GENETICA MECANISMOS April 4,

DE TRANSCRIPCION 2011

Mecanismos de transcripcion

Cromosoma contiene genes, que controlan la trayectoria bioquímica. Hay una

dependencia, el gen va a codificar una proteína y esta va a ir a actuar sobre un gen.

La información va de DNA a ARN y esto va ser traducido en una proteína que va tener
una secuencia aminoacidica. Si esto parte mal desde el gen estructural vamos a tener
una pérdida de la secuencia. Los ácidos ribonucleicos nos permiten el traspaso
fidedigno del RNA desde el núcleo al citoplasma, ya que llevan la información.

A modo de recuerdo: Ribonucleotido con grupo fosfato, azúcar y base nitrogenada. El

ADN tiene grupo hidroxilo en la posición 2. 4 bases nitrogenadas que componen el
ARN: Adenina, guanina, citosina, uracilo.

El ARN la secuencia va estar escrita de 5’ a 3’. El RNA se transcribe de la cadena

de DNA que va de 3’a 5’, hebra molde. Esto es entonces un Transcrito primario,
unidad básica de ARN, y que luego sufrirá serie de modificaciones para llegar a ser un
RNA maduro

Tenemos un gen que tiene regiones

reguladoras tanto en 5’como en 3’,
regiones promotoras, exones, intrones y
secuencias que no se traducen. En
maduración desaparecen. Las UTRi
( secuencia no codificadora). Luego de
nuestro RNA primario vamos a tener todo
el proceso de maduración.

Cuando se realiza la transcripción vamos a necesitar una serie de enzimas. El DNA se

encuentra compactado y enrollado sobre las histonas, por lo tanto para que la enzima
entre a la doble cadena debe haber un desenrollamiento previo. Para el
desenrollamiento necesitaremos factores, secuencia de DNA y enzimas.
Entonces primeramente vamos a necesitar la RNA polimeraza, que necesita
elementos trans (factores de transcripción para iniciación del proceso) y factores
CIS (secuencia regulatoria promotora rio arriba) que están en DNA y determina
cuando, como y que rápido se transcribe. Junto con esto, a medida que este DNA en la
parte 3’ se está desenrollando, en la parte 5’ una vez que la polimerasa ha pasado,
tiene que volver a enrollarse. Por lo tanto, nosotros tenemos enzimas capaces de
abrir el DNA en 5’ y elementos que van a permitir el enrollamiento en 3’. La
polimerasa se ve rodeada de factores de transcripción, no hay que imaginarse a la
enzima sola sobre el DNA, si no que hay una serie de factores de transcripción que
junto con los factores cis que están en el DNA, van permitir el inicio de la
transcripción.

TRANSCRIPCION:

Entonces, la idea de la transcripción es pasar la información de un lado a otro,

transcribir, transmitir la información, de una forma que nosotros podamos entenderla,
en este caso las células, y ello pueda ser traducido en una proteína.
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Esto fue adaptado por la evolución para tener un mensajero que llevara la
información almacenada en ella en forma parcializada, ordenada y regulada. ¿Por
qué parcializada? Porque se transcribe por partes, no se transcribe completa. Sin
embargo, el DNA en el humano tiene una forma en que los genes por lo general están
de a uno, distinto es en el genoma de las bacterias en los cuales los genes pueden ir
sobrepuestos, por lo tanto las transcripciones se pueden hacer de forma simultánea.
El resultado de la transcripción entonces es este “transcrito”.
Secuencia:

 Lo primero que vamos a necesitar es abrir una pequeña

sección de DNA.

 La hebra que se va a usar para la transcripción va de 3’ a 5’

 ésta sirve de molde entonces para formar el mRNA.

 El mRNA se sintetiza de nucleótidos libres en la célula. Estos

deben ser trifosfato y tiene que existir la maquinaria
necesaria para que se tomen estos nucleótidos y se los
pasen o presenten a la enzima. Se deben llevar los
nucleótidos respectivos; entonces, esto va a ocurrir en 3 etapas:

- iniciación, que va a partir de las secuencias promotoras.

- elongación que es producida por las polimerasas
- terminación que puede ser dependiente o independiente de rho.

Procesamiento post-transcripcional:
El mRNA es un RNA primario, necesitamos madurarlo. En primer lugar con la
adición del CAP, que es la 7-metilguanosina, y este CAP se adiciona en el primero
nucleótido en 5’. Su utilidad es de proteger del ataque de exonucleasas, facilitar el
transporte desde el núcleo al citoplasma y permitir el anclaje del tRNA en el ribosoma.
Esto es en eucariontes, porque los procariontes no necesitan etapa de maduración,
porque todo el proceso se realiza en el citoplasma celular. En cambio en las
eucariontes tenemos compartimentalización, y se necesita el CAP para poder pasar del
núcleo al citoplasma, se necesita protegerlo, necesita un conductor hacia el ribosoma,
todas estas son las funciones que tiene el CAP.
Luego un segundo elemento de maduración es agregar el poli-A en el extremo 3’,
que son aprox. 200 nucleótidos de adenina que se agregan en la cola 3’. Básicamente
la función de este poli-A es ayudarle o conferirle estabilidad al RNA.
Finalmente a través de un complejo RNA-proteína en el spliceosoma se va a
producir la eliminación de todos los intrones que no están codificando para “nada” en
nuestro DNA. Existen además unas secuencias que son claves en la unión del
intrón-exón que son GUAAG GUAAG. Normalmente se encuentran esas secuencias
en los sitios de corte entre el intrón-exón y eso es lo que permite que sea reconocido
por toda la maquinaria para que se pueda producir el corte. Esto quiere decir que el
corte no se hace en cualquier lugar, sino que se necesita de esta secuencia.
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La poli A necesitan 200 adeninas, así forma una estructura secundaria e impide que
entren las nucleasas y lo degraden. Al alcanzar una estructura secundaria, por ejemplo,
en forma de trébol va a hacer al RNA mucho más estable, si es que son mas tiene una
mayor estructura y por lo tanto mayor estabilidad.
El CAP se adiciona en 5’ en el azúcar, se produce una unión entre los fosfatos y el 5’
del azúcar, siendo una guanosina en la posición 7 tiene un grupo metilo. Normalmente
las bases están unidas de la misma forma, el CAP, entonces queda dado vuelta, o sea
en la otra posición y eso impide que sea degradado, por ejemplo ya no es de 5’-3’, sino
de 5’-5’, esto hace que tenga un giro lo que lo hace no susceptible a degradaciones.
Entonces el CAP le da estabilidad a nivel de 5’, tal como se la da el poli A a
nivel de 3’.
En procariontes el sistema es bastante “simple”, porque no hay barreras que
atravesar, por lo tanto una vez que tenemos este RNA maduro pase al citoplasma y en
el citoplasma se produzca la traducción (el profe dice que procarionte no tiene
intrones, sin embargo lennigher dice que algunas bacteria tienen secuencias no
codificantes). En eucariontes sin embargo este sistema es mucho más complejo por las
barreras, el núcleo y la compartimentalizacion. Otra diferencias es que los procariontes
solo tienen una RNA polimeraza, mientras que los eucariontes tienen 3 RNA
polimerazas.

Tipos de RNA
• RNA mensajero (mRNA): Sirve como patrón para la síntesis de proteínas,
lleva la secuencia codificante. hnRNA procesado.
• RNA ribosomal (rRNA): Constituye parte de la estructura de los ribosomas
(2/3 de ribosomas son RNA ribosomal). Tiene actividad catalítica lo que significa
que es capaz de procesar un elemento y sacar un producto.

• RNA de transferencia (tRNA): Cuando participan como adaptador de aa.,

permiten el traspaso fidedigno de información. Es el mas pequeño de los RNA.
Permite llevar el aminoácido hasta el ribosoma e inducir la traducción, que
presenta un sitio de unión del aminoácido, y presenta el anticodón, que podrá
reconocer el codón base a base el aminoácido que se quiera integrar. Todos
estos RNA tienen una secuencia CCA, que es el que permite la unión del
aminoácido (pagina 1017 lenningher revisar)
• RNA citoplasmático pequeños (scRNA): forman parte de lo que se denomina
SRP “partícula del reconocimiento señal”, y esto tiene que ver con la proteína
cuando ya esta sintetizada, es una señal para donde tiene que dirigirse la
proteína, hacia compartimiento intracelular o extracelular.
• RNA heterogéneo nuclear (hnRNA) : molécula precursora del mRNA. Se
transfieren directamente del DNA y finalmente van a codificar para una
proteína.
• RNA pequeño (snRNA): que participa en el proceso de soldadura de los
exones, por lo tanto forma parte del espleisosoma.
• RNA de interferencia ( tRNAi): cumplen varias funciones como enzimáticas,
lisosimas, etc.
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A veces estos mismos pasan por subtipos, por ejemplo el RNA mensajero pasa por
distintos estadios (pre-RNA, RNA maduro, etc). En el caso de los eucariontes un gen
podría codificar para más de una proteína, pero depende del splacing del ARNm.

Otra característica del ARNm, es su estructura lineal. Debe tener el CAP y poli A, y
además en su estructura están los codones, que permiten traspasar información a las
proteínas.

Existen 20 tipos de aminoácidos, por lo tanto vamos a tener, mas menos, 20 tipos de
ARN.

Existen diferentes tipos de tRNA, en los procariontes: 16s 23 s 5 s que son las
subunidades de cadena liviana. En los eucariontes están las subunidades 18, 28, 5,8s,
y 5 s. La s corresponde al coeficiente de sedimentación que es una técnica que permite
separar la proteína por gradientes ¿??

RNA nuclear pequeños: participan en el proceso de soldadura de los exones durante la

formación del mRNA por lo tanto, están formado parte del spliceosoma. Estos son
pequeñas secuencias de 150 nucleótidos. Algunos ejemplos de ellos U1, U2, U3, U4,
U5, U6.

RNA citoplasmático: formados aproximadamente por 300 nucleótidos y forman parte

de lo que se denomina SRP que es la partícula señal de reconocimiento y esto tiene
que ver con la proteína.

Lo anteriormente mencionado no tiene que ver directamente con el proceso de

transcripción o traducción sino que se presenta en la proteína que ya esta sintetizada.

En el DNA se ve una secuencia 5’ otra 3’ que servirá de molde para la síntesis del RNA,
nuestra secuencia del DNA molde es T por lo tanto e primer riblonucleótido añadido en
el mRNA es A.

Para la transcripción se necesita una RNA polimerasa dependiente de DNA (la

independiente de DNA es la que sintetiza DNA a partir de DNA).

Esta enzima sintetiza nucleótido en dirección 5’a 3’, (lo ribonucleótidos deben estar
trifosfatados). Se fijna a regiones promotoras y necesita una hebra de DNA molde.

Secuencia de acción:
- Se une la RNA polimeraza
- Hay separación de DNA por parte de una helicasa, que permiten girar el DNA (ir
abriéndolo)
- Ocurre el apareamiento de bases por complementariedad.
- Se agrega segunda base trifosfato y se forma enlace fosfodiester, P 5’y OH
3’del nucleótido previo.
- Union y adicción del tercer nucleotrido trifosfato y asi continuamente, mientras
la RNA pol se va moviendo.
-
Se necesitan los trifosfatos para poder incorporar el CAP y poder establecer el puente
con la base de la 7 metil guanosina.
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Las etapas de enrollamiento y desenrollamiento van ocurriendo simultáneamente en el

DNA a medida que la trancriptasa va a vanzando y se produce esta burbuja de
transcripción en lugares donde hay un hibrido DNA- RNA. Se debe llegar al estado
inicial en que se encontraba este DNA y que salga este mensajero a partir de los
ribosomas.

En las células procariontes ambas hebras son codificantes y también existe

solapamiento de genes, cosa que no ocurre en los eucariontes.

Inhibidores de la transcripción
Acridina y actinomicina D (ambos antibióticos). Pueden intercalarse entre 2 pares
sucesivos G-C o meterse en el surco menor de la doble hélice, formando una estructura
cíclica. Ambos procesos son para bloquear el paso de la polimeraza y el
desplazamiento a través de la cadena.

Transcripción en procariontes
La RNA polimeraza es la clave en este proceso no abandona el molde de DNA en todo
el proceso.
Está formada por 4 subunidades 2 α, 1β y 1β’. Las dos α dan el inicio, la β está
encargada de la elongación y la β’ se une al DNA. Esta enzima, con actividad catalítica,
actúa polimerizando en sentido 5’a 3’y no tienen actividad correctora por lo que tiene
una tasa de error de 10-4. No necesita de cebadores para iniciar la transcripción.
Pregunta: como discrimina el sistema cuando tiene que codificar uno u otro gen si no
necesita secuencias reguladoras?

Esta proteasa necesita el factor σ (sigma) y también hay un factor ρ (rho), con
actividad ATPasica que reconoce la señal de terminación.

Hay dos factores que son claros: sigma en el inicio y rho en el final. Esto no es tan
sencillo por que más adelante se verá que en eucariontes hay polimerasas,
dependientes de rho y otras que son independientes de rho, pero acá se necesita tanto
factor sigma como factor rho.

Acá tenemos la RNA- polimerasa con sus respectivas subunidades más el factor sigma.

RNA pol bacteriana tiene regiones:

-Alfa va a antes del inicio de la cadena permite interaccion con proteína reguladora y
promotora

-Beta inicio y elongación

-Beta prima unión al DNA

Omega y omega prima: no se les conoce la función.

Sigma: tiene que ver con el reconocimiento del promotor.

Cada una de ellas tiene una función pero en su conjunto permiten la actividad.
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Factor sigma: factor de iniciación, existen diversos factores en bacterias en este caso
echericha colli, pero que tiene que ver que son específicos para distintos genes, un gen
necesita un factor sigma especifico.

Por esto entonces la RNA-polimerasa reconoce distintos genes, al haber factor sigma
especificos para distintos genes dependiendo del factor sigma que se presente es gen
que se va a codificar, sigma debe asegurarse que la RNA-polimerasa se una
establemente al promotor del DNA. Sigma va a desestabilizar uniones no especificas,
va a estabilizar a nivel del promotor, acelera la busqueda del promotor.

Procariontes también necesitan Rna-mensajero, ribosomal y de transferencia, también

necesitan la secuencias reguladoras de RNA.

Al observar la lineación de distintos genes en la E. coli, se pueden observar dos

regiones de consenso la -35 o 35 bases rio arriba y la región de la -10 denominada caja
PRINOW.

Bases que determinan el inicio de un gen: AUG, siempre para el inicio se necesita un
codón que sea para metionina.

Estas separaciones de bases son importantes ya que el sistema noe s efectivo si estas
bases no están.

Se muestra la región -35 el espaciador, la región -10 el espaciador y el primer sitio de

inicio. Se necesita que se reconozcan ambas secuencias.

Pregunta, Tan grande es la RNA polimerasa que alcanza a cubrir ambas secuencias
reguladoras?

Los promotores presentan diferentes eficacias en la iniciación de la transcripción, una

trancripcion cada dos segundos o una transcripción cada 10 minutos. Los promotores
mas fuertes son las que tienen las secuencias de consenso -35 y -10, que son estas
secuencias de consenso, la distancia optima es de 17 nucleótidos.

La RNA polimerasa se une al DNA de una forma inespecífica, y sobre el DNA buscará el
sitio promotor desplazándose por la molécula, esto quiere decir que no es que la
polimerasa vaya a llegar y vaya a encontrar directamente la secuencia reguladora, sino
que se coloca en el DNA, avanza hasta que encuentra la zona reguladora y ahí empieza
a armar el sistema de transcripción. Puede detectar la secuencia incluso sin necesidad
de desenrollar la doble hélice.

La gracia es que este proceso es bastante rápido, y tiene que ser así.

Se tiene la cadena de DNA, la adición del templado, los nucleótidos, la formación del
enlace con la cadena siguiente. Luego la eliminación de un pirofosfato, y entre estos
dos ya se ha formado un puente de estas dos bases. Estas son varias formas de
elongación.

Acá nosotros necesitamos el factor rho, que es de término, al final de la

cadena, y va a permitir la disociación del complejo de RNA y de la polimerasa.
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Se tiene un gen de cadena lineal (de las bacterias) con secuencias codificantes
y no codificantes, y que pueden codificar de corrido para tres distintas proteínas (alfa,
beta y gamma). En el eucarionte, por el contrario, nosotros vamos a poder codificar a
partir de un gen una proteína. Pueden haber variantes dependiendo de los splicing
que se produzcan.

Una vez que la RNA polimerasa se desplazó por el DNA y encontró la secuencia
promotora, región de inicio, empieza a desplazarse y empieza a abrir esta burbuja y
sintetiza hasta llegar a la secuencia de término, o bien necesita el factor rho para la
terminación.

Ya sabemos que las regiones promotoras río arriba son necesarias para la
especificidad de la transcripción.

Necesitamos este factor sigma, que es el que permitía el reconocimiento y la

entrada al DNA, éste ya no se necesita una vez iniciado el proceso con la burbuja
abierta, por lo tanto este puede salir. Se produce la elongación hasta la secuencia de
término, que puede necesitar factor rho, y que permite la desestabilización del
sistema, la salida de la polimerasa, la salida del RNAm. El factor sigma puede volver a
unirse a la polimerasa para permitir una nueva transcripción.

Ya les había dicho que necesitan factores cis y trans, factores de transcripción y
secuencias regulatorias. Hay un numero de factores de transcripción es bastante
abundante, está el IIb por ejemplo que media la interacción entre el IId y la polimerasa,
IIf (4 proteínas) que permite la estabilización del complejo, el IIe (4 proteinas) que
promueve la formación y la adición del primer nucleótido.

Esto es un complejo, se tiene el gen, todas sus secuencias regulatorias donde se

va a unir el factor de transcripción I, va a entrar el segundo factor de transcripción.
Luego viene la polimerasa con otro factor y se va a formar todo este complejo, el que
con las características que tiene va a poder iniciar el proceso de transcripción. Una vez
que el complejo se ha establecido sobre el DNA es posible que se liberen algunos de
los factores, y que se desensamble el factor de transcripción inicial y pueda la
polimerasa recorrer sola su camino.

LA MORALEJA de esto es que la polimerasa no va a unirse al DNA mientras no

encuentre todos estos factores de transcripción asociados, que le permiten el
reconocimiento del promotor y la elongación.

Otra gracia que tienen los factores de transcripción es que permiten reconocer
elementos regulatorios a distancia, porque el DNA va a tomar distintas formas. Si
nosotros tenemos una proteína activadora que está muy río arriba, una forma de poder
ir a actuar bajo este mismo concepto es que el DNA gire en sí mismo y que este factor
activador pueda facilitar y aumentar la transcripción.

Entonces la MORALEJA de esto es que no sólo necesitamos los factores de

transcripción regulares, sino que además hay elementos activadores que están mucho
más río arriba. Incluso puede haber mas zonas regulatorias y entre todas ellas van a
formar este complejo de activación.
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¿Por qué se necesitan tantos elementos regulatorios? Para que todo este
proceso sea específico. Un ejemplo de estos son los operones, que van activando o
inhibiendo determinados genes, bajo presencia de un sustrato o no. Por lo tanto si hay
un estímulo nosotros necesitamos deprimir o activar.

Además de todo esto existen mediadores, los que también van a ir a actuar en
la región promotora. Estos son aumentadores, activadores o pueden ser también
inhibidores. De alguna forma actúan sobre el complejo, la maquinaria, y pueden inhibir
o activar este proceso. Son muchos a nivel humano, también en levaduras. Son
proteínas y no se unen al DNA, actúan por interacciones proteína-proteína. Pueden
unirse a las polimerasas y pueden regular la actividad de algunos factores de
transcripción que son quinasas.

Tenemos factores de transcripcion, activadores factores mediadores , un factor

mediador (CTB) que tiene que ver con actividad catalítica, kinasica, que va a producir
fosforilaciones que va a permitir el proceso de transcripción, sin la presencia de este
mediador este proceso no se realizaría hasta ver estas actividades kinasicas, los
factores que estan en el DNA son cis y las proteínas asociadas son trans y trans es río
arriba y cis es río abajo, acerca de los factores de transcripción , hay que ver la
acción catalítica y activadora.

RESUMEN: Tenemos el DNA como cromatina, este DNA para poder entrar en el
proceso necesita dimerizarse, por lo tanto, se comienza a descompactar la cromatina.
Tenemos todo el sistema de mediadores de factores de transcripción, que van a
producir finalmente la unión de la RNA polimerasa y el inicio de la elongación del RNA
mensajero. Con la adhesión de su CAP , esto luego vuelve a compactarse. El RNA
polimerasa va a seguir elongando este RNA y va a realizar el splicing inmediatamente,
porque hay regiones intrónicas que las está cortando. Vamos a tener un RNA lineal sin
intrones y además se agregó un poli A, al RNA se le agregan una serie de proteínas que
protegen al RNA y muestran los poros del núcleo al citoplasma, para encontrar los
ribosomas que van a realizar la síntesis de la proteína que luego tendrán todo su
procesamiento posterior. Todos los factores de transcripción van a salir de sus lugares
y podrán fosforilarse o desfosforilarce y volver a su actividad en el núcleo. Todos los
procedimientos son simultáneos: inicio, elongación, splicing, agregación del Poli A, del
CAP, la salida por el poro, el ingreso de proteínas pequeñas que permiten
estabilización del RNA en el citoplasma, donde viven muchas nucleasas. Estas
proteínas permiten el transporte, polaridad y lo más importante linealidad, y así
evitar la estructura secundaria que le impediría la salida por el poro nuclear.

RNA polimeraza tienen dos sitios de unión a ribonucleótidos, el sitio de unión que
generalmente tiene que ver con un GTP o un GTP. Generalmente en procarionte, las
RNA pol comienzan con una purina. En elongación se meten el resto de nucleótido que
se necesitan. Luego el grupo 3', el primer nucleótido ataca al fosfato alfa y esto
va permitir los enlaces fosfodiester que van a permitir la elongacion.

Se necesita de cebadores. Posteriormente se le ira agregando la segunda base, que

puede ser cualquiera. Tenemos también inhibidores de la transcripción como la
prostaciclina que es un antibiótico, que ataca el complejo de iniciación.
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Tras la polimerización de los primeros 3 a 6 ribonucleótidos, en la elongación, el factor

sigma se va y puede ser reutilizado en un nuevo proceso.

La burbuja de transcripción se va a ir desplazando por el DNA, el RNA sintetizado se

enrolla con la hebra de DNA molde formando un hibrido (máximo 8 a 10 nucleótido).La
región desenrollada y la porción hibrida DNA-RNA permanecen constantes. Finalmente
la molécula de DNA debe ir desenrollándose por delante de la burbuja y enrollándose
por detrás, y es aquí donde encontramos a las topoisomeraza con función de las
DNA girasas. La velocidad de este proceso es bastante rapida, y es 50 nucleotido por
segundo.

La RNA polimerasa, carece de una actividad nucleasica y posee una tasa de error 105
104 angstrom en total. Esto es porque en el RNA si podemos tener errores no como el
DNA con la DNA pol que tiene una tasa menor de errores.

Al finalizar, paralizaremos la formación de los enlaces fosfodiester, y se separara el

hibrido y se va a recombinar el DNA, llevando la hebra de RNA polimerasa. Tenemos
final de termino, que generalmente son secuencia ricas en GC seguida por secuencia
rica en AC y el sistema se destabiliza. Si no se tienen proteínas estabilizadores se
forman estructuras secundaria. En cambio, en procariontes esta estructura
secundaria podría servir estabilidad y protección frente el ataque de nucleasas.

En el humano, existe un sistema en que los mensajero que tiene orquilla en 3', le da
estabilidad al mensajero y mayor producción.

Puede haber una terminacion dependiente o independiente de rho.

Terminacion dependiente de rho:

- cuando RNA tienen este factor no hacen la horquilla, el factor rho detecta señales de
termino, que no son detectadas por la polimerasa. Tiene una estructura hexamerica,
con actividad ATPasica. Se une al RNA de la cadena y tiene 72 nucleotidos. Rho
reemplaza a la orquilla, dandole estabilidad a la molecula.

Terminación independiente de rho:

Forman horquillas y son estables por si solo.

En eucariontes, la señal de termino no esta tan bien descrita como en procariontes.

Con respecto a la transcripción tenemos la presencia de 3 RNA polimerasas (I, II, III).
Cada una de estas polimerasas van actuar con distintos RNA.

La RNA polimeraza II transcribe para precurso del mRNA y sRNA.

La RNA pol esta formada por 8 a 12 subunidades (en la pro. eran 4 subunidades), dos
de ellas son bastantes grandes (240 a 140 kDal) que son la RMP1 y RMP2.Ademas de la
presencia de múltiples secuencia repetidas de consenso. Esta secuencia proteica
permite regulación por fosforilación.

Regiones promotoras:
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-La caja TATA : Principal secuencia regulatoria. Ubicada entre el -25 y el -100 (TAT)
.Esta en la mayoría de los genes eucariontes. No existe factores sigma, sino gran
cantidad factores basales (en procarionte se necesita sigma). En el procesamiento de
mRNA se le agrega un CAP. Estructura final TATTT, que permite la adición del poli A.
También hay espliceosoma que permite la salida de los intrones. La unión entre exones
es por RNA ligasa.

En procarionte transcripción y traducción esta acoplados, son procesos

simultáneos. En eu la existencia de varios ribosomas traduciendo lo hace un proceso
más eficiente.

La caja TATA no es única, existen más de una región promotora en los eucariontes. En
procarionte también son necesario factores de transcripción donde la RNA polimerasa
pueda iniciar el proceso. El factor TFIID se une a caja TATA y provoca cambio en el DNA
para el inicio de la transcripción. Luego se empiezan a agregar otros factores de
transcripción (A, B, F) y luego va entrar la RNA polimerasa junto con la heliasa.

Hay serie elementos que solo son reconocido por factores de transcripción.
Hay elementos que responden a las big shock protein, otros solo responden a metales
o glucocorticoide o hormona .Por lo tanto los genes pueden tener una activación mixta.

Existe un sitio de inicio donde hay región intensificadores. Estas no tienen una
localización precisa, son bidireccionales (se pueden unir a cualquiera de las dos
hebras), pero aun así ejercen un efecto regulador activando promotores a miles pares
de bases. Esto es porque el DNA se puede doblar sobre sí mismo. Se pueden localizar
rio arriba, rio abajo o en el medio. Luego que se una esta secuencia intensificadora al
DNA, existen coactivadores como Histona acetyl transferasa, que tiene que ver con el
remodelamiento de la cromatina. Se unen los factores de transcripción a la caja TATA.

Para luego la activación de RNA polimerasa.

Existen algunos RNA que en la horquilla presentan residuos de uracilo

2 da
parte:

Vamos a ver un ejemplo de regulación producto de activadores o co-activadores

utilizando como ejemplo los operones, nosotros ya habíamos visto en la mañana que la
regulación de los genes en eucariotico es de tipo monositronico y ustedes pueden
apreciar acá que este tiene una serie de elementos regulatorios, proteínas regulatorias,
que hay espacios en el DNA, que hay secuencias de consenso en los promotores, hay
una series de factores de transcripción, todo esto además asociado a la polimerasa II y
que hay un sitio de inicio de la transcripción y esta transcripción se va a llevar a cabo
abriendo el DNA utilizando una serie de enzimas que permitirán que el DNA se abra, la
participación de un factor sigma en el caso de los procariotas y una vez que se ha
transcrito el gen a estas unidades regulatorias van a permitir el termino de la
transcripción , por lo tanto existe una serie de elementos que tienen que ver con todo
lo que tiene que ver con la transcripción, elementos que se unen al promotor, existen
factores de transcripción que pueden ser activadores o que pueden ser inhibidores y
toda vía tiene que ver con la modificación de las características de la cromatina,
entonces hay múltiples lugares o señales que permiten hacer la regulación, un
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concepto que tiene que quedar claro es el splicing alternativo, dependiendo la forma
en que se realiza el splicing de RNA podemos tener más de un producto, en algunos
casos podemos determinar productos que no son funcionales y productos que lo son,
es así como en un gen cualquiera que tenemos 5 exones, esto se va a transcribir en
un RAN que va a tener también 5 exones , pero al momento de hacer el splicing nos
puede dar tres proteínas distintas, los intrones son funcionales. En algunos casos
tenemos exones que por el splicing pueden cambiar, los exones que no pueden
cambiar son el primero y el último (1-5), porque estos llevan las secuencias de inicio y
de termino respectivamente. Sin embargo dentro de todos los exones que podemos
alternar son todos los demás para generar un nuevo producto bioquímico. De
producirse el splicing de forma correcta, por ejemplo al producirse un corrimiento en el
corte se produce una proteína inactiva, es decir una proteína disfuncional. A veces un
mismo gen puede codificar para mas de una proteína, esto es porque dependiendo de
la escisión que tenga en el splicing puede dar una proteína de características distintas.
Hay genes que dependiendo del tejido en donde se encuentren va a ser la proteína que
van a producir, cada uno con un splicing alternativo distinto.

Hay proteínas que son reguladoras y que participan en el splicing, un ejemplo es el de

la drosophila donde una proteína que es sintetizada previo a la embriogénesis y esta
va a regular el proceso de la diferenciación sexual, si esta proteína no se activa, no se
produce el corte entre dos y tres y lo que sucede es que queda con un codón de
termino en 2 y queda una proteína disfuncional.

Apolipoproteina B 48 tiene una función de absorber lípidos desde el intestino.

Una vez que se traduce el ADN al RAN es traducido en los ribosomas, donde después
debe pasar por un proceso de maduración en donde pueden experimentar
glicosilaciones y plegamientos, de no ser así esta proteína pasara a degradación,
donde se tomaran sus aminoácidos para la síntesis de otra proteína.

Por lo que tenemos muchos tipos de regulación a nivel pretraduccional y

postarduccional. Uno puede generar esto con el silenciamiento de ARN, podemos
afectarlo con la velocidad de síntesis y degradación de proteínas.

In vitro podemos tomar pequeñas secuencias complementarias del tRNA, se van a unir
al RNA mensajero y al unirse van a producir un bloqueo o una disminución en la
síntesis proteica, esto es un “knock-out”, una inhibición de un gen, pero aquí no
estamos hablando de la inhibición del gen propiamente tal, estamos hablando de
inhibición de siRNA, bloqueamos un gen colocándole RNA de interferencia. Basta que
bloqueemos la expresión de la síntesis para que podamos ver cuál es su función real, y
eso es colocando un pequeño RNA de interferencia que se une complementariamente
con el RNA, y esto va a bloquear todo el proceso que involucra la expresión de las
proteína. Un ejemplo: tenemos un siRNA que se une al RNA, al final lo que sucede es
que no se traducirá el producto final, y esto será degradado.

Regulación Epigenética

Existen otras regulaciones que últimamente están de moda, que es todo lo que
tiene que ver con la epigenética, que son modificaciones que se producen en los
genes por el ambiente, ya que estamos sometidos al estrés constante de la
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contaminación, alimentos, chatarra, etc; y todo este tipo de estímulos lo que producen
son modificaciones de tipo epigenético, en el tiempo estas modificaciones pueden ser
heredables, puede que a mí se me produzcan modificaciones pero a los que van a
afectar será a mi herencia.

Metilación de citosina en islas CpG e Imprinting

Una de las principales modificaciones epigenéticas es la metilación, si nosotros
tenemos un DNA y tras el proceso de replicación, este DNA tendrá las 2 hebras, y
normalmente lo que sucede es que nosotros tenemos estas citosinas que no son
metiladas y normalmente estas citosinas no son reconocidas y por lo tanto no son
metiladas, aquellas citosinas que si son reconocidas, por lo tanto metiladas, será un
proceso normal, pero cuando el sistema se sobrepasa en el proceso de metilación se
cambia lo que se va a expresar.

Acetilación-desacetilación de histonas
Aquí vemos una cromatina activa que está
abierta, y acá una cromatina inactiva que está
cerrada. Producto de la acción de la DNA metil
transferasa, nosotros vemos metilado el DNA, y a la
vez por estas otras enzimas que son entre otras la
histona deacetilasa, también podemos quitar estos
grupos acetilos, entonces la combinación de grupos
metilos más la salida del grupo acetilo hacen que esta
cromatina se inactive. Este es un proceso reversible,
se puede producir la acetilación y demetilación y dejar la cromatina activa. El daño se
produce cuando no podemos sacar estos grupos metilos y no podemos adherir acetilos.
En el fondo, metilación y acetilaciones pueden llegar a producir también alteraciones
del tipo epigenético que van a modificar la expresión de un gen.
El principal proceso de regulación que permite la maduración del RNA, es el que
tiene que ver con el spliceosoma, en el laboratorio podemos observar cuando un intrón
es sacado y como el exón 1 y el exón 2 se pegan, esto se va a producir a través de la
transcripción y procesamiento, normalmente nosotros deberíamos ver este pedazo de
RNA libre, lo vamos a ver en un gel de agarosa, en el que podremos ver 2 tipos de RNA,
uno lineal y uno circular, que por el tamaño y la migración se pueden identificar. ¿Por
qué el RNA lineal avanza más rápido que el RNA circular?
¿Cómo se empieza a producir el procesamiento de este cambio entre intrón y
exón? Tenemos la secuencia del exón aquí, el intrón y el siguiente exón, les dije que
tenían que existir unas secuencias específicas que tenían que estar en el sitio de corte
para que se produjera la eliminación del intrón, y que habían unas guaninas. Aquí
están, tenemos esta guanina y un grupo hidroxilo, se produce un ataque enzimático
que va a permitir la liberación de esta guanina, y este grupo hidroxilo va a interactuar
con el grupo fosfato del exón B, y esto va a producir la liberación del intrón, con la
consiguiente liberación del exón A y el exón B, y estos 2 (A y B) quedan juntos. El
intrón que quedo libre tiene la posibilidad de circularizarse por el ataque del hidroxilo a
una región cercana a la guanosina. Generando entonces un intrón y un trozo de una
secuencia de intrones, y entonces nos queda unido a través de esta interacción del
grupo hidroxilo con el grupo fosfasto entre el axón A y el axón B. necesitamos la
presencia de estas bases en el intercambio entre intrón y exón. Estos intrones
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normalmente pueden quedar en forma circular, y para ello el grupo hidroxilo de la

guanosina del intrón va a ir a atacar a las primeras bases del intrón para circularizarse,
y puede atacar a más de alguna base, una vez que los productos están circularizados
pueden volver a sufrir un ataque. Si uno agrega agua a la reacción podemos
relinearizar el intrón, o también puede que uno agregue pequeños oligonucleótidos
para poder romper el intrón y dejarlo lineal.
¿Qué importancia puede tener que un intrón sea lineal o circular? ( investigar,
pues no lo dijo)
Qué importancia puede tener un intron tisular, de que nos va a servir. La importancia
está en que como es un DNA lineal, este se va a degradar y eso nos va a dar una
cantidad de nucleótidos disponibles, en cambio un RNA circular no es susceptible a la
acción de endonucleasas. Que es lo que les sucede en cierto modo a un DNA familiar,
los DNA familiares son circulares, por tanto son susceptibles de degradación.

Por tanto cuando el DNA esta lineal es para una disponibilidad para nucleótidos, para ir
a hacer alguna función.

Aquí les muestro lo mismo pero un poco más complejo, aquí está el exón 1 y acá se
inicia el exón 2 y en el intertanto hay una serie de estructuras secundarias en el intron,
y de hecho cada una de estas regiones puede tener secuencias que generan de alguna
forma regulación. En este caso también esta presenta la guanina con grupo hidroxilo,
que es donde se va a producir el ataque para liberarlo y producir también que este
exón, con el exón que esta acá, y todo eso va a ser eliminado.

Todo esto tiene dentro de este intron algunas pocas frecuencias que son constantes,
que son elementos de regulación, y en algunas cosas también participan en otros
procesos. Pero solamente me interesa que tengan presente que el ataque que va a
producir la guanina en su grupo hidroxilo, quien se va a atacar el grupo fosfato y que
va a permitir finalmente que estos dos exones se unan.

Otra forma que tenemos de visualizar este proceso en el laboratorio es a través de las
características que tienen algunas bacterias, por ejemplo las Beta-galactosidasas. Lo
que se ha hecho actualmente para modificar gen; donde yo tengo el promotor del gen
de la beta-galactosidasa, tengo el codón de inicio, tengo la secuencia de la beta-
galactosidasa, y acá tengo mi intron que yo le agregue en forma manual en el
laboratorio, y aquí sigue el resto de la secuencia de la beta-galactosidasa, luego
permito que esto se transcriba, se procese y produzca beta-galactosidasa, solo
aquellas que estén normales van a tener el color azul, que es la presencia de beta-
galactosidasa con la enzima. Y aquellas que estén blancas van a ser las que tengan
este intron insertado.

Por lo tanto si yo realizo un experimento donde inserte este intron, porque quiero
modificar cualquier cosa, el producto que debería obtener es blanco, porque
normalmente la beta-galactosidasa da ese pigmento azul en un medio de cultivo que
contiene la lactosa. Si yo modifico la proteína y ya no está normal, no me va a producir
este colorante, por lo tanto en este caso yo puedo tener una columna blanca que es
donde esta modificada, una columna azul que es donde esta normal.

Lo mismo puedo hacer yo con un gen que le saque el intron y vea las características
por su resultado final.
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Esto es solamente un poco más detalle sobre lo que estábamos viendo, acá tenemos
nuestro famosa guanina con secuencias reguladoras, en el fondo lo que nosotros
necesitamos para poder unir los dos segmentos son las ligasas de RNA, que es la
enzima que va a permitir la unión de la guanosina del extremo 3’ del exón 1 con el
fosfato en 5’ del exón 2.

Entonces, necesitamos una guanosina con su grupo hidroxilo, necesitamos un grupo

fosfato, necesitamos ligasas y necesitamos además fosfatasas. Teniendo esos cuatro
elementos ya podemos producir el splicing de este intron.

Las reacciones catalizadas por RNA tienen la misma forma que las reacciones
catalizadas por enzimas, pero con un poco menos de eficiencia. Por tanto con distintas
enzimas y distintos sustratos, hay distintas Km y distintas velocidades de cambio. La
más eficiente será la que tenga la mayor tasa de recambio, ósea que el numero de
sustratos transformados por unidad de tiempo es mayor.

Una de las cosas que ya les había nombrado es que los intrones pueden generar
estructuras secundarias, y estas de alguna forma pueden facilitar o entorpecer el
empalme. La gracia de acá es que hay proteínas que van de las U1 a la U6 que son
pequeños RNA y permitían la participación en el splicing; entonces para que se
produzca el splicing, es necesario además de una guanosina un fosfato, una ligasa RNA
y fosfatasas necesitamos RNAs pequeños, que van de la U1 a la U6 y que van a estar
ligados en el empalme, y ayudan también a que las estructuras secundarias no
entorpezcan el empalme.

Tenemos un RNA nuclear lineal y se produce el ataque y se produce el splicing, y

también hay estructuras secundarias pero de todas formas el ataque se produce de la
misma manera.

Otra característica es el procesamiento normal, acá sacamos el intron y nos quedó el

exón 1, el 2, 3 y 4. Cuando se nos puede producir en algunas mutaciones una especie
de entrecruzamiento donde lo normal es 1, 2, 3 y 4, y vamos a tener 1 y 4, 2 y 3. Estos
intercambios pueden ser buenos o malos, existen núcleos específicos y puede que
en algunas células necesitemos que se produzcan estos intercambios y en otras células
no.

Otra forma de reconocer los splicing es la presencia de unos pequeños bulbos que se
producen porque se han insertado bases que no están perfectamente apareadas
(eosina) y la presencia de estos bulbos va a implicar entonces que aquí van a haber
sitios de corte y que van a permitir la unión con el exón siguiente. Entonces no
solamente depende de la secuencia sino que también existe la posibilidad de bases
que no son perfectamente apareadas.

También pueden producirse rompimientos o movimientos en los campos de

lectura, esto basta para que la proteína que se esté sintetizando cambie a otra. Por lo
tanto, tenemos alteración en el marco de lectura cuando se produce movimiento de
una base, con el intercambio de base, deleciones e inserciones.
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Existen una especie de rellenado o como una

terminación de segmentos. Si nosotros tenemos un
genoma, aquí tenemos lo que se denominan RNA
molde, estos le permiten al RNA que estamos
sintetizando sellar cualquier fragmento que le quede
incompleto y le indica donde debe insertar bases
para poder completarse. Necesitamos un RNA molde
en la etapa de splicing dentro del procesamiento ya que
nos van quedando fragmento separados y no siempre
esos fragmentos van a saber asociarse correctamente.
A veces el RNA molde se sintetiza junto con el mRNA.

Hemos visto que existen una serie de reguladores, pero los ejemplos más clásicos
están a nivel regulación de la transcripción en procariontes (bacterias) y muchas de
ellas son inducidas o reprimidas por algún factor que pueda venir por ejemplo en la
piel.

Vamos a hablar del operon LAC que codifica tres proteínas inducidas, es
reprimido por la unión de la proteína represora de LAC y esto se termina con la
presencia de lactosa. Ahora, una mutación en el promotor va a afectar solo la
expresión de los genes de la misma proteína, altero solamente genes lo que se traduce
en un aumento o disminución de la expresion. Si yo modifico la secuencia del operon
voy a producir una disminución de la unión del represor, entonces si no hay represor
esto va a estar constantemente expresándose. Entonces esta regulación viene dada
por proteínas que vienen en la dieta.

Si yo hago una mutación en la frecuencia del DNA Se me va a afectar la unión de la

ARN polimerasa y esto puede disminuir o incrementar la transcripción; son represores
o activadores, afectan la expresión de los genes. Los activadores, los represores actúan
en TRANS, esto es afectar la expresión de los genes sin importar donde están
localizados). Tenemos genes estructurales, genes reguladores, el operon, el operador,
el promotor.

5 características que necesitamos para esto:

-El DNA - tenemos sitios de unión al

activador

- sitios de unión de represor - tenemos frecuencias reguladoras

-el promotor y los distintos genes.

Se acuerdan ustedes que las bacterias en la transcripción están acopladas y se

expresan varios genes de una sola vez, por tanto tenemos como resultado varias
proteínas.

¿Cómo actúan?

Si yo tengo una señal y la tengo en el medio, al unirse la proteína señal al operador,

esto me lo va a liberar. Segundo, si yo tengo mi molécula señal en la uno a mi
molécula activadora esta puede activar.
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Se fijan que la misma molécula señal puede tener 2 acciones: activación o inhibición y
esto va a depender del operon de del cual se trate.

Una molécula señal va a producir una disociación en el DNA y en otros va a producir

que se quede y va a producir activación. El desarme de la molécula señal no va a
producir necesariamente una transcripción. La molécula señal y el represor, la
combinación de estos dos da el incentivo, en otros casos, si esta se mantiene y queda
unida acá que también puede ser señal de inhibición. Dependiendo del operon es la
forma en que va a actuar.

Aquí les voy a mostrar por ejemplo que son más clásicos
de forma de activación y desactivación. :

- Tenemos DNA que va a presentar un represor,

este represor va a ir a unirse al DNA y que tenemos
que está haciendo un control negativo, sin
embargo si yo coloco un inductor que se una al
represor este es capaz de liberarlo entonces va a
ser inducido

- Si yo tengo un DNA que coloca un activador

inactivo a activo, basta con que venga un inductor
a este activador inactivo lo transforma a activo y
este se une DNA y facilita la expresión.

- Tenemos un represor en estado de inactivo, pero

junto con la presencia de un co-represo, se unen,
y me inhiben la transcripción.

- Tenemos un activador activo que puede estar ligado al DNA pero basta con
que yo coloque un co represor para q se pierda la actividad.

El operon LAC, es un operon inducido, un represor activo que se va a unir al DNA que
impide que la RNA polimerasa actué por lo tanto no se va a producir RNA. Sin embargo,
basta con que yo agregue aquí una lactosa para que este represor se libere y quede
como represor inactivo y me produsca entonces todas las proteínas como la b-
galactosidasa, la pearmease y la transacetilasa.

Para que se produzca este control, en el mismo gen tenemos la síntesis de la proteína
represora y va a ir a a inhibir la expresión de los genes estructurales, pero si yo hubiese
colocado lactosa en el medio, el represor se sale y el gen se va a expresar

¿Qué sucede si tenemos glucosa presente en el medio? No hay transcripción, pero si

tengo lactosa además, se me va a reprimir al represor y se va a producir la inducción. Si
solo lactosa, se transcribe mucho más.

En este tenemos regiones de consenso en el -10 y -35, el operon y sitio CAP para unión
a cAMP. .
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El operon triptófano: También tenemos síntesis de represor inactivo y por lo tanto

no se une al DNA y la polimerasa está constantemente trabajando. Sin embargo si yo
coloco triptófano en el medio este se podrá unir al DNA y este es un co-represor. Este
es un represor activo. Este gen necesita de triptófano para arreglar la actividad y que
no se inactive. Debe estar rio a bajo. En el caso de la etcherichia coli tenemos cinco
genes que van a estar codificando, la velocidad de generar DNA será mucho mayor
cuando esto este activo por lo tanto el efecto de estos represores es bastante grande.
La vida media del RNA es de tres minutos, lo que es mucho.

Otro operon que tenemos es ARA: De la arabinosa. Siendo uno de los más
complejos que existe porque además es una proteína que actúa como positivo y
negativo simultáneamente. Tenemos el represor, la arabinosa, producido por Arac c, se
produce represor por presencia de arabinosa que produce un cambio conformacional al
DNA que permite la unión. Arac c tiene una autorregulación de la síntesis.

Cuando arac C es deficiente su gen se transcribe desde su propio promotor, regula su

propia síntesis uniéndose al gen ar1 y lo reprime. También regula los genes más arriba
y de lo rio abajo, lo que se produce así:

-Niveles alto de glucosa, niveles bajos de laminosa, aquí esta arac1 y arac2. En
cuanto a los niveles de arabinosa son baja y glucosa alta la proteína arac unida a ara,
forman dímero que aceptan los sitios de transcripción para definir una represión de
arac a. El hecho que se doble permite la interacción de estas dos zonas impidiendo la
transcripción del gen.

Cuando los niveles de glucosa están bajos y arabinosa alto no se produce la horquilla
por lo tanto no hay represión.

Entonces este ara es capaz de regularse a si mismo positivo y negativamente

y también la expresión de genes que constituyen su operon.

Existen operones alejados de los sitios de transcripción, que son capaces de activar el
sistemas a través de fosforilaciones que forman un loop.

La RNA polimerasa ya replico el DNA, entonces empieza la transcripción con más de un

cromosoma asociado a un mensajero. Se va a empezar a producir entonces la proteína,
cuya principal característica es su estructura primaria, secundaria y terciaria.

Recuerdo:

Splicing: Ovoalbúmina, 7 intrones a-b-c-d-e-f-g y si se los sacamos nos va a quedar un

RNA maduro. Quedando un RNA maduro con 1700 nucleotido con su poli A y su CAP.

Ahora si tenemos 35.000 genes, ¿Por qué no tenemos 35.000 proteinas?, es porque el
sistema es redundante. Tenemos 5000 proteinas. La mayor parte de estas proteínas
son necesarias para cualquier tipo celular y se expresan de forma constitutiva.

Nosotros tenemos toda la maquinaria para fabricar todo esto en todas nuestras células,
pero en los tejidos específicos solo se expresaran aquellas proteínas que sean
necesarias para el tejido (existen los mismos genes). En el hígado se va a sintetizar la
apolipoproteína B100 en el intestino la apolipoproteina B6.
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VIH:

Tiene una replicación intensa, 10 9, produce la perdida de los linfocitos TD4, produce
una profunda inmunodeficiencia. Lo mas característico de este virus es la transcriptasa
reversa, tiene unapolimerasa DNA dependiente de RNA. Infecta a los linfocitos TD4 y a
los macrófagos, esto hace demasiado rápida su replicación, que la infección se hace
masiva en poco tiempo.. Tiene un RNA único que posee una nucleocapsula, recubierta
capa lipidica.

La idea actual es poder trabajar con inhibidores que sean capaces de bloquear la
actividad de estos tres tipos de proteína, que vayan en contra de la envoltura y de las
polimerazas etc.

La función de la lipoproteina gal pol, es de desdoblar una integrasa, se pretende atacar

esta enzima para q no pueda alcanzar el estado maduro.

Este virus va a asociarse a los receptores de TD4 y va a permitir entonces ingresar,

entonces se rompe la nucleocapside, entra solamente material genómico y por una
transcripción reversa, se va a generar un hibrido de ADN y ARN y luego este cDNA
solito va a ser capaz de formar 2 hebras de DNA. Luego la enzima integrasa lo que
hace es meter la hebra al núcleo, donde forma parte del cromosoma y desde aquí
empieza a utilizar la maquinaria de la célula para replicarse. De esta forma a
ensamblarse, replicarse y madurar.

Entonces la etapas involucradas son: adherencia o fusión (etapa primordial que se

quiere frenar), la etapa de penetración y perdida de la cubierta, transcripción
reversa, transcripción. Para frenar estas etapas tenemos terapias involucradas con los
TD4, drogas para parar la transcripción reversa y algunas terapias que son utilizadas
para inhibir la transcripción.

Una de las “gracias” de este virus es la transcriptasa reversa, que utiliza el propio ADN
de la célula para poder replicarse