Les Etapes de Diagnostic en Bacteriologi

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE LA SANTE, DE LA POPULATION ET DE LA

REFORME HOSPITALIERE
INSTITUT NATIONAL DE FORMATION SUPERIEURE PARAMEDICALE
- SETIF -
Mémoire professionnel de fin d’étude
Pour l’obtention de la licence professionnalisante
Option : Laborantine de Santé Publique
Thème
Les étapes de diagnostic en bactériologie
"L’ensemencement et l’incubation "
(Enquête réalisé aux niveaux de laboratoire bactériologie du CHU de Sétif et
laboratoire d’hygiène)
Directeurs de mémoire : Elaboré par :

 Mr. BOUROUBA. A. Melle : AITER SABRINA
Inspecteur Pédagogique Paramédical

INFSPM SETIF
 Dr. TACHI NAWAL

Maitre assistante en microbiologie
CHU de -Sétif-
Promotion 2016 - 2019

Aiter Sabrina
Remerciement
En premier lieu et avant tout, je tiens à remercie le bon dieu, qui ma à
donné la santé et la volonté d'entamer et de terminer ce mémoire, et la
force pour accomplir ce travail.
Paix et salut sur le prophète.
Avant de commencer la présentation de ce travail, je profite l’occasion pour

remercier toutes les personnes qui ont contribué de prés et de loin à la
réalisation de ce projet de fin d’études.
Toutes mes salutations à Mesdames et Messieurs les membres de jury.
Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance et toutes mes pensées de

gratitudes à notre professeur et notre chef d’option Mr « A, Bourouba »
votre bonté, votre modestie, votre compréhension, ainsi que vos qualités
professionnelles ne peuvent que susciter ma grande estime et profond
respect.
Ce travail ne serait pas aussi riche et n’aurait pas pu avoir le jour sans
l’aide et l’encadrement de Mr, « A, Bourouba » je le remercie pour la
qualité de son encadrement exceptionnel, pour sa patience, sa rigueur et sa
disponibilité durant ma préparation de ce mémoire.
Je présenter ma chaleur remerciements à mes encadreurs Dr « N, Tachi »

pour leurs aides, leurs conseils, je vous souhaite beaucoup de bonheur.
Je remercie également toutes les personnes qui m’ont fortement aidé à

réaliser ce travail.
Dédicace
Je dédie ce modeste travail et ma profonde gratitude à ma cher maman
Nora et mon père Moustapha pour l'éducation qu'ils m'ont prodigué; avec
tous les moyens et au prix de toutes les sacrifices qu'ils ont consentis à mon
égard, pour le sensé du devoir qu'ils mon enseigné depuis mon enfance,
pour leur amour, leur tendresse, leur soutien et leurs prières tout au long de
mes études.
A mon chère frère Islam pour son appui et son encouragement.
Ma très chère sœur Rofia pour leur encouragement permanent, et leur

soutien moral.
Ma très chère copine aya Mimi, pour Notre vieille amitié a soulevé la vérité
de vos positions avec moi, je vous aime tellement.
Mes camarades sahar, chahra, hana, assala ikbal, sofia, chourouk, assala,
manel, hadia, salma, widade, marwa.
A touts mes collègues de la promotion 2016/2019
Merci d’être toujours là pour moi.

Tables des matières
 Introduction
 Choix du thème
 Problématique de recherche
 Hypothèses de recherche
 objectif
Première partie : partie théorique

Chapitre I : « Démarche de l’examen bactériologique »
I.Introduction ....................................................................................................................... 6
II.Prélèvements .................................................................................................................... 6
II.1. Schéma de la démarche ............................................................................................ 8
III. Examen microscopique ............................................................................................. 9
III.1 Analyse cytologique .................................................................................................. 9
III.2 Examen microscopique bactériologique ................................................................ 11
III.3 Examen direct à l’état frais .................................................................................... 15
III.4 Examen microscopique après coloration ............................................................... 15
IV. Culture et isolement des bactéries .......................................................................... 18
IV.1 Milieux de culture ................................................................................................... 18
V. Stérilisation des milieux de culture ............................................................................ 31
VI. Méthodes d’isolement ............................................................................................ 31
VII. Identifications ........................................................................................................ 38
VII.1Principe tests d’orientation ................................................................................... 38
VII.2Autre tests .............................................................................................................. 44
VII.3Galeries biochimiques et automates d’identifications ........................................... 46
VIII. Conservation des souches ................................................................................... 48
VIII.1Conservation de courte durée .............................................................................. 48
VIII.2Conservation de longue durée .............................................................................. 48
Chapitre II : Etude bactériologique des produits pathologiques
I. Phase pré-analytique des analyses de microbiologie médicale ............................. 50
II. Généralités ............................................................................................................. 50
III. Hémocultures ......................................................................................................... 51
III.1 Contextes cliniques ................................................................................................. 51
III.2 Milieux d’hémoculture ........................................................................................... 52
III.3 Nature du milieu ..................................................................................................... 52
III.4 Prélèvements .......................................................................................................... 54
III.5 L’incubation des flacons ........................................................................................ 54
III.6 Traitement des flacons ensemencés ........................................................................ 54
IV. Diagnostic bactériologiques et suivi biologique des méningites bactériennes ...... 57
IV.1 Contexte clinique .................................................................................................... 57
IV.2 Prélèvement ............................................................................................................ 57
IV.3 Démarche diagnostique.......................................................................................... 58
V. Examen cytobactériologique des Urines ECBU .................................................... 62
V.1 Contexte clinique ................................................................................................... 62
V.2 Prélèvement ............................................................................................................ 62
V.3. Examen cytobactériologique .................................................................................. 63
VI. Examen bactériologique des selles......................................................................... 68
VI.1 Circonstances de demande ..................................................................................... 68
VI.2 Prélèvement ............................................................................................................ 69
VI.3 Examen macroscopique.......................................................................................... 69
VI.4 Examen microscopique .......................................................................................... 69
VII. Analyse cytobactériologique des pus ..................................................................... 75
VII.1Diagnostic bactériologique direct ......................................................................... 75
VIII.Isolement des bactéries anaérobies en bactériologie médicale ............................. 77
VIII.1Prélèvement .......................................................................................................... 77
VIII.2Examen direct....................................................................................................... 77
VIII.3Méthodes d’isolement........................................................................................... 77
VIII.4Incubation ............................................................................................................ 77
VIII.5Subcultures ........................................................................................................... 78
VIII.6Identification ........................................................................................................ 78
Chapitre III : L’antibiogramme
I.Introduction .................................................................................................... 79
II.Milieux de culture pour Antibiogramme ............................................................ 79
III.L’antibiogramme standard en milieu gélosé : méthode des disques ....................... 80
III.1Principe général .......................................................................................... 80
III.2Technique................................................................................................... 80
Deuxième partie : partie pratique

Chapitre I : Méthodologie de travail
I.Méthodologie de travail .................................................................................... 78
II.L’Objectif de recherche. .................................................................................. 78
III.Lieu de l’enquête ……………………………………………………………………………...78
IV.La durée de l’enquête ..................................................................................... 78
V.La population cible et échantillonnage............................................................... 78
VI.Les outils de l’enquête ................................................................................... 78
Chapitre II : Présentation, Analyse et interprétation des résultats
I.Présentation, Analyse et interprétation des résultats ............................................. 88
I.IPrésentation du laboratoire de bactériologie du CHU de Sétif.............................. 88
I.IIPrésentation générale du laboratoire d’hygiène ................................................. 88
II.Questionnaires destinés au personnel du laboratoire du CHU de Sétif ................... 89
III.La grille d’observation au niveau du laboratoire CHU de Sétif .......................... 109
IV.Questionnaire au niveau de laboratoire d’hygiène de Sétif................................. 118
V.La grille d’observation au niveau de laboratoire d’hygiène................................. 139
Discussion générale ......................................................................................... 149
Analyse globale ............................................................................................... 150
Vérification des hypothèses ............................................................................... 151
Conclusion
Suggestions
Référence bibliographique
Annexe
Liste des abréviations
AAF : aéro-anaérobie facultatif.

ECBC : examen cytobactériologique des crachats.
ECBU : examen cytobactériologique des urines.
mCCD : milieu Campylobacter-charbon.
ME VAG : milieu de Hugh et Leifson.
MEYP: milieu Mannitol-Egg yol K polymyxin B Agar.
MGG: coloration de May-Grunwald-Giemsa.
MH: Gélose de Mueller-Hinton.
SS : Salmonella Shigella.
TS : gélose Tryptone Soja.
TSH : gélose TS additionnée de sang de cheval.
UFC : Unités Format Colonie.
VF : gélose Viande-Foie.
LCR : Liquide Céphalo-rachidienne.
ADN : Acide Désoxyribonucléique.
BAAR : Bacille Acido-Alcoolo-Résistant.
BCP : Bromocresol pourpre.
BHI : milieu Cœur-Cerveau (Brain Heart Infusion).
CLED : milieu Cystéine Lactose Electrolytes Déficient.
CAT : milieu Campylobacter.
DDASS : Direction Départementale des Affaires Sanitaires et Sociales.
ECEP ou EPEC : E. Coli enteropathogénes.
ECP : effet cytopathogéne.
McF : Mac Ferland.
SMAC : milieu de Mac Conkey au Sorbitol.
TSI : Tri-Suger-Iron.
CMA : Concentration minimale Antibactérienne.
CMB : Concentration minimale bactéricide.
CMI : Concentration minimale inhibitrice.
DO : Densité optique.
ml: millilitre.
nm : nanomètre.
µl : microlitre.
PH : potentiel d’ion d’hydrogène.
Définition des concepts
 Les flagelles : Ce sont des organes locomoteurs spécialisés ils sont des structures
inconstantes chez les bactéries. Ils sont très rares chez les coques.
 Les spores bactériennes : Elles se forment à l'intérieur des cellules bactériennes,
d'où le nom d'endospores, ce ne sont pas des formes de dissémination mais des
formes de résistance.
 Les bactéries anaérobies strictes : Elles constituent un groupe dont la propriété
essentielle est de ne pas pouvoir se développer en présence d’oxygène.
 Les bactéries aérobies strictes : Désigne la famille des bactéries qui ne peuvent
vivre et se développer qu'en présence d'oxygène.
 Les bactéries aéro-anaérobies facultative : Désigne des bactéries, vivants
indifféremment en présence (respiration aérobie) ou en absence
(respiration anaérobie) d'oxygène.
 Les bactéries fastidieuses : La population fastidieuse se développe seulement après
une période initiale de croissance des bactéries ayant des exigences nutritives
simples.
 Clostridium : est un genre de bactérie à Gram positif, qui inclut plusieurs agents
pathogènes humains importants, y compris l'agent causal du botulisme.
 Campylobacter : qui signifie "bactéries courbées" est un genre de bactéries à Gram
négatif. Les Campylobacter apparaissent généralement en forme de virgule ou de s
et sont mobiles. La plupart des espèces de Campylobacter peuvent infecter les
humains et d’autres animaux et provoquer des maladies.
 Les entérobactéries : famille des Enterobacteriaceae sont des bacilles Gram
négatif retrouvés partout dans le sol, dans l’eau, et surtout dans l’intestin (entéro-)
de l’homme et des animaux.
 Escherichia Coli : est une bactérie coliforme du genre Escherichia, anaérobie
facultative, à Gram négatif, qui se trouve couramment dans le bas de l'intestin des
organismes à sang chaud (endothermes).
 Les shigelles : les bactéries du genre Shigella, sont des Enterobacteriaceae
pathogènes strictes, rencontrées exclusivement chez l'être humain.
 Les salmonelles : (Salmonella) forment un genre de protéobactéries appartenant à

la famille des entérobactéries. Elles mesurent 0,7 à 1,5 μm de diamètre,
pour 2 à 5 μm de longueur avec un flagelle. Elles provoquent chez l'espèce
humaine des maladies telles que la fièvre typhoïde, la fièvre paratyphoïde et
la salmonellose, une des principales causes de toxi-infection alimentaire
collective (TIAC).
 Yersinia entérocolitica : est une bactérie en forme de bacille à Gram négatif,
appartenant à la famille des Enterobacteriaceae. Il est mobile à des températures de
22 à 29 ° C (72 à 84 ° F), mais devient non motile à la température corporelle
normale. L’infection à Y. entérocolitica est la cause de la yersiniose, une maladie
transmise par les animaux qui survient chez l’homme.
 Pseudomonas : sont des bacilles fins, rectilignes ou plus rarement incurvés Gram(-
), mobiles par une ciliature polaire, rarement immobiles, non sporulés. Cultivant
bien sur milieu ordinaire.
 Mycobactéries : Les mycobactéries (la famille des Mycobacteriaceae) sont
des bacilles fins, quelquefois incurvés, ne se décolorant ni sous l'action des acides
forts, ni sous l'action de l'alcool. Elles sont ainsi définies comme des « bacilles
acido-alcoolo-résistants » ou BAAR.
 Haemophilus : Haemophilus est un genre de bactéries coccobacilles Gram-
négatives, pléomorphes, appartenant à la famille des Pasteurellaceae. Bien que les
bactéries Haemophilus soient généralement de petits coccobacilles, elles sont
classées dans la catégorie des bactéries pléomorphes en raison du large éventail de
formes qu’elles prennent parfois.
 Brucella : Brucella est un genre de bactérie à Gram négatif nommée d'après David
Bruce (1855–1931). Ils sont petits (0,5 à 0,7 sur 0,6 à 1,5 µm), non encapsulés, non
mobiles, des coccobacilles intracellulaires facultatifs.
 Legionella : Le genre Legionella est un groupe pathogène de bactéries à Gram
négatif qui comprend l’espèce L. pneumophila, provoquant une légionellose (toutes
les maladies causées par Legionella).
 Staphylocoques : Staphylococcus est un genre de bactérie à Gram positif de la
famille des Staphylococcaceae dans l'ordre Bacillales. Au microscope, ils
apparaissent sphériques (cocci) et forment des grappes ressemblant à du raisin. Les
espèces de Staphylococcus sont des organismes anaérobies facultatifs (capables de
croître en aérobiose et en anaérobiose).
 Streptocoques : les streptocoques appartiennent à la famille des streptococcaceae.
Sont des cocci Gram+, immobiles, asporulés, ils sont souvent en chainettes+/-
longues parfois (en diplocoques).
 Les entérobactéries : Les Entérobactéries (famille des Enterobacteriaceae) sont des
retrouvés partout dans le sol, dans l’eau, et surtout dans l’intestin (entéro-) de l’homme
et des animaux, sont des bacilles Gram (-), mobiles ou immobiles, quelquefois
capsulés.
Les étapes de diagnostic en bactériologie :
« l’ensemencement et l’incubation »
Introduction
Le domaine du diagnostic en microbiologie médicale ou clinique recouvre
essentiellement la détection par des méthodes directes ou indirectes des micro-organismes
responsables d’une infection, et la détermination de leur sensibilité vis-à-vis d’agents
antimicrobiens destinés à les prévenir ou à les combattre.
Les méthodes directes, regroupent les techniques qui permettent de mettre en évidence
tout ou une partie de la bactérie. Ces méthodes mettant en évidence les bactéries dans leur
intégralité sont basés principalement sur l'examen microscopie à l'état frais ou après
coloration et sur la culture par l'isolement sur un milieu artificiel liquide ou solide, et
l’incubation dans des meilleures conditions Pour garantir la bonne identification de la
bactérie en cause et la réalisation de l’antibiogramme pour tester la sensibilité de la souche
bactérienne. La détection d’antigènes spécifiques de la bactérie ainsi que les méthodes de
mise en évidence d’acides nucléiques (ADN ou ARN) spécifiques de la bactérie
constituent les autres méthodes de diagnostic direct.
Les techniques de diagnostic indirect correspondent aux techniques de détection

d’anticorps développés par l’organisme infecté en réponse à l’agression par la bactérie
pathogène .il s’agit dans ce cas des méthodes de sérodiagnostic.
Choix du thème
Durant mon cursus pédagogique, comme une laborantine de santé publique au niveau de
l’institut National de La Formation Supérieure Paramédical de Sétif, et à l’issue des Trois
années de formation et en vue de la réalisation d’un mémoire de fin d’études. Mon choix à
porter sur un thème relatif au diagnostic en bactériologie.
Pendant mon passage aux différents laboratoires de bactériologie. J’ai pu assister à la

réalisation de plusieurs techniques d’études bactériologique de différents prélèvements
biologique, en l’occurrence : LCR, Pus, Selles, Urines, Sang et tissus provenant de patients
hospitalisés et non hospitalisés.
Ce qui à attiré mon attention est l’étude les étapes de la culture permettant l’isolement de
la bactérie et j’ai voulu vérifier le déroulement des techniques d’ensemencement et
d’incubation des échantillons. J’ai décidé de réaliser le thème suivant :
« Les étapes de Diagnostic en bactériologie : L’ensemencement et L’incubation »
Ce qui permettra de décrire le déroulement et les conditions de ces étapes dans différents
laboratoires.ces étapes qui sont d’importance cruciale pour la bonne identification
bactérienne tout en espérant que ce modeste travail sera considéré comme un outil qui
contribuera objectivement à l’amélioration de la qualité des prestations de soins en
laboratoire de bactériologie médicale.
Problématique
Le diagnostic bactériologique est un ensemble de moyens permettant l’identification de

la bactérie responsable de l’infection. Ce diagnostic est soit un diagnostic direct ou bien
indirect.
Le diagnostic direct est le seul diagnostic de certitude, car il permet la mise en évidence
de la bactérie elle-même, sa culture ou son isolement permet l'identification ultérieure
mais aussi sert à préciser sa sensibilité aux antibiotiques par un antibiogramme.
L'examen cytobactériologique d'un produit pathologique débute par l'examen

macroscopique, puis l'examen microscopique. Simultanément cet examen microscopique,
est ensemencé le produit pathologique dans des milieux de culture différents soit des
Milieux spécifiques ou appropriés et l’incubation de ces milieux dans des bonne conditions
(Ph, atmosphère, température, etc.) permet d'isoler un ou plusieurs bactéries.
Le déroulement de ces deux étapes (l'ensemencement et l'incubation) est très important

pour une meilleure identification.
Mais dans la situation observée, il y a des différentes techniques d’ensemencement et

d’incubation, utilisés aux niveaux des différents laboratoires de bactériologie médicale à
Sétif.
Ce changement permet d’obtenir une insuffisance d’identification de l’agent responsable

de l’infection.
Durant mon stage pratique à plein temps et cursus de formation au niveau de laboratoire
bactériologique de CHU du Sétif, et laboratoire d’hygiène.
Certains problèmes ont été recensés ayant un impact négatif sur l’activité dont il serait
nécessaire de les énumérer à savoir :
- le non respect des étapes du diagnostic bactériologique. Ce qui m’a poussé à poser la
question suivante :
* Pourquoi le diagnostic bactériologique demeure insuffisant malgré les efforts

déployés ?
Hypothèses
- L’insuffisance de formation théorique et pratique concernant l’ensemencement et

l’incubation.
- l’insuffisance de moyens assurant la bonne pratique de l’ensemencement et l’incubation.

Objectif
Décrire les différentes techniques de l’ensemencement et les conditions de l’incubation
des différents prélèvements au sein des laboratoires de bactériologie médicale dans
lesquels j’ai effectué mon stage de formation afin de ressortir les anomalies et les
insuffisances dans le déroulement de ces deux étapes auprès des techniciens de laboratoire
.
Objectif secondaire :
Proposer des solutions pour garantir le bon déroulement de ces étapes de diagnostic
bactériologique.
Partie théorique
Chapitre I :
« Démarche de l’examen
bactériologique »
Partie théorique chapitre I :
examen microscopique bactériologique
I. Introduction :
Les moyens de diagnostiquer une infection bactérienne sont de deux ordres, les
méthodes de diagnostic direct et les méthodes de diagnostic indirect.
Les méthodes directes, regroupent les techniques qui permettent de mettre en évidence
tout ou une partie de la bactérie. Les méthodes mettant en évidence les bactéries dans leur
intégralité sont basées principalement sur les techniques de microscopie en l’absence de
coloration (l’état frais), ou après coloration, et sur les techniques de culture sur milieu
artificiel. La détection d’antigènes spécifiques de la bactérie ainsi que les méthodes de
mise en évidence d’acides nucléiques (ADN ou ARN) spécifiques de la bactérie
constituent les autres méthodes de diagnostic direct.
Les méthodes de diagnostic indirect, correspondant aux techniques de détection
d’anticorps développés par l’organisme infecté en réponse à l’agression par la bactérie
pathogène. Il s’agit dans ce cas des méthodes de sérodiagnostic. Les méthodes indirectes
ne seront pas abordées dans ce chapitre. (1)
II. Prélèvement :
Les objectifs amenant à effectuer un prélèvement de liquide biologique ou de tissu pour
une analyse bactériologique, afin de détecter directement la bactérie peuvent répondre à
plusieurs objectifs. Le plus fréquemment, il s’agit pour le laboratoire de mettre en évidence
la ou les bactéries responsables d’une infection, d’effectuer une identification précise du ou
des pathogènes et de tester sa (leurs) sensibilité (s) aux antibiotiques habituellement actifs
sur cette ou ces bactérie (s). Dans certains cas, il s’agit de s’assurer que la bactérie
initialement responsable de l’infection pour laquelle un traitement antibiotique a été
entrepris est bien éradiquée. Dans d’autre cas, il peut s’agir de rechercher un portage
bactérien.
Ainsi, les prélèvements permettent une analyse bactériologique sont très divers. Ils
dépendent du site anatomique de l’infection, mais peuvent correspondre à des liquides
biologiques dans lesquels la bactérie ou des antigènes bactériens peuvent être présents. Un
élément majeur caractérise ces prélèvements. Il s’agit de la présence éventuellement,
associée d’une flore bactérienne ou d’une contamination par cette même flore lors du
prélèvement. Certains prélèvements proviennent de sites normalement stériles (LCR,
liquide articulaire, sang, biopsies, etc.), pour lesquels une contamination est très peu
probable si la désinfection cutanée préalable au prélèvement a été correctement exécutée.
L’interprétation de ces prélèvements est relativement aisée. Dans d’autres cas.
6
Le prélèvement provient d’un site anatomique normalement stérile mais la contamination

par une flore endogène est pratiquement obligatoire (par exemple : les prélèvements
pulmonaires profonds comme les brossages distaux même s’ils sont protégés).
Enfin lorsque la bactérie responsable de l’infection est associée à une flore endogène,
c’est le cas dans les infections digestives, les infections cutanées, les angines, etc. La
présence de cette flore va interférer inévitablement avec l’isolement de la bactérie ce qui
nécessitera l’utilisation de milieux sélectifs et/ou de milieux d’enrichissement. D’autre
part, il est vrai, essentiellement dans les infections cutanées, qu’il faut distinguer les
prélèvements superficiels des prélèvements profonds, seuls ces derniers présentant un
intérêt médical réel.(1)
II.1 Schéma de la démarche :

La démarche classique de l’analyse effectuée en laboratoire pour la mise en évidence
d’une bactérie, à partir d’un prélèvement, est schématisée à la figure 01 :
7
Prélèvement - Analyse moléculaire ?
- Recherche d’antigènes ?
Analyse cytologique Analyse bactériologique
-Examen quantitatif :
(Numération des éléments figurés)
-Examen qualitatif :
*Coloration de MGG
Examen direct
*Coloration de GRAM ou autre coloration
Mise en culture
Isolement Enrichissement sur bouillon
Culture pure
Identification bactérienne Conservation
Antibiogramme
Figure 01 : Schéma de la démarche.
8
III. Examen microscopique :

L’analyse d’un prélèvement effectué dans un but diagnostique est, règle générale, une
analyse à la fois cytologique et bactériologique. Ainsi, l’examen microscopique est une
étape clé dans la démarche diagnostique des infections bactériennes.(1)
III.1 Analyse cytologique :

Cette analyse cytologique doit répondre à un deux objectifs, en fonction de la nature de
l’échantillon, il peut s’agir d’une analyse quantitative qui va permettre de répondre en
nombre l’élément figurés par unité de volume (millimètre cube ou microlitre, millilitre).
Cette numération est effectuée pour les prélèvements de nature liquide (liquides
céphalo-rachidiens, urines liquides articulaires, liquides pleuraux, etc.). Une analyse
qualitative, précisant la nature des éléments figurés observer, sera effectuée sur la plupart
des prélèvements précédemment cités lorsqu’une réaction cellulaire aura été mise en
évidence. Cette analyse qualitative sera quant à elle également effectuée pour les
prélèvements de nature solide (biopsies, tissus, écouvillonnages, etc.)
Lorsque des éléments figurés seront présents, la richesse en ces éléments sera évaluée
(rares, présence, nombreux), et leur nature sera précisée.
Dans le cas particulier les prélèvements respiratoires, l’appréciation de la qualité du

prélèvement.
Sera basée sur une évaluation quantitative du nombre de leucocytes et de cellules

épithéliales par champ microscopique (objectif 10). (1)
III.1.1. Analyse Quantitative :

La quantification des éléments est effectuée manuellement ou bien, plus récemment, en
utilisant des systèmes automatiques de comptage, en particulier pour les prélèvements
d’urine.
A. Systèmes manuels de comptage :

Ces systèmes font appel à des hémocytomètres ou hématimètres communément appelés
cellules. Ces cellules sont soit réutilisables comme les cellules de Lemaur ou de Malassez
par exemple, ou bien à usage unique comme les Kovaslide ®. Le liquide biologique est
analysé directement ou après ajout d’un colorant des noyaux (bleu de toluidine) qui dans
certains cas permet de faciliter la détection des éléments figurés.(1)
9
a. Cellules réutilisables :
Les différentes cellules sont constituées de la même façon. Il s’agit d’une épaisse lame
porte Object en verre, quadrillée en son centre qui présente de part et d’autre des plateaux
surélevés qui permettent, lorsque ceux-ci reçoivent une lamelle, de définir un volume de
liquide défini propre à chaque cellule.
Les cellules utilisées dépendant des habitudes de l’utilisateur ainsi que de la cellularité
des milieux étudiés. Pour les milieux riches en cellules, l’hématimètre de Thoma permet
l’étude d’un volume de 0.1 microlitre et la cellule de Malassez, l’étude d’1 microlitre. Pour
des milieux ou les éléments figurés sont rares. Des volumes plus importants peuvent être
analysés ; la cellule de Lemaur permet d’étudier jusqu’à 40 microlitres et celle de Nageotte
par exemple jusqu’à 50 microlitres. (1)
b. Cellules à usage unique :

Les cellules à usage unique type Kovaslide® présentent l’avantage de regrouper sur un
même support, 10 cellules. Ce support étant jeté après utilisation sans désinfection; comme
doivent l’être les cellules précédentes. Le volume étudié d’1 microlitre. (1)
c. Utilisation de systèmes automatiques de comptage :

Les systèmes automatiques de comptage utilisent l’urine native avec un volume
d’échantillon, analysé voisin de 0.8 à 1 millilitre. Ces systèmes sont basés soit sur une
coloration des éléments urinaires avec différents colorants fluorescents, qui sont ensuite
comptés et différenciés par cytométrie en flux, soit par cytométrie en flux avec capture
d’images associée à une reconnaissance automatique des particules. Dans ce dernier cas,
toutes les particules sont numérisées et mémorisées. Ces systèmes sont connectables au
système informatique de laboratoire. (1)
III.1.2 Analyse qualitative :

Afin de connaitre avec précision la nature des éléments figurés observés lors de l’analyse
quantitative, l’étalement du prélèvement avant ou après centrifugation suivi d’une
coloration, est indispensables.
La finesse de l’étalement du frottis est importante pour une observation de qualité. Ce

frottis doit être réalisé, dans la mesure du possible, rapidement après le prélèvement car
certains éléments cellulaires se dégradent vite, en particulier dans les liquides pauvres en
protéines comme les urines ou le liquide céphalo-rachidien. La fixation des frottis est
effectuée en recouvrant de méthanol la préparation jusqu’à évaporation.
10
Les méthodes de centrifugation douces sont intéressantes pour les liquides contenant peu
de cellules et l’utilisation d’une cytocentrifugeuse permet d’obtenir un dépôt cellulaire de
très bonne qualité.
La coloration cytologique effectuée est la coloration de May-Grunwald-Giemsa. La

méthode classique consiste à déposer sur le frottis préalablement fixé la solution de May-
Grunwald et à la laisser agir 5 minutes. Après un lavage à l’eau d’1 minute, la solution de
Giemsa est laissée en contact 15 minutes.
Après un dernier lavage à l’eau, la préparation est laissée sécher puis est observée à
l’immersion. Cette coloration, permet de colorer les noyaux en bleu, le cytoplasme en rose
et les bactéries lorsqu’elles sont présentes en bleu. Il existe des colorations dérivant de la
méthode de May-Grunwald-Giemsa qui sont plus rapides et qui permettent d’obtenir un
résultat satisfaisant en quelques minutes.les frottis réalisés dans ce conditions sont
également colorés par la coloration de Gram qui ne permet qu’une observation grossière de
la morphologie des cellules. (1)
III.2. Examen microscopique bactériologique :

L’examen microscopique en bactériologie peut être effectué sans coloration de
l’échantillon, par observation directe entre lame et lamelle (technique de l’état frais), ou
bien après coloration de l’échantillon, ou encore après réaction d’immunofluorescence. Cet
examen renseigne sur la présence de bactéries confirmant l’origine bactérienne d’une
infection (morphologie, propriétés tinctoriales particulières après coloration de Gram ou
coloration de Zeil - Nielsen) ,ce qui représente un élément majeur pour une prise en charge
thérapeutique adaptée. Ainsi, cet examen oriente sur une famille de bactéries ou un genre
bactérien, permettant ainsi d’adapter ou de modifier une antibiothérapie. En fonction du
prélèvement ou du contexte clinique, il peut dans certains cas, en quelques minutes,
identifier de façon quasi-certaine un pathogène.
L’examen renseigne également sur la quantité de bactéries présentes dans le

prélèvement. Si on estime que lors d’une observation à un grossissement de 1000 fois
(oculaire de 10 et objectif 100 à l’immersion), le volume observé correspond à 1/1000 de
microlitre, alors l’estimation de la qualité de bactéries visibles lors d’un examen direct peut
être donnée selon le tableau - 01(1) :
11
Estimation de la qualité de bactéries par ml de prélèvement en fonction de la

qualité de bactéries visibles au microscope à un grossissement de 1 000 fois.
Nombre de bactéries par champ Quantité de bactéries par ml
1 bactérie par 100 champs 104 bactéries/ml (seuil de sensibilité
estimé du microscope optique)
1 bactérie par 10 champs 10⁵ bactéries/ml
1 bactérie par 1 champ 10⁶ bactéries/ml
10 bactéries par champ 10⁷ bactéries/ml
100 bactéries par champ 10⁸ bactéries/ml
Tableau 01: Estimation de la qualité de bactéries par ml de prélèvement.
III.3. Examen direct à l’état frais :

Les méthodes basées sur la technique de l’état frais correspondent à l’observation d’un
matériel biologique, ou d’une suspension bactérienne entre lame et lamelle sans fixation,
préalable du matériel par la chaleur ou l’alcool. (1)
a. Etat frais :
Une méthode rapide consiste à observer entre lame et lamelle une suspension bactérienne
à l’objectif 40. Les renseignements obtenus par cette observation concernent
principalement la mobilité des bactéries.il faut cependant être prudent sur le fait que des
courants de convection, dans ces conditions, peuvent être présents et perturber
l’observation. En fonction de la mobilité observée, si elle est présente, on peut préjuger du
type de ciliature de la bactérie (monotriche, péritriche, etc.) ce qui oriente sur la bactérie en
cause. Ainsi par sa mobilité, P. aeruginosa, par exemple, peut se distinguer aisément d’une
entérobactérie. Cet examen peut s’avérer très utile lors de la positive d’une hémoculture.
Effet, un doute peut persister sur l’orientation d’identification, après coloration de Gram
d’un étalement du bouillon d’hémoculture coloré. Une mobilité importante avec des
bacilles qui traversent le champ microscopique, est en faveur de P.aeruginosa alors qu’une
entérobactérie sera mobile sur elle même dans la majorité des cas.
Certaines bactéries de mobilité caractéristique sont également repérées par la technique

de l’état frais comme les vibrions ou les campylobactéries.
Cet examen peut être effectué après avoir luté la lamelle sur la lame, c’est-à-dire après
avoir déposé sur la totalité du pourtour de la lamelle un peu de paraffine préalablement
fondue. Cette méthode permet de « sceller » la lamelle et ainsi d’empêcher les courants de
12
convection. Ainsi, dans ces conditions, une observation à l’immersion peut être effectuée.
(1)
b. Etats frais pour la mise en évidence d’une capsule par méthode à

l’encre de chine :
La mise en évidence d’une capsule bactérienne peut être effectuée par coloration
« négative », les capsules ne se colorant pas en pratique quotidienne, cette technique est
principalement utilisée pour la mise en évidence de la capsule de cryptococcus
neoformans ; une levure impliquée dans les infections du système nerveux central chez le
patient immunodéprimé, en particulier pour les malades VIH positifs. Un état frais après
coloration du produit pathologique prélevé (en l’occurrence le liquide céphalo-rachidien
pour les cryptocoques) peut être réalisé. Une goutte du liquide pathologique et une goutte
d’encre de chine sont déposées cote-à-cote sur une lame.une lamelle vient recouvrir les
deux gouttes et les deux constituants se mélangent. Lorsque ces levures capsulées sont
présentes, elles sont visibles par la présence d’un large halo clair, correspondant à la
capsule fungique, autour d’une levure éventuellement bourgeonnante. (1)
c. Etat frais sur un microscope à fond noir :

Un état frais particulier permet, lorsque le microscope dispose d’un condensateur
particulier, d’observer les bactéries par contraste. En effet, les rayons lumineux émis par la
source d’éclairage sont déviés par réflexion sur un miroir de telle sorte qu’ils ne peuvent
pénétrer l’objectif. Lorsqu’un élément est présent sur ce trajet lumineux, il modifie le trajet
des rayons lumineux qui se trouvent réfractés et pénètrent dans l’objectif. Les éléments
apparaissent brillants sur fond noire. Cette technique est intéressante pour les bactéries
mobiles qui sont difficilement colorables par les colorations classiques, ainsi les
spirochètes et en particulier les tréponèmes et les leptospires sont facilement repérables à
l’aide de cette méthode avec visualisation de la mobilité et présence de spires régulières
pour les premiers et mise en évidence d’une mobilité par flexion pour les seconds. (1)
III.4. Examen microscopique après coloration :

Les techniques les plus communément utilisées au laboratoire de bactériologie médicale
font appel à des colorations. La préparation est fixée sur une lame puis colorée. Plusieurs
types de coloration existent. Les colorations non différentielles, anciennes, peu utilisées en
pratique, colorent toutes les bactéries de la même façon sans distinction si ce n’est qu’elles
permettent de mieux visualiser les morphologies bactériennes et de préciser les
agencements des bactéries les unes avec les autres.
13
Les colorations différentielles qui distinguent les bactéries en fonction de la structure de

leur paroi. Deux colorations de référence sont employées.la coloration de Gram distinguant
bactéries à Gram positif et bactéries à Gram négatif, et la coloration de Zeil-Nielsen
mettant en évidence les bacilles acido-alcoolo-résistants. Certaines colorations spéciales
seront ensuite abordées. (1)
A. Colorations non différentielles :
a. Coloration au bleu de méthylène :

La coloration au bleu de méthylène est réalisée en faisant couler une solution de bleu de
méthylène sur un frottis correctement fixé. Le temps de contact est d’une minute. La lame
est ensuite rincée à l’eau du robinet, séchée entre deux feuilles de papier buvard puis
observée à l’immersion. Les structures colorables apparaissent bleues, Néanmoins, cette
méthode n’est que peu informative. (1)
b. Coloration à l’acridine orange :

La coloration à l’acridine orange est réalisée en déposant sur le frottis une solution
aqueuse à 1% d’acridine orange pendant 15 minutes. L’acridine orange est un agent
intercalant qui vase fixé sur les acides nucléique, après rinçage à l’eau, puis séchage, la
lame est observée à l’objectif X40 à l’aide d’un microscope à fluorescence. Cette méthode
est intéressante pour détecter des bactéries dans des produite pathologiques
(1)
pancibacillaires.
B. COLORATION différentielles :
a. Coloration de Gram :
C’est la coloration de référence en bactériologie ; Elle est réalisée comme suit :
- Sur frottis fixé à la chaleur puis à l’alcool.

- recouvrir la lame de violet de gentiane : 1 minute.
- jeter le violet de gentiane.
- recouvrir de Lugol : 1minute.
- décolorer à l’alcool, la lame est tenue inclinée. La durée de décoloration à l’alcool est
variable selon l’épaisseur du frottis. En pratique, la durée de décoloration est suffisante
lorsque ce qui s’écoule en bas de la lame inclinée est devenu clair.
- stopper la décoloration par un nouveau lavage à l’eau.
14
- recouvrir la lame de fuchsine diluée 30 secondes à 1 minute.

- laver à l’eau.
- sécher entre deux feuilles de papier filtre, puis à la chaleur.
- examiner à l’immersion.
Les bactéries à gram positif doivent apparaitre colorées en violet et les bactéries à gram
négatif en rose. Lorsque la coloration est effectuée à partir d’un produit pathologique
contenant des cellules ou des leucocytes, la coloration des noyaux de ces cellules doit
apparaitre violette et le cytoplasme rose.
Des variantes de cette coloration existent dans lesquelles, le violet de gentiane est
remplacé par le cristal violet. La décoloration à l’alcool, peut être remplacée par une
décoloration avec un mélange alcool-acétone. Enfin, la fuchsine peut être remplacée par la
safranine.
Des techniques de coloration utilisant des appareils à colorer par spray sont également
disponibles. Elles offrent l’avantage de consommer moins de colorent et d’éviter le rejet de
colorants sous forme liquide.
Lorsque les prélèvements sont hémorragiques, les nombreuses hématies peuvent genre
l’observation microscopique. Dans ce cas, les frottis sont immergés pendant 5 minutes
dans le liquide de carnoy (24ml de chloroforme, 8 ml d’acide acétique, 100 ml d’alcool
éthylique qsp). (1)
Figure 02 : principe de Coloration de Gram
15
b. Coloration de Zeil Nielsen, coloration des bacilles acido-alcoolo-

résistants (B.A.A.R) :
C’est la coloration de référence des mycobactéries, elle est réalisée classiquement comme
suit et le résultat obtenu à chaque étape est schématisé dans la figure 03. Dans variantes de
cette méthode existent en particulier la coloration de Kinyoun et Gabett.
-Sur frottis fixé à la chaleur puis à l’alcool méthylique.

- recouvrir la lame de fuchsine ; chauffer par intermittence pendant 10 à 15 minutes,
jusqu’à émission de vapeur (pour la technique à froid, la durée de contact entre la fuchsine
et la préparation est de 3 heures).
- laver à l’eau.
- décolorer à l’acide sulfurique dilué au ¼ pendant 1 minute.
- laver à l’eau.
- décolorer à l’alcool à 95° pendant 10 minutes.
- laver à l’eau.
- contre colorer au bleu de méthylène pendant 2 minutes.
- laver à l’eau.
Les bacilles acido-alcoolo-résistants apparaissent roses sur fond bleu. (1)
Figure 03 : Principe de coloration de Zeil Nielson.
16
C. Coloration spéciales :
Certaines colorations spéciales permettent de mettre évidence des éléments de la cellule
bactérienne. (1)
a. Coloration des flagelles par méthode de Rhodes :

A partir d’une suspension d’une culture jeune à peine trouble réalisée en eau
déminéralisée, laisser s’écouler une goutte de la suspension sur une lame propre, inclinée à
45° environ.
La réalisation de cette coloration est décrite ci-dessous :

- laisser sécher la lame à l’étuve à 37°C.
- faire agir le mordant de Rhodes : 5 minutes (mordant de Rhodes, tanin, alun de
potassium, huile d’aniline, chlorure ferrique.)
- laver à l’eau distillée.
- sécher.
Les flagelles et les corps bactériens sont colorés en brun-noir. (1)
b. Coloration des spores bactériennes par la méthode de Moeller :

La coloration des spores bactériennes par la méthode de Moeller est effectuée comme
suit :
Sur un frottis fixé à la chaleur puis à l’alcool :
- recouvrir d’acide chromique à 5% pendant 5 minutes.

- laver à l’eau.
- colorer à la fuchsine à chaud (60°C) 3 à 4 émissions de vapeurs pendant 10 minutes.
- décolorer à l’alcool absolu rapidement.
- stopper la décoloration par lavage à l’eau.
- recolorer au bleu de méthylène pendant 3 minutes.
- laver à l’eau.
- sécher.
Les spores sont rouge-rose, les corps bactériens bleus. (1)
17
IV. Culture et isolement des bactéries :

Les bactéries d’intérêt médical les plus fréquemment responsables d’infection arrivent à
se développer sur des milieux de culture. Ces milieux de culture sont indispensables à la
multiplication bactérienne ce qui permet par la suite une identification bactérienne ainsi
que l’étude de la sensibilité aux antibiotiques lorsque la bactérie est isolée en culture
pure.(1)
IV.1. Milieux de culture :

Les milieux de culture utilisés en bactériologie doivent contenir les éléments nécessaires
à la survie et à la multiplication des bactéries et doivent posséder les propriétés physico-
chimiques convenant à cette culture (pH en particulier). Les milieux sont de différents
types. Il s’agit soit de milieux de base. Permettant la croissance d’espèces non ou peu
exigeantes, soit de milieux enrichis par l’addition de diverses substances (sérum, œuf,
sang, vitamines, etc.) qui autorisent la croissance de bactéries plus exigeantes. Il peut s’agir
également de milieux rendus sélectif par addition d’antibiotiques, d’antiseptiques ou de
colorants qui vont inhiber les bactéries sensibles à ces composés. (1)
IV.1.1. Milieux de base :

Le milieu liquide de base est représenté par le bouillon nutritif ordinaire qui est composé
de trois composants principaux, les peptones, les extraits de viande et les extraits de levure.
Les peptones sont des hydrolysats enzymatiques de protéines animales ou végétales riches
en acides aminés et en petits peptides. En fonction des enzymes utilisées, les compositions
des peptones et leurs propriétés sont différentes. Les extraits de viande apportent des sels
minéraux, des vitamines, des protéines peu dégradées et des glucides. Les extraits de
levure, quant à eux, représentent une source d’acides aminés et de vitamines
hydrosolubles. Du chlorure de sodium est habituellement ajouté à la concentration de 5g/l.
Les milieux se présentent sous forme liquide ou solide. Par addition, dans les milieux
liquides, d’un agent solidifiant, on obtient des milieux solides appelés communément
gélose. En effet, l’agent le plus souvent utilisé est l’agar-agar (agar ou gélose) qui est un
polysaccharide complexe provenant d’algues marines. Cette substance permet à des
concentrations de 15 à 20 g/l, de solidifier les milieux liquides. Cette gélose fond à 80°C,
reste en surfusion à des températures voisines de 50°C et se solidifie à des températures
inférieures. D’autres agents solidifiant peuvent être utilisés, comme les œufs coagulés dans
le milieu de Loewenstin-Jensen utilisé pour la recherche des mycobactéries et le sérum
coagulé pour le milieu de Loeffler utilisé pour la recherche du bacille de la diphtérie.
18
Les milieux sont commercialisés soit sous forme de poudres déshydratées, soit prêts à
l’emploi en tube ou en boîte de Pétri. Pour les poudres déshydratées, les milieux doivent
être reconstitués selon les instructions du fabricant et doivent être autoclaves avant
utilisation, sauf dans certains cas lorsque les milieux contiennent des composées
thermolabiles. Les milieux prêts à l’emploi présentent l’avantage d’être de qualité
constante et de garantir la croissance d’un certain nombre de bactéries testées avant mise
sur le marché des lots fabriqués, cela bien évidemment sous la condition d’avoir été
stockés selon les recommandations du fabricant et d’être utilisés dans leur période de
validité. (1)
IV.1.2. Milieux d’enrichissement :

Ces milieux permettent de favoriser une croissance bactérienne à partir de prélèvements
paucimicrobiens. Il s’agit en général de milieux liquides riches permettant le prélèvement
d’un maximum de bactéries y compris des milieux permettant le développement de
bactéries anaérobies strictes. Parmi les plus utilisés, le bouillon nutritif, le milieu de
Schaedler, le milieu cœur-cerveau (BHI, Brain Heart Infusion), le milieu de Rosenow, des
milieux d’enrichissement peuvent également être utilisés pour favoriser le développement
de certaines bactéries de façon préférentielle aux bactéries présentes dans des flores. Il
s’agit dans ce cas de milieux d’enrichissement sélectifs. Ainsi la recherche par exemple de
bactéries enteropathogénes dans les coprocultures utilise ces milieux (milieu de Muller-
Kauffmann, eau peptonée alcaline, etc.) le milieu de Muller-Kauffmann ou bouillon de
base tétrathionate est un milieu d’enrichissement sélectif pour les Salmonelles contenant de
la bile et du vert brillant.
Composition du bouillon nutritif :

- extrait de viande de bœuf 1 g/L.
- extrait de levure 2g/L.
-peptone 5g/L.
- chlorure de sodium 5g/L.
- ph 7,4 ± 0,2.
La composition du bouillon de Schaedler est la suivante :

- bouillon tryptone soja 10g/L.
- peptone spéciale 5g/L.
- glucose 5g/L.
- chlorhydrate de cystéine 0,4 g/L.
- hémine 0,01 g/L.
19
- tampon tris 0,75 g/L.

- ph 7,4 ± 0,2.(1)
IV.1.3. Milieux d’isolement :

Les milieux d’isolement, contrairement aux précédents, sont des milieux solides qui
permettent d’obtenir des colonies isolées permettent d’effectuer les tests d’identification ou
d’étudier la sensibilité aux antibiotiques des bactéries d’intérêt médical, seules les géloses
les plus couramment utilisées seront abordées. (1)
1) Géloses de base :
a. Gélose nutritive :
Sa composition est la suivante :
- extrait de viande de bœuf 1g/L.

- peptone 5g/L.
- chlorure de sodium 5g/L. Figure04 : Gélose nutritive.
-agar 15g/L.
- PH 7, 4 ± 0, 2. (1)
b. Gélose tryptone Soja (TS):

Milieu d’usage courant adapter à la culture des germes exigeants. Sa composition est la
suivante :
- tryptone (hydrolysat trypsique de caséine) 15g/L.

- peptone de soja 5g/L.
- agar 15g/L.
- pH 7,3± 0,2.(1)
c. Gélose de base Columbia :

Milieu hautement nutritif pour la culture des germes exigeants. Sa composition est la
suivante :
- peptone (hydrolysat pepsique de viande) 23g/L.

- amidon 1g/L.
20

- agar 10g/L.
- pH 7,3± 0,2.(1)
d. Gélose CLED (Cystine-Lactose-Electrolyte déficient) :

Milieu recommandé pour l’analyse bactériologique des urines. Ce milieu permet la
croissance et l’isolement de la plupart des bactéries responsables d’infection urinaires. La
déficience en électrolytes s’accompagne d’une absence de mobilité des Proteus.
Sa composition est la suivante :
- peptone 4g/L.
- extrait de viande de bœuf 3g/L.
- Tryptone 4g/L.
- Lactose 10g/L.
- L-cystine 0,128g/L.
-bleu de bromothymol 0,02 g/L. Figure 05 : Gélose CLED.
- agar 15g/L.
- pH 7,3 ± 0,2.(1)
2) Géloses enrichies :
a. Géloses au sang frais :
Les géloses au sang frais, en général sont de mouton ou de cheval, sont obtenues en
ajoutant à des géloses ordinaires du sang frais dans des proportions de 5 à 10% en volume.
Ce sont des géloses qui permettent la croissance des bactéries exigeantes, grâce à la
présence de facteurs de croissance contenus dans le sang. En fonction de l’origine des
hématies, les caractères hémolytique des bactéries peut varier. Les géloses au sang sont en
général fabriquées soit à partir de géloses TS additionnées de sang de cheval (gélose TSH,
tryptone-soja-horse Blood), soit à partir de gélose de base Columbia, plus riches,
additionnées de sang de mouton (gélose SBA, sheep-Blood-agar). (1)
b. Géloses au sang cuit :

Les géloses au sang cuit appelées géloses « chocolat » permettent de libérer par la
cuisson, des facteurs de croissance supplémentaires. Néanmoins ces géloses sont souvent
supplémentaires en vitamines (ex : gélose « chocolat » Polyvitex®). Elles permettent la
croissance des bactéries exigeantes, en particulier celles du genre Haemophilus. (1)
21
Figure06 : Gélose au sang.
3) Géloses sélectives :
a. Pour Bordetella pertussis :
Les milieux de Bordet-Gengou ou les géloses au charbon contenant de l’acide

nicotinique. Supplémenté de 10% de sang de cheval défibrée sont rendus sélectifs par
addition de céfalexine à 40 µg/l. (1)
b. Pour Brucella :
La gélose de base Columbia ou la gélose de base pour Brucella additionnées de 5 à 10%
de sérum de cheval décomplémenté et 1% de glucose sont rendues sélectives par addition
d’antibiotiques (polymyxin B, bacitracine, acide nalidixique, nystatine, vancomycine.) (1)
c. Pour campylobactéries :
Un grand nombre de milieux de culture sélectifs ont été développés pour permettre la
croissance des campylobactéries à partir des selles notamment pour inhiber la flore fécale.
De plus, ces bactéries présentent des exigences variables en fonction des espèces en termes
d’atmosphère et de température pour une culture optimale. Les géloses de
bases sont variables en fonction des milieux (Columbia éventuellement associée à du
charbon activé, etc.) et les suppléments antibiotiques qui vont rendre sélectif le milieu sont
également divers (vancomycine, polymyxin B, triméthoprime pour le milieu de Skirrow.
bacitracine, colistine, céfazoline, novobiocine, cycloheximide ou amphotéricine B pour le
milieu de Butzler. pyruvate de sodium, céfopérazone, vancomycine, cycloheximide pour
le milieu de Karmali.).(1)
d. Pour l’isolement de Clostridium difficile :

La gélose de base est rendue sélective par ajout de cyclosérine, de cefoxitine. (1)
22
e. Pour l’isolement de Corynebacterium diphtheriae :

La gélose de Tinsdale est une gélose de base contenant de la cystine supplémentée en
sérum de bœuf, en tellurite de potassium et en thiosulfate de sodium. Les colonies sont
noires, petites avec un halo marron-noir après 24 heures d’incubation. (1)
f. Pour l’isolement de Escherichia coli O157 : H7

Le milieu utilisé est le milieu de Mac Conkey au sorbitol (SMAC). Ce milieu est
sélectif par la présence de sels biliaires et différentiel par le remplacement du lactose du
Mac Conkey standard par du sorbitol pour la recherche d’E. Coli O157 :H7.en effet, ce
sérotype d’E. Coli ne fermente habituellement pas le sorbitol à la différence des autres E.
coli. Les colonies apparaissent incolores alors les colonies de bactéries fermentant le
sorbitol sont roses. (1)
g. Pour les légionelles :

Le milieu de base pour la recherche des légionelles est composé de charbon activé et
d’extrait de levure. Il est supplémenté avec un tampon ACES/hydroxyde de potassium, du
pyrophosphate ferrique, de la L-cystéine et de cétoglutarate dans le milieu BCYE et peut
être rendu sélectif par l’ajout de glycine, vancomycine, polymyxine B, cycloheximide. (1)
h. Pour les Neisseria pathogènes :

Plusieurs associations d’antibiotiques permettent de rendre sélectif pour les gonocoques
et méningocoques des géloses enrichies. Les associations VCN (vancomycine, colistine,
nystatine), VCNT (vancomycine, colistine, nystatine, triméthoprime), VCAT
(vancomycine, colistine, amphotéricine B, triméthoprime). (1)
i. Pour Pseudomonas :
Les géloses de base sont rendues sélectives par addition de cétrimide éventuellement
associé à l’acide natidixique. (1)
j. Pour Salmonella et Shigella :

Des milieux sélectifs pour l’isolement des Salmonella et des Shigella. Sont disponibles :
-La gélose Hektoen contient des sels biliaires, un taux élevé de peptone pour compenser
l’effet inhibiteur de sels biliaires sur les Shigelles, une quantité importante (12g/l) de
lactose pour une mise en évidence précoce des bactéries fermentant le lactose, du
23
thiosulfate et de citrate ferrique permettant de détecter les bactéries H₂S positives. Ainsi
sur ce milieu les Shigelles forment des colonies vertes et les Salmonelles des colonies
bleu-vert avec ou sans centre noire.
- Le milieu Salmonella-Shigella contient du rouge neutre comme indicateur de pH et du

vert brillant comme inhibiteur supplémentaire. Les bactéries ne fermentant pas le lactose
donnent des colonies rose, celles H₂S positives en plus un centre noir.
- La gélose XLD (Xylose, Lysine, Desoxycholate) est basée sur la fermentation du xylose
(les Shigelles ne fermentent pas le xylose), la décarboxylation de la lysine (Salmonelles et
Shigelles possèdent une lysine décarboxylase) et la production d’H₂S.(1)
Figure07 : Gélose salmonella, Shigella.
k. Pour l’isolement des staphylocoques :

Le milieu de Chapman est un milieu au mannitol, hyper salé (75 g/l de chlorure de
sodium) qui est sélectif pour les staphylocoques à l’exception de quelques espèces
halophiles appartenaient à d’autres genres bactériens. Le milieu de Baird-Parker utilisé
pour les aliments contient jaune d’œuf et tellurite.(1)
Figure08 : milieu de Chapman.
24
l. Pour l’isolement de S. aureus, des streptocoques hémolytiques et de

entérocoques :
La gélose Columbia ANC est une gélose de base Columbia rendue sélective par addition
d’acide nalidixique et de sulfate de colistine. Elle est en particulier utilisée à partir de
prélèvements rhinopharyngés. (1)
m. Pour Yersinia entérocolitica :

Le milieu de Schiemann CIN est un milieu sélectif pour Yersinia entérocolitica.
A la gélose de base est additionnée de la céfsulodine, de l’irgasan et de la novobiocine.(1)
n. Géloses chromogènes pour l’identification présomptive :

Les milieux chromogènes sont des milieux gélosés solides permettant, grâce à la mise en
évidence d’activité enzymatiques, l’identification directe de certaines espèces bactériennes,
ou l’orientation vers certains groupes de bactéries. Ce sont des milieux géloses non
sélectifs adaptés à l’isolement, l’identification et à la numération des germes urinaires
notamment. Les chromogènes sont des substrats artificiels incolores directement
incorporés dans la gélose, qui libèrent des composés de couleurs différentes après
dégradation par leurs enzymes respectives, directement visibles. Il existe de nombreux
milieux chromogènes qui permettent l’isolement et la numération des germes en particulier
ceux responsables d’infections du tractus urinaire afin de faciliter l’identification des
germes les plus fréquemment impliqués.(1)
o. Milieux chromogènes utilisés dans le diagnostic des infections

urinaires :
A titre d’exemple, quatre milieux sont présentés :
- Le milieu CHROM agar Orientation® (Becton Dickinson), le milieu CPS ID 3®

(bioMérieux).
- Le milieu UriSelect 4® (Bio-Rad).
-Le milieu UTI® (Oxoid). Les propriétés des 4 milieux chromogènes utilisés pour
l’identification sont présentées dans le tableau 02.
Ces milieux contiennent à partir d’une gélose de base des mélanges chromogènes
permettent de détecter des enzymes produites par les bactéries comme des béta-
glucosidases, des béta-D galactosidases. Le milieu contenant du tryptophane et de la
25
phénylalanine, en présence de tryptophane désaminase, les colonies sont brunes.

Certains de ces milieux sont translucides, c’est le cas des milieux BD CHROM agar
Orientation® (Becton Dickinson) et CPS ID 3® (bioMérieux). D’autres sont opaques
comme le milieu UriSelect 4® (Bio-Rad) et le milieu UTI® (Oxoid). (1)
p. ESCHERICHIA. Coli :
L’activité béta-galactosidase donne des colonies rose à pourpre, plus ou moins
translucides sur les 4 milieux. Une confirmation par la recherche de la production d’indole
est recommandée. Pour réaliser ce test, il suffit de déposer une colonie sur un papier
préalablement imbibé de réactif de Kovacs. Un virage au rose est observé pour les
bactéries indole positives (E. Coli). En cas de réaction négative, il est nécessaire de pour
suivre l’identification par une méthode classique. (1)
q. Enterococcus spp :
Les colonies sont de petite taille et l’activité béta-glucosidases se traduit par une
coloration bleu-turquoise à bleu-vert selon les milieux.
L’association de l’examen microscopique montant des cocci Gram positif en chainette

permet de confirmer le genre. Pour le milieu UTI®, une étape supplémentaire est
recommandée : la réalisation d’un test PYR, mettent en évidence l’hydrolyse du
pyroglutamate, afin de différencier les entérocoques (test PYR négatif) des streptocoques
spp, (test PYR positif). (1)
r. Proteus, Morganella, Providencia :

L’activité tryptophane désaminase (TDA) est détectée par la production d’un pigment
brun diffusible : des colonies beiges à brun-orangé, avec ou sans brunissement de la gélose
sont obtenues. La recherche de la production d’indole qui orientera vers les Proteus
indologènes (indole positif) ou vers Proteus mirabilis (indole négatif) sera effectuée. (1)
s. Klebsiella, Entérobacter, Serratia, Citrobacter :

Les colonies sont de grande taille et l’activité béta-glucosidases donne une coloration bleu
franche intense sur CHROMagar Orientation®, UriSelect 4®, UTI® et bleu-vert sur CPS
ID 3®. La mise en évidence de bacilles Gram négatif à l’examen microscopique donne une
forte présomption de bactérie appartenant à ce groupe. L’identification par une méthode
classique sera poursuivie. (1)
26
4) Autres milieux chromogènes :

La plupart des fabricants de milieux gélosés ont développés des milieux chromogènes
pour un nombre important de bactéries dans des circonstances particulières. Il s’agit
notamment du dépistage du portage génital de Streptococcus agalaciae chez les femmes
enceintes, du dépistage du portage nasal de S. aureus résistant à l’oxacilline, du dépistage
des bactéries multirésistantes (dépistage des entérobactéries porteuses de béta-lactamases
à spectre étendu par exemple) et de la recherche de Salmonelles à partir de selles.(1)
Figure09 : milieux chromogènes.
a. Gélose pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques :

Des géloses adaptées et recommandées pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques
des bactéries ont également été développées. (1)
b. Gélose de Mueller-Hinton (MH) :

L’utilisation de cette gélose est recommandée par le comité de l’antibiogramme de la
Société française de Microbiologie. Milieu utilisé pour tester la sensibilité des bactéries
aux antibiotiques ; sa composition est la suivante :
- infusion de viande de bœuf 300g/L.

- hydrolysat de caséine 17,5g/L.
-amidon 1,5g/L.
-agar 17g/L.
-pH 7,4 ± 0,2.
Figure10 : Gélose MH.
27
Cette gélose MH peut être supplémentée en sang frais ou en sang cuit lorsque les bactéries
testées nécessitent ces milieux enrichis. (1)
c. Gélose HTM (Haemophilus Test Medium) :

Cette gélose transparente a été développée pour tester la sensibilité des souches de
Haemophilus aux antibiotiques. Sa composition est la suivante :
- gélose de Mueller Hinton 38g/L.

-extrait de levure 5g/L.
-pH 7,4 ± 0,2.
Ce milieu est supplémenté en hémine et en NAD

indispensables à la croissance de H. influenzas. (1)
Figure11 : Gélose HTM.
d. Gélose de Wilkins Chalgren :

Milieu utilisé pour la croissance et pour tester la sensibilité des bactéries anaérobies aux
antibiotiques. Sa composition est la suivante :
-tryptone 10g/L.
- peptone de gélatine 10g/L.
-extrait de levure 5g/L.
- glucose 1g/L.
- L-arginine 1g/L.
- pyruvate de sodium 1g/L.
-ménadione 0,0005g/L.
- hémine 0,005g/L.
- agar 10g/L.
-pH 7,1± 0,2.
Cette gélose peut être supplémentée avec 5% de sang. (1)
28
Interprétation de résultats obtenus en fonction des bactéries pour 4 milieux chromogènes

CHROMag CPS ID 3® UriSelect 4® UTI ®(Oxoid)
ar (bioMérieux) (Bio-Rad)
Orientation
® (BD)
Colonies rose à Colonies rose.
pourpre. Confirmation
Confirmation obligatoire par une
E. coli obligatoire par une recherche d’indole ;
(béta- Colonies Colonies rose à recherche d’indole déposer une colonie
galactosidase rose bordeaux déposer une colonie sur un papier
s +) sur un papier préalablement
préalablement imbibé de réactif de
imbibé de réactif de Kovacs virage au
Kovacs. Virage au rose si positif
rose si positif. Indole + = E. coli
Indole+ = E. coli Indole - =
Indole - = identification par
identification par méthode classique
méthode classique
Enterococcus Colonies Colonies bleu à Colonies bleu-
sp. bleu-vert à turquoise de turquoise franc,
(béta- turquoise de petite taille et brillant, de petite
glucosidase petite taille l’examen taille, et l’examen Colonies bleu-
+) microscopique microscopique turquoise
montrant des montrant des cocci
cocci. Rq : si une des
Rq : si une des conditions n’est pas
conditions n’est remplie, identifier le
pas remplie, germe par la
identifier le méthode classique.
germe par la
méthode
classique.
Proteus sp Colonies brunes Colonies brun Colonies brun beige,
( tryptophane à marron orangé effectuer une effectuer une
désaminase+) Colonies effectuer une recherche d’indole recherche d’indole
beige avec recherche déposé une colonie déposé une colonie
un halo d’indole ; sur un papier sur un papier
brun déposer une préalablement préalablement
colonie sur un imbibé de réactif de imbibé de réactif de
papier Kovacs Kovacs.
préalablement Virage au rose si Virage au rose si
29
imbibé de réactif positif positif

de Kovacs Indole - = Proteus Indole - = Proteus
virage au rose si mirabilis mirabilis
positif Indole + = Proteus Indole + = Proteus
Indole - = indologène, indologène,
Proteus Morganella, ou Morganella ou
mirabilis providencia ; providencia ;
Indole + = identifier identifier
Proteus précisément par une précisément par une
indologène, méthode classique. méthode classique
Morganella, ou
providencia,
identifier
précisément par
une méthode
classique.
Groupe Colonies Colonies vert à Colonies bleu-violet, Colonies bleu-
Klebsiella bleu- brun vert de de grande taille et pourpre, de grande
-entérobacter- métallique grande taille er examen taille poursuivre
serratia- avec ou l’examen direct microscopique l’identification par
citobacter sans halo montrant des montrant des une méthode
(béta- rose, de bacilles bacilles, poursuivre classique
galactosidase grande Poursuivre l’identification par
+ et béta- taille. l’identification une méthode
glucosidase+) par une méthode classique
classique
Staphylococc Colonies Colonies Colonies blanches, Colonies blanches,

us rose, pâle, blanches, poursuivre poursuivre
Saprophyticu opaques, de poursuivre l’identification par l’identification par
s petite taille l’identification une méthode une méthode
par une méthode classique classique
classique
Autres Colonies Colonies Colonies blanches, Colonies blanches,
bactéries blanches, blanches, poursuivre poursuivre
poursuivre poursuivre l’identification par l’identification par
l’identificati l’identification une méthode une méthode
on par une par une méthode classique classique
méthode classique
classique
Tableau 2 : résultats obtenus en fonction des bactéries dans des milieux chromogènes.
30
Figure12 : différents milieux gélosé.
V. Stérilisation des milieux de culture :

Les milieux de culture sont stérilisés à la vapeur d’eau sous pression. L’appareil
permettant d’atteindre ces conditions est appelé « autoclave », son principe est le suivant :
quand la pression augmente la température de l’eau s’élève et atteint 250°F ou 121°C à 2
atmosphères ou 15 livres de pression. Plusieurs facteurs contribuent à l’obtention d’une
stérilisation parfaite dont la température de chauffage, le volume des récipients à stériliser,
la nature des produits à stériliser, le degré thermique,... etc. La chaleur humide agit sur les
bactéries en entrainant la dénaturation de leurs protéines.
Les milieux renfermant des sucres sont stérilisés à une température ne dépassant pas 116
à 118°C. D’une manière générale, il faut éviter de trop chauffer les milieux de culture.
Certains milieux peuvent être utilisés sans qu’il soit nécessaire de les stériliser à
l’autoclave.(1)
VI. Méthodes d’isolement :

En fonction de la présentation des milieux et de leur utilisation, les méthodes
d’ensemencement différent.
Ensemencement des milieux solides en boite de Pétri :
31
VI.1. Méthodes DES QUADRANTS :

Ce mode d’ensemencement permet d’isoler les différentes bactéries contenues dans un
mélange.
Le dépôt de l’échantillon ou de la suspension de germe est effectué prés d’un bord de la

boite de pétri, ou en une strie dans un quart de la boite qui constituera le premier quadrant.
Un isolement est effectué à l’aide d’une pipette pasteur boutonnée ou d’un ensemenceur à
usage unique stérile.
Ainsi par cette méthode, le dernier quadrant contient des colonies isolées dont la
morphologie permet de s’orienter vers une espèce ou un genre bactérien voire une famille
de bactéries. C’est à partir de ces colonies isolées que des tests d’identification pourront
être pratiqués et la sensibilité aux antibiotiques testée. Parfois une subculture peut être
nécessaire pour parfaire l’obtention d’une culture pure avec un inoculum suffisant pour les
tests effectué.(1)
Figure 13 : l’ensemencement en quadrants.
VI.2. Ensemencement pour dénombrement des bactéries :

Plusieurs approches en dehors de l’isolement en quadrant peuvent être retenues pour une
appréciation semi-quantitative de la quantité de bactéries présentes. (1)
Figure 14 : l’ensemencement pour dénombrement des bactéries.
32
Figure 15 : échantillon des urines avec dénombrement bactérien.
VI.3. Ensemencement en stries :

Cette technique est en particulier appliquée pour en estimer de manière approchée la
quantité de bactéries dans les urines. Un volume connu d’urine est déposé en strie d’un
bord au centre de la boite de pétri. L’étalement est effectué en réalisant des stries serrées
bord à bord comme indiqué sur la figure16(1) :
Figure 16 : ensemencement en stries serrées.
VI.4. Ensemencement par la technique du râteau :

A partir d’un volume défini déposé à la surface d’une gélose, 50, 100, ou 200 microlitres
par exemples, il est possible d’étaler le dépôt à l’aide d’un étaleur ou « râteau ».
L’ensemble de la suspension est étalé sur la gélose en faisant tourner la boite.(1)
33
Figure 17 : l’ensemencement par étalement.
VI.5. Ensemencement en spirale :

Des appareils appelés « ensemencement en spirale » permettent d’étaler un volume donné
à la surface d’une gélose en partant du centre jusqu’au bord.(1)
Figure 18 : l’ensemencement en spirale.
VI.6. Autres méthodes :

Plusieurs souches peuvent être déposées sur une seule et même gélose en faisant des
stries radiaires ou en faisant des stries parallèles.(1)
34
Figure 19 : l’ensemencement par des stries parallèles.
VI.7. Ensemencement pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques en

milieu solide :
Pour la méthode d’étude de la sensibilité aux antibiotiques par diffusion en gélose. Les
suspensions bactériennes peuvent être ensemencées par « inondation ». La suspension
bactérienne est déposée à la surface de la gélose et l’excès de liquide est respiré. Un temps
de séchage de la surface de la gélose avant dépôt des disques d’antibiotiques est nécessaire.
L’autre méthode consiste à déposer la suspension à l’aide d’un écouvillon trempé dans la
suspension et « essoré » sur le bord du tube avant étalement à l’aide de l’écouvillon sur la
gélose. La gélose étant ensemencée sur sa totalité en faisant tourner la boite de 120°
environ.(1)
Figure20 : l’ensemencement à l’aide d’un écouvillon.
35
Figure21 : l’ensemencement par inondation.
VI.8. Ensemencement des milieux solides en tube :

La plupart de ces milieux sont ensemencés en surface sur la pente de la gélose. Soit en
déposant quelques gouttes d’un liquide biologique soit en faisant des stries à la surface de
la pente.
Pour l’ensemencement de certains milieux particuliers comme le milieu de Kligler-Hajna,

une piqure centrale venant inoculée en profondeur la gélose complète l’ensemencement de
la pente effectué par des stries à la surface.(1)
Figure 22 : l’ensemencement de milieu solide en tube.
Figure 23 : l’ensemencement par des stries en tube.
36
Figure24 : l’ensemencement par piqure et par touche.
VI.9. Ensemencement des milieux liquides :

Les milieux liquides d’enrichissement sont ensemencés directement avec le produit à
analyser.
Les milieux liquides d’identification sont ensemencés en ajoutant des bactéries prélevées
avec un ensemenceur ou bien en déposant quelques gouttes de la bactérie à étudier en
suspension.(1)
Figure 25 : l’ensemencement en milieu liquide.
37
VII. Identification :
En fonction de l’aspect morphologique des colonies bactériennes, de la morphologie des
bactéries après coloration, de leurs caractéristiques de croissance (vitesse, type respiratoire,
exigences culturales, etc.) de leur pigmentation, de leur odeur, de leur caractère
hémolytique sur gélose au sang. Le bactériologiste s’oriente sur une famille bactérienne ou
un genre bactérien particulier. Néanmoins, les identifications précises des espèces
bactériennes font appel pour les intérêts médical les plus communes à des galeries
d’identification biochimique manuelles ou pouvant être lues sur des automates : Vitek
(bioMérieux), Phoenix (BD), Walk-Away (Micro scan) permet les plus courants. Un
certain nombre d’épreuves biochimiques de base est utilisé dans l’élaboration des galeries
d’identification des souches bactériennes. Après avoir rappelé, les tests d’orientation (type
respiratoire, catalase et oxydase), un certain nombre d’épreuves métaboliques ont été
détaillées. Celles-ci concernent principalement le métabolisme protéique le métabolisme
lipidique. Des tests d’agglutination viennent compléter l’identification bactérienne dans
certains cas.(1)
VII.1. Principaux tests d’orientation :

A. Etude du type respiratoire :
L’ensemencement est effectué sur une gélose viande fois (VF) préalablement régénérée
au bain-marie bouillant pendant 20 minutes et lorsque la température est redescendue à
40-45°C. cet ensemencement est effectué soit à l’aide d’une pipette Pasteur de bas en haut,
en spirale, soit en déposant à la surface du tube maintenu à 45°C, la suspension de la
bactérie à étudier puis à mélanger en faisant subir au tube des mouvements en forme de 8,
le tube étant maintenu verticalement. Les tubes sont ensuite refroidis sous l’eau du robinet.
Après 24 heures, à 37°C, la lecture consiste à étudier le niveau du tube ou une croissance
bactérienne est visible.
Une façon quotidienne d’apprécier le type respiratoire bactérien est de comparer les
cultures bactériennes incubées en aérobiose et en anaérobiose pour savoir si la bactérie est
anaérobie stricte, aérobie stricte, ou aéro-anaérobie facultative. Dans ce cas, le caractère
microaérophile n’est pas appréciable.(1)
38
B. Recherche de la catalase :
Certaines bactéries ont la faculté de dégrader le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂). en
présence d’une bactéries productrice de catalase, on observe à partir de H₂O₂ une libération
d’oxygène gazeux selon la réaction : H₂O₂ + ½ O₂.(1)
C. Recherche d’un cytochrome oxydase :

Les bactéries possédant une chaine respiratoire complète sont dotées d’un cytochrome
oxydase. La mise en évidence de cette oxydase est effectuée à l’aide d’un disque imprégné
d’une solution aqueuse à 1% de chlorhydrate de diméthylparaphénylène diamine qui
forme un complexe violet au contact de cette enzyme les colonies sont déposées à l’aide
d’une pipette Pasteur.(1)
D. Etude des accepteurs minéraux, recherche d’un nitrate réductase :

Les bactéries, lorsqu’elles possédant une nitrate réductase, sont capables de transformer
les nitrates (NO-₃) en nitrates (NO-₂) et éventuellement en azote (N₂).
Un bouillon nitraté (bouillon nutritif supplémenté de 1.5% de nitrate de potassium) est

ensemencé avec la bactérie à étudier et incubé 18 heures à 37°C après incubation,
3 gouttes d’une solution d’acide sulfanilique (Griess A) et 3 gouttes d’une solution de
naphtylamine (Griess B) sont ajoutées au bouillon. Si une coloration rose fugace apparait,
les nitrates ont été réduits au stade nitrites. En l’absence de coloration, soit les nitrates ont
été réduits au stade azote soit la bactérie ne possède pas de nitrate réductase. L’addition de
poudre de Zinc (réactif de Zobell, qui va réduire les nitrates en nitrites) permet de trancher.
Si une coloration rose apparait, alors la bactérie ne possède pas de nitrate réductase, si
aucune modification de coloration n’est visible après ajout de Zinc, alors les nitrates
avaient été réduits au stade azote.(1)
E. Etude du métabolisme glucidique :

a. Etude de la voie d’attaque des glucides M.E.V.A.G (milieu de Hugh et
Leifson) :
Les bactéries peuvent utiliser les glucides selon deux voies. La voie fermentative se
déroule en l’absence d’oxygène de l’air et les catabolites formés, acides, entrainent une
diminution du pH du milieu. Par voie oxydative, l’oxygène de l’air est utilisé et peu de
catabolites acides sont formés.
39
Deux milieux semi-solides contenant un indicateur de pH (par exemple : du bleu de

bromothymol) sont régénérés au bain-marie bouillant pendant 20 minutes. Ensuite
lorsqu’ils sont refroidis autour de 45°C, 6 gouttes d’une solution de glucose à 30%
(concentration finale en glucose de 1%) sont ajoutées. Les milieux sont ensuite refroidis
complètement et ensemencés par piqure centrale. L’un des deux tubes est recouvert de ½
cm d’huile de paraffine stérile. Ce tube constitue le tube dit « fermer », c’est-à-dire dans
lequel les réactions s’effectueront en absence d’oxygène. L’autre tube dit « ouvert ».(1)
Figure26 : milieu de Hugh Leifson.
b. Milieu mannitol-mobilité :
Il s’agit d’un milieu semi-solide contenant entre autres du mannitol, du rouge de phénol
comme indicateur de pH. Après régénération au bain-marie bouillant pendant 20 minutes,
le milieu est refroidi totalement puis ensemencé par piqure centrale. Lorsque l’indicateur
coloré passe du rouge au jaune, ce qui correspond à l’acidification du milieu, le mannitol à
été utilisé. le caractère mobile est défini dans ce milieu par un trouble envahissant toute la
largeur de la gélose de part et d’autres de la piqure centrale, alors qu’une bactérie immobile
ne se développer que le long de la piqure centrale.(1)
Figure27 : Milieu mannitol-mobilité.
40
F. Etude de la fermentation de plusieurs sucres pour l’identification des

entérobactéries :
Le milieu de Kligler-Hajna ou milieu lactose-glucose H₂S est le plus couramment utilisé.
Ce milieu solide en pente contient du glucose (0.1%), du lactose (1%) des acides aminés,
de thiosulfate de sodium, du citrate ferrique et du rouge de phénol. Ce milieu est
ensemencé avec la souche à étudier en effectuant des stries à la surface de la pente de la
gélose puis le culot est ensemencé par piqure centrale.
Figure28 : milieu de Kligler-Hajna.
Si les bactéries acidifient le glucose en anaérobiose relative (culot), le culot vire au jaune
(ex : entérobactéries), si le germe n’utilise pas le lactose, la pente devient rouge par
réalcalinisation du milieu du à la formation de produits alcalins provenant de la
dégradation des acides aminés (ex : Proteus). Si les bactéries utilisent le lactose en
aérobiose relative (pente), il y a virage de la pente au jaune (ex : E. coli). Le milieu peut
être coloré en noir de façon plus ou moins intense par production d’H₂S. Une pointe fine
d’H₂S est observée pour Salmonella Typhi. Le milieu peut être entièrement noir. La
présence de gaz est détectée par la mise en évidence de bulles ou le soulèvement de la
gélose. Un milieu contenant en plus du saccharose à 1% peut être utilisé, il s’agit du milieu
TSI (Tri-Suger-Iron.).(1)
G. Etude de la dégradation de la lactase :

La recherche d’une béta-galactosidase qui dégrade le lactose en galactose et glucose. En
pratique ce test utilise l’ortn-nitro-phényl-galacto-pyranoside (ONPG) ou le para-nitro-
phényl—galacto-pyranoside (PNPG).
L’ONPG et le PNPG qui diffusent spontanément dans la bactérie (à la différence du

lactose qui nécessaire une perméase) sont dégradées par la béta-galactosidase en galactose
41
et orthonitrophénol ou paranitrophénol respectivement qui sont des composés jaunes. Ces

tests sont inclus dans la plupart des galeries d’identification. Individuellement, ils peuvent
être réalisés en mettant en contact une suspension bactérienne épaisse en eau physiologique
avec un disque d’ONPG par exemple. Après mise à l’étuve à 37°C pendant 18 heures
l’apparition d’une coloration jaune peut être observée. Les entérobactéries ONPG négative
sont par exemple avec Salmonella, Shigella et Proteus. Alors qu’Entérobacter et
Escherichia coli par exemple possèdent une béta-galactosidase.(1)
H. Recherche de métabolites formés à partir de l’acide pyruvique :

A partir du milieu de Clark-Lubs contenant de l’acide pyruvique, la formation d’acide
formique et d’acide acétique (réaction de rouge de méthyle, RM) et la formation d’acétone
ou acétyil-méthylcarbinol (réaction de Voges-Proskauer, VP) est étudiée. En pratique, la
réaction de VP est fréquemment réalisée notamment sur les galeries miniaturisées. Sinon,
le bouillon Clark-Lubs est ensemencé et incubé 18 heures à 37°C. Et 1 ml de culture
ajouter 0.5 ml d’alpha naphtol à 6% et 0.5 ml de soude à 16%. La lecture est à effectuer
dans les 10 minutes. Les entérobactéries des genres Klebsiella, Entérobacter et Serratia
produisent de l’acétoine, test VP+.(1)
Figure29 : milieu Clark-Lubs.
Figure30 : Test RM, VP et ONPG
42
I. Dégradation de l’esculine :
L’esculine est un sucre. Certaines bactéries comme les entérocoques peuvent hydrolyser
l’esculine en esculétine et glucose. L’esculétine se lie au citrate ferrique présent dans le
milieu pour former un complexe brun-noir correspondant à une réaction positive. (1)
J. Etude du métabolisme protéique :

L’appréciation du pouvoir protéolytique n’est peu utilisée actuellement. Plusieurs
méthodes permettent d’apprécier la protéolyse de la gélatine, elles sont citées ici pour
mémoire : la méthode de le Minor et Pie-chaud. L’étude de la protéolyse de la gélatine
associée à de l’encre de Chine permet, lorsque le pigment noir diffuse, d’apprécier cette
activité. Ce test est inclus dans les galeries miniaturisées.
Actuellement les tests les plus utilisés concernent la mise en évidence d’enzymes
intervenant dans la dégradation des acides aminés. (1)
K. Recherche de décarboxylases :
Trois décarboxylases sont fréquemment recherchées, la lysine décarboxylase (LDC),
l’ornithine décarboxylase (ODC) et l’arginine dihydrolase(ADH). Les tests correspondants
sont présents notamment sur les galeries APT 20 E. le test individuel peut être effectué sur
le milieu de Taylor contenant l’acide aminé étudié (soit la lysine, soit l’ornithine, soit
l’arginine) du glucose et un indicateur coloré, le bromocrésol pourpre la réaction s’effectue
en deux temps. Lorsque le glucose est fermenté, il y a virage au jaune du bromocrésol
pourpre, lorsque l’acide aminé est dé carboxyle, il y a une réalcalinisation du milieu qui
vire au violet. Après 18 heures à 37°C, un milieu violet trouble correspond à une réaction
positive. Par exemple, E. coli possède une lysine décarboxylase alors que Proteus vulgaris
n’en possède pas. (1)
L. Recherche de désaminases :
a. recherche de tryptophane désaminase :
A partir du milieu de Ferguson contenant du tryptophane, du rouge de phénol et de l’urée,

il est possible de mettre en évidence une activité tryptophane désaminase (TDA). Une
suspension bactérienne dense dans un milieu de Ferguson, permet après incubation à 37°C
pendant 18 heures et ajout d’une goutte de perchlorure de fer à 30%, de mettre en évidence
une coloration brune si la bactérie testée est dite TDA +. Les entérobactéries TDA+
appartiennent aux genres Proteus, Providencia et Morganella. (1)
43
b. recherche d’une phénylalanine désaminase :

De la même façon, une gélose à la phénylalanine peut être ensemencée pour mettre en
évidence une phénylalanine désaminase. Après incubation de 18 heures à 37°C et ajout de
quelques gouttes de perchlorure de fer à 30%, il apparait en cas de positivité une coloration
verte.(1)
c. Recherche de tryptophanase :
La production d’indole par hydrolyse du tryptophane peut être recherchée à partir d’une
culture de 24 heures de la souche à étudier en milieu de Ferguson ou en eau peptonée
dépourvue d’indole.
L’indole produit donne une coloration rouge en présence du réactif de Kovacs (para
diméthylaminobenzaldéhyde + alcool isoamylique) ou de réactif de James.(1)
d. Recherche de désulfhydrases :
Elle est réalisée sur milieu de Kliger-Hajna ou fait partie des tests des galeries. La
dégradation des acides aminés soufrés conduit à la formation de groupements SH ou H₂S
qui se combinent avec le citrate de fer ammoniacal du milieu pour former du sulfure de fer
noir. Salmonella Typhimurium par exemple est H₂S positif, alors que E. coli est H₂S
négatif.(1)
M. Etude du métabolisme lipidique :

La recherche d’une lipase sur milieu au tween 80 est détectée par une opacification du
milieu, ce qui est le cas pour S. aureus. Le milieu de Baird-Parker contenant de la lécithine
du jaune d’œuf permet de mettre en évidence une lécithinase par apparition d’un halo clair
autour des colonies (ex : S. aureus).(1)
VII.2. Autres tests :

A. recherche d’une uréase :
La recherche d’une uréase s’effectue en milieu urée-tryptophane (improprement appelé

milieu urée-indole). Ce milieu contient du tryptophane, de l’urée et du rouge de phénol
comme indicateur de pH. L’urée, sous l’action d’une uréase bactérienne va être
transformée en carbonate d’ammonium alcalin entrainant une coloration rouge du milieu.
Ce milieu ne permet pas la croissance bactérienne. Il permet également la recherche d’un
tryptophane désaminase selon la méthode précédemment décrite.(1)
44
Figure31 : Test d’uréase.
B. recherche d’autres enzymes :

a. recherche d’une DNAse :
La mise en évidence de la production d’une DNAse est effectuée sur une gélose
contenant de l’ADN. Les bactéries sont ensemencées en réalisant une strie à la surface de
la gélose. La gélose et incubée 18 heures à 37°C. L’hydrolyse de l’ADN est révélée en
ajoutant de l’acide chlorhydrique. Lorsque l’ADN a été dégradé, un halo clair est visible au
pourtour de la strie alors que l’ADN, sous l’action de l’acide, est à l’origine d’un précipité
blanchâtre.(1)
b. recherche d’une coagulase secrétée :

La coagulation du plasma de lapin oxalate par une coagulase s’effectue à partir d’un
bouillon enrichi comme le bouillon staphylocoagulase. Un bouillon de 18 heures incubé à
37°C est miss en contact, volume, avec du plasma de lapin oxalate pendant au moins 30
minutes à 37°C. Si la bactérie possède une coagulase, il y a coagulation du plasma de
lapin.
- Utilisation du citrate comme unique source de carbone :
Le milieu au citrate de Simmons contient du citrate de sodium et du sel d’ammonium

ainsi que bleu de bromothymol. Une utilisation du citrate se traduit par une culture sur la
gélose et le plus souvent cette croissance s’accompagne d’une libération d’ammoniaque à
partir des sels d’ammonium ce qui se traduit par un virage du bleu de bromothymol au
bleu. Par exemple : Klebsiella pneumoniae entraine une croissance et une coloration bleu
du milieu, ce qui n’est pas le cas d’E. Coli.(1)
45
C. Tests d’agglutination :
Un nombre important de réactions d’agglutination participe à l’identification bactérienne.
Le plus souvent ces tests sont basés sur l’utilisation d’hématies ou de particules de latex
sensibilisées avec des anticorps spécifiques du pathogène recherché. Pour S. aureus,
plusieurs tests d’agglutination détectant un ou plusieurs antigènes ou récepteurs de surface
(récepteur pour le fibrinogène, protéine A, antigènes capsulaires) sont commercialisés. En
pratique, il est recommandé d’utiliser deux tests pour l’identification de S.aureus. La
détection de la coagulase et un test d’agglutination. L’identification des streptocoques béta-
hémolytiques par agglutination de la structure du polyoside C pariétal participe également
à l’identification de ces bactéries.
L’identification des sérotypes bactériens fait appel aux méthodes d’agglutination et sont
basées sur l’utilisation d’immunsérums polyvalents et monovalents reconnaissant des
antigènes bactériens. Dans le cas des Salmonelles, les sérotypes sont identifiés sur la base
des propriétés antigéniques des antigènes O de paroi et antigènes H flagellaires et
éventuellement recherche de l’antigène Vi. Pour les E. coli des agglutinations permettent
d’identifier certains sérotypes pathogènes dans les elles (O157. H7. O111. Etc.) Mais
également capsulaires (E. coli K1). Une réaction d’agglutination confirme l’identification
des espèces de Shigella. Divers sérotypes de P. aeruginosa peuvent être identifiés sur la
base de leurs antigènes O.(1)
Figure32 : Test d’agglutination.
VII.3. Galeries biochimiques et automates d’identification :

Les tests effectués en tube de 15 ou 20 ml ont été progressivement remplacés depuis de
nombreuses années par des tests miniaturisés en galerie dans lesquels les différents
substrats étaient déshydratés. Pour ne citer qu’un seul type, universellement employé, il
s’agit du système API® de bioMérieux. Ces tests d’identification sont basés soit sur
l’étude d’une dizaine, d’une vingtaine ou de trente-deux caractères en fonction des genres
et espèces bactériens à identifier. Ces tests sont basés soit sur une croissance bactérienne
associée à une étude de métabolisme (incubation de 18-24 heures éventuellement
prolongées à 48 heures), soit à une recherche d’activité enzymatique ne nécessitant pas de
46
multiplication bactérienne, l’inoculum de départ étant plus important dans ce cas. Afin de
faciliter l’interprétation de ces tests colorimétriques ou turbidimétriques, des appareils de
lecture peuvent être utilisés, permettant de faire bénéficier l’utilisateur de logiciels
d’interprétation de l’identification.
Actuellement les tests biochimiques d’identification sont effectués plus souvent sur des
automates. Les tests utilisés correspondent à la plupart de ceux précédemment décrits avec
l’utilisation, en fonction des utilisateurs et des versions d’automates de substrats
conventionnels, de substrats chromogèniques, fluorescents ou fluorogèniques, de
carbohydrates couplés à une lecture colorimétrique, turbidimétriques ou fluorimétrique.
Les méthodologies utilisées dépendent des fabricants.
Les systèmes Vitek® (bioMérieux) utilisent des cartes plastiques renfermant des
microcupules, chaque cupule contenant un substrat spécifique déshydraté. Une quarantaine
de substrats sont testés. Les cartes sont identifiées par un code à barres précisant le type de
carte (carte Gram positif, carte Gram négatif), le numéro de lot, la date de péremption.
L’inoculum de départ doit être voisin de 0.5 Mc Farland et le délai d’obtention du résultat
variable de 2 à 8 heures pour les grams positif et de 2 à 10 heures pour les grams négatif.
La lecture est uniquement colorimétrique ou couplée à de la fluorimétrie en fonction des
versions des automates. Les tests varient bien évidemment en fonction des cartes et sur ce
principe, plus de 120 espèces peuvent être identifiées pour les Gram positif et plus de 150
pour les Gram négatif fermentant et non fermentant. Un algorithme d’interprétation est
ensuite utilisé par l’appareil pour associer à un taxon particulier des résultats de
métabolisme biochimique.
L’automate Phonix® de la firme BD utilise une démarche assez voisine avec des
caractéristiques comparables sur le plan du nombre de taxons identifiés et une absence
d’identification par l’automate à ce jour des Neisseria et Haemophilus et comme pour le
précédent des bactéries anaérobies strictes. Des développements sont en cours chez ces
deux fabricants. Les appareils Walk-away® de Dade Behring permettent d’identifier, de
manière globalement plus rapide que les appareils précédents, un nombre similaire de
taxons mais également Neisseria et Haemophilus et les bactéries anaérobies strictes.(1)
Figure33 : les tests biochimiques article.
47
VIII. Conservations des souches :

Les raisons de conserver des souches sont d’ordre varié. Il peut s’agir soit d’une
collection dans le cadre purement hospitalier, soit dans un objectif de recherche ou
d’enseignement. Chaque laboratoire gère ses souches bactériennes en fonction de choix
propres mais également en fonction de sa capacité à gérer sur le long terme ces
collections. Avant d’être conservées, les bactéries doivent être obtenues en culture pure.
Elles doivent, durant la durée de stockage, être dans des conditions de non multiplication,
en milieu solide et protecteur et doivent être effectuées sur une culture récente.(1)
VIII.1. Conservation de courte durée :

Lorsque la conservation est de courte durée, elle consiste le plus souvent a effectué des
repiquages sur milieu gélose en tube et conservation à l’obscurité à température ambiante
.Lorsqu’il devient nécessaire de réutiliser la souche. Celle-ci est mise en subculture sur un
nouveau milieu. Une autre méthode consiste à ensemencer par piqure centrale une gélose
profonde et de conserver dans les mêmes conditions que précédemment les souches. Dans
ces conditions, le risque de perdre la souche est grand. La fréquence de repiquage de ces
souches varie en fonction de la bactérie concernée. La dessiccation permet de conserver sur
un papier filtre stérile maintenu dans un tube stérile contenant un dessiccateur des cultures
d’entérobactéries ou de vibrions. Les bactéries capables de sporuler peuvent être
conservées dans de la terre ou du sable préalablement stérilisé.(1)
VIII.2. Conservation de longue durée :

La lyophilisation et la congélation à très basses températures représentent les deux
méthodes le plus souvent employées pour conserver sur le long terme des souches
bactériennes. La concentration bactérienne doit être supérieure à 10⁶ bactéries par
millilitre de suspension.(1)
a. Lyophilisation :
Cette méthode a pour principe d’éliminer par sublimation sous pression réduite l’eau de
suspensions bactériennes préalablement congelées dans l’azote liquide. La congélation est
effectuée dans un milieu contenant un agent cryoprotecteur comme le lait écrémé à 20%, le
saccharose à 12%, le dextran à 10%, le sérum de veau ou de cheval à 10%. Les ampoules
sont ensuite conservées à l’obscurité, au froid. Les subcultures sont effectuées après
réhydratation du lyophilisat par quelques gouttes de bouillon nutritif et ensemencement de
géloses adaptées à la bactérie.(1)
48
b. Congélation à basse température :

Elle a lieu au congélateur à -80°C ou bien dans l’azote liquide à -80°C. A partir d’une
culture jeune les colonies de la gélose ou les bactéries obtenues après centrifugation d’un
bouillon de culture sont mises en suspension dans un bouillon de conservation adapté à la
bactérie additionné de 10% de glycérol ou de 5% de diméthyle sulfoxide (DMSO) ou
encore de 10% de sérum de veau. Les tubes utilisés pour la conservation peuvent contenir
des billes (cryobilles). La démarche est un peu plus lourde pour l’azote liquide car
l’abaissement de la température ne doit pas être trop brutal.
Les souches peuvent également être conservées pour des durées très courtes (durée
d’expédition à un Centre national de référence par exemple). Sur des tubes type TGV®
(transport de germes vivants) ou Portagerm®. (1)
Figure 34 : l’étuve de la bactériologie
49
Chapitre II :
Etude bactériologique des
produits pathologiques
Partie théorique Chapitre II : étude
bactériologique des produits pathologique
I. Phase pré-analytique des analyses de microbiologie médicale :

Les principaux objectifs des analyses de microbiologie médicale, sont de mettre en
évidence et d’identifier les microorganismes pathogènes, et de mesurer leurs sensibilités
aux antibiotiques. Les analyses sont définies par le Guide de Bonne Exécution des analyses
comme un ensemble d’étapes successives, allant du prélèvement de l’échantillon
biologique jusqu’à la remise des résultats. La qualité des résultats microbiologiques dépend
ainsi étroitement de celle des phases pré-analytique et analytique, ainsi que de la validation
des résultats.
La phase pré-analytique comprend plusieurs étapes, dont la séquence et la coordination

doivent être sans faille. Il s’agit en effet d’une phase «critique » dont toutes les étapes
doivent être de qualité optimale. Elles comprennent le clair énoncé de la question posée au
technicien par le prescripteur, le choix de l’échantillon, ainsi que la modalité technique de
prélèvement, de conditionnement, de transport et de conservation de l’échantillon. Toute
insuffisance de l’une de ces étapes peut entrainer des résultats d’analyse sans utilité
clinique.(2)
II. Généralités :
Le technicien de laboratoire est responsable de l’analyse bactériologique des
prélèvements provenant des patients (prélèvements qu’il a pratiqué lui-même ou qui lui ont
été transmis), sa responsabilité va de la phase pré-analytique jusqu’au résultat.
Afin de pouvoir optimiser la prise en charge des prélèvements, il doit disposer

d’informations claires : données cliniques et biologies concernant notamment la nature
précise du prélèvement, le terrain (femme enceinte, diabétique, mucoviscidose,
splénectomisé, immunodéprimé), le traitement antibiotique préalable, ou les bactéries
potentiellement causales.
Certaines situations vont en effet requérir des recherches particulières.

Le technicien de laboratoire procédera à un examen macroscopique de l’échantillon et
réalisera sur celui-ci, souvent au préalable, une analyse qualitative voire quantitative de la
cytologie avant de réaliser les examens relevant de la démarche bactériologique classique :
diagnostic direct (avec examen direct et recherche qualitative ou quantitative des bactéries
et / ou de leurs constituants, étude de la sensibilité aux antibiotiques) et diagnostic indirect
ou le sérodiagnostic.
Il devra aussi interpréter les résultats, même s’il ne maitrise pas toutes les étapes pré-
analytiques ou tous les éléments cliniques.
Dans un certain nombre de situations, lorsqu’on examine des liquides normalement

stériles, l’interprétation est simple (méningites purulentes avec examen direct évocateur et
culture mono microbienne ou plusieurs hémocultures positives avec le même germe, etc.).
Dans d’autres cas, l’interprétation est plus délicate, c’est le cas notamment si la flore est
50
poly-microbienne et si la ou les bactéries potentiellement pathogènes doivent être isolées

ou révélées sélectivement, voire quand le terrain fait que des espèces peu virulentes
profitent d’un terrain favorable (patients fragilisés, immunodéprimés, patients poly-
instrumentés) peut entrainer une infection. L’analyse critique des résultats doit se faire
dans le cadre de confrontations clinico-biologiques. Ceci étant valable également tant, pour
l’établissement du diagnostic, que pour l’instauration du traitement et faisant partie de ce
que l’on peut appeler un « code de bonne conduite entre biologiste et clinicien ».
Les principaux examens microbiologiques seront passés en revue, sous un angle

pratique, en recourant à une démarche type, en analysant spécifiquement certains d’entre
eux du fait de leur fréquence au sein du laboratoire ( urines, hémocultures, coprocultures)
ou de la gravité des infections diagnostiquées (méningites, septicémies, endocardites, etc.)
mais aussi sous l’angle de tableaux particuliers (mère-enfant), voire dans un contexte plus
spécifique tels que procréation médicament assistée (PMA), contrôle de dons de sang ou
tissus, etc. Cette revue des principaux examens pratiques n’a pas pour ambition d’être
exhaustive, mais d’examiner sous un angle pratique et critique la plupart des prélèvements
que reçoivent les laboratoires de bactériologie, en excluant les prélèvements de
l’environnement que le même laboratoire peut être amené à traiter, mais qui relèvent cette
fois d’hygiène. Des éléments complémentaires seront, bien sur, trouvés pour certains
prélèvements dans la partie consacrée à la systématique bactérienne.(1)
III. Hémoculture :
L’hémoculture consiste à mettre en culture du sang circulant qui est normalement stérile
(chez les sujets en bonne santé). Afin de pouvoir rapidement diagnostiquer une bactériémie
(1)
qui est la présence de bactéries dans le sang. Elle est confirmée par l’isolement d’un ou
plusieurs germes pathogènes dans les hémocultures (2), mais aussi détecter et identifier
l’agent infectieux responsable (1) (soit des bactéries ou autres micro-organismes cultivables
comme les levures, les champignons ou des filamenteux). L’hémoculture constitue un
moyen simple permettant d’isoler et d’identifier l’agent responsable. Ainsi, des
hémocultures sont systématiquement effectuées devant tout signe faisant supposer un
syndrome infectieux (agression microbienne caractérisée par une réponse inflammatoire
due à la présence de micro-organismes ou à leur passage à l’intérieur de tissus
habituellement stériles) associé à un état septicémique. (1)
III.1. Contextes cliniques :

La symptomatologie des septicémies est dominée par :
- La fièvre fréquemment accompagnée de frissons et de sueurs.
- Le risque de choc septique, accident évolutif aigue redoutable, essentiellement du aux

toxines bactériennes, et pouvant être responsables de la mort en quelque heures.
Les bactéries recherchées par hémoculture.
51
* Les bactéries les plus fréquemment recherchées par hémoculture sont par ordre
décroissant :
- Les salmonelles.
- Les brucelles.
- Les staphylocoques.
- Les pneumocoques.
- Les Pseudomonas.
- Pasteurella, E. Coli, Klebsiella, Méningocoques.
III.2. Milieux d’hémocultures :

Que l’on ait recours à des hémocultures surveillées de manière manuelle ou automatisée,
on ensemence généralement deux flacons pour chaque prélèvement, un flacon aérobie et
un flacon anaérobie. Puisque l’isolement de bactéries anaérobies dans les hémocultures est
en constante diminution, l’opportunité du flacon anaérobie pourrait être discutée sauf lors
de suspicion d’infections à point de départ gynécologique, oto-rhino-laryngologique ou
colorectal. Cependant, certaines souches de streptocoques et d’entérocoques ont une
croissance facilité par une atmosphère anaérobie et de nombreuses bactéries aéro-
anaérobies, voire aérobies stricte (Pseudomonas aeruginosa en présence de nitrates)
peuvent cultiver en anaérobiose. Enfin, le principal gain tient au fait que l’ensemencement
du flacon anaérobie double le volume de sang mis en culture. (2)
III.3. Nature du milieu :

Actuellement, trois milieux sont utilisés comme base :
- Cœur-cervelle pour les flacons SA® (aérobies) et SN® (anaérobies) dépourvus de

charbon de l’automate BacT/ALERT® (bioMérieux).
- Trypticase soja pour les flacons FA® (aérobies) et FN® (anaérobies) comportant du
charbon de l’automate BacT/ALERT® ( bioMérieux), les flacons BD Bactec® des
automates Bactec® (Becton Dickinson) ainsi que pour les flacons manuels Signal®
(Oxoid).
- Bouillon à base de peptones, type milieu de Wilkins Chalgren, pour les flacons manuels
Hémoline®de bioMérieux. Tous ces milieux sont supplémentés avec des nutriments et des
facteurs de croissances (vitamines, hémine, hydrates de carbone, cystéine, etc.) permettant
la culture des micro-organismes retrouvés en pathologie humaine.
-Conditions physico-chimiques et additifs présents dans les milieux :
Quels que soient les systèmes et les flacons utilisés, on joue sur plusieurs facteurs(2) :
52
a. pression :
Les flacons utilisés pour les hémocultures sont fabriqués sous pression réduite (sous
vide) permettant un ensemencement direct du flacon au travers d’un opercule.(2)
b. atmosphère :
A plupart des flacons commercialisés comportent une atmosphère enrichie en CO₂ afin de
favoriser la culture des germes exigeant une atmosphère enrichie en CO₂ tels que Brucella,
Neisseria, Haemophilus, Streptococcus et Campylobacter, ce CO₂ constituant un facteur
de croissance pour des nombreuses espèces. En général, l’atmosphère des différents
flacons est constituée de gaz tels que CO₂ et O₂ pour les flacons aérobies et CO₂ et H₂ ou
N₂ pour les flacons anaérobies.(2)
c. anticoagulant :
Le polyanéthol sulfonâtes de sodium (SPS) est l’anticoagulant le plus couramment utilisé
dans les bouillons d’hémocultures. Selon les fabricants, sa concentration peut varier de
0.025% à 0.05%. Le SPS possède des activités inhibitrices vis-à-vis de l’activité
bactéricide du sérum, de la phagocytose cellulaire, du complément, du lysozyme, ainsi que
sur certains antibiotiques tels que les aminosides. Toutefois, une concentration trop
importante de SPS peut inhiber la culture de certaines souches de Neisseria spp, de
Peptostreptococcus anaérobius ou de Streptobacillus moniliformis. Une concentration de
0.025% apparait comme un bon compromis.(2)
d. neutralisation des antibiotiques :

Pour certains flacons d’hémocultures, les fabricants ajoutent soit des résines adsorbants
de cations (Bactec®), soit du charbon activé (BACT/ALERT®), substances qui auraient un
effet neutralisant sur les antibiotiques. Même si l’activité neutralisante de ces substances
est revendiquée par les fabricants, les rares publications sur le sujet sont contradictoires.
De toute manière, si le patient reçoit des antibiotiques, il est toujours conseillé de pratiquer
le prélèvement à la « vallée » c’est-à-dire juste avant ré-administration des antibiotiques,
moment ou leurs concentrations sanguines sont les plus faibles, ou après avoir pratiqué une
« fenêtre thérapeutique ».
Les résines interviendraient aussi dans la lyse cellulaire, permettant la libération des
bactéries intracellulaires. Il est à noter que l’examen direct des flacons positifs comportant
du charbon ou des résines est rendu plus difficile que celui des flacons classiques. (2)
53
III.4. Prélèvement :
Les prélèvements pour hémoculture sont pratiqués le plus tôt possible après les premières
constatations cliniques, avant antibiothérapie et au moment du pic fébrile (frissons). Après
une antisepsie soigneuse de la peau (alcool iodé), un échantillon de sang est prélevé par
ponction veineuse (5 à 10ml de sang) et ensemencé en conditions aérobie et anaérobie. Les
hémocultures doivent être acheminées le plus rapidement possible au laboratoire.
Figure 1. Paire de flacons à hémocultures aéro et figure 2. Flacons de

prélèvement anaérobie devant l'automate à
agitation et
détection continue Bactec 9240.®
III.5. Incubation des flacons :

Une incubation à 35°C pendant 7 jours, la lecture est visuelle et doit être réalisée deux
fois par jour au cours des 48 premières heures puis seulement une fois par jour pour les 5
jours suivant. L’observateur va rechercher la présence d’un trouble du milieu provoqué par
la croissance bactérienne (bacilles à Gram négatif aérobies, Staphylococcus spp, et
Bctériodes spp), d’une hémolyse (Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Clostridium
spp), de production de gaz (bactéries aéro-anaérobies facultatives et anaérobies strictes) ou
la présence de colonies sur les géloses. Certains genres bactériens comme Brucella,
Haemophilus, Neisseria et Campylobacter troublent peu ou pas le bouillon de culture,
l’usage d’un flacon biphasique s’avérant alors utile.(1)
III.6. Traitement des flacons ensemencés :

III.6.1. Examen microscopique :
L’examen du bouillon est effectué en deux étapes :
- Etat frais afin d’observer la morphologie et la mobilité des bactéries.
- Coloration de Gram pour déterminer plus précisément la morphologie des bactéries, cocci
ou bacille et leur affinité tinctoriale, caractère à Gram positif ou négatif.(1)
54
III.6.2. Ensemencement :
Les repiquages des flacons suspects sont effectués en fonction de l’examen direct. Les
cultures étant généralement mono-microbiennes, des milieux gélosés non sélectifs seront
utilisés, géloses Columbia avec 5% de sang incubées en aérobiose pendant 48 heures et en
anaérobiose pendant 5 jours, géloses au sang cuit enrichies (polyvitex) placés sous CO2
pendant 48 heures lorsqu’un Haemophilus spp, ou une Neisseria spp, sont évoqués.
Si à l’examen direct un mélange de bactéries et suspecté, des milieux sélectifs pourront

alors être utilisés, la gélose ANC (acide nalidixique-colistine) pour isoler sélectivement les
bactéries à Gram positif et la gélose CLED pour les bacilles à Gram négatif. Le choix de
l’atmosphère (aérobiose, CO₂ à l’anaérobiose) pour l’incubation de ces milieux à 37°C
dépend du diagnostic présomptif.
Les flacons sont conservés à température ambiante pour un éventuel nouveau repiquage
ultérieur si les cultures sont restées négatives. De plus, sur des hémocultures mono-
microbiennes, il est possible à partir d’un culot lavé, de réaliser directement un
antibiogramme, soit manuellement, soit à l’aide d’une galerie ou d’un automate suivant
l’équipement du laboratoire. Suivant le type bactérien observé à la coloration de Gram, une
identification sera parallèlement lancée. Les résultats n’auront alors de valeurs que si
l’isolement observé le lendemain est bien mono-microbien. Dans le cas contraire, à partir
des colonies des repiquages, seront pratiqués un examen direct et quelques test
biochimiques rapides, permettant d’orienter vers une identification complète (galerie,
biotypages/sérogroupages, etc.) et d’étudier la sensibilité aux antibiotiques de la/des
souche(s) isolée(s).
Afin de gagner du temps lorsque l’on suspecte un germe parmi S. pneumoniae, E. Coli
K1, H. influenza b ou N. meningitidis A, B ou C, une recherche d’antigène soluble peut
être réalisée directement sur le surnageant du flacon d’hémoculture à l’aide de latex
sensibilisé ou du Kit Now® Streptococcus pneumoniae de chez Binax.(1)
III.6.3. En cas d’une hémoculture négative :

Des repiquages négatifs d’hémocultures peuvent être dus à un micro-organisme de culture
difficile, le choix des conditions de subcultures n’étant pas adaptés et/ou le temps de
culture trop court. En effet, pour certains micro-organismes ayant des exigences nutritives
particulières, les subcultures pourront se faire sur des milieux différents et en atmosphère
adaptée en fonction de la morphologie et du contexte clinique, notamment pour les
bactéries comme Brucella spp, Compylobacter spp, Legionella spp, Mycoplasma spp, ou
des bactéries anaérobies. Les subcultures seront alors conservées au minimum 4 jours. Il en
est de même pour les streptocoques déficients, Abiotrophia et Granulicatella, qui
nécessitent du pyridoxal ou de la cystéine pour leur croissance. Elles se caractérisent par
une croissance en flacon d’hémoculture et une absence de croissance en milieu gélosé
55
normal. Par contre ces bactéries pousseront sur milieu gélosé additionné de pyridoxal ou de
cystéine, ou en satellitisme autour d’une strie de S. aureus.
Techniques d’hémocultures
Castanéda Bouillon citraté
Sérum (SDW)
Caillot
Incubation à 37°C 18 à 24h Bouillon

Si trouble, hémolyse ou pousse aux sels
sur la partie solide. biliaires
E. frais Gram. Mélanger jusqu’à dissolution du caillot
Isolement sur milieux appropriés Gélose +

glucose +
indicateur
de pH
Galerie biochimique + ATB
Incubation à 37°C
Si absence de trouble, hémolyse
ou autres signes de culture,
reincuber à 37°C et contrôler les Isolement sur SS, BCR ou HK 24h à 37°C
flacons d’hémocultures tous les
24 h
Si après 7 jours absence de Repiquage des colonies suspectes sur TSI 24h à 37°C
trouble ou autres signes faire
quand même un isolement de
contrôle et donner le résultat
définitif. Galerie biochimique + antibiogramme
56
IV. Diagnostic bactériologique et suivi biologiques des

méningites bactériennes :
L’examen du liquide céphalorachidien (LCR) est une étape essentielle du diagnostique de
la méningite bactérienne et fongique. Ce produit biologique est un liquide stérile à l’état
normal, et clair, il occupe deux grands compartiments du système nerveux central.
Le prélèvement du LCR doit toujours être considérer comme prioritaire et exigeant une
prompte attention de la part du personnel du laboratoire, il s’agit toujours d’un examen
d’urgence à traiter le plus rapidement possible.(2)
IV.1. Contexte clinique :

L’examen cytobactériologique du LCR est souvent demandé en cas d’une atteinte
cérébrospinale et qui est généralement due à :
- des lésions traumatiques.

- de mal formation du système nerveux centrale ou ses enveloppes.
- de manœuvres instrumentales ou interventions neurochirurgicales.
- une attente microbienne virale ou, mycosique.
Les bactéries recherchées dans LCR :

- Streptocoques, E. Coli K1, Listeria monocytogenes, Pneumocoque, Méningocoque.
- Staphylocoques, entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa et apparentés.
IV.2. Prélèvement :
Le prélèvement de LCR est effectué dans des conditions très rigoureuses d’asepsie le
plus souvent, le liquide est recueilli au niveau lombaire par ponction du cul de sac dural
entre les espaces vertébraux L4-L5 ou L5-S1 habituellement 1 à 5 ml d’LCR sont collectés
dans trois récipients stériles ne contenant aucun anticoagulant.
L’échantillon de LCR doit être adressé rapidement au laboratoire pour y être analysé
dans les plus brefs délais, toutes conservations du LCR avant sa mise en culture réduit la
chance d’isolement d’un micro-organisme toutefois, si l’examen du LCR ne peut être
réalisé immédiatement, un échantillon pourra être conservé une à deux heures à 30°C pour
les cultures bactériennes, un autre à 4°C pour l’étude cytologique.
57
IV.3. Démarche diagnostique :

A. Examen direct :
a. Examen macroscopique :
- LCR clair (eau de roche) avec faible quantité de polynucléaires.

- LCR hémorragique par piqûre vasculaire ou hémorragie méningée; dans ce cas il peut
devenir xanthochromique lorsque l’hémorragie méningée est ancienne.
- LCR trouble dû à l’hyperleucocytose et en fonction de son intensité, tous les degrés
existent depuis une légère opalescence jusqu’au pus en passant par l’aspect «eau de riz».(3)
b. Examen biochimique :
- Proteinorachie augmentée.
- Glycorrachie souvent abaissée voire indosable.
- Chlorurorachie le plus souvent normale.(3)
c. Examen microscopique :
- La numération en cellule de Malassez permet d’évaluer le nombre d’élément nucléé et
d’hématies par mm³.
- La coloration de Gram, élément essentiel du diagnostic, permet la mise en évidence des

bactéries dans le LCR.(2)
B. Analyse bactériologique :
a. Culture bactérienne :
Quelque soit le nombre d’éléments, le LCR est ensemencé sur milieux de cultures
adaptés aux bactéries recherchées. En effet, au tout début d’une méningite bactérienne, il
est possible de constater une cellularité normale. Dans de rares cas et selon les données
cliniques, la recherche de germes anaérobies peut être envisagée. Les cultures sont
observées quotidiennement, avec une réponse provisoire à 48 heures, et conservées en
incubation 5 jours. Selon la cytologie ou le contexte cliniques, différentes possibilités
peuvent être envisagées.(2)
Dans tous les cas sont ensemencés des milieux permettant la croissance des bactéries
exigeantes responsables des méningites purulentes.
- Gélose au sang cuit, supplémentée en facteurs de croissance, incubée à environ 35°C

sous une atmosphère de 5 à 10% de CO₂.
- Gélose au sang, incubée à environ 35°C sous une atmosphère de 5 à 10% de CO₂.
58
b. Cytologie normale :
Le LCR est ensemencé en quadrant sur gélose « chocolat » Isovitalex®, incubée 5 jours
à 37°C sous 5% de CO₂ et sur gélose Columbia au sang incubée en anaérobiose.
Cytologie anormale et absence de germe à l’examen direct :
La mise en culture du LCR sur gélose « chocolat » Isovitalex® sous 5% de CO₂ et sur
gélose Columbia au sang incubée en anaérobiose, est complétée par l’ensemencement d’un
bouillon cœur-cervelle. Ces 2 milieux sont incubés 5 jours à 37°C. (1)
c. Présence de germes à l’examen direct :

La morphologie, le groupement et la coloration de Gram permettent d’orienter le
diagnostic. L’examen direct du LCR par la coloration est généralement positif à partir 10⁴-
105 UFC/ml. Les patients ayant une quantité initiale de germes ≥ 10⁷ UFC/ml ont un risque
de stérilisation retardée du LCR et de séquelles à court moyen terme plus élevé que chez
les patients ayant un taux initial <10⁷ UFC/ml.
En conséquence, en plus de l’ensemencement classique, une culture quantitative doit être

réalisée par ensemencement au râteau de 100µl de LCR pure, et de dilutions au 1/10 et
1/100 du LCR, sur géloses « chocolat » Isovitalex® incubées à 37°C, sous CO₂. En cas
d’examen direct positif, antibiogramme et détermination des CMI peuvent être directement
tentés à partir du LCR, et sont confirmés secondairement après isolement bactérien.(1)
d. Cas particuliers :
Patients immunodéprimés : En cas de suspicion de cryptococcose méningée, on
recherche le cryptocoque par examen direct à l’encre de Chine. De plus, les
ensemencements de la gélose « chocolat » Isovitalex® et du bouillon cœur-cervelle sont
complétés par la mise en culture du LCR sur gélose Sabourand. Le plus souvent dans les
cryptococcoses méningées le LCR est lymphocytaire et normoglycorachique.
Suspicion clinique de tuberculose avec localisation méningée : l’ensemencement sur

milieux traditionnels est complété par la mise en cultures sur géloses Lowenstien ou
Coletsos et milieux liquides.
Selon les données cliniques, une recherche de Leptospire peut être entreprise. Dans se
contexte, le LCR est normoglycorachique et montre une hypercellularité lymphocytaire.(1)
59
C. Résultats et interprétation :
1- Résultats (à transmettre en urgence) :
- Leucorrachie et formule leucocytaire.

- Présence ou absence de bactéries à l’examen direct.
- Si présence des bactéries, préciser leur morphologie (bacilles ou coque) et leur affinité
tinctoriale (Gram (+) ou Gram (-)), s’aider éventuellement d’une recherche d’antigènes
solubles.
- Glycorrachie, proteinorachie et chlorurorachie. (1)
2- Examens des cultures, identification et antibiogramme :

a- Lecture des cultures :
L’orientation diagnostic sera portée sur :

- L’aspect des colonies bactériennes.
- La morphologie et l’affinité tinctoriale des bactéries isolées.
- Les exigences nutritionnelles des micro-organismes.
- La présence ou l’absence d’une oxydase ou d’une catalase.(1)
b- Ensemencement d’une galerie d’identification :

- A partir des colonies isolées, effectuer les testes biochimiques d’identification
appropriés.
-A titre indicatif pour les trois espèces principales responsables de méningites

(méningocoque, pneumocoque, et hæmophilus) pratiquer les tests suivants :
- Pour les méningocoques :

Cocci Gram (-), oxydase (+), glucose (+), maltose(+), saccharose(-), glutamyl transférase
(+) et groupage antigénique.(1)
- Pour pneumocoque :
Diplocoque Gram (+), catalase (-), sensible à l’optochine, la lyse par les sels biliaires et
agglutination avec les particules de latex sensibilisées par un immun sérum polyvalent anti
S. pneumoniae.(1)
- Pour hæmophilus :
Coccobacilles Gram (-), oxydase (-) ou lente, exigence en hémine et en NAD, présence
d’une (uréase, ODC, indole et PNPG) détermination du biotype, puis groupage antigénique
(hæmophilus influenzae ‘b’).(1)
60
c- Recherche d’antibiotique dans le LCR :

La recherche d’antibiotique par procédé microbiologique est souhaitable pour éliminer
toute cause de cultures faussement négatives : une goutte de LCR est déposée à la surface
d’une gélose préalablement ensemencée par inondation avec une suspension bactérienne
d’un germe sensible. La présence d’une zone d’inhibition, après 24 heures d’incubation,
témoigne de la présence effective d’antibiotique dans le LCR. L’ensemencement d’un
bouillon cœur-cervelle peut cependant permettre d’éliminer par effet de dilution,
l’inhibition de la croissance bactérienne due à l’antibiotique. Cette recherche est effectuée
en cas de suspicion de méningite décapitée et sur les PL de contrôle.(1)
Technique du LCR
Examen direct
Examen macroscopique : culture bactérienne :
- Aspect macroscopique
- Analyse cytologique enrichissement sur BGT isolement

sur BN ou
- Etat frais (cellule de comptage) Mx

appropriés
- Les colorations GN, BCP,

GS, LJ
(Bleu, Gram, Ziehl Nielsen)
Incubation à 37C pendant un temps nécessaire (24H)
Identification biochimique, antigénique, et antibiogramme.
61
V. Examen cytobactériologique des Urines ECBU

Le prélèvement d’urine est celui qui est le plus fréquemment mis en culture pour
diagnostiquer une infection urinaire basée ou haute d’où les sites d’infections des voies
urinaire les plus fréquents sont la vessie (cystite) et l’urètre, à partir de ces deux points
l’infection peut remonter le long des uretères (urétérite) et gagner le rein (néphrite
interstitielle). Les femmes sont sujettes à l’infection des voies urinaire que les hommes et
ce sont également chez elles que l’on rencontre les difficultés les plus grandes pour
prélever correctement des échantillons d’urines.
V.1. Contexte clinique :

L’ECBU est prescrit dans les circonstances suivantes :
- Présence d’une symptomatologie d’infection urinaire.
- Contrôle systématique (femmes enceintes, ECBU préopératoire en urologie).
- Contrôle post thérapeutique.
Les bactéries responsables d’infection urinaires :
Les bactéries les plus fréquemment retrouvées dans les infections urinaires sont :
- les entérobactéries (90% E. Coli, 5% le proteus, Klebsiella-Entérobacter 1%).
- Entérocoques 1%
- Les staphylocoques 1%
- Les autres 3%
Par contre chez les malades hospitalisés, les bactéries responsables sont celles qui sont
résistantes aux antiseptiques et antibiotiques et qui sont :
- Pseudomonas aeruginosa, staphylocoques coagulase négatives.

- Entérobactéries à des pourcentages différents par rapport à ceux responsables d’infection
urinaires chez les patients (de ville).
V.2. Prélèvement :
L’objectif majeur du prélèvement est de recueillir l’urine vésicale, normalement stérile,
en évitant sa contamination lors de la miction par la flore commensale qui colonise
l’urèthre et la région périnéale.
Afin d’éviter toute prolifération bactérienne, le transport au laboratoire se fera en moins

de 2 heures.au delà de ce délai, le flacon d’urine sera placé dans un récipient contenant de
la glace (les urines pourront être gardées 24h à 4°C, en sachant toutefois que la
réfrigération ne préserve pas les leucocytes).(1)
62
V.3. Examen cytobactériologique :

V.3.1. Examen cytologique :
A l’aide d’un dispositif à numération de type cellule de Malassez (de préférence à usage
unique) ou par une méthode automatique validée. On dénombre les différents éléments
figurés contenus dans un volume donné de l’urine à étudier, préalablement homogénéisée.
Leur nombre doit être rapporté par millilitre.(1)
V.3.2. Mise en culture :

Une leucocyturie normale associée à l’absence de bactéries à l’examen microscopique
lors d’un examen attentif a un fort pouvoir prédictif négatif d’infection urinaire. En milieu
communautaire, et sans pathologie sous-jacente, l’urine ne nécessite pas de culture dans
ces conditions. Chez le nouveau-né, le nourrisson, le sujet fortement neutropénique ou
présentant des antécédents chirurgicaux ou des malformations du tractus urinaire, la culture
doit être réalisée.(1)
V.3.3. Dénombrement des micro-organismes :

L’évaluation quantitative de la bactériurie peut s’opérer par technique de l’anse calibrée
(généralement à 10µL), par la méthode de la lame immergée ou par toute autre méthode
permettant la quantification des bactéries par culture. Ces méthodes permettent de détecter
des bactériuries ou des candiduries à partir d’un seuil d’environ 10² UFC/ml d’urine.(1)
V.3.4. Uroculture : « à la fois qualitative et quantitative »

A. Choix des milieux :
La très grande majorité des bactéries responsables d’infections urinaires ne sont pas
exigeantes et sont cultivées sur géloses ordinaires (tableau 01).(1)
a. Milieux non chromogènes :

Initialement, les milieux les plus usuels étaient adaptés à la croissance des
entérobactéries avec le plus souvent un indicateur de l’attaque du lactose permettant une
différenciation des colonies. Les milieux les plus utilisés étaient soit non sélectif : le milieu
de CLED, et milieu lactosé au bromocrésol pourpre, soit sélectif : le milieu de Mac
Conkey. L’utilisation d’un milieu sélectif pour les bactéries à Gram négatif rendait
impératif l’ensemencement d’une gélose adaptée aux bactéries à Gram positif telle qu’une
gélose au sang avec ou sans inhibiteurs type acide nalidixique plus colimycine.(1)
63
b. Milieux chromogènes :
Le principe du milieu chromogène est d’utiliser des substrats synthétiques qui sont des
analogues structuraux d’une molécule naturellement clivée par une enzyme caractéristique
d’une espèce bactérienne ou d’un groupe d’espèces bactériennes. Le substrat clivé acquiert
des propriétés chromogéniques et précipite en colorant la colonie sans diffuser dans la
gélose. La plupart des milieux chromogènes utilisent un jeu de différents substrats
permettant une très bonne différenciation des colonies et une identification présomptive de
ou des espèces bactériennes présentes dans l’urine. Le tableau (02) indique les enzymes
détectés et l’aspect des colonies suivant les différents milieux commercialisés.
Aujourd’hui, les milieux chromogènes bien que plus onéreux, ont largement supplanté les
milieux non chromogènes en raison de plusieurs avantages.ces milieux permettent une
discrimination plus fine des colonies et donc une meilleure sensibilité de détection des
urines poly-microbiennes. Ils permettent une identification directe de E. Coli,
Enterrococcus spp et Proteus mirabilis, à l’aide de tests complémentaires simples (indole,
état frais) permettant un rendu d’identification plus rapide au clinicien et une éventuelle
adaptation de l’antibiothérapie probabiliste. Ils permettent une économie substantielle en
réactifs et en temps-technicien. Il est à noter toutefois que dans de rares cas ce système
d’identification peut être pris en défaut. Ainsi par exemple, de rares souches de Citrobacter
freundii indologènes dépourvue de β-D-galactosidase peuvent être identifiées à tort comme
E. Coli (Tableau 02). Par ailleurs quelques souches d’Entérobacter spp et de Citrobacter
spp, ont été décrites avec un phénotype de β-D-glucuronidase. Le microbiologiste,
notamment en milieu hospitalier du fait de la plus grande diversité des entérobactéries
rencontrées, devra donc rester vigilant et bien contrôler l’adéquation entre l’identification
et l’antibiogramme. Un autre risque est représenté par la possibilité de confondre un
entérocoque et un streptocoque du groupe B qui peut être responsable d’infection urinaire
chez la femme enceinte ou le nouveau-né. Chez ces patients l’utilisation en parallèle d’une
gélose au sang apparait souhaitable.(1)
c. Autres milieux :
D’autres milieux seront utilisés en fonction du contexte clinique ou en fonction du Gram :
- En cas de suspicion de tuberculise, la recherche de M. tuberculosis sera réalisée sur les
milieux adéquats.
- En cas de cystite hémorragique chez des patients immunodéprimés, on recherchera
Corynebacterium urealyticum en ensemencement une gélose au sang et en prolongeant
l’incubation au-delà de 24heures.
- En présence de bactéries à Gram (+) à l’examen direct, une gélose au sang sera
systématiquement ensemencée.
-En présence de germes à l’examen direct et en l’absence de culture en 24heures, une
recherche d’anaérobies et de germes exigeants sera réalisée en ensemençant une gélose au
64
sang incubée en anaérobiose durant 48heures et une gélose « chocolat »sous CO₂ durant
48heures.
- En présence de levures, un milieu Sabourand ou un milieu chromogène pour levures
(permettant l’identification de C. albicans) sera ensemencé et incubé à 30°C.(1)
Figure03 : Culture d’E. Coli sur CPS à partir d’une urine.
Figure04 : Culture d’Enterococcus faecalis sur CPS à partir d’uneurine.
Espèces responsables d’infections urinaires (proportion en %)

Espèces Infections Infections Infections S.A.U.
bactériennes communautaires nosocomiales groupe d’un hôpital
réseau AFORCOPI- d’étude ESCMID pédiatrique 2005
BIO rapport Onerba Europe 2000(n=421) (n=221)
2002 (n=417)
Gram négatif
Escherichia coli 68 38 79
Proteus mirabilis 8 7 9
Klebsiella spp 5 9 3
Pseudomonas 1 6 0,5
aeruginosa
Autres 3 7 1
entérobactéries
Acinetobacter spp 2
Gram positif
Enterrococcus spp 5 17 3
Staphylococcus 3 0,5
saprophyticus
Staphylococcus 3 2 2
aureus
Streptococcus 3 1
agalactiae
Autres 1 2 1
Levures 10
Tableau 01 : Espèces responsables d’infections urinaires.
65
Milieux chromogènes et ECBU : enzymes recherchées et aspect des colonies

Espèces ou groupe d’espèces bactériennes
Enzyme détectée E. Coli* Groupe Groupe Enterococcus
réaction Klebsiella, Proteus*
chromogènique et Entérobacter, Morganii,
milieu Serratia, Providencia
commercialisé Citrobacter
β -D- + - - -
glucuronidase[1]
= colonie rose
β -D- galactosidase + + - -
[2]
=colonie rose
Β -D- glucosidases - + - +
[3]
= colonie bleue
Tryptophane - - + -
déaminase [4]
= pigmentation
beige de la gélose
Uriselect4® Rose Violet Beige Bleu
Enzymes 2 + 3 + 4
CHROMagar Rose Violet Beige Bleu
Orientation®
Enzymes 1 + 3 + 4
CPI ID 3® Rose Bleu Beige Bleu
Chromogenic UTI Rose Violet Beige Bleu
medium®
Enzymes 2 + 3 + 4
Tableau 02 : Milieux chromogènes et ECBU.
La confirmation de l’espèce E. Coli et l’identification de l’espèce Proteus mirabilis sera

réalisée par la recherche d’indole (test complémentaire), positive dans le premier cas et
négative dans le deuxième cas.(1)
B. Mode d’ensemencement :
L’ensemencement doit répondre au double but de dénombrer les bactéries et d’isoler la
ou les bactéries en cause en obtenant des colonies bien distinctes les unes des autres.(1)
- Méthode originale de Kass :

On fait des dilutions en série de 10 en 10 un volume connu de chaque dilution est étalé sur
un boite de Pétri.(1)
66
- Méthode simplifiée de Véron :

L’urine est diluée au 1/100 en eau distillée stérile. On étale 0,1 ml de cette dilution. Une
colonie correspond à 1000 bactéries par millilitre.(1)
- Méthode de l’anse calibrée :

Cette méthode est actuellement la plus utilisée. L’urine est prélevée à l’aide d’une anse de
10µl et est ensemencée selon une méthode standardisée qui permet, grâce a un abaque, de
convertir l’aspect de la culture en UFC par millilitre et ce sans dénombrement. Cette
méthode simple, sans dilution préalable, permet une numération de 103 à 106 UFC/ml tout
en permettant l’obtention de colonies isolées.(1)
Figure05 : l’ensemencement d’un ECBU.
- Méthode de la lame immergée :

On plonge dans l’urine fraichement émise une lame portant des milieux nutritifs,
généralement Mac Conkey et CLED. Cette méthode permet l’ensemencement des urines
au lit du malade. Toutefois elle présente le désavantage de ne pas obtenir des colonies
isolées pour des concentrations de 10 bactéries par ml et donc nécessite souvent le
réensemencement en isolement de l’urine en cas d’infection. (1)
Incubation des Uroculture :

La majorité des bactéries des infections urinaires poussent en 18 à 24 heures et en dehors
de contexte particulier il n’y a pas lieu de prolonger l’incubation. Dans certains cas,
bactéries exigeantes, déficientes, ou culture négative, malgré la présence de bactéries à
l’examen direct, il faut savoir modifier le milieu de culture (gélose au sang ou
« chocolat ») et l’atmosphère (anaérobiose et CO₂), et prolonger l’incubation.(1)
67
La technique de l’ECBU
Examen direct :
- Etat frais (cellule de comptage)
- Coloration de Gram
- Coloration bleu La culture bactérienne :
Isolement sur milieux appropriés GN, GC, EMB
Chapman ou lame immergée
Incubation à 37°C pendant 24 heures
Identification + Antibiogramme.
VI. Examen bactériologique des selles

L’objectif de cette analyse consiste à rechercher le(s) micro-organisme(s) pathogène
responsable de la diarrhée (entéro-invasif ou entéro-toxique) ou à rechercher un
déséquilibre de flore. Il faut isoler ce pathogène au sein d’une flore fécale complexe.
VI.1. Circonstances de demande :

- Diarrhée aigüe.
- Le portage d’une bactérie enteropathogénes est orienté par la clinique.(4)
a. Bactéries recherches :
Dans tous les cas :
- Salmonella spp.
-Shigella spp.
-Campylobacter spp.
-Yersinia spp.
-Aeromonas spp.
-Salmonella spp.(4)
68
b. Demande spécifique/tableau clinique particulier :

- Clostridium difficile toxinogènes Vibrio spp.
- Escherichia coli producteur de vérotoxine Bactéries multi résistantes (BMR).(4)
VI.2. Prélèvement :
Echantillon Conteneur Transport Conservation Commentaires
Selles Poudrier stérile ≤ 1 ≤ 24 heures Si hospitalisation ≥ 3
stérile heure 4°C jours la coproculture
température standard n’a pas
ambiante d’utilité* ; seule une
recherche de
Clostridium difficile
doit être effectuée
Ecouvillonnage Ecouvillon ≤2 heures ≤24 heures Non recommandé

rectal température température sauf parfois en
ambiante ambiante ou pédiatrie Non
4°C recommander pour
détecter la présence
de C. difficile
Tableau03 : prélèvement des selles.
VI.3. Examen macroscopique :

L’aspect macroscopique de la selle est important pour orienter sur la physiopathologie de
la diarrhée :
-Si selle solide : rechercher du sang, du pus, des glaires.
-Si selle liquide, l’aspect fécal avec des glaires sanglantes oriente vers un syndrome
dysentériforme alors que l’aspect incolore ou eau de riz évoque un syndrome
cholériforme.(4)
VI.4. Examen microscopique :

• Présence de polynucléaires : si les bactéries sont invasives mais inconstant parfois.
• Absence de polynucléaires : si les bactéries sont entéro-toxiques. (4)
69
VI.4.1. Milieux, inoculum, durée et température d’incubation :

Des milieux sélectifs d’isolement et des milieux d’enrichissement sont utilisés en
fonction du contexte clinique.
La recherche de Salmonelle et Shigelles doit être systématique. Différents milieux

sélectifs sont commercialisés : gélose Salmonella Shigella (SS), gélose Hektoen, etc. des
milieux chromogènes ont été mis au point pour permettre une différenciation plus aisée de
Salmonelles, les milieux sont incubés 24 heures à 37°C.
Pour la recherche de Salmonella, on ensemence un milieu d’enrichissement au sélénite-

milieu d’eifson- ou au tétrathionate- milieu de Mueller-Kauffmann- avec 0,5 ml de selles.
Il est important de les épiquer après 3 à 6 heures maximum d’incubation à 37°C afin
d’éviter la multiplication des bactéries commensales mal inhibées au-delà de ce délai. Il
n’existe pas de milieu d’enrichissement pour les Shigella.(1)
VI.4.2. Mode opératoire :

- Dilution de la selle au 1/10 dans de l’eau distillée.
- Ensemencer systématiquement.
- Une goutte de la dilution en quadrant sur un milieu pour recherche de Salmonelle-
Shigelle (HeKtoen, SS, milieu chromogène).
- Une goutte de la dilution en Bouillon Mueller-Kaufman (pour l’enrichissement en
Salmonelle).(1)
a) Ensemencer en plus :
- un milieu de Karmali pour la recherche de Campylobacter pour les enfants de moins et/ou
en cas de suspicion à l’examen direct.(1)
b) Selles sanglantes :
- Un milieu Mac Conkey Sorbitol : pour la recherche de E. Coli O157 et autres STEC et
conserver la selle pour recherche de Shigella like toxines.
- Un milieu sélectif pour Yersinia.
- Un milieu sélectif pour recherche Clostridium difficile er recherche de la toxine de C.
difficile en immuno-chromatographie.
- Un milieu de Sabourand : si présence de levures à l’examen direct.
- En cas de suspicion de choléra : ensemencer un milieu spécial alcalin TCBS pour la
recherche du vibrion.(1)
70
c) Recherche de Salmonelles et Shigelles :

L’orientation s’effectue selon l’aspect des colonies :
-Sur milieu Hektoen après 24h à 37°C, les colonies suspectes sont H2S+ et lactose(-).
-Sur la gélose SS, la présence de colonies incolores ou faiblement colorées avec ou sans
centre noir est une forte présomption de Salmonella ou de Shigella.
-Sur les milieux chromogènes, la détection spécifique de l’estérase des Salmonella donne
une coloration des colonies variant du rose au mauve.
-On repère au moins cinq colonies suspectes isolées.
-La recherche de l’Uréase (milieu urée-indole) est faite sur chaque colonie suspecte :
* Eliminer les colonies de Proteus : Uréase+ (milieu-indole rouge en 2H).
* Ensemencer avec les autres colonies à partir du milieu urée-indole, une galerie
d’identification (API 20 E) et un antibiogramme d’entérobactérie.
* Ensemencer les colonies suspectes sur milieu de Kligler Hajna.
L’identification définitive se fait par les caractères biochimiques et l’étude de la formule

antigénique. Un test présomptif des Salmonelles consiste en la lyse par les bactériophages
spécifiques est pratiqué sur une gélose Mueller Hinton en déposant une microgoutte d’une
suspicion phagique. A partir de la cinquième heure d’incubation à 37°C, on peut déjà voire
une plage lyse au niveau du dépôt de la goutte.(1)
d) Identification antigéniques des Shigella :

- Utiliser une culture en milieu solide non inhibiteur. Faire les agglutinations de préférence
à partir des colonies réensemencées sur milieu de Kligler-Hajna.
- Effectuer les agglutinations à l’aide des réactifs Bio-Rad.(1)
e) Recherche de Campylobacter :
a. Examen direct :
L’observation microscopique directe de selles diarrhéiques au microscope à contraste de

phase peut permettre un diagnostic avec présence de bactéries présentant une mobilité
caractéristique en « vol de mouette ».
L’examen après coloration de Gram met en évidence des petits bacilles à Gram négatif
incurvés.(1)
71
b. Aspect des colonies :

On repère aprés48H d’incubation les colonies suspectes. Selon l’humidité du milieu :
petites colonies grisâtres convexes à bords réguliers ou colonies plates muqueuses de
forme irrégulière :
- C. Fétus ; petites colonies, rondes, transparentes.
- C. jejuni : colonies grises, humides, plates et qui ont tendance à s’étaler après 48H
d’incubation à 37°C.
*Les caractères suivants sont recherchés :

- Oxydase+
- Très mobiles en « vol de mouette ».
- Petits bacilles à Gram négatif incurvés avec des formes en S.
- Test à l’hippurate : à partir d’une culture riche sur gélose « chocolat » Isovitalex®.
- Suspension laiteuse dans 0,25 ml de Na Cl+ un disque d’hippurate.
- Incuber 4heures à 37°C.
- Lecture : ajouter 5 gouttes de ninhydrine.
-Réincuber 10 à 15 min (maximum) à 37°C.
- Test + : bleu foncé.
- Test - : incolore, jaune léger, bleu très clair.(1)
f) Recherche de Clostridium difficile :

Culture et mise en évidence de la bactérie dans les selles :
Isolement de C. difficile par culture : la culture est effectuée dans des conditions
d’anaérobiose stricte (sachet individuel ou jarre) sur milieux sélectifs contenant de la
cyclosérine et de la cefoxitine comme le milieu TCCA (gélose cœur-cervelle +5% de sang
de cheval, 0,1% de taurocholate, 250mg/l de cyclosérine et 10mg/l de céfoxitine). Les
subcultures peuvent être effectuées sur gélose au sang ou milieu de Wilkins-Chalgern.
Après 48heures d’incubation en anaérobiose à 37°C, les colonies sont présentent les
caractéristiques suivantes :
- Colonies à bords irréguliers (3-5 mm), non hémolytiques présentant un aspect de verre
fritté à la loupe binoculaire.
- Odeur caractéristique de crottin de cheval (libération de crésol).
- Colonies fluorescentes sous UV (mais dépond du milieu utilisé).
L’identification se fait à l’aide de galeries biochimiques (Rapide ID32A, API20A, etc.).

Elle peut également se faire par un test d’agglutination avec un latex sensibilisé par des
anticorps anti-glutamate déshydrogénase (GDH).(1)
72
g) Recherche des différents pathovars d’Escherichia coli :

*Méthodes biochimiques de détection et d’isolement des EHEC :
Les EHEC n’ont pas de propriété biochimique commune permettant leur isolement sur
un milieu particulier sauf le sérotype O157 :H7. En effet, contrairement aux autres E. coli,
E. coli O157 :H7ne fermente pas le sorbitol et ne possède pas de β-glucuronidase. Ainsi
l’absence de fermentation de sorbitol à justifié l’utilisation de la gélose Mac Conkey au
sorbitol (SMAC). Le milieu SMAC a été rendu plus sélectif par l’adjonction de tellurite et
de cefixime dont les CMI sont plus élevées pour les E. coli. La présence de colonies
suspectes (sorbitol négative) E. coli O157 :H7 sur SMAC doit être confirmée par :
- Un test d’agglutination latex réalisé directement sur la colonie suspecte pour vérifier la
présence de l’antigène somatique O157.
- L’identification biochimique de l’espèce (galerie API).
Les STEC non-O157 n’ont pas les caractéristiques biochimiques communes rendant
possibles l’utilisation d’un milieu d’isolement particulier. Ces souches fermentant le
sorbitol ne seront pas repérées sur SMAC, ce milieu est donc inadapté. Une solution
alternative pour l’isolement de ces souches est l’utilisation de la gélose « entéro-
hémolysine ». La méthode est fondée sur le fait qu’une proportion importante des STEC a
la propriété de produire une entéro-hémolysine décelable sur gélose contenant des
érythrocytes de moutons lavés, additionnés d’ions Ca2⁺. Les colonies (STEC) suspectes
obtenues sur gélose au sang peuvent être confirmées par la recherche des gènes stx codant
les Shiga toxines par PCR. (1)
VI.4.3. Interprétation par le biologiste et modalités de réponse pour le

clinicien :
Chez un patient diarrhéique, la mise en évidence d’une bactérie réputée pathogène
(Salmonella spp, Shigella spp, Campylobacter spp, Y. entérocolitica) dans une
coproculture standard doit toujours être considérée comme pathologique (grade B). À noter
que l’isolement de Salmonella spp, et de V. cholerae doit être déclaré à la DDASS.
La présence d’E. Coli, même en grande quantité à la coproculture, ne doit pas être
considérée comme pathologique (grade C). Seules les souches d’E. Coli entéro-
hémorragique sécrétrices de Shiga-toxine doivent être considérées comme pathogènes
(grade B). S. aureus ne peut être impliqué dans une diarrhée aigue de plus de 24 heures
(grade C).
Concernant C. difficile, seules les souches toxinogènes sont pathogènes.

Un antibiogramme doit être réalisé sur les bactéries en situation de pathogénicité.(2)
73
Schéma de la coproculture
Selles
Examen macroscopique
Suspension 1/10
Examen microscopique :
- état frais culture
- Gram
Enrichissement, sélénite ou isolement milieux appropriés
Muller Kaufman BCP, HK, EMB, Shirrow ou Blaser
Incubation à 37°C
Repiquage après 6H d’incubation sur Après 24H réisolement des
BCP ou HK ou EMB colonies suspectes
Identification + ATB + Agg.
Coproculture pour la recherche du Vibrion Cholérique
Selles
Suspension
Isolement sur GNAB Enrichissement sur EPA₁
6H à 37°C
EPA₂ + GNAB₂
6H à 37°C
EPA₃ + GNAB₃
Identification des colonies OX(+) réaction de Roth + agglutination et antibiogramme.
74
VII. Analyse cytobactériologique des pus

Les prélèvements appelés « pus » en globale toutes les suppurations qu’elles soient
superficielles (escarre, ulcère, furoncle, etc.) ou profondes (ostéomyélite, spondylodiscite,
d’origine digestive, etc.). À coté de ces suppurations primitives, on distingue aussi les
suppurations secondaires post-chirurgicales ou post-traumatiques. Ces prélèvements de pus
sont très fréquents et constituent une grosse part de l’activité d’un laboratoire
bactériologie.(1)
VII.1. Diagnostic bactériologique direct :

VII.1.1. Prélèvements :
De manière générale, il est préférable de limiter ou minimiser les prélèvements par

écouvillonnage qui seront plus facilement contaminés, plus sensibles à la dessiccation et
non adaptés à la recherche de bactéries anaérobies.
Les prélèvements de pus doivent arriver rapidement au laboratoire (< 2 heures à

température ambiante), car très souvent il sera nécessaire de rechercher les bactéries
anaérobies.(1)
VII.1.2. Examen direct :

Une coloration de Gram sera effectuée sur un frottis du produit pathologique pour les
localisations profondes. On évaluera la quantité de polynucléaires, de cellules et, dans le
cas de prélèvements contaminés par une flore commensale, on évaluera l’abondance de la
flore.(1)
VII.1.3. Milieux de culture :

De par la diversité des bactéries potentiellement impliquées dans les prélèvements de
pus, des milieux de culture enrichis seront nécessaires ainsi que des milieux sélectifs,
notamment pour les prélèvements contaminés par une flore commensale.
Seront ensemencés au moins :

- Une gélose au sang incubée en aérobiose.
- Une gélose au sang + supplément polyvitaminique incubée sous CO₂ pour les bactéries
de cultures difficile.
- Une gélose au sang incubée en anaérobiose sauf pour les prélèvements réalisés sur
écouvillon.
- Un milieu liquide permettant la recherche d’anaérobie (Schaedler, Rosenow, etc.).
75
Peuvent être ajoutés :

- Une gélose au sang + ANC incubée sous CO₂.
- Une gélose simple incubée en anaérobiose pour la culture de bactéries à Gram négatif
type CLED, BCP, etc.
- Des flacons d’hémocultures peuvent être ensemencés avec les prélèvements liquides, soit
au lit du malade, soit au bloc opératoire, soit au laboratoire.
Les milieux de culture seront gardés au moins 48heures en anaérobiose de 5 jours pour
des localisations profondes ou pour recherche de bactéries de culture difficile.les milieux
de culture placés en anaérobiose seront gardés au moins 5, voire 10 jours.(1)
Schéma de pus
E. direct culture
- état frais isolement :
- coloration de Gram gélose au sang
48h en anaérobiose
5 à 10jours en anaérobiose
Identification + antibiogramme.
76
VIII. Isolement des bactéries anaérobies en bactériologie médicale :

Les bactéries anaérobies strictes sont des bactéries incapables de se multiplier dans une
atmosphère contenant 20% d’oxygène, donc dans l’air atmosphérique. Cette sensibilité à
l’oxygène est variable d’une espèce à l’autre. Elle est due à l’absence, chez la plupart de
ces bactéries, d’enzymes de la chaine respiratoire telles que cytochrome oxydase, catalase,
superoxyde dismutase. (9)
VIII.1. Prélèvement :
Ils ne doivent pas être contaminés par la flore commensale et doivent être maintenus à
l’abri de l’oxygène.
Les prélèvements qui peuvent être réalisés sans traverser une zone colonisée ne posent
pas des problèmes comme : LCR, liquides pleural, sang, pus profond………..
Le transport au laboratoire doit être rapide et éviter au maximum le contact avec

l’oxygène. Les écouvillons sont placés dans des Milieux de transport semi-gélosés.(9)
VIII.2. Examen direct :

Les écouvillons doivent être rechargés dans un ml de bouillon thioglycolate pour réaliser
un examen direct et ensemencement. Les frottis sont fixés à l’alcool à 90°, puis colorés
par la méthode de Gram en insistant sur l’étape à la safranine pour bien visualiser les
bacilles à Gram négatif effilés.(9)
VIII.3. Méthodes d’isolement :

Il faut utiliser des milieux enrichis en sang et vitamine K, additionnés de L-cystéine
comme agent réducteur. Les plus utilisés sont les milieux de Schaedler, Columbia,
Brucella qui peuvent être rendus sélectifs par addition d’aminosides. Le milieu Schaedler
néomycine-vancomycine sélectionne les anaérobies à Gram négatif. Tous ces milieux
doivent être pré-réduits par un passage de 24 heures en anaérobiose avant
l’ensemencement. Les milieux liquides ne sont utiles que pour isoler des bactéries qui
poussent mal sur milieu solide et parce qu’ils peuvent être conservés jusqu’à 15jours ou
même 3 semaines pour isoler des bactéries de croissance lente comme les Actinomyces.
Ces milieux liquides doivent être désoxygénés avant l’ensemencement par chauffage 10
mn à 100°C. Les plus utilisés sont : le bouillon de Schaedler, le bouillon thioglycolate ou
le milieu de Rosenow.(9)
VIII.4. Incubation :
Elle se fait le plus souvent en jarres hermétiquement closes dans lesquelles l’atmosphère
anaérobie peut être obtenue par différents types de sachets générateurs de gaz : CO₂, H₂.
Certains nécessitent la présence d’un catalyseur au palladium favorisant la fixation de
77
l’oxygène sur l’hydrogène. Ce catalyseur est inactivé par la vapeur d’eau de l’hydrogène
sulfuré produits par la croissance bactérienne et doit être régulièrement régénéré 2 heures
en chaleur sèche à 160°C. Certains sachets produisant uniquement du CO₂ sans addition
d’eau ne nécessitent pas la présence de catalyseur. Il existe aussi des jarres munies de
deux robinets que l’on peut perfuser avec un mélange gazeux anaérobie (N₂ 85%, CO₂
10%, H₂ 5%). L’intérêt de ce dernier système est qu’il permet d’obtenir l’anaérobiose sans
aucun délai, contrairement aux sachets qui nécessitent environ 2 heures avant décoloration
complète du papier indicateur redox. Il existe également des sacs hermétiques en plastique
fonctionnant sur le même principe et qui permettent d’incuber une à deux boites ou de
transporter un prélèvement.
Le système le plus performant est la chambre anaérobie dans laquelle les prélèvements
sont introduits par l’intermédiaire d’un sac, puis manipulés à l’aide de gants ou à mains
nues. L’intérêt principal de ce système est de pouvoir observer les boites et de faire les
différents repiquages sans rompre l’atmosphère anaérobie. La durée d’incubation est au
minimum de 48 heures. Sauf recherche particulière (Actinomyces), les boites sont
conservées 5 jours avant de communiquer un résultat négatif.(9)
VIII.5. Subcultures :
Lorsqu’il est fait en atmosphère normale, l’examen de différentes boites doit être rapide.
Il est important de comparer la croissance obtenue en anaérobiose à partir du même
inoculum. Toutes les colonies suspectes sont repiquées en anaérobiose et, sur le même
milieu, dans une atmosphère aérobie enrichie de 10% de CO₂ afin d’assurer du caractère
anaérobie strict de la bactérie. Certaines bactéries classées comme anaérobies strictes sont
en fait aérotolérantes et vont pousser dans cette atmosphère aérobie enrichie de CO₂. C’est
le cas de Propionibacterium, Actinomyces, Bifidobactérium, Clostridium tertium,
Lactobacillus. Après subculture, les boites de primoculture sont réincubées jusqu’à
5jours.(9)
VIII.6. Identification :
L’utilisation des galeries miniaturisées et commercialisées (API 20A) qui permettant
d’utiliser sensiblement les mêmes critères d’identification. Inoculées avec une forte
densité bactérienne, elles peuvent être incubées « enroulées » dans les jarres anaérobies. En
24 à 48 heures, les bactéries ayant une bonne activité glucidolytique sont correctement
identifiées.
Des galeries mettant en évidence l’activité enzymatique des bactéries sont également
commercialisées (Rapid ID32A...). Elles présentent l’intérêt de ne pas nécessiter de
croissance bactérienne puisqu’elles révèlent des enzymes cellulaires. Elles sont donc
incubées en atmosphère normale puis révélées après 4 heures à 37°C. Ces galeries
permettent d’identifier correctement la plupart des bactéries les plus fréquemment
rencontrées en clinique humaine.(9)
78
Chapitre III :
L’antibiogramme
Partie théorique chapitre III :
l’antibiogramme
I. Introduction :
L’antibiogramme est un examen de laboratoire visant à déterminer la sensibilité
d’une bactérie à différents antibiotiques. En effet, de nombreuses bactéries sont devenues,
avec le temps, résistantes aux antibiotiques. Il n’est donc pas toujours évident de trouver
l’antibiotique qui sera efficace pour traiter une souche bactérienne donnée.
En mettant en contact des bactéries (prélevées chez un malade) avec plusieurs

antibiotiques, l’antibiogramme permet de voir quels sont les produits qui inhibent la
croissance bactérienne et qui seront efficaces pour traiter l’infection. Il existe plusieurs
techniques pour réaliser un antibiogramme. Le plus souvent, les bactéries sont
« ensemencées » à la surface d’une boite de Pétri, sur un milieu gélifié, et des disques
imprégnés d’une dose connue de différents antibiotiques sont déposés à la surface de la
gélose. Si l’antibiotique est inefficace, les bactéries pourront tout de même croitre et l’on
pourra mesure la taille de leur colonie. Au contraire, si l’antibiotique est efficace, on
apercevra à la surface du disque des « zones d’inhibition », où la croissance bactérienne a
été inhibée. Le résultat est généralement obtenu en 24 heures.(4)
II. Milieux de culture pour Antibiogramme :
II.1. Gélose Mueller Hinton :
La gélose Mueller Hinton, favorise la croissance des bactéries non fastidieuses

(entérobactéries, bacilles à Gram négatif fermentant, staphylocoques et entérocoques) que
l’on trouve dans les pathologies humaines.
- Incubation : 18-24heures.(5)
II.2. Gélose Mueller Hinton + 5 % de sang de cheval, + 20 mg/l β-NAD*

(MHF) :
La gélose Mueller Hinton + 5 % de sang de cheval + 20 mg/l β-NAD (MHF)
favorise la croissance des bactéries fastidieuses (pneumocoques, autres types de
streptocoques, Haemophilus…..etc) que l’on trouve dans les pathologies humaines. (5)
II.3. Gélose Mueller Hinton 2 + 5 % de sang de mouton (MHS) :
La gélose Mueller Hinton 2 + 5% de sang de mouton (MHS) est un milieu destiné à

tester la sensibilité des pneumocoques et autres types de streptocoques aux antibiotiques et
aux sulfamides. Elle est préconisée pour des souches qui ont besoin de sang pour leur
croissance.(5)
79
l’antibiogramme
II.4. Autres milieux disponibles pour antibiogrammes :
 Gélose Brucella au sang.

 Mueller Hinton avec Cloxacilline.
 Gélose Mueller-Hinton hypersalée.

Gélose cœur-cervelle.(5)
Figure 01 : Exemple d'un antibiogramme (méthode de diffusion ou des disques) d'une

souche d’Escherichia coli productrice d'une pénicillinase.
III. L’antibiogramme standard en milieu gélosé : méthode des disques
III.1. Principe général :

Pour réaliser l’antibiogramme par la méthode des disques, la culture bactérienne est
ensemencée à la surface d’une gélose spécialement étudiée, la gélose de Mueller-Hinton,
éventuellement additionnée de sang. Des disques pré-imprégnés d’une dose connue
d’antibiotique sont déposés à la surface de la gélose. L’antibiotique diffuse à partir du
disque en créant un gradient de concentration. La détermination du diamètre de la zone
d’inhibition permet une estimation de la concentration minimale inhibitrice. Les caractères
de sensibilité ou de résistance de la souche bactérienne en seront déduits.
III.2. Technique :
En pratique, on réalise à partir de l’isolement (souche pure) un ensemencement en tapis

sur le milieu. On dispose ensuite les disques d’antibiotiques et on place à l’incubateur. Au
bout de 24h, on lit les différents diamètres d’inhibition et on peut conclure en comparant
ceux-ci aux abaques de lecture.
80
l’antibiogramme
Figure 02 : Exemple d’antibiogramme, pour une souche bactérienne ensemencée sur

gélose Mueller Hinton.
III.2.1. Les techniques d’antibiogramme :
A. Méthodes de dilutions :
a. En milieu solide :
Les solutions d’antibiotiques sont introduites dans un milieu gélosé maintenu à 45°C
puis coulé en boites de pétri, après refroidissement, la souche bactérienne est inoculée
sur la surface en une ou plusieurs stries parallèles. La CMI correspond à la plus petite
quantité d’antibiotique capable d’inhiber totalement le développement de la culture.
C’est une méthode sensible de réalisation délicate.(6)
III.2.2. Méthodes de diffusion en milieu gélosé ou méthodes de disque :

A. Matériel et réactifs :
- Milieu de culture en fonction de germes.

- Milieu de Muller Hinton pour les Entérobactéries, Pseudomonas et Staphylocoques.
- Milieu de Muller Hinton additionné 5% de sang de mouton pour les Streptocoques.
- Gélose chocolat + isovitalex pour l’Haemophilus et Neisseria.
- Disques en papier imprégnés d’antibiotique
-Etalons de turbidité ou échelle de Mac Ferland.
- Ecouvillons stériles ou pipettes.(6)
B. Milieu pour antibiogramme :

- Il doit être coule en boites de Pétri sur une épaisseur de 4mm.
- Les géloses doivent être séchées avant l’emploi.(6)
C. Préparation de l’inoculum :
- A partir d’une culture pure de 18 à 24h sur milieu d’isolement approprie, racler a l’aide
d’une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. Dans le cas
81
l’antibiogramme
de Streptococcus spp. Et d’Haemophilus spp. Utiliser un écouvillon pour prélever plus
facilement les colonies bactériennes.
- Bien décharger l’anse ou l’écouvillon dans 5 a 10ml physiologie stérile à 0,9%. Dans le
cas de Neisseria gonorrhée, décharger l’anse dans 1 a 2ml de tampon phosphate stérile a
pH 7,2.
- Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalence a 0,5 MF
ou a une D.O de 0,08 à 0,10 lue a 625nm. L’utilisation d’un densitomètre est fortement
souhaitable.(6)
D. Ensemencement :
- Tremper un écouvillon stérile dans l’inoculum.
- L’essorer en le pressant fermement (et en le tournant) contre la paroi interne du tube, afin
de décharger au maximum.
- Frotter l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosées, sèche, de haut en bas, en strie
serrées.
- Répéter l’opération 2 fois, en tournant la boite de 60° a chaque fois, sans oublier de faire
pivoter l’écouvillon sur lui-même. Finir l’ensemencement en passant l’écouvillon sur la
périphérie de la gélose.
- Dans le cas ou l’on ensemence plusieurs boites de Pétri, il faut recharger l’écouvillon a
chaque fois.(6)
E. L’application des disques d’antibiotiques :

- Il est préférable de ne pas mettre plus de 6 disques d’antibiotique sur une boite de 90mm.
- Pour les bactéries exigeantes (Streptococcus spp, Neisseria meningitidis, Haemophilus

spp,….), ne pas mettre plus de 4 disques par boite de 90mm.
- Presser chaque disque d’antibiotique à l’aide de pinces bactériologiques stériles et ne pas

déplacer les disques après application.(6)
Figure03 : l’application des disques d’antibiotiques.
82
l’antibiogramme
F. Incubation :
Elle se fait dans l’étuve pendant 18 à 24heures à 35°C. Durant la période d’incubation,
l’antibiotique diffuse dans la gélose à partir des disques, selon un gradient de concentration
jusqu’à une limite de distance ou sa concentration est la plus faible. Après incubation on
constate dans la boite de Pétri un développement bactérienne normal dans la gélose sauf
autour des disques d’antibiotiques qui ont une action inhibitrice.
Autour de ces disques, on observé une zone d’inhibition exempte de développement

microbien, avec un diamètre proportionnel à la concentration et à l’efficacité de
l’antibiotique.(6)
G. Condition d’incubation :
Respecter la température, l’atmosphère et la durée d’incubation recommandées pour
chaque bactérie. (6)
Microorganismes Milieu Inoculum Conditions d’incubation

-Entérobactéries
Pseudomonas
aeruginosa 18heures (à prolonger
Acinetobacter Gélose 0,5 MF en eau pour OXA et VAN/TEC)
spp. Staphylococcus Mueller-Hinton physiologique 35°C
spp. Entérococcus spp. Atmosphère ordinaire
Vibrio cholerea
Vibrio spp. Autres
bactéries non exigeantes.
Gélose
Streptococcus spp. Mueller-Hinton 0,5 MF en eau 20-24 heures 35°C
+ 5% sang de physiologique 5%CO₂
mouton
Neisseria gonorrhoeae Gélose GC + 1% 0,5 MF en tampon 20-24heures 35°C
supplément* phosphatent pH 7,2 5%CO₂
Gélose 0,5 MF en tampon 18-24 heures 35°C

Neisseria meningitidis Mueller-Hinton + PBS ou eau 5%CO₂ Atmosphère
5% sang de mouton physiologique humidifiée
Gélose 0,5 MF en eau 16-18heures 35°C

Haemophilus spp. Haemophilus Test physiologique 5%CO₂
Medium*
Tableau 01 : Technique d’antibiogramme (diffusion de disques antibiotiques).
83
l’antibiogramme
H. Lecture :
- Mesurer avec précision les diamètres des zones d’inhibition à l’aide d’un pied à coulisse.
- Pour les bactéries testées sur Mueller-Hinton simple, les mesures seront prises en
procédant par transparence à travers le fond de la boite de Pétri fermée.
- Pour les bactéries testées sur Mueller-Hinton au sang, les mesures de diamètres de zones
d’inhibition seront prises, boite de Pétri ouverte et bien éclairée.
- Comparer les résultats obtenus, aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture
correspondantes.
- Classer la bactérie dans l’une des catégories Résistant (R), Sensible (S), ou Intermédiaire
(I). (6)
Figure04 : exemple d’antibiogramme après l’incubation.
I. Détermination de la CMI :
Dans le cas de certaines souches, la technique de l’antibiogramme n’est pas validée pour
certaines molécules antibiotiques. Pour ces molécules, la sensibilité de ces germes est
appréciée uniquement par la détermination de la CMI, soit par la technique de référence,
soit par une autre technique. La technique de diffusion des disques n’est pas validée pour
ces germes. La technique recommandée est la détermination de la CMI par dilution en
milieu Mueller-Hinton liquide ajusté en cations. Ce milieu est supplémenté de 2.5 à 5% v/v
de sang de cheval lysé et parfois de facteurs de croissance selon les espèces bactériennes
testées.(6)
84
l’antibiogramme
III.2.3. Technique de dilution en gélose :

A. Milieu de culture :
- Milieu Mueller-Hinton en gélose.
- Il est liquéfié par ébullition puis maintenu à la température de surfusion (45°C) jusqu’au
moment de l’emploi.
- Il peut être supplémenté en sang frais ou autres en fonction des micro-organismes

testés.(6)
B. Préparation des boites de dilutions d’antibiotique

C. Préparation de l’inoculum bactérien :
- L’utilisation de l’eau physiologique à 0.9% pour la préparation de la suspension directe à
partir d’une culture jeune de la bactérie à tester.
- Déposer sous forme de spots à la surface de la gélose, 10⁴CFU/ml par spots de 5 à 8

mm.(6)
D. Dépôt des spots bactériens :

- Déposer les spots dans les 15 min suivant la préparation de l’inoculum.
- Marquer la boite de dilution d’antibiotique pour localiser et identifier chaque spot.
- Appliquer chaque spot sur la gélose.
- Commencer par la boite témoin, puis déposer les spots sur les différentes boites en allant
de la plus faible concentration à la concentration la plus élevée. Terminer en appliquant les
spots sur une 2éme boite témoin.
- Etaler une goutte de chaque souche testée, sur une gélose non sélective et incuber une
nuit (détection des cultures mixtes, obtention d’une culture jeune).(6)
E. incubation :
- Laisser les boites à température ambiante. Couvercle vers le haut, jusqu’à absorption de
l’humidité (séchage des spots, pas plus de 30mn).
- Retourner les boites et incuber à 35°C± 2 pendant 16-20 heures.
- Ne pas incuber en atmosphère à forte concentration de CO₂ si cela n’est pas recommandé
(le CO₂ perturbe le pH du milieu).
- Incuber Neisseria meningitidis et Streptococcus spp, dans une atmosphère contenant 5%
de CO₂.(6)
85
l’antibiogramme
F. Lecture des CMI :

- Placer les boites sur une surface sombre, non réflective.
-Noter la CMI (la plus faible concentration d’antibiotique inhibant toute croissance
bactérienne visible).
-Ne pas prendre en considération 2 colonies ou un léger film.
-Si on note plus de 2 colonies persistantes ou si l’on constate une réapparition de la culture
au-delà de la CMI, vérifier la pureté de l’inoculum et refaire le test.
-Comparer les résultats obtenus, aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture
correspondantes.
-Classer la bactérie dans l’une des catégories S, R ou I.(6)
Figure05 : H. influenzae Incubation 24h
Figure06 : S. pneumoniae Incubation 24h
Figure07: S. pneumoniae Incubation 48h
86
Partie pratique
Chapitre I :
Méthodologie de travail
Partie pratique chapitre I :
Méthodologie de travail
I. Méthodologie de travail :
Il s agit d’une étude descriptive, transversale, prospective réalisée au niveau de deux
laboratoires de bactériologie de Sétif durant une période allant de 13 /01/2019 à
14/05/2019. Elle a touchée les employés des services sus-cités par l’emploi d’un
questionnaire (ANNEXE).
II. L’Objectif de recherche :

Mon étude vise essentiellement la vérification des hypothèses que j’ai proposées afin de
connaitre les raisons pour lesquelles les différentes techniques de diagnostic en
bactériologie ne sont pas rigoureusement respectées ; inclure l’ensemencement et
l’incubation.
III. Lieu de l’enquête :

Mon enquête a été réalisée aux niveaux de deux laboratoires bactériologie de la Wilaya
Sétif :
- Laboratoire de CHU Sétif.

- Laboratoire d’hygiène de Sétif.
IV. La durée de l’enquête :

La durée de réalisation de mon étude est :
- Laboratoire de CHU Sétif : 13/01/2019 à 07/02/2019.
- Laboratoire d’hygiène de Sétif : 17/02/2019 à 14/03/2019.
V. La population cible et échantillonnage :

La population ciblée par mon étude est le laborantin et les licenciés en biologie des deux
laboratoires.
VI. Les outils de l’enquête :

Le questionnaire est l’outil de base de mon enquête, et qui consiste à poser des questions à
la population cible afin de connaitre leurs jugements, leurs point de vue et qui a pour but de
vérifier mes hypothèses.
Ce questionnaire est formé de 21 questions : Des questions destinées aux laborantins et

biologistes.
La grille d’observation est le deuxième outil utilisée et qui a ciblé l’ensemble des données
observables dont une observation direct quand au respect des conduites et des
comportements de notre population.
87
Chapitre II :
Présentation, Analyse et
interprétation des résultats
Partie pratique chapitre II : Présentation,
analyse et interprétation des résultats
I. Présentation, Analyse et interprétation des résultats
I.I. Présentation du laboratoire de bactériologie du CHU de Sétif

Le laboratoire de bactériologique du CHU de Sétif s’occupe des analyses médicales. Il se
compose de deux unités fonctionnelles qui sont :
- L’unité de réception.
- L’unité de bactériologie.
I.I.1. Présentation de l’unité de bactériologie :

L’unité de bactériologie se charge des analyses des patients hospitalisés et non
hospitalisés. Cette unité comprend 06 paillasses qui sont :
- La paillasse de l’hémoculture.
- La paillasse des liquides de ponction (LCR, liquide pleural et autres).
- La paillasse de l’étude cytobactériologique des urines (l’unité de l’ECBU).
- La paillasse de Divers (Pus, crachats et autres).
- La paillasse des infections sexuellement transmissibles IST (spermoculture et
prélèvement vaginal).
- l’unité des mycobactéries.
* les techniciens du laboratoire sont au nombre de 10.
* Avec un professeur en microbiologie.
I.II. Présentation générale du laboratoire d’hygiène :

Le laboratoire d’hygiène s’occupe des analyses médicales, les analyses des eaux et des
aliments. Il se compose de plusieurs unités fonctionnelles qui sont :
- L’unité de réception.
- L’unité de bactériologie.
- L’unité des analyses des aliments.
- L’unité des analyses des eaux.
I. Présentation de l’unité de bactériologie :

L’unité de bactériologie se charge des analyses des patients non hospitalisés. Cette unité
comprend 02 paillasses qui sont :
-La paillasse de l’étude cytobactériologique des urines (l’unité de l’ECBU).

- La paillasse de la copro-parasitologie des selles.
* les techniciens du laboratoire sont au nombre de 6.

* Il n’y a aucun médecin spécialiste en microbiologie au niveau du laboratoire d’hygiène.
88
Présentation, analyse et interprétation des résultats

L’analyse des résultats a été faite après l'exploitation des outils de recherche un par un.
II. Questionnaires destinés au personnel du laboratoire du CHU de Sétif

J’ai distribué des questionnaires (10 au total) au personnel de l’unité de bactériologique
que j’ai tous récupérés par la suite. Le dépouillement des résultats obtenus a donné lieu à
ceci :
Question N°01 : Quelle est la qualité de votre grade et l’expérience ?
Spécialité du personnel travaillant Fréquence Pourcentage

L.S.P (Laborantin de santé publique) 04 40%
Licenciés en biologie 06 60%
Total 10 100%
Tableau n°01 : Spécialité du personnel travaillant.
a. Analyse et interprétation des résultats :
La plupart des participants sont diplômés de l’université (60%), seulement 40% sont des
L.S.P. Par conséquent, je peux dire que ce personnel a plus de connaissances théoriques
que pratiques.
b. Représentation graphique :
Graphe N°01: Spécialité du personnel travaillant
40%
L,S,P
60%
D,E,S en biologie
* Les années d’expérience :
Expérience Fréquence Pourcentage

< 5ans 03 30%
Entre 5 et 10ans 05 50%
> 10ans 02 20%
Total 10 100%
Tableau n°02 : Les années d’expérience.
89
a. Analyses et interprétation des résultats :
A partir des réponses recueillies, je remarque que 30% de mes participants ont une
expérience professionnelle de moins de (5ans), 50% entre (5 et 10ans) et 20% plus de
(10ans) d’ancienneté de travail. Donc tout le personnel du service de bactériologie a de
l’expérience.
Graphe N°02: Les années d'expérience.

20%
30% moins de 5ans
Entre 5 et 10ans
50%
plus de 10ans
Question N°02 :
Est-ce que vous êtes suffisamment informés sur « l’ensemencement et l’incubation » ?
Réponses Oui Non Total

Les techniciens 09 01 10
Pourcentage 90% 10% 100%
Tableau n°03 : Informations concernant l’ensemencement et l’incubation.
Les résultats montrent que 90% des techniciens disent qu’ils ont des informations sur
« l’ensemencement et l’incubation ». Ils ont donc les connaissances nécessaires pour
interpréter et identifier le germe responsable d’une infection bactérienne.
Graphe N°03: Informations concernant

l'encemencement et l"incubation
10%
oui
90% Non
90
Question N°03 : Quel est l’intérêt de la culture ?
Réponses Mauvaises réponses Réponses moyennes Réponses correctes Total

Fréquence 01 07 02 10
100%
Tableau N°04 : L’intérêt de la culture.
Ces réponses prouvent que la majorité des techniciens (70%) ne connaissent pas
exactement l’intérêt de la culture, en effet seulement 20% ont répondu correctement à la
question, alors que 10% n’ont pas donné de réponse. Pour répondre à la question, l'intérêt
exacte consiste à identifier et caractériser le germe responsable de l'infection bactérienne,
pour étudier la sensibilité à l'antibiotique et parfois l'utilisation de la biologie moléculaire.
Graphe N°04: L'intérêt de la culture

10% 20%
réponse correcte
réponse moyenne
70%
mauvaise réponse
Question N°04 : Quels sont les différents types de milieux utilisés pour la culture
bactérienne ?
Réponses Réponses justes Réponses insuffisantes Total

Fréquence 10 0 10
Tableau n°05 : Les différents types de milieux de culture.
Ces réponses prouvent que tout le personnel (100%) connait les différents types de
milieux utilisés pour la culture bactérienne. Aussi bien les milieux d’enrichissement que
les milieux utilisés pour l’isolement bactérien.
91
Graphe N°05: Les types de milieux de culture

0%
réponse insuffisante
100% réponse juste
Question N°05 : Est-ce-que vous contrôlez la qualité des milieux de culture ? Si non
pourquoi ? Si oui comment ?
Réponses Fréquence Pourcentage

Oui 04 40%
Non 06 60%
Total 10 100%
Tableau n°06 : Le contrôle de qualité des milieux de culture.
La majorité des techniciens (60%) disent qu’ils ne contrôlent pas la qualité des milieux
de culture. Seulement 40% d’entre eux la contrôlent. Le non contrôle de la qualité des
milieux peut entrainer le risque de contamination ou avoir un effet sur la fiabilité des
résultats.
Graphe N°06: la qualité des milieux de culture
40% Non
Oui
60%
* Si Non, pourquoi :

Le raison du non-contrôle 0 0%
Aucune réponse 06 100%
Total 06 100%
Tableau n°07 : La raison du non-contrôle de la qualité.
92
D’après les résultats obtenus, de toutes les personnes (100%) qui ne contrôlent pas la
qualité des milieux de culture, personne ne donne de réponse quant à ce manque de
contrôle. Alors que ce contrôle permet d’assurer que le milieu est adéquat pour la culture
des bactéries provenant d’un prélèvement.
b. Présentation graphique :
Graphe N°07: La raison du non-contrôle de la qualité

0%
Bonne réponse
0% Mauvaise réponse
Aucune réponse
100%
* Si Oui, comment ?

La méthode de contrôle de qualité des milieux de culture 00 0%
Total 04 100%
Tableau n°07 : La méthode de contrôle des milieux de culture.
D’après les résultats obtenus, personne n’a donné de réponse sur la méthode de contrôle
de la qualité des milieux de culture dont les étapes sont :
-La souche témoin est inoculée dans un bouillon non sélectif et est cultivée pendant 24
heures.
-Préparation d'un inoculum standard pour tester des milieux sélectifs
-Un tube ou une gélose de chaque milieu doit être inoculé avec l’inoculum standardisé de
la souche témoin.
-Les boîtes de Pétri seront ensemencées, par une anse calibrée, puis mises en culture par
stries. La même anse peut être utilisée pour tous les contrôles de la qualité ; à défaut
d’utiliser une anse calibrée, il est important de toujours utiliser la même anse pour les
ensemencements.
93
Graphe N°07: La méthode de contrôle des milieux de

culture
0%
la méthode du contrôle de qualité
des milieux de culture.
100%
Aucune réponse
Question N°06 : Quels sont les méthodes d’ensemencement dans un milieu gélosé solide ?
Réponses Réponses Réponses Aucune Total

correctes moyennes réponse
Fréquence 01 08 01 10
Pourcentage 10% 80% 10% 100%
Tableau n°08 : Les différentes techniques d’ensemencement.
Ces réponses prouvent que la majorité des techniciens (80%) ne connaissent pas toutes
les méthodes d’ensemencement. Ils ne connaissent que deux méthodes : soit
l’ensemencement en quadrants ou l’ensemencement par des stries. Alors qu'il existe
d’autres méthodes par exemple: l'ensemencement par piqure, par touche, en spirale.....
Graphe N°08: Les méthodes d'ensemencement
10% 10%
réponse correcte
réponse moyenne
aucune réponse
80%
Question N°07 : Est-ce qu’on ensemence, dans chaque boite de Pétri, un seul échantillon?

Oui 10 100%
Non 0 0%
Total 10 100%
Tableau n°09 : Le nombre d’échantillons dans une boite de pétri.
94
Ces réponses prouvent que tout le monde (100%) utilise un seul échantillon dans une
boite de Pétri. Donc, la fiabilité des résultats obtenus est assurée.
Le Question N°08 « Quelle est la méthode que vous utilisez pour diviser chaque milieu
de culture en cas d’ensemencement de plusieurs prélèvements sur la même boite ? » n’a
pas lieu au niveau du laboratoire de bactériologie CHU de Sétif. Car tous les techniciens
utilisent un seul échantillon dans une boite de pétri.
Graphe N°09: Le nombre d'échantillons ensemencés dans

une boite de pétri
0% Oui
Non
100%
Question N°09 : Est-ce que vous vérifiez la profondeur de la gélose ? La quantité d’agar ?

Oui 04 40%
Non 06 60%
Total 10 100%
Tableau n°10 : La vérification de la profondeur de la gélose et la quantité d’agar.
La majorité des techniciens (60%) ont dit non, ils ne vérifient ni la profondeur de la
gélose ni la quantité d’agar. En revanche, 40% ont répondu oui. Ou moment qu’il faut
vérifier l’épaisseur avant chaque ensemencement donc il joue un rôle très important. Car
pour les différents milieux de culture avec une épaisseur faible, il ya un risque de
déshydratation si l’incubation est prolongée, ou un risque de d’épuisement des milieux.
95
Graphe N°10: La vérification de la profondeur de la gélose et la

quantité d'agar.
40%
60% Oui Non
Question N°10 : Quelle technique d’ensemencement utilisez-vous pour réaliser un

antibiogramme ?
I. Par Ecouvillonnage Par Inondation

Ecouvillonnage 09 90%
Inondation 01 10%
Total 10 100%
Tableau n° 11 : Technique d'ensemencement de l'antibiogramme.
i. Analyse et interprétation des résultats :
La majorité des techniciens (90%) utilisent l’écouvillonnage pour réaliser un

antibiogramme. Seulement 10% ensemencent l'antibiogramme par inondation. La
technique par inondation est abandonnée suite à la standardisation de la technique de
l’antibiogramme. Car elle cause un dysfonctionnement des résultats.
ii. Représentation graphique :
Graphe N°11: La technique d'ensemencement d'un

antibiogramme.
10% Ecouvillonnage
Inondation
90%
96
II. Avez-vous recensé un dysfonctionnement lors de l’ensemencement par

inondation ?

Oui 0 0%
Non 01 100%
Total 01 100%
Tableau n°12 : L'identification d'un dysfonctionnement.
i. Analyse et interprétation des résultats :
A partir de la dernière question (N°10/I) 10% des techniciens disent qu’ils ensemencent
par inondation pour réaliser un antibiogramme direct pour gagner du temps en cas d’avoir
à l’état frais nombreux (+++) de bactérie. Ils affirment n’avoir pas identifié un
dysfonctionnement. Alors que ce type d’ensemencement des fois permet le déplacement
des disques.
ii. Représentation graphique :
Graphe N°12: L'identification d'un dysfonctionnement.
0%
Oui
100% Non
Question N°11 : A quelle température faut-il incuber la gélose pour l’antibiogramme ?

A 37°C 10 100%
Autre réponse 00 0%
Total 10 100%
Tableau n°13 : La température d’incubation de la gélose pour l’antibiogramme.
Tous les techniciens (100%) disent que la gélose de l’antibiogramme est incubée à 37°C.
Or, il faut l’incuber à 35°C en respectant le temps nécessaire pour chaque variété
bactérienne, par exemple :
- Streptococcus spp: 20-24 heures, 35°C, 5%CO₂.

- Haemophilus spp: 16-18heures, 35°C, 5%CO₂.
97
Graphe N°13: La température d'incubation pour l'antibiogramme.
0%
à 37°C
100% Autre réponse
Question N°12 : Quel est le nombre de disques d’antibiotique par boite de 90mm ?

Inférieur à 06 disques 03 30%
06 disques 04 40%
Supérieur à 06 disques 03 30%
Total 10 100%
Tableau n°14 : Le nombre de disques d’antibiotique par boite de 90mm.
À travers ces réponses 40% des techniciens disent que le nombre maximum de disques
d’antibiotique pour une boite de 90mm est de 06. Alors que 30% disent que le nombre est
supérieur à 06 disques et pour finir 30% disent que le nombre est inférieur à 06 disques.
Or, il est préférable de ne pas mettre plus de 06 disques d’antibiotique dans une boite de
90mm, et pour les bactéries exigeantes ne pas mettre plus de 04 disques pour mesurer le
diamètre de la zone d’inhibition.
Graphe N°14: Le nombre de disques d'antibiotique par boite

de 90mm.
30% 30% Supérieur à 06 disques

06 disques
40% Inférieure à 06 disques
Question N°13 : Est-ce que vous contrôlez systématiquement l’étuve ?

Oui 05 50%
Non 05 50%
Total 10 100%
Tableau n°15 : Le contrôle de l’étuve.
98
Ces réponses prouvent que 50% seulement, contrôlent systématiquement l’étuve, et 50%
ne la contrôlent pas. Par contre ce contrôle est très important car il y a une influence de la
qualité de l’étuve sur les résultats obtenus.
Graphe N°15: Contrôle de l'étuve.
Oui
50% 50%
Non
* Si Oui, le contrôle se fait :

Chaque semaine 03 60%
Tous les 15 jours 02 40%
Chaque mois 00 0%
Total 05 100%
Tableau n°16 : La durée de contrôle de l’étuve.
À partir de la dernière question, on remarque que des 50% qui font le contrôle de l’étuve,
60% le font chaque semaine par contre 40% le font tous les 15 jours. Il faut faire le
contrôle de l'étuve chaque semaine pour éviter le risque de contamination et assurer les
résultats obtenus.
Graphe N°16: La durée de contrôle de l'étuve.
40% Chaque Semaine

60% tous les 15jour
99
Question N°14 : Quelles sont les conditions d’incubation des milieux de culture ?

Bonnes réponses 00 00%
Mauvaises réponses 10 100%
Total 10 100%
Tableau n°17 : Les conditions d’incubation des milieux de culture.
D’après les résultats obtenus, je remarque que la totalité des laborantins ne connaissent
pas toutes les conditions d'incubations des milieux de culture. Parce qu'ils ne mentionnent
que la température alors qu'il y a l'oxygène, le Co2, la pression, le temps d'incubation, la
pression osmotique, le ph .....etc.
Graphe N°17: Les conditions d'incubation.

0%
Bonne réponse
Mauvaise réponse
100%
Question N°15 : En cas d’une hémoculture vous incubez les boites de Pétri après le
repiquage des flacons dans :
Réponse Fréquence Pourcentage

L’étuve 02 20%
La jarre 08 80%
Total 10 100%
Tableau n°18 : L’incubation des flacons d’hémoculture après le repiquage.
D’après les réponses obtenues, la majorité des laborantins (80%) incubent les flacons
d’hémoculture dans la jarre après le repiquage, pour les 20% restants, ils l’incubent dans
l’étuve. L’incubation dans la jarre est plus fiable que l’étuve, car il permet la croissance
des bactéries exigeantes et anaérobies.
100
Graphe N°18: l'incubation des flacons d'hémoculture après le

repiquage.
20%
L'étuve
80% La jarre
* Quelle est le rôle de la jarre ?

Total 10 100%
Tableau n°19 : Le rôle de la jarre.
Suite aux réponses recueillies, seulement 50% connaissent le rôle de la jarre qui est
d’offrir les conditions requises aux bactéries exigeantes et anaérobies. 50% des techniciens
ne connaissent pas ce rôle.
Graphe N°19: Le rôle de la jarre.
Bonne réponse
50%
Aucune réponse
0%
Question N°16 : En cas d’une culture négative, est-ce que vous faites une réincubation ? Si
oui comment ? Si non pourquoi ?

Oui 10 100%
Non 00 00%
Total 10 100%
Tableau n°20 : La ré-incubation en cas d’une culture négative.
101
D’après les résultats obtenus, tous les techniciens (100%) font la ré-incubation en cas
d’une culture négative. Car il y a des bactéries qui poussent lentement donc il faut ré-
incuber les milieux de culture pendant 24h encore.
Graphe N°20: La ré-incubation en cas d'une culture

négative.
0%
Oui
Non
100%
* Si Oui, à quelle durée ?

Pendant 24h 04 40%
Pendant 48h 06 60%
Total 10 100%
Tableau n°21 : La durée de ré-incubation en cas d’une culture négative.
En fonction des résultats recueillis, 60% des laborantins ré-incubent les milieux en cas
d’une culture négative pendant 48h et 40% les ré-incubent seulement pendant 24h.
Alors que généralement, dans le cas d’une culture négative les milieux doivent être ré-
incuber pendant 24h encore.
Graphe N°21:La durée de réincubation.
40%
Pendant 24h
60% Pendant 48h
102
Question N°17 : Qu’est ce qu’un contrôle de qualité interne en bactériologie ?

Total 10 100%
Tableau n°22 : Le contrôle de qualité interne en bactériologie.
D’après les résultats obtenus, j’en conclus que la majorité des techniciens (70%) ne
savent pas ce qui est un contrôle de qualité interne en bactériologie. Et seulement 10% ont
donné une réponse acceptable. Pour répondre à cette question, ce contrôle est une
procédure où une série de procédures visant à s'assurer que les milieux de culture et les
réactifs, les colorants, satisfont un ensemble défini de critères de qualité.
Graphe N°22: Contrôle de qualité interne en bactériologie.
10%
20% Bonne réponse

Aucune réponse
* Est-ce-que vous faites le contrôle de qualité ?

Oui 03 30%
Non 06 60%
Total 10 100%
Tableau n°23 : La réalisation d’un contrôle de qualité.
D’après les résultats obtenus, la majorité des laborantins (60%) ne font pas le contrôle de
qualité, 30% seulement le font. Alors que ce contrôle est très important pour assurer la
crédibilité du matériel nécessaire et des réactifs utilisés.
103
Graphe N°23: La réalisation d'un contrôle de qualité.

10%
30%
Oui
Non
60%
Aucune réponse
* Si Non, pourquoi ?
Réponses fréquence Pourcentage
Total 06 100%
Tableau n°24 : Le non réalisation du contrôle de qualité.
D’après l’avant dernière question, 60% des techniciens ne font pas le contrôle de qualité,
et à la question de savoir pourquoi ils ne font pas ce contrôle, personne ne répond. Or, ne
pas faire le contrôle de qualité peut entraîner des résultats erronés.
Graphe N°24: La raison de la non réalisation du contrôle de

qualité.
0%
Bonne réponse
0%
Mauvaise réponse
100% Aucune réponse
Question N°18 : Quel est l’objectif d’un contrôle de qualité ?

Total 10 100%
Tableau n°25 : L’objectif d’un contrôle de qualité.
104
Ces réponses prouvent que 60% du personnel n’a aucune idée sur l’objectif d’un contrôle
de qualité en bactériologie. 30% seulement m’ont donné des réponses justes et 10% m’ont
donné des réponses fausses. Il s’avère qu’elle est utilisée pour obtenir de bons résultats.
Graphe N°25: L'objectif d'un contrôle de qualité.

17%
5%
Bonne réponse
Mauvaise réponse
78%
Aucune réponse
Question N°19 : Est-ce que vous faite la rotation entre les paillasses ? Est-ce que vous
jugez que c’est bénéfique ?

Oui 10 100%
Non 00 00%
Total 10 100%
Tableau n°26 : La rotation entre les paillasses.
D’après les résultats obtenus, tout le personnel (100%) fait la rotation entre les paillasses.
Et tous jugent que cette rotation est bénéfique. Donc je pense qu’elle est importante dans le
travail afin de maitriser la manipulation des différents prélèvements, et ne pas oublier les
acquis scientifiques et pratiques.
Graphe N°26: La rotation entre les paillasses.
0%
Oui
Non
100%
105
Question N°20 : Est-ce qu’il vous arrive de faire des formations ou stages en
bactériologie ?

Oui 04 40%
Non 06 60%
Total 10 100%
Tableau n°27 : L'obtention de formations ou stages en bactériologie.
D’après les résultats recueillis, je remarque que 40% seulement du personnel ont obtenu
des formations ou stages en bactériologie ce qui n’est pas le cas des 60% qui restent. J’ai
appris aussi que quelques personnes n'ont pas bénéficié de stages ou formations en
bactériologie durant leurs études. Il faut donc sensibiliser sur l'importance d’octroyer des
stages ou des formations aux techniciens avant leur emploi, et une formation
complémentaire après leur emploi si nécessaire.
Graphe N°27: L'obtention de formations ou stages en

bactériologie.
40% Oui
60% Non
106
Question N°21 : Selon quel pourcentage classez-vous la fiabilité de votre travail ?

100% 03 30%
75% 07 70%
50% 00 00%
25% 00 00%
Total 10 100%
Tableau n°28 : La fiabilité du travail.
D’après les résultats obtenus, 70% du personnel classent leur fiabilité de travail à 75%
et 30% la classent à 100%. Ceci m’autorise à dire que les techniciens pratiquent leur
travail convenablement.
Graphe N°28: La fiabilité du travail.
30% Pourcentage à 100%

Pourcentage à 75%
70%
107
La grille d’observation au niveau de laboratoire bactériologie CHU Sétif
Grille d’observation des conditions de manipulation et conservation

des milieux de culture et les conditions d’incubation dans les Oui Non Parfois
laboratoires de bactériologie
 La désinfection de la paillasse avant et après chaque utilisation
avec un désinfectant. *
 Contrôle de la température du réfrigérateur.
*
 Vérification de la date d’expiration des milieux de culture
*
 La conservation des milieux à l’abri de la lumière, de l’humidité
et de la chaleur. *
 Respect du protocole de la zone aseptique (20 cm autour du
bec). *
 Séchage des boites de pétri avant leur mise en culture.

*
 Vérification de la profondeur de la gélose / quantité d’agar.
*
 L’utilisation de différentes méthodes d’ensemencement et
d’isolement. *
 Respect des techniques d’ensemencement.

*
 Respect de la position couvercle vers le bas après
ensemencement. *
 Vérification de : L’atmosphère, la température et l’humidité de

l’étuve. *
 Mise des milieux de culture dans l’étuve en position couvercle
vers le bas. *
 En cas d’une culture négative réincubation des milieux pendant
24h à 37°C. *
 Respect de la durée d’incubation pour chaque variété
bactérienne. *
 Contrôle de la qualité des milieux de culture.
*
 Contrôle du fonctionnement de l’étuve.
*
108
III. La grille d’observation :

D’après les informations recueillies par l’observation, il est apparu les situations
observables suivantes :
Objectif de l’observation N°01 :
Désinfecter la paillasse avant et après chaque utilisation avec un désinfectant.

Personnes effectuant la désinfection des paillasses
(avant et après le travail) 02 20%
Personnes effectuant la désinfection des paillasses après le
travail. 08 80%
Total 10 100%
Tableau n°01 : Répartition des résultats de l’objectif de l’observation N°01.
a. Analyse :
D’après les résultats recueillis, je constate que 80% des techniciens, nettoient les
paillasses seulement après le travail, en revanche 20 % désinfectent les paillasses avant et
après le travail.
Graphe N°01: La désinfection des paillasses
personnes effectuant la
20%
désinfection des paillasses
(avant et après le travail)
80% personnes effectuant la

désinfection des paillasses
après le travail.
Objectif de l’observation N°02 : Contrôler la température du réfrigérateur.

Personnes qui contrôlent la température 01 10%
Personnes qui ne contrôlent pas la température 09 90%
Total 10 100%
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, 10% de personnes (ce qui est faible) contrôlent la
température du réfrigérateur et 90% ne la contrôlent pas.
109
Graphe N°02: la température du réfrigérateur.
10%
personnes qui controlent
latempérature
personnes qui ne controlent
90% pas la température
Objectif de l’observation N°03 : Vérifier la date d’expiration des milieux de culture.

Personnes qui vérifient la date d’expiration des 01 10%
milieux
Personnes qui ne vérifient pas la date d’expiration 09 90%
des milieux
Total 10 100%
Tableau n°03 : répartition des résultats de l’objectif de l’observation N°03.
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, seuls 10% du personnel vérifient la date d’expiration des
milieux de culture, ce qui n’est pas le cas des 90% qui restent.
Graphe N°03: La date d'expiration.

10%
personnes qui vérifie la date
d'expiration
90% personnes qui ne vérifie pas la date

d'expiration
Objectif de l’observation N°04 :
Conserver les milieux de culture à l’abri de la lumière, de l’humidité et de la chaleur.

la conservation des milieux à l’abri de la lumière, de 10 100%
l’humidité et de la chaleur
Le non respect de la conservation des milieux à l’abri de la 00 00%
lumière, de l’humidité et de la chaleur.
Total 10 100%
110
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, tout le personnel conserve les milieux de culture à l’abri de
la lumière, de l’humidité et de la chaleur. Donc toutes les conditions de conservation sont
respectées.
Graphe N°04: La conservation des milieux de culture.

0%
le respect des condition de

conservation des milieux
100%
le non respect des condition de
conservation des milieux
Objectif de l’observation N°05 : Respecter le protocole de la zone aseptique.

Position correcte 06 60%
Une position erronée 04 40%
Total 10 100%
a. Analyse :
D’après les résultats recueillis, je remarque que 60% du personnel respectent le protocole
de la zone aseptique (20cm autour du bec) par contre 40% ne le respectent pas.
Graphe N°05: Protocole de la zone aseptique.
40% position correcte

60% une position erronée
111
Objectif de l’observation N°06: Sécher les boites de Pétri avant leur mise en culture.

Personnes qui sèchent les boites de Pétri avant leur mise en 07 70%
culture
Personnes qui ne sèchent pas les boites de Pétri avant leur 03 30%
mise en culture
Total 10 100%
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, 70% des techniciens sèchent les boites de Pétri avant leur
mise en culture, par contre 30% des techniciens ne la sèchent pas.
Graphe N°06: Sèchage des boites de Pétri avant leur mise en culture.
personnes qui sécheent les
boites avant leur mise en
30% culture
personnes qui ne séchent pas
70%
les boites avant leur mise en
culture
Objectif de l’observation N°07: vérifier la profondeur de la gélose/ la quantité d’agar.

Personnes qui vérifient la profondeur de la gélose/ quantité 02 20%
d’agar
Personnes qui ne vérifient pas la profondeur de la gélose/ 08 80%
quantité d’agar
Total 10 100%
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, 80% des personnes ne vérifient ni la profondeur de la

gélose ni la quantité d’agar. 20% seulement vérifient les milieux.
112
Graphe N°07: La vérification de la profondeur de la gélose/ quantité

d'agar.
20%
personnes qui vérifient
personnes qui ne vérifient pas
80%
Objectif de l’observation N°08: Utiliser les différentes méthodes d’ensemencement et

d’isolement.

Personnes qui utilisent les différentes méthodes 10 100%
d’ensemencement
Personnes qui utilisent des méthodes spécifiques 00 00%
d’ensemencement
Total 10 100%
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, je remarque que tous les techniciens utilisent les différentes
méthodes d’ensemencement et d’isolement.
Graphe N°08: L'utilisation des différentes méthodes d'ensemencement et

d'isolement.
0%
personnes qui utilisent les
différentes méthodes
d'ensemencement et d'isolement
100% personnes qui utilisent des
méthodes spécifiques
d'ensemencement et d'isolement
Objectif de l’observation N°09: Respecter les techniques d’ensemencement.

Le respect des techniques d’ensemencement 10 100%
Le non respect des techniques d’ensemencement 00 00%
Total 10 100%
113
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, je remarque que tous les techniciens (100%) respectent les
techniques d’ensemencement.
Graphe N°09: Le respect des techniques d'ensemencement.
0%
le respect des techniques
d'ensemencement.
le non respect des techniques
100% d'ensemencement
Objectif de l’observation N°10: Respecter la position couvercle vers le bas après

l’ensemencement.

Le respect de la position couvercle vers le bas après
l’ensemencement 10 100%
Le non respect de la position couvercle vers le bas après
l’ensemencement 00 00%
Total 10 100%
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, tout le personnel (100%) respecte la position couvercle vers
le bas après l’ensemencement.
Graphe N°10: Le respect de la position couvercle vers le bas après

l'ensemencement
le respect de la position
24% couvercle vers le bas
le non respect de la position
76% couvercle vers lr bas
114
Objectif de l’observation N°11: Vérifier l’atmosphère, la température et l’humidité de

l’étuve.

Personnes qui vérifient l’atmosphère, la température et 01 10%
l’humidité
Personnes qui ne vérifient pas l’atmosphère, la température et 09 90%
l’humidité
Total 10 100%
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, 10% seulement des techniciens vérifient les paramètres de
l’étuve (atmosphère, température et humidité). Par contre, les 90% restants, ils ne font pas
la vérification.
Graphe N°11: La vérification des paramètres de l'étuve.

10% personnes qui vérifient
l'atmosphère, la température et
l'humidité
personnes qui ne vérifient pas
90% l'atmosphère,la température et
l'humidité
Objectif de l’observation N°12: Mettre des cultures dans l’étuve en position couvercle vers
le bas.

Personnes qui mettent les cultures, couvercle vers le bas 10 100%
dans l’étuve.
Personnes qui ne mettent pas les cultures, couvercle vers le 00 00%
bas dans l’étuve
Total 10 100%
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, je remarque que tout le personnel (100%) met les boites de
Pétri après l’ensemencement en position couvercle vers le bas dans l’étuve.
115
Graphe N°12: La position couvercle vers le bas dans l'étuve.

0%
personnes qui mettent les
cultures, couvercle vers le bas
dans l'étuve.
personnes qui ne mettent pas
100% les cultures, couvercle vers le
bas dans l'étuve
Objectif de l’observation N°13:
En cas d’une culture négative, ré-incubation des milieux pendant 24h à 37°C.

Personnes qui font la ré-incubation 10 100%
Personnes qui ne font pas la ré-incubation 00 00%
Total 10 100%
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, 100% du personnel font la ré-incubation en cas d’une
culture négative pendant 24h à 37°C.
Graphe N°13: La réincubation des milieux de culture.

0%
personnes qui font la
réincubation
100% personnes qui ne font pas la

réincubation
Objectif de l’observation N°14:
Respecter la durée d’incubation pour chaque variété bactérienne.

Personnes qui respectent la durée d’incubation pour toutes 10 100%
les variétés bactériennes.
Personnes qui ne respectent pas la durée d’incubation pour 00 00%
toutes les variétés bactériennes.
Total 10 100%
116
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus et ma propre observation tous les techniciens incubent les
cultures à 37°C pendant 24h, seule l’hémoculture est incubée pendant 48h.
Graphe N°14: La durée d'incubation

0%
personnes qui respectent la durée d'incubation
pour toutes les variété bactérienne
100% personnes qui ne respectent pas la durée

d'incubation pour toutes les variétés
bactériennes
Objectif de l’observation N°15: Contrôler la qualité des milieux de culture.

Personnes qui contrôlent la qualité des milieux de culture 01 10%
Personnes qui ne contrôlent pas la qualité des milieux de 09 90%
culture
Total 10 100%
a. Analyse :
D’après les résultats obtenus, je remarque que 10% seulement de l’ensemble du personnel
contrôlent la qualité des milieux de culture contrairement aux 90% restants.

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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE LA SANTE, DE LA POPULATION ET DE LA

INSTITUT NATIONAL DE FORMATION SUPERIEURE PARAMEDICALE

Mémoire professionnel de fin d’étude

Pour l’obtention de la licence professionnalisante

Option : Laborantine de Santé Publique

Directeurs de mémoire : Elaboré par :

Inspecteur Pédagogique Paramédical

 Dr. TACHI NAWAL

Promotion 2016 - 2019

Paix et salut sur le prophète.

Avant de commencer la présentation de ce travail, je profite l’occasion pour

Toutes mes salutations à Mesdames et Messieurs les membres de jury.

Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance et toutes mes pensées de

Je présenter ma chaleur remerciements à mes encadreurs Dr « N, Tachi »

Je remercie également toutes les personnes qui m’ont fortement aidé à

A mon chère frère Islam pour son appui et son encouragement.

Ma très chère sœur Rofia pour leur encouragement permanent, et leur

A touts mes collègues de la promotion 2016/2019

Merci d’être toujours là pour moi.

Première partie : partie théorique

Deuxième partie : partie pratique

AAF : aéro-anaérobie facultatif.

 Les salmonelles : (Salmonella) forment un genre de protéobactéries appartenant à

Les techniques de diagnostic indirect correspondent aux techniques de détection

Pendant mon passage aux différents laboratoires de bactériologie. J’ai pu assister à la

« Les étapes de Diagnostic en bactériologie : L’ensemencement et L’incubation »

Le diagnostic bactériologique est un ensemble de moyens permettant l’identification de

L'examen cytobactériologique d'un produit pathologique débute par l'examen

Le déroulement de ces deux étapes (l'ensemencement et l'incubation) est très important

Mais dans la situation observée, il y a des différentes techniques d’ensemencement et

Ce changement permet d’obtenir une insuffisance d’identification de l’agent responsable

* Pourquoi le diagnostic bactériologique demeure insuffisant malgré les efforts

- L’insuffisance de formation théorique et pratique concernant l’ensemencement et

- l’insuffisance de moyens assurant la bonne pratique de l’ensemencement et l’incubation.

Le prélèvement provient d’un site anatomique normalement stérile mais la contamination

II.1 Schéma de la démarche :

Prélèvement - Analyse moléculaire ?

Analyse cytologique Analyse bactériologique

(Numération des éléments figurés)

*Coloration de GRAM ou autre coloration

Isolement Enrichissement sur bouillon

Identification bactérienne Conservation

Figure 01 : Schéma de la démarche.

III. Examen microscopique :

III.1 Analyse cytologique :

Dans le cas particulier les prélèvements respiratoires, l’appréciation de la qualité du

Sera basée sur une évaluation quantitative du nombre de leucocytes et de cellules

III.1.1. Analyse Quantitative :

A. Systèmes manuels de comptage :

b. Cellules à usage unique :

c. Utilisation de systèmes automatiques de comptage :

III.1.2 Analyse qualitative :

La finesse de l’étalement du frottis est importante pour une observation de qualité. Ce

La coloration cytologique effectuée est la coloration de May-Grunwald-Giemsa. La

III.2. Examen microscopique bactériologique :

L’examen renseigne également sur la quantité de bactéries présentes dans le

Estimation de la qualité de bactéries par ml de prélèvement en fonction de la

III.3. Examen direct à l’état frais :

Certaines bactéries de mobilité caractéristique sont également repérées par la technique

b. Etats frais pour la mise en évidence d’une capsule par méthode à

c. Etat frais sur un microscope à fond noir :

III.4. Examen microscopique après coloration :