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Transformação genética
em Escherchia Coli
Inserção e expressão do gene GFP através do vector pGLO
Cláudia Franco | Cláudia Lobo | Edgar Couto | Sofia Osório
Resumo
Após concluída a Actividade Prática Laboratorial Bactérias Fluorescentes, no
laboratório aberto do IPATIMUP, elaborou-se o seguinte relatório, no qual se esclarecem os
conceitos de Técnica do DNA recombinante e de como esta permite induzir novas
características fenotípicas em bactérias Escherichia Coli, utilizando como vector,
geneticamente modificado através de enzimas de restrição, o plasmídeo pGLO; e o gene
responsável pela fluorescência GFP (Green Fluorescent Protein). Esclarece ainda o conceito de
Técnica de Gram, Gram negativo e Gram positivo e ainda as vantagens de ter conhecimento da
composição da membrana bacteriana.
Abstract
Once completed the Practical Activity Fluorescent Bacteria, in the open laboratory of
IPATIMUP, this report was written to clear concepts such as recombinant DNA technique and
how it may induce new phenotypic characteristics in Escherichia Coli bacteria, using pGLO
plasmid as a vector, genetically modified by restriction enzymes; and the gene which is
responsible for fluorescence GFP (Green Fluorescent Protein). It also clarifies Gram Technique
concept, positive and negative Gram and the advantages of knowing the composition of the
bacterial membrane.
Todos os dias novas descobertas são feitas, por experimentação, teoria e prática
obtêm-se novas potencialidades capazes de alterar ideias prévias e neste caso testar métodos
alternativos com o objectivo de quebrar barreiras.
Bactéria
As bactérias são procariontes unicelulares tendo, por isso, uma constituição muito
simples. São seres que não apresentam organelos membranares, nem núcleo individualizado,
tendo o DNA disperso no citoplasma e não associado a histonas. Para além da molécula de
DNA principal, as bactérias possuem ainda porções de DNA circular em cadeia dupla
denominadas Plasmídeos. Estes replicam-se independentemente da molécula de DNA
principal e não são essenciais à
sobrevivência da bactéria.
Organelo Função
Membrana Captação de elementos
Citoplasmática necessários e excreção de toxinas
Parede Celular Rigidez e Protecção
Hidratação
Cápsula Protecção contra Fagocitose
Maior adesão a outras células
Pili Prender o Alimento
Flagelo Locomoção
Figura 1 - Bactéria
Figura 1 -União entre o grupo fosfato ligado ao Figura 3 -Esquematização da acção de uma Enzima de
carbono 5′ e o grupo hidroxila ligado ao carbono 3’ Restricção (EcoRI)
das moléculas de desoxiribose presentes no DNA.
Plasmídeo pGLO
É através da técnica resumidamente descrita acima que é sintetizado,
laboratorialmente, o plasmídeo pGLO. A constituição deste plasmídeo é responsável pela sua
utilização na experiência “Bactérias Fluorescentes” e destacam-se quatro zonas principais.
A zona ara-C é responsável pela regulação da expressão do gene GFP, este apenas é
transcrito na presença de Arabinose (dissacarídeo). É um operão indutível, constituído por um
operador, um promotor e três genes estruturais que codificam a síntese das proteínas
necessárias à degradação da Arabinose: o araA, que codifica a isomerase, o araB que codifica a
ribulocinase e o araD, que codifica a ribulose 5-fosfato epimerase.
Método / Procedimento
Com a experiência “Bactérias Fluorescentes”, desenvolvida no Laboratório Aberto do
IPATIMUP, pretendia-se compreender o processo complexo utilizado em engenharia genética.
Como introduzir um plasmídeo numa bactéria? Como torná-la resistente a determinado
antibiótico?
As bactérias que não foram postas em contacto com o plasmídeo recombinante, não o
incorporaram, logo não sobreviverão em meios de cultura onde esteja presente o
antibiótico Ampicilina. Da mesma forma, não apresentarão fluorescência devido à
ausência do GFP.
1
Sendo que o microtubo continha plasmídeos pGLO foi identificado com um + (=mais), todos os que não continham
DNA plasmídico foram identificados com um – (=menos).
Resultados2
Discussão
Após observação dos resultados pôde observar-se que o único meio de cultura em que
são expressos, na totalidade, os genes presentes no plasmídeo recombinante é o que é
constituído por LB (meio nutritivo), Ampicilina e Arabinose.
2
Estão presentes os resultados de todos os grupos de trabalho, para posterior análise e discussão.
Quanto ao Operão Arabinose, tão necessário à expressão do gene GFP, pode dizer-se
que foi bastante útil a aplicação dos conhecimentos das aulas de Biologia relativas ao operão
Lactose. Foi essencial perceber a aplicação do que é um operão indutível numa biomolécula
completamente diferente.
Foram incubadas as quatro caixas de Petri invertidas a 37oC, o que faz todo o sentido e
confirma o que já havia sido dito. Sendo que as bactérias Escherichia Coli vivem em simbiose
no organismo humano, que temperatura poderia ser mais eficaz na sua reprodução do que a
As duas caixas de Petri, onde foram colocadas as bactérias não modificadas, serviriam
como montagens de controlo. Deste modo, foi possível observar que, no seu genoma natural,
as Escherichia Coli , não possuem o gene que lhes confere resistência à Ampicilina, sendo que
na caixa de Petri que continha meio nutritivo LB e Ampicilina não se verificou alteração no
crescimento. Como no meio de cultivo que apenas continha LB se deu crescimento e formação
de colónias, a morte da outra montagem terá sido, inequivocamente, devida à presença de
Ampicilina no meio.
Por outro lado, ambas as montagens que continham as células modificadas, tinham
presente Ampicilina, e em ambas se verificou o crescimento populacional das bactérias,
formando colónias. Estes resultados permitem concluir que as bactérias modificadas através
da incorporação do plasmídeo pGLO adquirem resistência à Ampicilina, devido ao gene -
lactamase (Bla).
Foi descoberta pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884. Este cientista
obteve com a coloração realizada uma melhor visualização das bactérias em amostras de
material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactérias coravam com este
método o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu
em 1935 sem ter conseguido que fosse dada a devida importância ao seu método de
coloração.
No entanto, com o tempo foi dada a devida importância a esta técnica, sendo muito
utilizada em algo tão importante como a Taxonomia e identificação de bactérias, sendo uma
técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.
A principal diferença entre Gram positivas e Gram negativas é o teor lipídico da sua
membrana. A parede celular das bactérias Gram negativas tem um teor lipídico elevado na sua
membrana externa e uma camada de peptidoglicano que envolve a membrana plasmática.
A parede celular das bactérias Gram positivas é principalmente constituída por uma
grossa camada de peptidoglicano. O seu teor lipídico é muito baixo, ou mesmo nulo
(característica rara em espécies bacterianas).
Método / Procedimento
Antes de efectuar a experiência e baseados nos conhecimentos teóricos anteriormente
descritos, elaboraram-se as seguintes hipóteses:
Se as bactérias Escherichia Coli forem Gram positivas, prevê-se que adquiram uma
coloração arroxeada, devido ao Corante Primário (Violeta de Genciana)
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O Objectivo do Óleo de Imersão é melhorar a nitidez da imagem.
Figura 10 - Bactéria Escherichia Coli ao ME 10 000x Figura 11 - Bactéria Escherichia Coli ao MOC 100x
Discussão
Durante todo o procedimento recorre-se a lavagens sucessivas da lâmina que contém
a porção colonial de Escherichia Coli. Todos esses passos têm o objectivo de caracterizar a
parede celular destes procariontes.
Figura 12 - Parede Celular Gram Negativa Figura 13 -Parede Celular Gram Positiva
Nas bactérias Gram positivas isto não se verifica, pois a parede celular destas é
constituída por uma espessa camada de peptidoglicanos, sem ser revestida pela bicamada
fosfolipidica. A camada de peptidoglicanos actua como barreira, impedindo a saída do corante
primário. Assim sendo, a cor destas células será a do Corante Primário.
Com os resultados obtidos, pôde verificar-se que, tendo as E.Coli adquirido uma
coloração avermelhada, estas são Gram negativas. Assim, a sua parede celular é constituída
por uma fina camada de peptidoglicanos, que está circundada por uma bicamada fosfolipídica,
idêntica à da membrana celular.
Referências
www.microbiologybytes.com
www.cientic.com
www.e-escola.pt
biotecnologia-na-escola.up.pt
www.cve.saude.sp.gov.br/htm/hidrica/Ecolinet.htm
www.science.uva.nl/research/molphot/research/sm/peterSMS.html
onubiol217.blogspot.com/2011/01/module-3-lab-08-section-2-genetic.html
NASCIMENTO, A., ESPREAFICO, E., LARSON, M., MONESI, N., ROSSI, N. – “Tecnologia
do DNA recombinante”, Universidade de S.Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, 2003
Correia, R., “Controlo da Expressão Genética em Procariotas”, Licenciatura em
Bioquímica ISCS-N, Biotecnologia – 3º ano
Martins, C., Ferreira, J., Siqueira, L., Ferreira, L., Bazzo, M., Franchini, M., Berro, O.,
Valle, S., “Técnica de Coloração de GRAM”, Ministério da Saúde, Secretaria de Políticas
de Saúde, Programa Nacional de DST e Aids, Brasília, 2001