Génie Enzymatique

TD 3

Problème

La cinétique de croissance et de production d’une protéase acide par Aspergillus niger

est suivie sur milieu optimisé contenant : lactose, extrait de levure, peptone et sels, dans des
erlenmeyers de 250ml, à raison de 50ml par erlen, à pH 4.0, sous agitation 160 rpm, 25°C.
Deux prélèvements quotidiens sont réalisés sur une période de 7 jours permettant d’établir
l’évolution de la croissance mycélienne, du lactose, des protéines et de l’activité enzymatique
en fonction du temps.
Les résultats suivants sont obtenus :

Figure 1 : Évolution de la biomasse et de l’activité enzymatique (a), du taux de lactose et de

protéines (b) de la souche A. niger

 Interprétez les deux graphes

Après culture de la souche Aspergillus niger, le filtrat récupéré est séparé par différentes
technique dans le but de purifier l’enzyme, les techniques utilisées sont les suivantes:
1. Chromatographie d'exclusion moléculaire
2. Chromatographie échangeuse d'ions
3. Chromatographie d'affinité
4. Électrophorèse SDS-PAGE

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La première étape de purification de l’enzyme est une chromatographie d’exclusion
moléculaire. Le filtrat obtenu après fermentation est passé sur colonne contenant du Sephadex
G-25 M. La colonne est équilibrée et le mélange élué par du tampon acétate 50 mM, pH 3.8.
Les fractions de 2 ml sont récoltées au fur et à mesure que le pic d'exclusion moléculaire
apparaît sur l'enregistreur. Le profile d’élution suivant a été obtenu :

Figure 2 : Profil d’élution sur colonne d’exclusion Sephadex G-25 M du filtrat issu de la
culture de : Aspergillus niger

 Interprétez ce graphe.

Les fractions issues de la chromatographie d'exclusion moléculaire et qui présentaient une

activité enzymatique ont été chargées sur colonne contenant du DEAE qui a été préalablement
équilibrée par du Bis-tris 20 mM, pH 8.35. L'élution est réalisée par gradient de sel en
utilisant le même tampon contenant du NaCl de 0-0.5 M. À chaque gradient des fractions sont
récoltées et leur activité enzymatique déterminée.
Le profil d’élution sur colonne échangeuse d’ions DEAE-Sepharose est reporté sur la figure 3.

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 Figure 3: Profil d’élution sur colonne échangeuse d’ions DEAE-Sepharose de la fraction
active d’Aspergillus niger.

 Interprétez ce graphe.

L’enzyme a été purifiée en trois étapes en partant d’un extrait brut contenant au total
188583,09 unités de cette enzyme.
 Complétez le tableau ci-dessous :

Souche Étapes de Protéines Activité totale Activité Facteur de Rendement

purification totales (µg) spécifique purification
(U.) (U/µg)

A. niger Extrait brut 14675,19 188583,09

Exclusion 5661,15 167088,24

moléculaire

Échangeuse 4500,45 151677,21

d’ions

Affinité 3879,22 143846,5

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