Semestre S5

Biologie Moléculaire
Séance 1
Cours (2h)
Introduction
Des milers d’années auparavant l’homme avait le contrôle:

- la reproduction des animaux

- la culture et l’hybridation des plantes

Deux derniers siècles (la molécule en question)

- l’apparition de la génétique

Le siècle passé

- développement des techniques de biologie moléculaire

(élucider d’avantage cette molécule)
Notre monde est au milieu de deux grandes révolutions scientifiques:

1- La technologie de l’information (ou de l’informatique)

2- La biologie moléculaire

Les deux :

- gèrent des grandes quantités de données

- données codées

La première est la création de l’homme

La deuxième est une création divine (évolution?)
Ces deux derniers décennies deux impacts majeurs de la biologie
moléculaire sur notre quotidien:

- la santé Humaine
le séquençage du génome humain
l’ingénierie génétique sur des modèles de souris

- L’agriculture (ingénierie génétique et les organismes

génétiquement modifies)
 La biologie Moléculaire
Terminologie

La biologie moléculaire :
- Science qui étudie le vivant à l’échelle moléculaire, c’est la
science qui étudie les molécules liées aux gènes , aux produits
des gènes et l’hérédité.

- En d’autre terme, c’est la science qui étudie les acides nucléiques

(l’ADN et ses produits) souvent substituée par un terme plus
approprié: la génétique moléculaire

la génétique:
la science de l’hérédité, étudie les mécanismes de la transmission
des gènes des ascendants (progéniteurs) aux descendants, cette
science est classée en deux grandes catégories, la génétique
classique apparue fin 19ème siècle et la génétique moléculaire au
début du 20eme siècle.
Les acides nucléiques sont les molécules portants l’information génétique,
nous avons plusieurs types d’acides nucléiques

ADNg (ADN): L’ADN génomique est l’ADN contenu dans tout être vivant
contenant l’ensemble de l’information nécessaire pour le fonctionnement normal de
toutes les fonctions vitales d’une cellule.
C’est un polymère linéaire composé de sous unités connues sous le nom de
nucléotides, l’information de chaque gène est déterminée par l’ordre des différents
nucléotides

ADNc: c’est l’ADN complémentaire à l’ARNm, c’est un ADN simple brin

Plasmide (réplicon), est une molécule d’ADN résidant dans une cellule vivante
portant des informations génétiques et capable d’autoréplication. Les plasmides
peuvent se trouver en une seule ou plusieurs copies et contenant une douzaine à
une centaines de gènes. Trouvés principalement dans les bactéries, mais on peut les
trouver aussi dans les organismes plus évolués comme les levures et les
champignons.
ADN mitochondrial, c’est acides nucléiques (ADN) de petite taille environ 16 Kb,
trouvé au niveau de la mitochondrie

ADN chloroplaste, c’est acides nucléiques de petite taille (ADN) trouvé au niveau de
la mitochondrie

ARNm, des acides ribonucléiques qui peuvent être traduit en protéines

ARNr, des acides ribonucléiques qui forment les ribosomes (association entre des
ARNr et les protéines ribosomiques) nécessaire pour la traduction

ARNt, des acides ribonucléiques nécessaire pour la traduction

microRNA des petits des acides ribonucléiques de 22pb qui contrôlent la régulation
des ARNm
Le génome: c’est l’ensemble du matériel génétique d’une cellules

Le transcriptome, c’est l’ensemble des transcrits d’une cellules

Le methylome, c’est l’ensemble des événements de méthylation du génome

Le protéome, c’est l’ensemble des protéines d’une cellule

Human

ADN
Tissue
(ensemble de cellule)

- ADN est le même pour une espèce,

- Il existe juste des variations nucléotidiques entre les

individus d’une même espèce, ce qu’on appelle
polymorphisme

- Au sein de l’individu l’ADN est le même dans les

différents tissues

- Mais le produit des gènes (transcrits) vont être

différents d’un tissu à l’autre
L’unité de base de l’ADN est le nucléotide

H H

H
Les différents types de nucléotides (base):

- Adénosine (adenine) A

- Thymidine (thymine) T

- Cytidine (cytosine) C

- Guanosine (guanine) G

Uridine (uracile) (pour les ARN) U

Constitution d’un seul brin d’ADN
Hybridation des deux brins d’ADN

Les deux brins

A=T

G=C
 La structure en forme de double hélice de l’ADN

ADN :
- deux chaînes 5’
3’
-chaque chaîne est un polymère de nucléotide
-les nucléotides sont hybridés.
-les deux chaînes sont antiparallèles, c’est à dire
que l’extrémité 5’ de l’une est du côté de
l’extrémité 3’ de l’autre
- les nucléotides d’une chaîne sont
complémentaires de la chaîne opposée
-Les bases azotées liées par les liaisons
hydrogènes sont tournées vers l’intérieur
-les riboses et les acides phosphoriques,
hydrophiles sont tournés vers l’extérieur.
-La chaleur peut dissocier les deux chaînes :
c’est la fusion du DNA. Cette fusion est
réversible : les deux chaînes peuvent s’hybrider
à nouveau.
-un tour double hélice fait 3,4 nm (environ 10
3’ 5’
paires de nucléotides pour chaque tour d’hélice.
Dogme Central de la Biologie Moléculaire

ACGT

Why would the cell want to have an intermediate between DNA and
the proteins it encodes?

1. The DNA can then stay pristine and protected, away from the
caustic chemistry of the cytoplasm.
UGCA
2. Gene information can be amplified by having many copies of an RNA
made from one copy of DNA.

3. Regulation of gene expression can be effected by having specific

controls at each element of the pathway between DNA and proteins.
The more elements there are in the pathway, the more opportunities
there are to control it in different circumstances.
 Le brin sens 5'-ATGTCCACTGCGGTCCTGGAA-3' Sens
3'-TACAGGTGACGCCAGGACCTT-5'
Le brin anti sens Anti sens

Transcription

ARN messager (ARNm) 5'-AUGUCCACUGCGGUCCUGGAA-3'

The DNA strand that has the same sequence
except U for T) Traduction

Traduction de 5’ (Nt)3’(Ct) 5'-AUG UCC ACU GCG GUC CUG GAA-3'

Protéine NH2 Met Ser Thr Ala Val Leu Glu COOH
N terminale C terminale
Procaryotes: Traduction peut se produire simultanément
que la traduction. Chez les Eucaryotes impossible car le
membrane nucléaire sépare les ribosomes du noyau
Transmission et expression de l’information génétique

ADN Réplication

Transcription

ARN

Traduction

Machine très spécialisée

Protéine
exerçant une activité précise
Séance 2
Cours (2h)
TD1: 1h
La réplication
 Utilité de la replication
La réplication est la synthèse
d’acide désoxyribonucléique
qui reproduit exactement le
génome d’une cellule au cours
du cycle cellulaire afin de
préparer la division de cette
cellule.

La réplication se produit en
deux phases S (duplication de
l’ADN) et phase M (mitose)
constitution de deux cellules
chaque récupère une copie de
l’ADN). Principalement des
résultats proviennent des
procaryotes (bactéries ) car ils
sont facile à expérimenter
Réplication, chaque nucléotide va être dupliquée
Type de Réplication
Réplication semi-conservative
- Les 1er Tests avec 32P mais les résultats n’étaient pas concluants

- Expérience de Meselson et Stahl pour déterminer le type de réplication,

M. Meselson and F. W. Stahl, 1958, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 44:671.

Les cellules E. coli

Milieu contenant les sels d’ammonium préparés avec le nitrogène lourd “heavy”
nitrogene (15N) jusqu’au marquage de l’ADN cellulaire

Après, les cellules sont transférées dans un milieu contenant l’isotope normal de
nitrogène “light” isotope (14N)

Analyse par centrifugation sur gradient de densité

Topology Issues for semi-conservative replication
In Prokaryotes, we identified Tus
proteins (proteins terminators).

In Eukaryotes terminators are not

well understood
In Prokaryotes DNA polymerase stops
when rich the RNA primer, the DNA
polymerase I continues the replication
Figure
Réplication Bidirectionnelle

Origine de réplication

Fourche de réplication Fourche de réplication

Boucle de réplication
Origine de Réplication

L’origine de réplication est la région du chromosome par laquelle la réplication

commence.
Origine de réplication

Chez les virus et la plupart des bactéries la réplication est initiée par une seule et unique
origine de réplication. Séquence conservée!

Chez les eucaryotes, chaque chromosome contient plusieurs origines de réplication

séparés par ~ 40 kpb.
Chez les procaryotes l’origine de réplication (OriC) a:

13 bases répétées, chacune contenant GATCTNTTNTTTT suivie de 9 bases répétées

contenant TTATNCANA

Ces deux séquences sont riches en séquences AT

L’origine de réplication fait en général une taille de 245 pb

Rencontre des Boucles
de Réplication
In eukaryotic cells, movements
of each replication fork
proceeds at rate of
approximately 10 to 100
nucleotide pairs per second.

For example, in D.
melanogaster, the rate of
replication is about 50
nucleotide pairs per second at
25oC. Because the DNA
molecule in the largest
chromosome in Drosophila
contains about 7x107
nucleotide pairs, replication
from a single bidirectional
origin of replication would
take about 8 days
Developing drosophila embryos actually use about
8500 replication origins per chromosome, which
reduces the replication time to a few minutes.

In a typical eukaryotic cell, origins are spaced about

40000 nucleotide apart, which allows each
chromosome to replicate in 15 to 30 minutes.
Because chromosomes do not all replicate
simultaneously, complete replication of all
chromosomes in eukaryotes usually takes from 5 to
10 hours.
Chez les eucaryotes

ORC: Origin recognition

complex
Les différentes étapes de réplication
Étape 1, se lier aux séquences répétitives de l’origine de réplication (OriC) et
ouvrir le double brin d’ADN,
Ceci est réalise grâce à l’hélicase (DnaA/DnaB/DnaC), cette enzyme se lie a l’ADN
GATCTNTTNTTTT………..TTATNCANA
et après coupe les liaisons hydrogènes qui lient les bases entre elles.

l’hélicase ne casse pas les chaînes nucléotidiques. L’helicase majeure de E. Coli est
la protéine DnaB. L’activité de l’hélicase nécessite de l’énergie.
l’hélicase fournie cette énergie en clivant l’ATP.
Etape 2 : Elimination du super-enroulement de l’ADN
The DNA molecule must be opened up before replication can proceed. The helix is a very stable structure, and in a test tube the two strands
separate only when the temperature reaches about 90°C. In the cell the combined actions of several proteins help to separate the two
strands. Much of our knowledge of replication comes from studying E. coli, but similar systems operate in all organisms, prokaryote and
eukaryote.

La même molécule d’ADN peut avoir diffèrent formes de surenroulement ce

qu’on appelle les isomères topologiques ou les topoisomers

The chromosome of the bacterium E. coli is a single

circular. DNA molecule of about 4.5 x 106 base pairs.
multiple loops emerging from a central region and some
loops are supercoiled.
Les enzymes qui enlèvent le super-
enroulement de l’ADN sont Les
Topoisomérases.
Topisomerase I
Topoisomérase type I coupe seulement un seul brin alors
que la Topoisomérase II (ADN gyrase en fait partie de
cette famille) coupe les deux brins d’ADN. Ces enzymes
permettent de déstabiliser la structure surenroulé de
l’ADN et aussi provoquer le super-enroulement et lier les
brins d’ADN entre eux après réplication.

• La réplication ou la transcription du DNA nécessite une

fusion partielle de la double hélice et modifie
l’enroulement des deux brins.

• Afin de permettre ces réactions, la topoisomérase est

capable de modifier l’enroulement en hydrolysant un
brin du DNA et en le reconstituant après avoir fait le tour
de l’autre brin. Cette activité de la Gyrase nécessite
l’énergie (ATP)
Etape 3, maintenir les deux brins parentaux de l’ADN séparés
Ceci est réalise grâce aux protéines SSB (single strand binding protein) qui se lient
séparément à chaque brin d’ADN permettant aux brins d’être loin l’un de l’autre et
éviter ainsi l’appariement.
Etape 3, Initiation le nouveau brin d’ADN,

Ceci implique la synthèse d’in oligo-

nucléotide court appelé (primer d’ARN) par
une enzyme spécifique qui appartient aux
ARN polymérase connue sous le nom de
primase (protéine DnaG).
 DNA Polymerase

Single-strand binding
DNA polymerase III protein

DnaB Helicase
Etape 4, Synthèse du double brin d’ADN,
Ceci est effectué grâce à l’ADN polymérase qui utilise le primer d’ARN et ajoute les
nucléotides (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) au groupe hydroxyle à l’extrémité 3’ du brin à copier
suivant la l’homologie des bases (C-G et A-T).
À la différence de
l’ARN polymérase,
l’ADN polymérase ne
peut pas initier le
nouveau brin
d’acides nucléiques.

Trois conditions sont

nécessaire pour faire
une synthèse d’ADN:
dNTP,
amorce
ADN 1
2
Synthèse du double brin du brin retardé d’ADN (fragments d’Okazaki)

brin retardé

brin direct
Orientation de l’activité polymérase de l’ADN polymérase

5’
5’ 3’
DNA polymerase III
5’

3’

DNA polymerase III

3’ 5’
3’
 Synthèse des fragments d'Okazaki et maturation du brin retardé

Polymerase extends the growing strand until the RNA of the primer of the previously synthesized precursor fragment is
reached. where the DNA/RNA segments meet, there is a single-strand interruption, or nick that cannot be sealed because a
triphosphate is present (it can link only a 3’-OH and a 5’-monophosphate)

3’OH

5’P
Etape 5, corriger les mésappariements par l’ADN polymérase
l’ADN Pol III: fonction d’édition
Polymerase activity Exonuclease activity 3’->5’
Étape 6 Clivage des nucléotides des primers ARN
ADN polymérase I avec l’ activité exonucléase 5’3’

ADN polymérase I a une

activité exo-nucléase se
déplace dans la direction
5’->3’ en enlevant les
nucléotides ARN un par un
et en les remplaçant par
des nucléotides ADN
In Eukaryotes,
two models suggested
Étape 7, relier le dernier nucléotide au brin synthétisé

Une fois les nucléotides

ARN sont enlevés et
remplacés, l’ADN ligase lie
le groupe 3’-OH du
dernier nucléotide ajouté
au groupe 5’-P du
nucléotide précèdent
Problèmes de
réplication
linéaire
La solution a la perte de l’extrémité 5’ après chaque réplication chez les Eucaryotes, Les
eucaryotes ont développés des structures a la terminaison des chromosomes connues sous le
nom: télomères qui sont formes de répétitions en tandem, exemple TTAGGG chez les vertébrés
Figure
La différence entre Procaryotes (plus étudié) et Eucaryotes

- Le principe reste le même sauf pour le nombre d’origine de réplication qui :

- Généralement un seul origine de réplication chez les procaryotes alors il y a plusieurs

origine de réplication chez les eucaryotes

- Les protéines impliquées peuvent être différentes

- La réplication est circulaire généralement chez les procaryotes alors linéaire chez les
eucaryotes

- L’extrémité 5’ de l’ADN chez les eucaryotes peut être perdue due à la réplication linéaire
(mais il y a le système des télomèrases)
Séance 3
Cours 1h00
TD 2h00
Régulation de la Réplication
Résumé du Mécanisme de réplication
Complexe d’initiation de la replication (Topisomerase, helicase et SSBP)
 Pre-RC
Le complexe de pré-réplication

-Se lier ORF

- Composé de:

Les protéines Cdc6p

Les facteurs RLF (replication licensing factors)

Le complexe de pré-réplication est contrôlé par un ensemble de protéines:

- Cyclines

- Protéines kinases dépendants de la cycline

- Protéines kinases indépendants de la cycline

Séance 4
La transcription
 Définition d’un gène

Un gène est une séquence d’ADN contenant l’information nécessaire

pour la synthèse d’un ARN ou d’une protéine

Séquence régulatrice en
amont

Séquence codante
(mRNA)
ORF =open reading
frame

Séquence régulatrice
en avale
 Cistron?
Monocistron ou polycistron?
Procaryotes vs Eucaryotes
 ARN

ARN codants (ARNm)

ARN non codants (ARNt, ARNr, microRNA)

 Nature de la molécule d’ARN

ADN ARN
Acide DésoxyriboNucléique Acide RiboNucléique

Désoxyribose Ribose
• La base azotée thymine (T) remplacée par Uracyl (U)
(U peut s'apparier à A)
• Une seule chaîne de nucléotides
• Molécules plus courtes et plus instables que l'ADN
Initiation de la transcription
 Structure du promotrice chez les procaryotes
Promoter

Le promoteur indique: • Le début du gène à transcrire en ARNm

• Quel brin d’ADN doit être transcrit
Les gènes exprimés de façon constitutive (Housekeeping genes)
Ont les séquences consensus parfaites pour que l’ARN polymerase transcrit en continue

Alors que,

Les gènes requis pour une condition spécifique nécessite un mécanisme de transcription
plus compliqué
 Structure de l’ARN polymérase des procaryotes

Composé de deux protéines :

- Le Core Enzyme (initier la transcription)

Content deux trous (un pour l’ADN à transcrire
Et l’autre pour le nouveau ARN)

-La protéine sigma (fixation sur l’ADN)

Chez les procaryotes un seul type

Plusieurs types d’ARN polymérase chez les Eucaryotes,

Chez les Eucaryotes, trois types:

- ARN polymérase I pour les ARNr (45s qui donne la 28S et 18S)

- ARN polymérase III pour les ARNt

Et

- ARN polymérase II pour les ARNm codant pour des protéines

en plus; la mitochondrie et les chloroplastes ont leur propre ARN polymérase qui
ressemble à celui des procaryotes
Élongation de la transcription
Terminaison de la transcription
Deux modèles de terminateurs de transcription:

Terminateurs indépendant de la protéines Rho

Terminateurs dépendants de la protéines Rho

Rho=hélicase
Transcription Summary
 ARNm

5’UTR
3’UTR
AUGCCCUUA UUUUUU
Pas de modification des ARNm des procaryotes

La maturation des ARN ribosomaux (rRNA) par cleavage

tRNA Maturation
Séance 5
La transcriptions chez les eucaryotes est comparable à celles des procaryotes,
à quelques exceptions:

-1 La durée de vie des transcrits (quelques minutes chez les procaryotes

vs 10-20min chez la levure à quelques heures chez les mammifères)

-2 Vitesse de transcription

-3Trois ARN polymérase chez les Eucaryotes alors un seul chez les procaryotes
 Expression génique chez les eucaryotes

• Chez les eucaryotes, il y’a trois types d’ARN polymérases.

• L’ ARN polymérases I transcrit les gènes codant les ARNr.
• L’ ARN polymérases II transcrit les gènes codant les protéines.
• L’ ARN polymérases III transcrit les gènes codant les ARNt et des petits ARN.

• Ils sont plus complexe que l’ARN polymérase des procaryotes, mais Ils
ont des structures similaires.
Composition des ARN polymérases I, II et III
-4 Facteurs d’élongations associes a l’ARN
polymérase
Elongation Factors for mammalian RNA polymerase II
chez les eucaryotes
- L’information
Polycistronique vs monocystronique
 Organisation des gènes chez les
procaryotes et chez les eucaryotes
- Epissage alternatif
Modifications Post-transcriptionelles
 Gppp capping
(ajout de guanosine en extrémité 5’)

Guonosinetransferase
Methylaguanosine transferase

5’
Autres eucaryotes
exibitent d’autres
modifications (*)
Polyadenylation
 Rôle de la Polyadénylation

mRNA stability mRNA translation

-Modification et maturations des transcrits mRNA chez les eucaryotes par:

Gppp capping (ajout de guanosine en extrémité 5’)

Polyadenylation de l’extrémité 3’

Excission des Introns

Organisation des genes Chez les Eucaryotes
Séance 6
Excission des Introns
Modifications Post-transcriptionelles: Maturation des
introns “RNA processing, or RNA Splicing”
Type de l’excision dépendra de la classe des Introns

Table
Introns type GU (5’end intron)-
AG(3’end intron) ou AU-AC
 Intron type GU (5’end intron)-AG(3’end intron) ou AU-AC
Spliceosomes (hnRNPs)

Transcription

Primary RNA transcript (pre-mRNA) heterogeneous

nuclear RNA
+ (hnRNA)
Nuclear RNAs of various sizes heterogeneous
ribonucleoprotein
particles (hnRNPs)
+
Abundant set of nuclear proteins (RNA-Binding Protein)

Pre-mRNA processing
 Extr3’ de l’intron YYYYYYNCAG (Y=PYRIMIDINE (C ou U)
Extr5’ de l’intron: AG-GUAAGU

Bras (branch) UACUAAC

 Goupes I. II. III des introns
- N’ont pas besoin de protéines pour couper les introns
- Ils sont self-splicing
Groupe I, un guonosine libre externe (GMP, GDP, GTP) attaque le hydroxyle de la
guoanine
A l’extr 3’ de l’exon1, Ensuite ce dernier attaque et se lie a la guanosine au niveau de
l’extremite
5’ de l’exon 2
Pour le groupe II et III, c’est la A trouve dans la sequence de l’intron du pre-mRNA qui
attaque le G de l’extr 3 de l’exon1, Ensuite ce dernier attaque et se lie a la guanosine au
niveau de l’extremite 5’ de l’exon 2, la difference entre le groupe II et III est que les introns
de type III sont plus courts et la structure tridimentionnelle est diffferente
Différents épissages alternatifs fournissent différentes formes d’ARN
Eucaryotes (notion de splicing), diffentes formes sont possibles
Par sélection du site de polyadenylation
Par sélection du promoteur
 Par sélection d’exon
Most primary transcripts
must by spliced to
connect the proper
exons. Some genes
contain alternative splice
sites that can be used to
bring two different exons
together and make
different gene products
depending on need.

Exemple de deux formes protéiques du gène de la fibronectine

 Epissage au niveau des protéines

Notion: Inteines et exteines

Protein synthesis
 The central dogma with simple version (Le dogme central) by Francis Crick

The decoding of mRNA is carried out by submicroscopic machine called a ribosome, that
binds the mRNA and translates it. The ribosome moves along the mRNA reading the
message and synthesizing a new polypeptide chain.
 Number of proteins per gene

- Normal (one protein),

- Polyprotein,
- Alternative splicing
- frameshift (completly different)

In bacteria there is an almost one-for-one correspondence between genes and proteins.

However, in higher organisms where alternative splicing is common, there may be an
average of two or three final proteins per gene and so the proteome may be significantly
larger than the genome.
 The genetic code
There are 20 amino acids in proteins, selenocystein is the 21st amino acid and pyrrolysine
the 22nd. The codon is three bases of mRNA that are read off, each codon represents a
particular amino acid.

In mRNA we have four different bases, gives 43(64 codons) possible groups of three bases,
but in the genetic code we have only 20 different amino acids so:
- Some are coding for the same amino acid
- Some codon are STOP codons that signal the end of polypeptide chain
The genetic code is not universal
 Decoding the genetic code

To read the codons, a set of small RNA molecules, or transfert RNA (tRNA) are needed:

- at one end he has an anticodon consisting of three bases that are complementary to the
three bases of the codon on the mRNA. The codon and anticodon recognize each other
by base pairing and are held together by hydrogen bonds

- and its other end, each tRNA carries the amino acid corresponding to the codon it
recognizes
 Structure of transfer RNA
Different tRNA molecules vary considerably in sequence but they all conform to this overall
structure:
- tRNA molecules are about 80 nucleotides in length (varations from 73 to 93 nucleotides)
- Half the bases are paired to form double helical segments
- Four short base-paired stems
- Three loops
- The acceptor stem:
pairing of 5’-end (always ends in G and is phosphorylated) and the 3’-end,
which ends in CCA-OH. The amino acid is bound to the 3’-hydroxyl group of the
adenosine (A).

- The anticodon loop:

seven bases with the three anticodon bases in the middle

- The T ψc-loops (T sigh loop) (=T pseudouracil loop), contain also thymine (T) is made by
methylaton of uracil after transcription.

- The D-loop (DHU-loop) has ‘D’ (dihydrouracil)

These strange bases (ψ, D) are required for

proper folding and operation of the tRNA

The T ψc-loops and D-loop are needed for

binding to the ribosome and other protein
factors involved in translation)
 Modified bases are present in transfer RNA
As originaly transcripted, RNA contains only the four bases A, U, G and C, however, Some RNA
molecules contain bases that are altered chemically after the RNA has been made.
In tRNA up to 15 modified bases per molecule may occur
 Some tRNA molecules read more than one codon

Each transfer RNA carries only a single amino acid. Some tRNA can read more than one
codon, but this must all code for the same amino acid.

Remimber that the standard base pairing rules apply to bases that form part of a DNA
double helix. Since the codon and anticodon do not form a standard double helix, slightly
different rules apply:

- The last two bases of the tRNA anticodon pair strictly according to normal rules
with the first two bases of the mRNA codon
- However, the first base of the tRNA anticodon which pairs with the third base of the
mRNA codon can wobble around a little because it is not squeezed between other bases, in
this case some pairing possibilities are permitted (table below)
 Charging the tRNA with amino acid
In two steps and with the help of amino-acyl tRNA synthetases that are highly specific for
Both correct amino acid and the correct tRNA:

1- Amino acid +ATP  Aminoacyl-AMP (aminoacyl-adenylate)+PPi

2- Aminoacyl-AMP+tRNA  Aminoacyl-tRNA+AMP
 The Ribosome: The cell’s decoding machine

- The decoding process is carried out by a submicroscopic machine called a ribosome.

- The ribosome binds to the mRNA and moves along it, adding a new amino acid to the
growing polypeptide chain each time it reads a codon.

- The ribosome binds mRNA and charged tRNA (aminoacid-tRNA)

 - The bacterial ribosome (70S) (svedberg units measure molecule sedimentation by
ultracentrifugation) consists of two subnits, the 50S (large subnit) and the 30 S (small
subnit)

- The bacterial ribosome contains three ribosomal RNA and 50 smallish proteins

- Eukaryotic (80s) ribosomes are somewhat larger, consisting of 60s and 40 s subnits

The bacterial ribosome

 rRNA
rRNA molecules have highly defined secondary structures with many:
- Stems
- And loops

rRNA is responsible for most of the critical reactions of protein synthesis, in particular, the
23S rRNA of the large subnit is a ribosome that catalyzes the synthesis of the peptide
bonds between the amino acids, it is the peptidyl transferase
 Three possible reading frames exist

- ORF (open reading frame) (le cadre ouvert de lecture): any sequence of DNA or RNA,
beginning with a start codon, and which can, at least theoretically, be translated into
protein

- As there are three bases in a codon, there are only three possible reading frames
GAAAUGUAUGCAUGCCAAAGGAGGCAUCUAAGGA

- Changing the reading frame by three (or multiple of three provides the same sequence
as the first example)
- One way to define the ORF is by choosing the start codon, the first codon is
always AUG (methionine), this will define both the start of translation and the
reading frame

GAAAUGUAUGCAUGCCAAAGGAGGCAUCUAAGGA

- There are three possible start codons in the above sequence that gives a
different reading frame

- Sometimes the initial methionine is snipped off later, so mature proteins do

not always begin with methionine
- AUG codons also occur in the middle of messages and result in the
incorporation of methionines in the middle of proteins

- To know which AUG codon to start with:

In Prokaryotes, near the 5’end of the mRNA exist a special sequence, the
ribosome binding site (RBS) often called the Shine-Dalgarno ou S-D
sequence,
the anti-Shine-Dalgarno sequence (the complementary sequence) is
found close to the 3’-end of the 16SrRNA, consequently, mRNA and
16srRNA bind together by base pairing

In Eukaryotes, do not use S-D sequence to locate the start

translation, but they scan the mRNA starting from the 5’-cap
- Occasionally, coding sequenes even start with GUG (normaly encoding valine)

- but the same Met-tRNA is used as when AUG is the start codon

- So the first amino-acid will be Methionine (not valine), but the initiation of translation
will be inefficience

In general only found for proteins required only in very low amounts
 The translation initiation complexes
A-
- Before protein synthesis starts the two subnits of the ribosome 30s and 50 s are
separately

- Ribosome 30s binds via 16srRNA to mRNA (Shine-Dalgarno sequence)

B-
- 30S initiation complex needs three initiation factors (IF1, IF2 and IF3) which prevent
binding ribosome 50S subnit before and help arrange all the components correctly
C-
- Once the 30S initiation complex has been assembled, IF3 is released

- And the 50S submit binds resulting in he 70s initiation complex

- IF1 and IF2 are released

- This ptocess consumes energy in the form of GTP

 Elongation of the translation

The ribosome has three sites for tRNA:

- The A (acceptor) site
- The P (peptide) site
- The E (exit) site

However only two charged tRNA molecules can be accomomodated on the ribosome
at any given instant
- The initiator tRNA starts out in the P site
- The second charged tRNA arrives and enters the A-site
- The first amino acid is cut loose from its tRNA and bounded to the second amino
acid
- mRNA moves one codon sideways relative to the ribosome (translocation) which
moves the two tRNA into P- and E-sites, leaving tha A-site empty
- The A-site can carry the third charged tRNA, this triggers release of tRNA from the E-
site
Elongation requires two elongation factors (EF-Tu and EF-Ts) and energy (GTP)
 Termination of Protein synthesis

- Presence of stop codons: UGA, UAG and UAA

- No tRNA exists to read these three codons

- But exist proteins called release factors (RF) that read the stop signal:
RF1 recognizes UAA or UAG
RF2 recognizes UAA or UGA

- Ribosome recycling factor (RRF) dissociates the large and small subnits
 Several Ribosomes usualy read the same message at once

- Several attached ribosomes is called a polysome (polyribosome)

Polysome
 tmRNA

Cell must allow errors:

- Defective mRNA
- Lack of stop codon ..etc

tmRNA: Specialized RNA in bacterial cells used to terminate

protein synthesis when a ribosome is stalled by damaged mRNA
(example mRNA that lacks stop codon)
 Differences between Eukaryotic and Prokaryotic protein synthesis
The overall scheme of protein synthesis is similar in all living cells, the significant differences
are:
- Eukaryotic cells contain mitochondria and chloroplastes which have their own DNA and
their own ribosomes (operate similarily to those of bacteria)

- In Eukaryotic cells the cytoplasmic ribosomes that translate nuclear genes

- The ribosomes of Eukaryotic cells are larger and contain more rRNA and proteins than
those of prokaryotes

- Eukaryotic cells have more initiation factors

- mRNA in prokaryotes is polycistronic

- In eukaryotic cells each mRNA is monocistronic

- In procaryotes the genome and the ribosome are both in the cytoplasm

- In eukaryotic cells the ribosome are in the cytoplasm, coupled transcription and
translation is not possible

- Both procaryotes and eukaryotes have a special initiator tRNA that recognizes the start
codon and inserts methionine as the first amino acid

- In prokaryotes the first amino acid is N-formyl-methionine but in eukaryotes is

unmodified methionine (methionine )
Comparison of Protein synthesis