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Histoire du séquençage séquencer des génomes d’organismes modèles, et élaborer les outils

informatiques permettant de traiter, d’archiver, et de communiquer


Le séquençage du génome humain constitue une tâche gigantesque, qui a l’ensemble des données ainsi produites.
mobilisé de nombreuses équipes.
Parallèlement, et après de nombreuses discussions, la stratégie retenue
Cette histoire a débuté il y a un peu plus de 15 ans aux États-Unis. Le pour le séquençage a été de partager les différents chromosomes entre les
projet d’établir la séquence complète du génome humain a été discuté la divers groupes du consortium international, et d’utiliser les données des
première fois à Alta (Utah) en 1984, lors d’une réunion organisée par le cartes obtenues antérieurement. Un nombre minimal de clones recouvrant
Department of Energy (DOE) . Le but de cette réunion était d’évaluer le génome a été déterminé et partagé entre les membres du consortium. La
l’utilité des méthodes d’analyse de l’ADN pour la détection des France, représentée par le Genoscope, a rejoint le HGP en 1998 et
mutations, et l’éventuelle augmentation de leur fréquence parmi les séquence le chromosome 14.
survivants d’Hiroshima et de Nagasaki. Mais la principale conclusion fut L’ensemble du séquençage a déjà permis d’identifier de nombreux gènes,
qu’aucune méthode ne permettait l’identification des mutations, à moins de caractériser des gènes impliqués dans des maladies et de stimuler de
qu’un projet de séquençage énorme, complexe et très coûteux, ne soit nombreuses recherches fondamentales ou appliquées. Vingt-deux gènes
entrepris. Et la meilleure sensibilité ne serait obtenue que s’il était responsables de maladies ont été identifiés à partir de la version de travail,
possible de comparer la séquence complète de parents avec celles de leurs tels que les gènes responsables de la maladie de Usher de type 1C, de la
enfants ! LGMD 2G (limb-girdle muscular dystrophy), de l’ataxie
Les premières discussions sérieuses ont lieu lors de Workshops à Santa spinocérébelleuse de type 10, du cancer du sein (BRCA2)... Par ailleurs,
Cruz (Californie) en 1985, puis à Santa Fe (Nouveau-Mexique) en 1986 . l’établissement de la séquence finie a déjà permis d’identifier des
L’établissement de la séquence complète du génome humain, et donc de mutations ponctuelles de type SNP (single nucleotide polymorphism:
ses gènes (dont le nombre était alors estimé à 50 000-100000) serait un polymorphisme de séquence bialléliques), et plus de 1,5 million de ces
atout majeur pour la localisation puis la caractérisation de gènes marqueurs ont été déposés dans les bases de données. Plus de 12000 SNP
impliqués dans de nombreuses maladies comme la maladie d’Alzheimer , ont par exemple été identifiés et caractérisés à partir des séquences du
les maladies cardio-vasculaires , les diabètes. chromosome 22 . Ce type de marqueur génétique est très utile pour
En 1990, un premier programme de 5 ans a été développé : le Human l’identification de gènes responsables de maladies héréditaires
Genome Project (HGP) représentait la première entreprise d’envergure multifactorielles.
internationale dans le domaine biomédical, ayant comme but ultime la Extrait de l’INSERM 2001
détermination de la séquence complète de notre génome. Le projet Génome humain, financé par des fonds publics, a duré près de
Ce programme comprenait les points suivants: établir une carte génétique, quinze ans et coûté 2,7 milliards de dollars (2 milliards d’euros). Il s’est
dont les marqueurs soient espacés de 2 à 5 centimorgans ( 1CM = 106 terminé en avril 2003, grâce à plusieurs donneurs différents. En mai
bases chez l’homme ) ; établir une carte physique, dont les marqueurs 2007, pour la première fois, le génome humain d’un seul individu est
soient espacés d’environ 100kbases ; améliorer les performances du entièrement séquencé. Il s’agit de celui de James Watson, biologiste à
séquençage automatique (le séquençage complet du génome humain était l’origine de la découverte de la structure de l’ADN avec Francis Crick 
considéré comme un objectif réservé à une date plus lointaine) ; extrait du journal le Monde
La méthode de séquençage de Sanger 1977 : - des nucléotides des quatre catégories à A , à T , à C , à G
- une enzyme nommée polymérase
Avant le séquençage les chromosomes sont découpés en fragments de 100 - une amorce = petit bout d’ ADN pour la fixation de l’enzyme
kbases grâce à des enzymes de restriction qui agissent comme des ciseaux polymérase
chimiques et les fragments sont clonés pour obtenir de nombreux
fragments identiques .

Extrait de planet-vie
Les fragments sont assemblés au moyen de courtes séquence d’ADN
dont on connaît la localisation ( document b page 84 manuel ) et qui
servent de balises . Lorsque plusieurs fragments ont une balise en
commun on en conclut qu’ils sont partiellement recouvrants . Les
fragments sont ainsi mis bout à bout . Les deux brins sont séparés.
Le séquençage avec la première méthode de Sanger Les fragments d’ ADN sont versés avec les enzymes les amorces et les
Le séquençage nécessite : nucléotides dans quatre type de solutions contenant des nucléotides
- le fragment d’ ADN à séquencer ( simple brin) bloquant la lecture: ddGTP , ddATP, ddTTP et ddCTP .
déposant plus loin pour les plus petits et plus près pour les
Les nucléotides dd(TTP , ATP , CTP , GTP ) stoppent l’enzyme
plus gros . L’ ADN se comporte comme une molécule
polymérase et sont complémentaires de A pour ddTTP , de T pour ddATP
et ainsi de suite . De nombreuses copies du fragments de longueur négative donc attirés par l’anode ( positif)
différentes sont fabriquées et se terminent toujours par un nucléotide
bloquant .

* * *
Fragment à séquencer : A T G G T A C G T C A A C T
T A C C A T G G A G T TdG
T A C C A T G G A dG
T A C C A T dG

Arrêt de la synthèse par des


nucléotides bloquants ddGTP

Nucléotides A ,T ,C,  G +
bloquants ddGTP

Les fragments sont ensuite passés sur un gel à


électrophorèse :ils se déplacent grâce à un courant en se
Cathode -

du plus grand
fragment

5’ 3’

GTAGGCAT
GTAGGC

GTAGG

Fragment à séquencer :
GTA
3’ 5’

GT CATCCGTA
G
Au plus petit
fragment
Anode+
Amélioration de la technique de Sanger en remplaçant les Vidéo dans INSERM youtube <le séquençage de l’ADN>
les quatre tubes par des bloquants fluorescents. Il n’y a
plus besoin des quatre tubes remplacés par un tube Sanger quatre Tubes capillaires Fluorescent
capillaire de quelques µm rempli de gel . Les fragments tubes
migrent plus ou moins vite dans un gel sous l’effet d’un Vitesses de 1 kBases en 8 300 kBases en 3 heures
courant selon leur taille et un système optique identifie séquençage heures
chaque nucléotide de la terminaison par la nature de sa
fluorescence .

A gauche : méthode standard de Sanger


À droite : méthode avec les bloquants fluorescents
Evolution de la vitesse de séquençage :

Extrait de www.journaldu net.com

Le séquenceur d’ADN pas plus gros qu’une clé USB


Le séquençage et l’éthique extrait du journal le Monde
Est-ce possible en France ?
Le premier séquençage finalisé en 2003 a notamment servi de base de
En France, il est illégal pour un particulier de demander son séquençage
comparaison aux suivants. Il a permis d’identifier les gènes humains et de
génomique. Le code civil, modifié par la loi de bioéthique de 2004,
les cartographier. Le séquençage permet de comprendre et de poser un
stipule que «  l’'examen des caractéristiques génétiques d'une personne ne
diagnostic, mais également d'identifier des mutations génétiques.
peut être entrepris qu'à des fins médicales ou de recherche scientifique  »,
Aujourd’hui, le séquençage peut être réalisé pour des individus ou des
ainsi que pour les enquêtes criminelles ou la recherche de paternité. Le
fœtus. Il permet d’identifier une mutation ou un gène impliqué dans une
code de la santé publique ajoute que cet examen médical ne peut être
maladie. Il permet également d’évaluer les prédispositions génétiques
effectué que par « des praticiens agréés à cet effet par l'Agence de la
d’une personne pour certaines maladies ou d’en savoir plus sur
biomédecine ».
sa «  généalogie génétique ».
En France, les tests génétiques de prédisposition sont donc exclusivement
Des entreprises proposent des analyses génétiques ciblées. Mais demain,
réservés aux patients dont l'histoire familiale est alarmante, avec par
elles pourraient, en proposant un séquençage intégral, constituer des bases
exemple plusieurs générations de femmes atteintes d'un cancer du sein ou
de données sur les gènes de leurs clients, permettant de mener des projets
de l'ovaire.
de recherche, ou éventuellement d'être vendues à des laboratoires.
La découverte de gènes à l'origine de maladies peut justifier un suivi
Loi de bioéthique : vidéo sur le lien ci-dessous
médical particulier, ou des opérations préventives, comme la mastectomie
https://www.youtube.com/watch?v=Wx5YsGGUJpI
en prévention d'un cancer du sein  médiatisée par l'actrice Angelina Jolie.
Mais qu’est-ce que cela changera de se savoir prédisposé à Alzheimer,
Le projet 1000genomes :
maladie pour laquelle il n’existe aucun traitement préventif ?
C’est une recherche internationale pour établir des variations génétiques
Et sur les fœtus et les embryons ?
humaines à partir d’un millier de participants anonymes dans des groupes
Le séquençage chez le fœtus, dont une partie de l'ADN circule dans le
ethniques différents pour établir les variations génétiques humaines
sang de la mère, permet d’éviter l’amniocentèse et de dépister certaines
utilisable en médecine , génétique , pharmacologie , biochimie , étude des
maladies et mutations génétiques, comme la trisomie 21. Ce type de
variants . Ces banques de séquences sont en accès libre sur internet dans
diagnostic prénatal peut même être réalisé avant l'implantation de
le site :Ensembl (document 3 page 85)
l'embryon dans l'utérus.
 Tests prénataux : vers la fin de l'amniocentèse ?
Ce séquençage pose d’importantes questions éthiques. En mars 2014,
dans  Le Monde, Laurent Alexandre, président de DNAvision, expliquait
que les séquençages seront bientôt accessibles facilement en début de
grossesse. «  Le séquençage intégral de l’ADN de l’enfant va bouleverser
notre rapport à la procréation, puisque des milliers de maladies pourront
être dépistées systématiquement pendant la grossesse », s’alarme-t-il,
mettant en garde contre un « toboggan eugéniste ».
Compétence : rechercher comment a été déterminée la première
séquence du génome humain

Groupe A : Expliquez à l’aide des documents les grandes étapes du


séquençage de Sanger et comment cela fonctionne .
+ vidéos

Groupe B : Proposez à l’aide des documents une frise historique des
grandes dates d’avancée du séquençage du génome humain et
expliquez les intérêts de cette connaissance

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