suivantes :
• Séparation basée sur la migration différentielle des solutés sous l’influence d’un
champ électrique
• Séparation s’effectue dans des tubes de silice fondue de petit diamètre (25μm to 75 μm
id)
• Haut voltages (10 to 30 kV) et haut champs électriques (100 to 500 V/cm) sont
appliques aux extrémités du capillaire.
• Haute résistance du capillaire limite la génération de courant et l’effet Joule.
• Grande efficacité (N>105to 106) et rapidité d’analyse.
• Détection “en ligne” (pas de cellule externe).
• Petit volume d’injection (1 to 50 nL)
• Différents modes de séparation et application.
• Séparation en milieu aqueux
• Automatisation
Le schéma de principe de fonctionnement d’électrophorèse capillaire est représenté ci-
dessous :

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2. Support de séparation
Est la silice, sachant que :
• Matériel le plus utilisé pour les capillaires
• Tubes résistants (polyimide) et de petit diamètre
• Haute constante diélectrique (isolant)
• Haute transmission UV
• Faible fluorescence

3. Instrumentation
L’instrument d’électrophorèse capillaire utilisé est simple à mettre en œuvre :

4. Conversions des unités


1 joule (j) = 1 kg.m2/s2
1 centiPoise (cp) = 10-3 kg/m.s
1 psi = 6,8948.103 Pa
1 Coulomb (C) = 1j/V = 1 Kg.m2/s2.V

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II. Bases de l’Electrophorèse Capillaire
1. Vélocité

q est la charge électrique possédée par un ion i(C)


E est le champ électrique (V/m)
f est le coefficient de friction (cP m), pour un ion sphérique
η est la viscosité du milieu (cP)
v est la vitesse linéaire de la particule i (cm/s), dans un champ électrique
ri est le rayon hydrodynamique (ionique) de la particule i, (une forme sphérique) (m)

2. Mobilité ionique
On définit la vitesse d’un ion par l’expression suivante :

La mobilité électrophorétique d’un ion est défini par :

On déduit alors :

Remarque :
La mobilité électrophorétique, μep, et donc la vitesse électrophorétique, vep, dépend du milieu:
pH et composition du tampon (force ionique, viscosité, etc.).

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3. Séparation
Assigner les différents pics observés et justifier leurs positions relatives.

4. Electro-osmose
La silice fondue (SiO2, H2O) possède des groupements silanols ionisables lui conférant des
propriétés acides :

La silice fondue en contacte avec le tampon formera une double couche électrique à la paroi
du capillaire :

Que se passe-t-il suite à l’application du voltage ?

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La migration des cations solvatés de la couche diffuse occasionne un déplacement vers la
cathode, lequel est appelé électro-osmose.

Le potentiel zeta associé à la couche diffuse est obtenue à partir de l’équation de Helmholtz :

μeo est la mobilité électro-osmotique (m2V-1s-1)


ε est le constant diélectrique du milieu
ζ est le potentiel Zeta (quelques mV)
η est la viscosité du milieu (cP)

Donc la mobilité électro-osmotique, μeo, et la vitesse électro-osmotique, vep sont obtenu par :

5. Mesures de mobilité

Le mouvement d’un soluté chargé à travers le capillaire est la somme des deux phénomènes :
électrophorèse et électro-osmose.
On définit la vélocité apparente (vélocité totale) d’un soluté, vapp, et la mobilité apparente μapp
comme :

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6. Caractéristiques du débit électro-osmotique

Le débit électro-osmotique issu de la couche diffuse est uniforme et a un profile étroit


contrairement à celui associé aux systèmes utilisant une pression appliquée pour éluer les
analytes (HPLC). Le débit électro-osmotique ne cause pas un élargissement significatif de la
bande.

7. Ordre d’élution

L’ordre d’élution dépend :


• Vitesse électrophorétique
• Vitesse électro-osmotique
• Vitesse apparente
Des anions et des cations en solution

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8. Efficacité et plateau théorique

En chromatographie Liquide, la hauteur d’un plateau théorique s’exprime par :

En électrophorèse capillaire, l’électro-osmose ne cause pas d’élargissement significatif mais


affecte le temps auquel un ion prendra pour être détecté. Seule la diffusion longitudinale a un
impact important sur la diffusion des bandes.

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9. Résolution

On exprime la résolution de deux pics en électrophorèse capillaire par :

III. Facteurs affectant l’efficacité et sources de variance

La variance en général exprimée par l’expression suivante et dépend de plusieurs facteurs :

dif. : Diffusion longitudinale, limite fondamentale déterminée par le coefficient de diffusion


inj. : Longueur de la bande d’injection doit être moindre que la longueur associée à
la diffusion. Contrainte de sensibilité nécessite bien souvent un compromis.
temp. : Effet Joule et gradient de °T avec augmentation de V
ads. : Interaction de l’analyte avec la paroi du capillaire
det. : Détecteur être relativement petit p/r à la largeur de pic.
Δk : Différence de conductivité entre l’analyte et le tampon

1. Température

Considérons les données expérimentales suivantes :

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Les effets d’échauffement peuvent causer un gradient de température non-uniforme, un
changement local de viscosité, et une diffusion de l’analyte. L’augmentation de V peut avoir
des effets néfaste lorsque l’effet Joule (augmentation de °T suite au passage de courant
électrique celle-ci dépendant de la puissance = V.I).

2. Volume d’injection

Variance associée a l’injection :

Largeur de la bande d’injection; doit être < à la déviation standard associée à la diffusion

Δtmax: Largeur max. acceptable de la bande


eh: Accroissement acceptable de Hobs. Comparativement à Hmin (dif.seul.)

Le nombre de plateau varie significativement avec le volume d’injection. La variance associée


à la diffusion représente la limite minimale d’élargissement et Nmax. Celle-ci varie également
avec Dm. De façon pratique on limite la longueur de la bande d’injection à~ 1% de L.

3. Adsorption
La variance associée due l’adsorption à la surface du capillaire est exprimée par :

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k’: Facteur de capacité
veo: vélocité électro-osmotique
Dm: Coefficient de diffusion
Kd: Constante de dissociation
r : Rayon du capillaire

On remarque qu’une augmentation significative de σ2ads survient lorsque k’(tm-teo/teo)


augmente et ce même avec k’<1. La séparation de protéines avec CE peut devenir
problématique a cause de l’adsorption à la surface. Afin de limiter cette source
d’élargissement de pic on peut diminuer les charges effectives à la surface en augmentant la
force ionique, en diminuant le pH ou en modifiant la surface du capillaire.

4. Electro dispersion et différence de conductivité

La différence de conductivité, Δk entre la zone de l’analyte et celle du tampon avoisinant est


donnée par:

C : Concentration de l’analyte
F : Constante de Faraday
Μ : Mobilité de l’analyte
μB : Mobilité de l’ion de même charge que l’analyte
μC : Mobilité de l’ion de charge opposé à l’analyte
ke : Conductivité du tampon

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Pour un échantillon de faible conductivité, l’analyte entrera dans la région du tampon moins
rapidement car le champ électrique est plus faible. Pour un échantillon de grande conductivité,
l’analyte entrera dans la région du tampon plus rapidement car le champ électrique est plus
grand. Pour minimiser les effets de diffusion associes aux différences de conductivité on
ajuste le tampon pour avoir Δke/ke < 0.5%.

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