RAPPORT DE STAGE

Analyses microbiologique de la moule de la

Méditerranée marocaine
Réalisée par : Wiam ATMANI

Période de stage : du 21/07/2014 au 28/08/2014

Sous l’encadrement : Dr Mostafa LAYACHI : Chef du Laboratoire de Surveillance de la Salubrité du Littoral au

Centre Régional de l’INRH à Nador.

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 Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier particulièrement Monsieur

FARAJ Abdelmalak, Directeur général de l’INRH, qui m’a
autorisé à faire ce stage, et à remercier vivement Monsieur
MESFIOUI Abdelhakim, chef du Centre Régional de l’INRH à
Nador pour m’avoir accueillie au sein du centre.
Je réserve des remerciements particuliers à Monsieur Mostafa
LAYACHI, Chef du Laboratoire de Surveillance de la Salubrité
du Littoral au Centre Régional de l’INRH à Nador qui malgré son
emploi du temps chargé, a toujours été présent pour
m’accompagner au cours de mon stage avec ses conseils pertinents
et pour m’apporter les éclaircissements nécessaires dont j’avais
besoin tout au long de mon stage.
Je remercie aussi Monsieur YAHYA AZZAOUI, technicien
du laboratoire pour le temps qu’il a bien voulu me consacrer afin
d’apporter des réponses à toutes mes questions, et dont le savoir
pratique m’a permis d’approfondir et d’enrichir mes connaissances
du fonctionnement du matériel et ses conseils pertinents. Je
remercie aussi toute l’équipe scientifique du Laboratoire pour
l’accueil et l’encouragement.
Au terme de ce travail, nous tenons à exprimer notre gratitude
et nos remerciements pour toutes les personnes qui ont dirigé ce
travail et prodigué de nombreux et judicieux conseils, et qui ont
contribué à sa réalisation.

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 SOMMAIRE
I. Introduction 4
II. Présentation de l’Institut National de Recherche Halieutique 4
III. Centre Régional de Nador 5
IV. Déroulement de stage 8
1- Choix de la zone d’étude 8
a-classement des zones 9
2- Matériels utilisés 9
a-Matériels biologiques 9
b-Matériels de laboratoire 10
c-Produits chimiques 10
3- Protocole expérimentale 11
a-Diluant 11
b-Bouillon de glutamate : 1er milieu de culture 11
c-Gélose TBX : 2eme milieu de culture  11
4- Echantillonnage et prétraitement d’échantillon 12
a- Stratégie d’échantillonnage 12
b-Conditions d’échantillonnage 13
c-Mode opératoire 13
d-Préparation de la suspension mère 13
 Test présomptif 14
 Test confirmatif 15
V. Lecture des résultats 15
VI. Calcul du NPP
VII. Discussion 18
VIII. Conclusion 19
IX. Bibliographie 19
X. Annexes 20

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 I. Introduction.
Dans le but de préparer mon projet de fin de stage, le Centre Régional de l’Institut
National de la Recherche Halieutique à Nador m’a autorisé d’effectuer un stage de
quatre semaines et ce, du 21/07/2014 au 21/08/2014 au sein du Laboratoire de Surveillance
de la Salubrité du Littoral.
Les objectifs de mon stage sont comme suit :
 Le contact direct avec le monde professionnel et la découverte de l’univers de la
microbiologique marine.
 L’adaptation et l’intégration à l’équipe du LSSL qui donne l’opportunité de mieux
comprendre la notion de la communication, de la responsabilité, de l’assiduité et de la
hiérarchie.
 Se familiariser avec les appareils du laboratoire
 Faire connaissance des techniques utilisées lors des analyses microbiologique des
échantillons issus du milieu marine.

II. Présentation générale du de l’Institut National de Recherche Halieutique .

L’institut National de la recherche halieutique est un établissement public à caractère
scientifique et technique, doté de la personnalité morale et de l’autonomie financière
nécessaires à la réalisation des programmes de recherche par DAHIR de création n°96-98 du
29juillet 1996 et 1998 du conseil supérieur pour la sauvegarde et l’exploitation du
patrimoine.

Missions :

1- Etude du fonctionnement de l’écosystème marin littoral.

2- Surveillance de la qualité et de la salubrité du milieu marin.
3- Evaluation des ressources halieutiques et suivi de leur exploitation.
4- Essais des techniques de pêche
5- Evaluation des potentialités aquacoles et contribution au développement de
l’aquaculture.
6- Valorisation des produits de mer.

L’INRH mène ses recherches en plusieurs centres réparties sur tout le littoral
marocain et il est doté de :

Cinq centres régionaux: Tanger, Nador, Agadir, Laayoune et Dakhla.

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 Deux centres spécialisés : M’diq (Centre d’Aquaculture) et Agadir (Centre de
Valorisation et de Technologie des Produits de Mer).

Un réseau de surveillance de la salubrité du littoral est implanté sur toute la côte

marine marocaine à savoir : Dakhla, Laayoune,Agadir , Oualidia , Casablanca ,
Tanger/M’diq et Nador.

Figure 1 : Implantation de l’INRH le long du littoral marocain.

III. Centre Régional de l’INRH à Nador.

Le Centre Régional de l’Institut National de Recherche Halieutiques à Nador a été créé

en octobre 1998. Il  assure les programmes et les études de recherche halieutique au niveau
de la zone compétence de la côte méditerranéenne comprise entre Jebha et Saïdia.  

Photo 1: Façade du Centre Régional de l’INRH à Nador.

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 Figure 2 : Zone de compétence du Centre Régional de l’INRH à Nador.
Missions :

 Études sur la biologie et l’écologie des principales ressources exploitées ;

 Évaluation des principales ressources halieutiques de la région dans l’objectif d’élaborer des
plans de gestion des pêcheries en Méditerranée;
 Études socio-économiques  sur les activités de la pêche artisanale et côtière ;
 Surveillance de la salubrité et de la qualité du milieu marin ;
 Étude de fonctionnement des écosystèmes.

Ressources Humaines :
Le personnel du centre est composé d’un Chef de Centre, de seize agents, dont neuf
Chercheurs, d’un Administrateur /Régisseur, de trois Techniciens, d’un
Plongeur,d’uneSecrétaire et de 02 chauffeurs

e
Unité
Chef du Centre
Socioéconomiqu
biostatistiqu Unité
e
Secrétariat

Laboratoire des Laboratoire de Laboratoire

Ressources Surveillance de la d'Aquaculture et
Halieutiques Salubrité du Ressources
Littoral littorales

Figure 3 : Organisation du Centre Régional de l’INRH à Nador

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 Le Centre Régional de l’INRH à Nador est composé de trois laboratoires :
1- Laboratoire des Ressources Halieutiques
2- Laboratoire de Surveillance de la Salubrité du Littoral
3- Laboratoire d’Aquaculture et des Ressources Littoral

Le Laboratoire du Surveillance de la Salubrité du Littoral du Centre Régional de

l’INRH à Nador est composé de deux unités à savoir :

 Unité microbiologique chargé de suivre la salubrité des zones de production conchylicole

par les analyses microbiologiques.
 Unité de phytoplancton chargé de la surveillance des phytoplanctons toxiques.

Ce Laboratoire est chargé de réaliser trois missions principales et qui sont comme
suit :
a) Préservation de l’environnement marin ;
b) Protection du consommateur ;
c) Appui technique à la profession.

IV. Déroulement de stage :

Ce stage a donc été une opportunité pour moi de savoir comment faire des analyses
microbiologiques des échantillons de coquillage issue de la mer et aussi comment interpréter
les résultats des dites analyses.

L’élaboration de ce rapport a pour principale source les différents enseignements tirés

de la pratique journalière des tâches auxquelles j’étais affecté

1- Choix de la Zone d’étude.

La zone qui a fait l’objet de l’étude microbiologique est la zone conchylicole d’Al
Hoceima situé à 180 km de la ville de Nador.
Les zones de production conchylicoles sont classés en 4 catégories A,B,C et D par
ordre décroissant de salubrité.les critères d’évaluation de la qualité microbiologique et
chimique d’une zone de production conchylicole sont basés respectivement sur le
dénombrement des E. coli β-glucuronidase positive dans 100g de chair et de liquide
intervalvaire (C.L.I)(tableau. 1)et la contamination moyenne en mercure totale en cardium et
en plomb, exprimé en mg par kg de chair humide de coquillage (tableau 2)

a-classement des zones d’études :

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Tableau 1 : Estimation de la qualité microbiologique des zones de production de
mollusques bivalves en fonction des fréquences de dépassement des seuils de contamination
fixés par la circulation n°1508/12 du 15/08/12.

Nombre d’E. coli β-glucuronidase positive dans /100g

Classes C.L.I
230 4600 46000
A < 0%
B < 0%
C < 0%
D >

Tableau 2 : Evaluation du niveau moyen de contamination chimique des zones de production

de coquillages en fonction des seuils fixé par le circulaire n° 1508/12 du 15/08/2.

Contamination chimique mg/kg chaire humide

Mercure Cadmium Plomb
Catégorie
0.5 1 1.5
A.B.C ≤ ≤ ≤
D > > >

2- Matériels utilisés :
a- Matériels biologiques 

Le matériel biologique utilisé est la moule qui est un mollusque bivalve très répandu,
de la famille des Mytilidés. C'est un animal marin, qui vit fixé aux rochers dans la zone de
balancement des marées.

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 Photo 2 : Photo de la Mytilus edulis (moule)

Tableau 3 : Classification des moules

Règne Animalia
Embranchment Mollusca
Classe Bivalvia
Sous-classe Pteriomorphia
Ordre Mytiloida
Famille Mytilidae

b-Matériels de laboratoire (voir annexe3)

c-produits chimiques (voir annexe2)

3- Protocole expérimentale :
Préparation des bouillons et du diluant. 
a- Le Diluant :
mettre en solution 1g de tryptone + 8,5g de NaCl dans 1 litre d’eau distillée 
agiter lentement jusqu’à dissolution complète
Mesurer le pH, il faut qu’il soit de 7,0 ± 0,2.
Répartir en tubes et en flacons.
Stérilisation à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.

b- Bouillon de glutamate : 1er milieu de culture

 Dissoudre les composants du bouillon glutamate dans 1 litre d’eau distillée en
chauffant et en agitant jusqu’à dissolution complète.
 Répartir les milieux par quantités de 10 ml dans des tubes des grands tubes dans le
cas du milieu double concentration, alors que dans des petits tubes de dans le cas du
milieu de simple concentration.
 Stériliser à l’autoclave à 115 °C pendant 15 mn.

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c- Gélose TBX : deuxième milieu de culture
 Dissoudre le milieu complet déshydraté dans 1 litre d’eau distillée et porter à
ébullition jusqu’à dissolution complète.
 Stériliser le milieu à l’autoclave à 121°C pendant 15 mn.
 Verser autour d’un bec Bunsen, dans des boîtes de Pétri stériles de 12 ml à 15 ml du
milieu fondu, et laisser se solidifier.
-Le diluant et les milieux de culture ont une durée et température de conservation
déterminées (voir tableau 4).
Tableau 4: condition du stockage des milieux de culture.

Durée de
Température de
Milieu de culture conditionnement conservation
conservation
à titre indicatif
Bouillon Tubes 6 mois 2 à 8 °c
glutamate
Eau peptonée Tubes ou flacons 6 mois 2 à 8°C

Gélose TBX Bo î tes de Pétri 6 mois 2 à 8°C

4- Echantillonnage et prétraitement de l’échantillon 

a- Stratégie d’échantillonnage 

Au niveau de la zone conchylicole d’Al Hoceima on a prélevé 07 échantillons de

moule de points  différents.
De chaque point, on prélève une quantité suffisante de moule aux besoins d’analyses
(1 kg de moule).
Après le prélèvement les échantillons sont mis dans des sacs en plastiques séparés
(voir photo)accompagnés des étiquettes de prélèvement permettant de distinguer les points.
Chacune de ces étiquettes contiennent (Date, heure, espèce, code…etc. ).
Les sacs sont rassemblés dans une glacière portative (voir photo) contenant un
thermomètre afin de contrôler la température de la glacière et pour éviter la dénaturation des
échantillons et les transporter dans de bonnes conditions, il faut que la température de la
glacière varie entre .1-8°c.

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 Photo 3 : de gauche à droite : la glacière portative, le sac en plastique contenant les moules
prélevés et l’étiquette de prélèvement.
b- Conditions du travail

- Avant d’utiliser les échantillons il faut que ces derniers répondent aux conditions
suivantes :
 Moules vivantes ;
 Leurs poids est égale à 1 kg ;
 Le nombre d’individus doit être d’un minimum de 6 moules ;
 Carapace non abimée.

c- Mode opératoire 
 Laver et brosser chaque individu sous un courant d’eau potable (voir photo)
surtout au niveau de la charnière ;
 Egoutter le moules dans un bac de plastique contenant un papier absorbant
(voir photo).
ATTENTION : Si il y’a présence d’un byssus .ne l’arrachez pas, couper le aux ciseaux
stériles.

Photo 4: Photo: de gauche à droite : lavage et égouttage

d- Préparation de la suspension mère :

 Recueillir la chair et le liquide intervalvaire (CLI) dans un bol stérile (6 individus au

minimum) (voir photo).

 Peser la masse X (g) représentative de l’échantillon sachant qu’il doit varier entre 75g-100g.

 Ajouter 2 fois (x) du diluant peptone-sel.

 Broyer pendant 2 minutes à l’aide d’un homogénéisateur (20000tours/min) (voir photo).

FPN/Licence en biologie et biotechnologie : biologie et biotechnologie. Page 11

 Laisser le mélange sédiment 15 mn jusqu’à l’apparition d’une limite entre la partie liquide et
la mousse qui surmonte. (voir photo).

 Pipeter 30 ml de la partie liquide de la suspension mère à l’aide d’une pipette, verser le dans
un flacon de 100 ml contenant 70 ml de diluant Tryptone-Sel, mélanger soigneusement, .ainsi,
on obtient suspension 1/10 ;

Photo 5 : de gauche à droite : la recueille du C.L.I et broyage de la CLI avec diluant.

N.B : Les étapes doivent se faire autour du bec bunsen pour éviter les contaminations et tout
le matériel doit être stérile avant usage.

 Test présomptif 
Le test présomptif consiste à préparer 3 séries de 5 tubes de bouillon glutamate; la
première série contient le milieu double concentration alors que les deux séries restantes
contiennent le milieu simple concentration. Ensemencement se fait sur un tube à essai
contenant le bouillon de glutamate (5 séries x 5 séries).
 Ensemencer de la 1ére série de bouillon de glutamate double concentration avec 10 ml de
la solution 1/3.
 Ensemencer la 2éme série de bouillon de glutamate simple concentration avec 1ml de la
solution 1/3.
 En parallèle de cette opération, on ajoute dans un autre tube, qui contient 9 ml de diluant
(peptone- sel) 1 ml de la suspension mère au 1/10 et on mélange. Puis on ensemence la
troisième série avec 1 ml du tube récemment préparé (dilué).
 A la fin on incube les tubes à essai dans une étuve à37°cependant 24h.

Photo 6 : Photo des Tubes incubé a 37°c

 Test confirmatif:

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 Repiquage des tubes positifs sur la gélose TBX à partir de chaque tube positif
présentant une colonie jaune, on repique des boites TBX en pratiquant des stries par l’anse
pour avoir des colonies bien isolées. Il faut effectuer ses étapes en conditions stériles
(manipulations entre deux becs bunsen). A la fin, on incube les boites de pétries dans l’étuve
44°C pendant 24 h.

V. Lecture des résultats 

Détermination du Nombre le Plus Probable NPP d’E.coli en fonction des colonies bleu
ou bleu-vert sur la gélose TBX et exprime lesdits résultats par un nombre.

 Le point A :
Tableau 5 : Résultats du test présomptif du point A

Dilutions 1er tube 2ème tube 3ème tube 4ème tube 5ème tube
Série 1(1g) + + + + +
-1
Série2(10 g) - - - - -
-2
Série 3 (10 g) - - - - -
(+) Changement de coloration (-) Pas de changement de coloration
Tableau 6 : Résultats du test confirmatif du point A.
Dilutions 1ereboite 2èmeboite 3èmeboite 4èmeboite 5èmeboite
Le point
Série1 (1g) - - - - +
B :
Série2 (10-1g) - - - - -
-2
Série3 (10 g) - - - - -

Tableau 7 : Résultats du test présomptif du point B

Dilutions 1er tube 2ème tube 3ème tube 4ème tube 5ème tube
Série 1(1g) + + + + + 5
Série 2 (10-1g) - - - - - 0
Série 3 (10-2g) - - - - - 0

Tableau 8: Résultats du test confirmatif du point B

Dilutions 1ereboite 2èmeboite 3èmeboite 4èmeboite 5èmeboite

Série1 (1g) - - - - - 0
Série2 (10-1g) - - - - - 0
-2
Série3en
FPN/Licence (10biologie
g) - - biologie et- biotechnologie
et biotechnologie : - . - 0Page 13
VI. Calcul du NPP:
L’évaluation du niveau de contamination par point de prélèvement est effectuée en
calculant le Nombre le Plus Probable d’E.coli par 100 g de C.L.I.
Le calcul de NPP se fait selon le tableau de Mac Grady (voir annexe), et en se basant
sur les résultats du test confirmatif.
Tableau 9: calcul de NPP par point de prélèvement
Points A B

NPP d’E. coli/100 g de C.L.I 2,0.10¹ <2,0.10¹

Les résultats obtenues montrent que les valeurs d’E.coli sont inférieur a 230/100g de
chair et de liquide intervalvaire (CLI), valeur recommandée pour les zones conchylicole
salubre. Pour statuer le classement sanitaire de la zone conchylicole d’Al Hoceima il faut
assurer au minimum 26 analyses bactériologique pour chaque point de moule échantillonné
(13 mois d’étude) et 12 analyses pour les métaux lourds Cd ; Hg ; Pb (c’est-à-dire 04
campagnes d’analyses dans l’année).

VII. Conclusion 
Lors de ce stage de 4 semaines, j’ai pu mettre en pratique mes connaissances
théoriques acquises durant ma formation, de plus, je me suis confronté aux difficultés réelles
du monde du travail et même j’ai su que l’étude bactériologique des mollusques bivalves est
nécessaire pour préserver la santé des écosystèmes marins et littoraux et protéger en amont
la santé du consommateur de toutes intoxications alimentaires.

VIII. Bibliographie

-INRH. (2009). Stratégie de surveillance des zones de production des coquillages.

Prescriptions générales. Département QSMM.
-INRH. (2012) Manuel d’analyses microbiologie. Méthode horizontale pour le
dénombrement des Escherichia coli ß-glucuronidase positive. Partie 3 : Technique du nombre
le plus probable utilisant bromo-5-chloro-4-indolyl-3beta-glucuronate XP ISO/TS 16649-3 V
2005.
Sites webs : www.inrh.gov.ma et www.wikipedia.ma

FPN/Licence en biologie et biotechnologie : biologie et biotechnologie. Page 14

IX. Annexes :

Annexe 1 : Méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli ß-

glucuronidase positive (technique du NNP) (INRH,2012) :

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 0 0
0 1
0 2
1 0
1 0
1 1
1 1
2 0
2 0
2 1
2 1
2 2
2 3
3 0
3 0
3 1
3 1
3 2
3 2
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4 0
4 0
4 1
4 1
4 2
4 2
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4 3
4 4
5 0
5 0
5 0
5 1
5 1
5 1
5 2
5 2
5 2
5 3
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5 4
5 4
5 4
5 4
5 4
5 5
5 5
5 5
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5 biologie et3 biotechnologie. 92
5 5
5 5
0 <0,2
0 0,2
0 0,4
0 0,2
1 0,4
0 0,4
1 0,6
0 0,5
1 0,7
0 0,7
1 0,9
0 0,9
0 1,2
0 0,8
1 1,1
0 1,1
1 1,4
0 1,4
1 1,7
0 1,7
0 1,3
1 1,7
1 2,1
2 2,6
0 2,2
1 2,6
0 2,7
1 3,3
0 3,4
0 2,3
1 3,1
2 4,3
0 3,3
1 4,6
2 6,3
0 4,9
1 7
2 9,4
0 7,9
1 11
2 14
3 18
0 13
1 17
2 22
3 28
4 35
0 24
1 35
2 54
Page 16
4 160
5 >180
Annexe2 : Produits chimiques utilisés dans les analyses microbiologiques.
 Alcool.
 Bouillon glutamate
 Chlorure de sodium (NaCl)
 Eau de Javel
 Gélose tryptone -bile- glutamate ou gélose TBX

FPN/Licence en biologie et biotechnologie : biologie et biotechnologie. Page 17

 Annexe 3 : Matériels de laboratoire utilisés dans les analyses microbiologiques.
Appareils et instruments:
 Distillateur
 Balances
 Pipetus
 Homogénéisateur
 Autoclave
 Incubateurs
 Plaque chauffante
 Réfrigérateurs
Verreries:
 Tubes à essai
 Flacons Schott
 Pipettes graduées
 Erlenmyers
Matériels divers :
 Spatules
 Scalpels
 Ciseaux
 Boîtes de Pétri
 Becs Bunsen
 Anses
 Thermomètre
 Sacs en plastique à usage unique
 Etiquettes de prélèvement
 Glacière
 Papier aluminium

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