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Universidade Federal de São Carlos

Centro de Ciências Agrárias - Campus de Araras


DBV – Departamento de Biotecnologia
Vegetal

Splincing Alternativo na Geração


Variabilidade

Curso: Biotecnologia
Professor: Ane Hackbart de Medeiros
Disciplina: Biologia Molecular

André Ohara RA: 314501


Kaidu Barrosa RA: 314463
Lucas Fachine Dato RA: 314439
Paulo Moisés R. Alexandrino RA: 314463
Araras, 30 de outubro de 2009.

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Índice

Universidade Federal de São Carlos............................................................1

Índice..............................................................................................................3

Identificação de Splicing Alternativo..............................................................6

Função do splicing alternativo e regulação....................................................7

Splicing alternativo e variabilidade................................................................8

Splicing Alternativo e Diversidade Proteômica.............................................10

Células ciliadas ........................................................................................10

Drosophila.................................................................................................10

Formação de sinapses...............................................................................10

Em plantas................................................................................................11

Splicing Alternativo e Evolução ...................................................................13

Noise em Splicings.......................................................................................14

Conclusão.....................................................................................................18

Glossário...................................................................................................... 19

Referências Bibliográficas:...........................................................................20

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Introdução

Após a transcrição, o pré-mRNA sofre “splicing”, ou seja, remoção dos


introns, através de um grande complexo de proteínas e RNA designado por
spliceossomo. Este complexo reconhece sequências consenso, locais de
splice, localizadas nas extremidades dos exons e introns e une os exons
removendo os introns. Entretanto um gene pode originar diversas proteínas
funcionalmente diferentes, por um processo chamado splicing alternativo, já
que existem diversas formas de retirar os introns do pré RNAm, resultando em
mais de um RNA maduro por gene. Não necessariamente o processo ocorre
em relação aos introns, mas também baseia-se na possibilidade de retirada de
exons ou parte deles (Fardilha, da Cruz e Silva, & da Cruz e Silva, 2008).
Existem basicamente três tipos de splicing alternativo mas que podem ser
subdivididos e originarem cinco (Fardilha, da Cruz e Silva, & da Cruz e Silva,
2008):

1 Inclusão alternativa de exon (também denominado “exon skipping”,


“cassete exon”): no qual um ou mais exons podem ser excluídos junto
com os introns flanqueantes, resultando em transcritos alternativos mais
curtos ( Sakabe, 2006).
2 Sítio de splice alternativo (5’ou 3’): engloba os eventos de splicing
alternativo que envolvem junções exon/intron diferentes daquelas
normalmente utilizadas, resultando em um encurtamento ou
alongamento do exon ( Sakabe, 2006).
3 Retenção de intron ( uso alternativo de intron): envolve os casos em
que um intron é mantido no transcrito final. Para estes casos, observa-se
duas populações de RNAm: uma que inclui um trecho de DNA genômico
flanqueado por “exons” (exon+intron+exon) nos RNAms maduros e outra
população na qual o mesmo trecho de DNA genômico é excisado como
um intron qualquer, sendo também flanqueado por exons (exon+exon)
(Sakabe, 2006).

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A classificão em cinco classes feita por alguns autores ocorrem quando
subdividem a classificação 2 em dois grupos, sendo um referente à “isoforma
do exon” e o outro, à “isoforma do intron”. A classe faltante para a divisão em
cinco grupos provém da classificação do mutuamente exclusivo de exons como
outro grupo e não um caso específico de 1 ( Sakabe, 2006).
Um termo importante de ressalvar e frequentemente utilizada é “exon
constitutivo” que define exons que aparecem sempre da mesma forma no
RNAm maduro. A utilização do termo é flexível, pode se considerar constitutivo
aquele exon que é sempre incluído mesmo que sofra aumento ou diminuição
de seu tamanho pelo uso de sítios de splice alternativo, por exemplo ( Sakabe,
2006).
Nos últimos anos tem sido realizado um número grande de trabalhos
envolvendo splicing alternativo por isso existe uma literatura que abrange
desde a frequência do fenômeno em diversos organismos, seu possível
impacto funcional, até as formas de regulação e sua relação com a evolução
(Sakabe, 2006). O objetivo do trabalho é focar na relação entre splicing
alternativo gerando variabilidade tanto fenotípica quanto genética e, a partir
disso, uma possível relação com aspectos da evolução.

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Identificação de Splicing Alternativo

A identificação da ocorrência de splicing alternativo, resumidamente,


ocorre pela determinação das sequências dos transcritos, o armazenamento
em formato digital, alinhamento das sequências com o genoma e assim
consegue-se além de identificar a ocorrência do splicing alternativo reconhecer
exons, introns e sítios de splice ( Sakabe, 2006).
O transcriptoma é o conjunto de transcritos gerados a partir de um
genoma. Os avanços moleculares permitiram seqüenciamento de milhares de
sequências expressas (cDNAs), lembrando que essas sequências podem ser
parciais e originarem os ESTs (Expressed Sequence Tags) ou completas, os
RNAms. As sequências dos transcritos obtidas são armazenadas em formato
digital e posteriormente utilizadas como fonte de evidências do fenômeno
(Sakabe, 2006).
Com o sequênciamento de genomas inteiros como de humanos e
camundongos entre outros, permitiu-se o alinhamento das sequências
expressas e a identificação de qual gene cada transcrito provém. É esse
alinhamento que permite identificar os introns, os exons e os sítios de splice,
este último por programas específicos de bioinformática. Os clusters de cDNA
são grupos que surgiram pela sobreposição dos alinhamentos e então, um
agrupamento indireto gene a gene de cDNAs. Esse agrupamento indireto se dá
pela comparação das coordenadas, utilizando-se critérios de sobreposição
mínimos para considerar duas sequências como parte de um mesmo gene. Ou
seja, um cluster é a coleção conhecida de transcritos parciais e completos de
um dado gene ( Sakabe, 2006).
Dentro de cada grupo de transcritos de um gene é então possível
identificar eventos de splicing alternativo buscando-se sequências que
apresentem certas diferenças. Por exemplo, um evento de inclusão alternativa
de exons pode ser detectada ao se encontrar um par de cDNAs alinhados em
que haja ausência de um exon em uma sequência e a presença do mesmo em
outra. De forma similar, um evento de retenção de introns é evidenciado pela
presença de um segmento em um cDNA entre dois exons que em outra
sequência esteja ausente. Por isso, os cDNAs ou transcritos conhecidos de um

6
gene são também denominados evidências de splicing alternativo ( Sakabe,
2006).
Como o tamanho do cluster representa o número de transcritos
produzidos por um gene, há uma certa relação deste valor com o nível de
expressão gênica. Com base na idéia de que características conservadas entre
organismos estão sob pressão seletiva e são portanto indicativos de função
biológica, a comparação de características biológicas entre organismos é
extremamente útil e recebe o nome de Genômica Comparativa ( Sakabe,
2006).

Função do splicing alternativo e regulação

Pelo menos duas funções podem ser observadas:


• Alteração da estrutura das proteínas codificadas ( Sakabe, 2006).
• Regulação dos níveis dos transcritos produzidos ( através da inserção
de códon de parada prematuro ou através da alteração da estabilidade
do RNAm) ( Sakabe, 2006).

A inserção ou deleção de partes da proteína por eventos de splicing


alternativo pode gerar mudanças na sua estrutura, nas propriedades de
ligação, na atividade enzimática, localização celular, estabilidade, carga e
modificações pós-traducionais. Além disso, uma simples inserção de um códon
de parada na região codificadora pode resultar em proteínas mais curtas, com
funções diferentes das isoformas completas ( Sakabe, 2006).
Ao analisar o possível impacto no potencial codificador do transcrito
nota-se que o splicing alternativo é um mecanismo importante na geração de
variabilidade protéica. Especula-se até que essas modificações poderiam
alterar o repertório de proteínas expressas a tal ponto de expandir o proteoma
de um dado organismo. No entanto, o impacto do fenômeno de splicing
alternativo poderia afetar desigualmente as proteínas ( freqüências distintas),
ocorrendo preferencialmente em grupos funcionais específicos onde a
variabilidade é crucial. Por exemplo, observou-se uma alta taxa do processo

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em receptores com funções no sistema imune e no nervoso, já enzimas
estariam menos sujeitas ao fenômeno. Vale lembrar ainda que em alguns
tecidos não nota-se diferença quanto a freqüência de ocorrência do processo
(Sakabe, 2006).
Em relação ao splicing, há evidências de que ele ocorre junto com a
transcrição, mas não compulsoriamente. O splicing alternativo está fortemente
acoplado à iniciação da transcrição ( escolha alternativa de promotores) e à
taxa de transcrição. Ou seja, nota-se que diferentes isoformas são geradas
dependendo do promotor utilizado para transcrever o gene ou da taxa de
transcrição ( Sakabe, 2006).
Os mecanismos de regulação do processo de splicing alternativo estão
envolvidos com diversos fatores, como o promotor, a taxa de transcrição,
elementos cis e trans, entre outros. As quatro classes de elementos em cis
( ESEs, ISEs, ESSs, ISSs) possuem um importante papel na regulação do
splicing e na geração de formas de RNAm alternativo, já que sua presença ou
ausência pode levar à remoção de exons inteiros, ao reconhecimento de sítios
de splice alternativo ou até à retenção de introns no RNAm maduro ( Sakabe,
2006).
Outro fator de influência é a força dos sítios de splice, quando mais
fracos ( menos conservados) estão associados a ocorrência de splicing
alternativo; quando mais fortes ( mais conservados) menor é a freqüência de
remoção ou retenção ( Sakabe, 2006).

Splicing alternativo e variabilidade

O processo de splicing alternativo explica a diversidade existente entre


organismos com um conjunto de genes semelhates, além de permitir que
diferentes tipos de tecidos tenham diferentes funções com base nos mesmos
genes, já que basta eles serem editados de formas diferentes para produzir
proteínas diferentes (Fardilha, da Cruz e Silva, & da Cruz e Silva, 2008). O
processo explica tanto a maior diversidade protéica em mamíferos como
também está envolvido em vários processos fisiológicos complexos como, por
exemplo, a determinação de sexo em Drosophilas, reconhecimento do som,
8
entre outros ( Sakabe, 2006). Portanto, a prevalência do splicing alternativo
aumenta com a complexidade do organismo. Evidenciando isso, tem-se que
mais de 60% dos genes humanos sofrem o processo enquanto que na
levedura, Saccharomyces cereviseae, nunca foi descrito (Fardilha, da Cruz e
Silva, & da Cruz e Silva, 2008).
Embora seja tentador tomar a ausência de splicing alternativo em
leveduras como uma evidencia da direcionalidade da evolução do fenômeno, já
que este é abundante em mamíferos, é possível que esses organismos, os
menos complexos, tenham sofrido um processo de perda de variabilidade por
razões de “economia”, já que seria mais interessante uma menor variabilidade
em favorecimento do racionamento energético. Ou seja, por serem organismos
de crescimento rápido onde erros são menos tolerados, a ocorrência de
splicing alternativo pode ter sido selecionada negativamente, já que é um
processo que poda gerar proteínas não funcionais ( Sakabe, 2006).
As variantes de uma proteína produzida por splicing alternativo, podem
ser específicas de um determinado órgão ou tipo celular, sendo assim, tornam-
se alvos terapêuticos ideais para o desenvolvimento de novos fármacos.
Portanto, as novas drogas não afetariam mecanismos semelhantes em outros
tecidos que envolvem as outras isoformas dessa proteína (Fardilha, da Cruz e
Silva, & da Cruz e Silva, 2008). Outro ponto importante é que o splicing
alternativo coloca em cheque a premissa do Dogma Central da Biologia
Molecular, o qual diz que um gene leva à uma enzima. Frente a essa
variabilidade, a frase deveria ser um gene, varias enzimas, ou melhor ainda,
um gene podendo gerar diversas proteínas ( Sakabe, 2006).
Outro ponto relevante é o paradoxo do Valor C, no qual é observado a
controvérsia entre o tamanho do genoma e número de genes dos organismos,
variando essa razão em função do organismo observado. Caso ele seja
considerado mais complexo esperava-se um número maior de gene mas isso
não é sempre observado, por exemplo, em um nematóide observa-se 19,500
genes, no milho, 40,000 e no genoma humano que se esperava 100,000 antes
do seqüenciamento completo, observou-se 30,000 genes (Fardilha, da Cruz e
Silva, & da Cruz e Silva, 2008). Essa discrepância entre o tamanho do genoma
e do proteoma é explicado pelo mecanismo do splicing alternativo.

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Splicing Alternativo e Diversidade Proteômica

Células ciliadas
A percepção dos sons pela audição ocorre devido à habilidade do ouvido
interno de detectar uma série notável de freqüências sonoras. A cóclea (porção do
ouvido interno) possui terminações nervosas compostas de células ciliadas individuais
organizadas em quatro fileiras ao longo de sua membrana basal. Cada uma destas
células é ajustada para responder a uma única e estreita faixa de freqüência de som,
desta forma irá existir um gradiente tonotópico no comprimento da membrana basilar
(Gravely, 2001)
A diferença de tons detectada pelas células ciliadas é mediada, em partes, pelo
splicing alternativo realizado nos transcritos do gene SLO, ativador do canal
cálcio/potássio. Desta maneira, algumas proteínas codificadas pelo gene SLO são
analisadas para demonstrar suas propriedades fisiológicas. Por exemplo, os
transcritos do gene SLO que possuem o STREX EXON sintetizam proteínas
responsáveis por desativar lentamente o fluxo cinético do canal de sódio/potássio,
aumentando a sensibilidade pelo cálcio. Contudo, as seqüências que não possuem o
STREX EXON sintetizam outra forma de proteína, capaz de desativar rapidamente o
fluxo cinético no canal e diminuir a sensibilidade pelo cálcio. Infelizmente, pouco se
sabe sobre como o splicing alternativo regula a transcrição do gene SLO (Gravely,
2001)

Drosophila
A determinação do sexo em Drosophila ocorre devido a um sistema de splicing
alternativo em cascata envolvendo os transcritos de vários genes (Sxl, tra, tra-2 e dsx).
Sendo assim, a presença dos cromossomos X da fêmea irão induzir o splicing
alternativo do gene Slx, desta forma este splicing no macho é inativo. O produto do
gene Slx irá induzir o splicing do gene tra e tra-2, estes genes produzirão proteínas
que direcionarão a inclusão de um exon 4 produzindo uma variação do gene dsx que
especificará o fenótipo feminino (Herbert & Rich, 1999) (Boue, Letunic, & Bork, 2003)

Formação de sinapses
As neuroxinas são a família das proteínas nervosas presentes nos vertebrados
que possuem função importante como receptoras de neuropeptídios (neuropeptídeos
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são substâncias químicas produzidas e liberadas pelas células cerebrais e outras) e
junção de moléculas que participam da origem de sinapses. A observação de múltiplos
cDNAs de ratos e vacas revelou que mais de 1000 neuroxinas diferentes poderiam ser
potencialmente sintetizadas por três genes devido ao splicing alternativo. As proteínas
codificadas por esses splicing alternativos são especificas para cada tipo de ligante,
por exemplo, sabe-se que a interação entre β neuroxina presente nas células pré-
sinapticas e as neuroliginas presentes nas células pós sinápticas é suficiente para a
formação de sinapse. Importante ressaltar que esta interação ocorre apenas se a β
neuroxina é codificada por um RNAm que não possui o exon 20 – proteínas
sintetizadas de transcritos contendo o exon 20 não interagem com as neuroliginas.
Apesar de a função exata das β neuroliginas que possuem o exon 20 não ser
conhecida, pode-se especular que os dois tipos de proteínas podem determinar a
formação ou a quebra de sinapses nervosas. Desta forma, o splicing alternativo dos
transcritos da neuroxina pode ter influencia direta na formação e manutenção de
sinapses, sendo assim a elucidação de como o splicing da neuroxina é regulado
promove um significativo avanço nas pesquisas sobre o sistema nervoso dos
vertebrados (Gravely, 2001)

Em plantas

Antes, o splicing alternativo era dado como menos relevante para as


plantas em comparação com os eucariotos superiores. Contudo, novos estudos
baseadas em análises computacionais em Arabidopsis thaliana provaram
diferente: a partir de livrarias de cDNAs e ESTs, mapeando um gene que
produzia uma sequencia de mRNA diferente da esperada (evidência de
splicing alternativo), estimou-se que dos 27.170 locus codificantes, 1267
sofrem splicing alternativo gerando 2678 proteínas. (Kazan, 2003)
Apesar da aparente pequena proporção, apenas 5% de todo os genes
sofrerem o splicing alternativo, acredita-se que tal valor é subestimado devido a
falta de informação disponível referente a ESTs e cDNAs, que possuem
apenas metade do total de genes da Arabidopsis. (Kazan, 2003)
Traçando um paralelo com o genoma humano, a maioria dos genes
identificados na planta que realizam splicing alternativo estão, assim como no
homem, relacionados com genes regulatórios e, muito possivelmente, a genes
relacionados com respostas a estresses. Alguns exemplos recentes foram duas

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isoformas produzidas pelo gene SOS4(salt overly sensitive 4) da Arabidopsis
regulados pelo estresse de sal e o OsIM da Oryza sativa que produz sob
estresse oxidativo uma oxidase e, sob estresse salino, uma oxidase alternativa.
(Kazan, 2003)
Perspectivas futuras, para melhor aprofundar o conhecimento sobre
plantas, é necessário maior disponibilidade de informações sobre sequencias
genômicas, cDNAs e ESTs. Em curto prazo, contudo, há uma abordagem que
permitiria a melhor análise de splicing alternativo em vegetais: uma técnica
utilizada em leveduras seria adaptada para a Arabidopsis, que envolveria chips
de DNA e micro-array que identificariam RNA em tecidos específicos nos
diferentes estágios de desenvolvimento a procura de splicing alternativo.
(Kazan, 2003)
Os resultados adquiridos referente à Arabidopsis foram baseados em
análises computacionais, quase nenhuma ainda foi verificada e comprovada
experimentalmente. Algumas abordagens que poderiam identificar o processo
seriam a superexpressão ou silenciamento do gene em plantas transgênicas e,
posteriormente, analisar seu fenótipo. As diferenças de característica entre
organismos seriam atribuídas ao gene/splicing alternativo modificado. (Kazan,
2003)

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Tabela 1. Exemplos recentes de genes de plantas que possuie splicing
alternativo por estresse abimental. Fonte: (Kazan, 2003)

Splicing Alternativo e Evolução

A complexidade do ser humano em relação às outras espécies, costuma ser


associada ao genoma. Contudo, inesperadamente, um pequeno número de genes,
revelados pelo seqüenciamento do genoma humano codificam as proteínas
responsáveis pelo complexo funcionamento da maquinaria humana (Boue, Letunic, &
Bork, 2003)
Desta forma o splicing alternativo é considerado um evento que aumenta a
diversidade protéica, sendo um mecanismo capaz de aumentar a complexidade nos
organismos (Boue, Letunic, & Bork, 2003)
Para evidenciar a afirmação acima, utiliza-se de comparações entre a
conservação do splicing alternativo entre duas espécies, neste caso humano e rato.
Para tanto analisou-se o splicing alternativo em genes ortólogos de ambas as
espécies. Genes ortólogos são genes que codificam proteínas correspondentes em
diferentes organismos (Boue, Letunic, & Bork, 2003)
13
Uma análise comparativa de 117 genes homólogos de humanos e ratos,
mostrou que 95% destes genes possuem o mesmo número de exons. Além disso, o
comprimento dos exons correspondentes é fortemente conservado (idêntico em 73%
dos casos), no entanto o comprimento dos introns varia consideravelmente (a maioria
dos introns humanos são 1,5 vezes maior que os introns de ratos). Desta forma, diante
da similaridade entre o conteúdo genético de ambos os indivíduos analisados, o
splicing alternativo explicaria o ganho de complexidade (Boue, Letunic, & Bork, 2003)
Para demonstrar o papel do splicing alternativo, deve-se primeiro distinguir
exons alternativos de exons constitutivos. Exons constitutivos, como já foi definido, são
encontrados em todos os transcritos de um gene, enquanto que os exons alternativos
estão ausentes em pelo menos um transcrito que seja longo o bastante para contê-lo
(Boue, Letunic, & Bork, 2003)
Analisando 9.434 genes ortólogos de humanos e ratos verificou-se que os
exons apresentam alto grau de similaridade (87% idênticos). Esta analise introduz uma
diferenciação dentro dos exons alternativos: “forma majoritária” do exon alternativo se
o exon aparece em pelo menos 50% dos transcritos e "forma minoritária” se o exon
aparece em menos de 50% dos transcritos. Na comparação dos exons de humanos e
ratos ocorre conservação de 98% de exons constitutivos, bem como a conservação de
98% dos exons alternativos de forma majoritária. Entretanto as formas minoritárias dos
exons alternativos são menos conservadas (apenas 25%). Estas formas estão ligadas
a perdas ou ganhos de exons que contribuem para a evolução das espécies (Boue,
Letunic, & Bork, 2003)
Desta forma, alguns conceitos anteriormente considerados absolutos como a
mutação de um gene originando um novo fenótipo e este podendo ser ou não
selecionado pelo meio causando a especiação e posteriormente a seleção, podem ser
explicados com maior profundidade com a biologia molecular, sendo que a
modificação de apenas uma parte do gene (perda ou ganho de exon) pode produzir
proteínas díspares originando fenótipos distintos o que contribui para a origem de
complexidade e evolução (Boue, Letunic, & Bork, 2003)

Noise em Splicings

O evento de splicing alternativo, como estimado, pode gerar dezenas de


centenas a dezenas milhares de diferentes RNAm que, por sua vez, produzirá
inúmeras proteínas isoformes. Contudo, não é possível aferir quantas das
diversas variações de RNAm e proteínas serão utilizadas no organismo, ou
14
seja, contribuirão para fenótipos. A produção de proteínas defeituosas ou não
funcionais a partir de splicing alternativo é chamado de noise no sistema.
(Gravely, 2001)
A maioria dos erros de splicing documentadas são causadas por
mutações no DNA genômico que destroem pontos de sinalização de splicing ou
criam um novo. Especula-se que mutações também podem ocorrer no RNAm
pré-maturo, criando ou destruindo sítios de splice durante a transcrição,
gerando erros de splicing. Outra causa poderia ser a mutação em proteínas
regulatórias do splicing ou seus locais específicos de associação. Em todos os
casos, o maquinário protéico responsável, o spliceossomo, não é inteiramente
culpado pelos erros. Na verdade, não há pesquisas que indicam tal fato.
(Gravely, 2001)
Assim como outros complexos protéicos, como RNA e DNA polimerase,
acredita-se que ela possua uma taxa de erro. Considerando o spliceossomo
com uma fidelidade de ação semelhante ao do ribossomo, que comete um erro
a cada 10 000 códons e levando em consideração que cada gene humano
possui 10 introns, ocorreria a falha de um a cada 1000 transcritos (Gravely,
2001). Contudo, tais dados apresentandos na pesquisa de Brenton R.
Gravely, do Department of Genetics and Developmental Biology, da University
of Connecticut, são um tanto quanto especulativos. Um diferente estudo foi
realizado por Eugene Melamud e John Moult, no Center for Advanced
Research in Biotechnology, University of Maryland Biotechnology Institute, para
tentar analisar e quantificar os casos de “stochastic noise”, termo para quando
o splicing alternativo produz uma proteína não funcional ao acaso, ou seja, não
influenciada por outros fatores (Melamud & Moult, 2009)
O trabalho fez algumas observações sobre a hipótese levantada sobre o
“noisy splicing” : o número de proteínas isoformes, ou seja, proteínas
provenientes de splicings alternativos teria relação com o nível de expressão
do gene e o número de introns existentes no gene. Estimou-se 1 a 10 % de
erro dependendo dos fatores citados anteriormente. A hipótese foi testada
através da simulação e amostragem experimental de transcritos de uma
biblioteca virtual de cDNA. (Melamud & Moult, 2009)
Apesar da baixa frequência de erros, quando ocorre uma falha no
sistema de splicing alternativo, o material transcrito erroneamente pode ser
15
degradado ou traduzido em proteína. Na maioria dos casos a proteína, devido
a sua mal conformação, não possuiria uma função portanto não afetaria a
célula. Contudo, se o RNAm for correspondente a uma característica
dominante, os efeitos podem ser alarmantes. Por tal fato é conveniente a célula
possuir uma frequência baixíssima de erro. (Gravely, 2001)
Para evitar a tradução de proteínas prejudiciais ao organismo, a célula
possui um mecanismo de segurança que monitora os RNAm recém
sintetizados procurando por códons de términos precoces, que quando
identificados, degrada o RNAm defeituoso. Casos de erros de splicing podem
gerar os códons de terminação, seja com a inclusão errônea de um exon ou a
falta de eliminação de um íntron que contenham o códon de terminação,
encaminhando o RNAm para a degradação pelo sistema de segurança celular.
(Gravely, 2001)
Devido à gigantesca capacidade de produzir diferentes proteínas a partir
de um mesmo gene, ainda não existe pesquisas ou métodos de estudos
eficientes para identificar ou diferenciar tantos casos de noise em splicing,
quando um splicing gera uma proteína funcional ou não. (Gravely, 2001)
Uma maneira realizada para analisar um splicing alternativo real ou
noise foi a comparação do evento entre espécies relacionadas. Uma sequência
do material genético referente a um exon não funcional muito provavelmente
não seria selecionado pela pressão ambiental e possivelmente não estaria
presente em um indivíduo de uma outra espécie, desaparecendo em meio a
evolução e seleção. Contudo, uma sequência que produzisse um exon
funcional e relevante – produzisse um fenótipo de fato – muito provavelmente
estaria presente no material genético de outro organismo da outra espécie.
Estudos foram conduzidos comparando o verme C. elegans com o C. briggsae
revelando uma certa sequência de introns entre um exon específico
conservada em ambas as espécies. (Gravely, 2001)
Pretende-se fazer estudos semelhantes entre o homem e o rato, assim
que o seqüenciamento do genoma do animal esteja completo. Ainda sim, deve-
se ressaltar que exons alternativos que não foram conservados entre a
evolução de espécies não necessariamente seriam desprovidos de relevância
– poderia indicar apenas uma evolução diferente, mais recente, uma vez que

16
mutações de um único nucletídeo (SNP) pode criar novos pontos de splicing,
potencialmente gerando um novo exon alternativo. (Gravely, 2001)

17
Conclusão

O splicing alternativo mostrou-se de mister importância para a


compreensão celular, genética e fisiológica do indivíduo: gera a grande
variabilidade proteomica que explica o paradoxo do valor C ; a vasta gama de
diferentes proteínas e fenótipos decorrentes do evento, sob ação da pressão
ambiental seletiva, é a chave para a evolução do indivíduo que,
consequentemente, leva a diferenciação em espécies.
A compreensão do splicing alternativo proporcionaria o entendimento de
diversas funções fisiológicas de diversos organismos, o que poderia trazer
incontáveis vantagens e benefícios ao homem. Para tal, é necessário investir
em pesquisas de sequenciament genético e ampliar as informações disponíveis
dos organismos estudados referente ao seu cDNAs e ESTs, principais bases
de dados para estudos do splicing alternativo. Adaptações de técnicas já
existentes para estudos de caso também são viáveis.
Os estudos de splicing alternativo mostraram-se tão impactantes a ponto
de interpretar diferentemente o dogma central da biologia: um gene através da
transcrição e splicing alternativo produziria diferentes transcritos, logo,
diferentes proteínas.

18
Glossário

cDNA: Molécula similar ao DNA, porém esta é sintetizada no laboratório.


Sua síntese é realizada pela transcriptase reversa, uma enzima de origem viral
que tem a capacidade de produzir uma molécula de DNA dupla fita a partir da
cópia de uma molécula de RNA.

ESE: Exonic Splicing Enhancer


ESS: Exonic Splicing Silencer
ESTs: Seqüências curtas de DNA geradas a partir do seqüenciamento
aleatório de uma biblioteca de cDNA

Genes Homólogos: Sequências de DNA com similaridade atribuída


devido à descendência de um ancestral comum

Genes Ortólogos: Genes que codificam proteínas correspondentes


em diferentes organismos.

ISE: Intronic Splicing Enhancer


Isoformas ou Variantes de RNA: Proteínas muito similares
capazes de desempenharem as mesmas funções das originais já que
diferenças discretas nas sequências de aminoácidos geram diferentes
propriedades estruturais e funcionais.

ISS: Intronic Splicing Silencer

19
Referências Bibliográficas:

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5, 10.

Boue, S., Letunic, I., & Bork, P. (2003). Alternative splicing and evolution.
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Fardilha, M., da Cruz e Silva, O., & da Cruz e Silva, E. (2008). A importância do
mecanismo de "splicing" alternativo para a identificação de novos alvos
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