Vous êtes sur la page 1sur 64

TRAVAUX DIRIGÉS 01

1
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

La formation du complexe Ag /Ac dépend des :

▪ Facteurs intrinsèques ou paramètres structuraux liés à la


molécule d'antigène

▪ Facteurs liés aux conditions du milieu (température, pH et force


ionique)

2
TD
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS 01
Force des interactions Ag-Ac

Épitopes et paratopes engagent des interactions non covalentes,


instables et réversible.

3
4
TD
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS 01
Force des interactions Ag-Ac
Les liaisons hydrogène dans lesquelles un atome d’H est partagé entre deux
atomes électronégatifs
Antigène Anticorps

liaisons hydrogène

liaisons ionique

interactions
hydrophobes

Forces de Van der


Waals

liaisons ionique 5
TD
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS 01
Force des interactions Ag-Ac
Les liaisons ioniques entre résidus porteurs de charge opposées

Antigène Anticorps

liaisons hydrogène

liaisons ionique

interactions
hydrophobes

Forces de Van der


Waals

liaisons ionique 6
TD
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS 01
Force des interactions Ag-Ac
Les interactions hydrophobes dans lesquelles l’eau force les groupes hydrophobes
à se réunir
Antigène Anticorps

liaisons hydrogène

liaisons ionique

interactions
hydrophobes

Forces de Van der


Waals

liaisons ionique 7
TD
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS 01
Force des interactions Ag-Ac
Les interactions de van der Waals entre les nuages électroniques externes de
deux atomes ou plus
Antigène Anticorps

liaisons hydrogène

liaisons ionique

interactions
hydrophobes

Forces de Van der


Waals

liaisons ionique 8
TD
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS 01
Force des interactions Ag-Ac

La somme de ces liaisons définit la force


d'interaction entre l'antigène et son récepteur

9
TD
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS 01
L'affinité de l'anticorps

L'affinité est définie comme la somme des forces de


liaison et de répulsion entre un épitope et un paratope.

10
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

L'affinité de l'anticorps

L'affinité de l'anticorps est évaluée par une constante d'affinité (Ka) qui
s'exprime en L/mol.

Ag + Ac Ag-Ac + chaleur

Ka = [Ag-Ac] / [Ag].[Ac]

▪ un anticorps de faible affinité possède une Ka proche de 10−4 L.mol−1

▪ un anticorps de haute affinité a une Ka proche de 10−12 L.mol−1

11
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

L'affinité de l'anticorps

L’inverse de Ka est la constante de dissociation Kd (1/Ka) qui est un


indicateur de la stabilité d’un complexe Ag-Ac


Les complexes très stables ont des valeurs très faibles de Kd.

12
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

L'affinité de l'anticorps

La constante d’équilibre Ka peut être déterminée par une méthode


permettant de mesurer l’affinité d’un Ac : La dialyse à l’équilibre.

Chambre de dialyse contenant deux


compartiments séparés par une membrane
semi-perméable

Antigène
Anticorps radiomarqué

13
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

L'affinité de l'anticorps

En l’absence d’Ac, l’Ag ajouté sera en équilibre des deux côtés de la membrane

14
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

L'affinité de l'anticorps

En présence d’Ac, une partie de l’Ag marqué sera liée à l’Ac et l’Ag non lié
sera distribué de façon égale dans les deux compartiments 15
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

L'affinité de l'anticorps

La différence de concentration de l’Ag dans les deux compartiments


représente la concentration de l’Ag lié à l’Ac
16
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

L'affinité de l'anticorps
Etant donné que la concentration totale de l’Ac dans la chambre de dialyse
à l’équilibre est connue, l’équation peut être réécrite :

Ka = [Ag-Ac] / [Ag].[Ac] = r / c(n – r)

r = [Ag lié] / [Ac total] ;


c = [Ag libre] ;
n = nombre de sites de liaison par molécule d’Ac.

Cette expression peut être réarrangée pour donner l’équation de Scatchard :

r / c = Kan - K ar

17
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

La valence antigénique

La valence antigénique correspond au nombre de molécules d'un épitope


donné pouvant être reconnues simultanément par des anticorps qui lui
sont spécifiques.

Les immunoglobulines portent au minimum deux paratopes semblables,


capables de reconnaître les mêmes épitopes → valence = 2, 4 ou 10 selon
les classes d'Immunoglobulines.

18
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

La valence antigénique

19
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

La valence antigénique

L'accès des paratopes aux épitopes est par ailleurs contraint par la
notion d'encombrement stérique.


La valence antigénique est ainsi toujours inférieure ou égale au
nombre d'épitopes.

20
TD
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS 01
L'avidité de l'anticorps

L'avidité représente la résultante des différentes forces d'interaction


engagées entre les anticorps et les épitopes.

La force d'interaction globale d'un anticorps avec sa cible dépend


alors du nombre de paratopes qu'il peut engager.

21
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

L'avidité de l'anticorps

Une IgM (pentamérique) qui peut engager ses dix paratopes lors de
l'interaction avec un antigène, a une force d'interaction (avidité) plus
importante que celle d'une IgG qui ne peut engager que deux paratopes
identiques.

22
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

L'avidité de l'anticorps

Les IgG synthétisés au cours d'une infection récente ont une avidité faible.
A l'inverse, les IgG produites lors des réinfections ont une avidité forte.


L'indice d'avidité mesure la dissociation de la liaison Ag-Ac en présence
d'urée et permet donc de dater l'infection.

23
THERMODYNAMIQUE DE LA RÉACTION
ANTIGÈNE–ANTICORPS

L'avidité de l'anticorps

24
SPECIFICITE ET RÉACTION CROISÉE

Spécificité

La spécificité fait référence à la capacité d’un site anticorps donné à réagir


avec un seul déterminant antigénique ou encore à la capacité d’une
population d’anticorps polyclonaux à réagir avec un seul antigène.

Les anticorps peuvent reconnaître des différences entre :


▪ La structure primaire d’un antigène
▪ La nature isomérique d’un antigène
▪ Les structures secondaires et tertiaires d’un antigène

25
SPECIFICITE ET RÉACTION CROISÉE

Spécificité

Une modification infime de l'épitope peut avoir des conséquences


majeures sur la qualité des récepteurs engagés, avec des
retentissements parfois importants sur la qualité de la réponse
immunitaire qui en découle.

26
SPECIFICITE ET RÉACTION CROISÉE

Spécificité

Dans le cas des épitopes peptidiques, on peut ainsi définir des motifs :

▪ Agonistes : qui présentent une structure proche ou dans lesquels le


remplacement d'acides aminés n'affecte en rien la qualité de la
reconnaissance par le récepteur et la réponse immunitaire qui en
découle.

▪ Agonistes partiels : au sein desquels le remplacement d'acides


aminés affecte la reconnaissance et surtout la quantité de signaux
transduits par le récepteur. La réponse immunitaire peut être moins
intense et/ou aboutir à un autre profil cytokinique (e.g. Th1 versus Th2).

27
SPECIFICITE ET RÉACTION CROISÉE

Spécificité

Dans le cas des épitopes peptidiques, on peut ainsi définir des motifs :

▪ Super-agonistes : si le remplacement d'acides aminés conduit à une


réponse amplifiée comparativement à celle obtenue avec la molécule
initiale.

▪ Antagonistes : lorsque le remplacement d'acides aminés affecte la


reconnaissance et conduit à la réponse inverse de celle obtenue avec
la molécule initiale.

28
SPECIFICITE ET RÉACTION CROISÉE

Réaction croisée

La réaction croisée fait référence à la capacité d’un site anticorps donné à


réagir avec plus d’un déterminant antigénique ou encore à la capacité
d’une population polyclonale d’anticorps à réagir avec plus d’un antigène.

29
SPECIFICITE ET RÉACTION CROISÉE

Réaction croisée

Les Ag microbiens induisent la formation d’Ac qui peuvent établir des


réactions croisées avec des Ag de la cellule hôte, il en résulte une réaction
auto-immune dommageable pour les tissus.

Exemple : des Ac produits


contre l’Ag M de la bactérie
Streptococcus pyogenes qui
établissent des réactions
croisées avec des protéines
musculaires.

30
TD
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Les anticorps (AC) sont devenus des outils indispensables
dans les activités de recherche, de diagnostic et de thérapie

Les AC peuvent reconnaître très précisément une molécule,


de s’y fixer avec une affinité variable et de façon réversible


Distinguer des différences subtiles entre les molécules
d'antigène

31
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Anticorps polyclonaux

Les Ac polyclonaux sont générés après l’injection d’un Ag multivalent à un


animal (souris, rat ou lapin) dont résulte la stimulation de plusieurs clones
différents de lymphocytes B.


On obtient un sérum d’Ac polyclonaux reconnaissant des épitopes
différents du même Ag.

32
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Anticorps polyclonaux

33
TD
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Préparation D'anticorps Monoclonaux

En 1975, Georges Köhler et Cesar


Milstein (prix Nobel 1984) ont mis
au point une technique qui permet
d'isoler in vitro des clones
plasmocytaires produits à l'issue de
l'hyperimmunisation d’un animal.

34
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

Définition :

Les anticorps monoclonaux sont produits par une même lignée


de lymphocyte B activé ou plasmocyte, reconnaissant le même
épitope d'un antigène.

35
TD
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Préparation D'anticorps Monoclonaux

Les avantages majeurs :

• Pouvoir choisir les anticorps monoclonaux dont les propriétés


(spécificité, affinité et isotype) sont les plus adaptées aux applications
prévues.

▪ Les anticorps retenus peuvent être produits de façon constante, en


quantité indéfinie et de façon illimitée dans le temps.

▪ Les immunoglobulines issues du clone ont les mêmes caractéristiques


physico-chimiques et biologiques, ce qui permet de standardiser les
analyses.

36
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

Principe général

La fusion d’un lymphocyte B ou d’un plasmocyte avec


1 des cellules de myélome conférant à l'hybridome ainsi
formé une capacité proliférative illimitée.

37
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

Principe général

Seules les cellules hybrides sécrétrices d'un anticorps

2 spécifique de l'antigène sont sélectionnées, puis isolées les


unes des autres afin de cultiver séparément chacun des clones
producteurs d’un anticorps monoclonal.

38
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

Cette technique d'obtention d'hybridomes se déroule en trois étapes


sur environ 6 mois :
▪ Immunisation
▪ Fusion cellulaire
▪ Sélection et séparation des clones.

39
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

La première étape : l'immunisation

- Injection répétées de l'antigène environ


toutes les 3 semaines à des souris
(BALB/c), voire des rats ou des lapins.

- Les cellules immunocompétentes sont


extraites à partir de la rate, mais parfois
de ganglions lymphatiques ou de
plaques de Peyer.

40
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

La deuxième étape : Fusion cellulaire

Fusion en condition stérile les cellules


immunocompétentes de l'animal avec
des cellules de myélome généralement
issues de la même espèce.

La fusion cellulaire se fait à l'aide d'un agent chimique, le polyéthylène glycol (PEG)

41
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

La deuxième étape : Fusion cellulaire

Les cellules en contact étroit peuvent


fusionner pour former des
hétérocaryons. Le rendement de fusion
est faible, moins de 1% des cellules
fusionnent et une cellule sur cent cinq
génère un hybride viable.

42
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

Après la fusion, l'ensemble des cellules est ainsi distribué dans des puits de
plaques de culture à raison d'une cellule par puits au maximum (principe de
la dilution limite) et cultivé en milieu sélectif HAT.

43
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

Les hybridomes

Fusion cellulaire

Les lymphocytes n'ayant Les cellules de myélome


pas fusionné meurent.

Il est nécessaire d'éliminer les myélome qui n'ont pas fusionné avec des lymphocytes

44
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

La lignée de myélome utilisée est déficiente


en hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl
transférase (HGPRT)


Intervient dans la de la voie exogène de
synthèse des nucléotides

45
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

Les hybridomes sont placés dans


un milieu HAT (Hypoxanthine
Aminoptérine Thymidine)
inhibiteur de la voie endogène de
la synthèse des nucléotides.

46
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

Les cellules myélomateuses ne


peuvent plus synthétiser d’ADN

47
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Préparation D'anticorps Monoclonaux

Fusion avec les LB


apporte l’enzyme HGPRT

48
TD
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Préparation D'anticorps Monoclonaux

Les hybridomes néoformés sont très instables génétiquement et seulement


un sur cent cinq donne une cellule viable.

Le milieu de culture sélectif est enrichi en facteurs de croissance apportés


par le SVF (20 %), des cocktails de cytokines contenant notamment de l'IL-6
et/ou des macrophages ou des splénocytes de souris préalablement
déposés dans les puits de culture (cellules feeder).

49
TD
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Préparation D'anticorps Monoclonaux

La troisième étape :

Sélection, par dilution limite, des


hybridomes dont le taux de
croissance est optimal et qui
sécrètent un anticorps spécifique de
l'antigène d'intérêt.

50
TD
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Préparation D'anticorps Monoclonaux

La troisième étape :

Les hybridomes sont cultivés en


grands volumes afin de caractériser
précisément les anticorps qu'ils
sécrètent (spécificité, affinité,
isotype).

51
TD
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Préparation D'anticorps Monoclonaux

La troisième étape : Expansion


clonale

Production des Ac monoclonaux


sélectionnés, soit in vitro, soit in vivo.

La productivité cellulaire peut aller jusqu'à


4 g/L grâce à l'utilisation de lignées
murines ou de hamster chinois.

52
TD
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Préparation D'anticorps Monoclonaux

Il est possible d'obtenir par génie génétique des hybridomes interespèces


(rat–souris, souris–rat, souris–homme).

(-) Plus instables génétiquement

(+) Les hybridomes souris–homme sont particulièrement intéressants dans


les applications thérapeutiques car ils entraînent peu de réactions immunes
chez le receveur.

53
TD
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Préparation D'anticorps Monoclonaux

54
TD
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Préparation D'anticorps Monoclonaux

55
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS
01
Intérêts des anticorps monoclonaux

Les Ac monoclonaux sont utilisés en :

▪ Recherche (techniques telles que la cytométrie en flux, le western


blots ou les tests d'immuno-hématologie),
▪ Diagnostic médical (tests de grossesse),
▪ Thérapie de diverses pathologies.

56
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Intérêts des anticorps monoclonaux

Test de grossesse:

Le principe repose sur la détection de l'hormone hGC (human Chorionic


Gonadotropin) dans les urines par le biais d'une réaction colorée
spécifique grâce à l'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-hGC.

57
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Intérêts des anticorps monoclonaux

Test d'ovulation:

Les anticorps monoclonaux anti-hormone lutéinisante qui révèlent


l'augmentation du taux d'hormone LH (signe précurseur de l'ovulation).

58
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Intérêts des anticorps monoclonaux

Test ELISA:

Utilisation des anticorps monoclonaux comme anticorps traceurs dans


le test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).

Ce type de test est utilisé notamment dans le dépistage de la


séropositivité au virus VIH, c'est à dire pour mettre en évidence la
présence d'anticorps anti-VIH dans le sérum.

59
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Intérêts des anticorps monoclonaux

Test ELISA:

60
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Intérêts des anticorps monoclonaux

Fabrication des anticorps monoclonaux contre des antigènes portés par


des cellules tumorales afin de les détruire.

L'intérêt de l'utilisation des anticorps monoclonaux pour un traitement


anti-cancereux réside dans la spécificité de ceux-ci à détruire des cellules
cibles.

61
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Intérêts des anticorps monoclonaux

62
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Intérêts des anticorps monoclonaux

Le trastuzumab (Herceptin®), un anticorps de classe IgG1 qui se fixe


sur la protéine HER-2. Une surexpression de HER2 s'observe dans 20 à
30 % des cancers primitifs du sein.

63
LES ANTICORPS COMME RÉACTIFS

Intérêts des anticorps monoclonaux

64

Vous aimerez peut-être aussi