Quel est le rôle principal de l’O2 dans le métabolisme bactérien? I. Rappel sur le transfert de matière par diffusion
I .1 Flux de matière aux interfaces (LOI DE FICK)
fluide membrane fluide
dX C1
C1i
C2 C2i
La loi de Fick décrit la diffusion de la matière dans un milieu binaire, Reliant le flux de matière au gradient de concentration dN dC J’’= = -Da dt dX
J" = exprime la vitesse de transfert de la matière (moles de soluté/h)
dN = nombre de molécules transférées pendant l'intervalle de temps dt (h) ou (s) D = coefficient de diffusion (en m2/h) ou (cm2/s) Par convention il est toujours négatif dans l'équation de Fick car le sens du flux va vers les faibles concentrations. a = aire inter faciale (en m2) ou (cm2) dC = variation de la concentration du soluté (en moles /m3) ou (en moles /cm3) au cours de son chemin dx (en m ou cm) au travers de la membrane On pose KL = - D/X vitesse de transfert par unité de surface (en m/h ou cm/s) L'équation prend la forme : = 1.2 Flux de matière entre deux phases (GAZEUSE ET LIQUIDE)
fluide Liquide PG C*
CL P* COTE GAZ J" = KG a ( PG - P*) écart de pression (mmoles soluté/m3/h) KG a = coefficient global de transfert volumique par rapport au film gazeux (m /h) a = surface spécifique d'échange (m2) PG = pression partielle du soluté dans la phase gazeuse (atm) P* = pression partielle en (atm) en équilibre CL à l'interface COTE LIQUIDE J" = KLa ( C* - CL) écart de concentration a = surface spécifique d'échange KL a = coefficient global de transfert volumique par rapport au film liquide (m3/h) C* = concentration du soluté dissous en équilibre avec la pression partielle PG dans la phase gazeuse (loi de Henry) (mmoles/m3) CL = concentration du soluté dans le liquide à proximité de la bulle de gaz A L'EQUILIBRE L'EQUATION DE TRANSFERT EST :
dCL/dt = KLa ( C* -CL)
(Exprime la vitesse de transfert du soluté (moles du soluté / h) ou en (mmoles / h)
Il Rappel transfert de matière entre deux phases (LOI DE HENRY)
À température constante et à l'équilibre, la quantité de gaz dissout dans un liquide est
proportionnelle à la pression partielle qu'exerce ce gaz sur le liquide.
Gaz A
A Liquide
PA = YA . PT PA = Pression partielle de A dans le gaz YA = fraction molaire dans la phase gazeuse PT = Pression totale Pression partielle
La pression partielle d'un gaz parfait i dans un mélange de gaz parfaits de pression totale p tot est définie comme la pression pi qui serait exercée par les molécules du gaz i si ce gaz occupait seul tout le volume offert au mélange, à la température de celui-ci. Elle correspond donc à la contribution de ce gaz i à la pression totale du mélange. La pression partielle d'un gaz est une mesure de l'activité thermodynamique des molécules de ce gaz. Les gaz se dissolvent, diffusent et réagissent selon leur pression partielle et non pas selon leur concentrations dans le mélange de gaz ou dans le liquide où ils sont dissout. III Application a l'aération des fermenteurs
III.1 Le rôle de l'oxygène en fermentation
Les micro-organismes ne métabolisent l'oxygène que sous sa forme dissoute
La solubilité de l'oxygène est très faible en milieu aqueux (7mg dans l'eau à 25 °C) alors que la demande des micro-organismes peut être de 3,5 g/l/h
BESOINS MAXIMA ET CONCENTRATION CRITIQUE D'OXYGENE
(Exprimée en milli moles /litre de milieu et par heure)
Conclusion Ce qui nécessite un renouvellement permanent de la phase gazeuse (air) dans le milieu liquide du fermenteur. III.2 Technologie de l'aération
Industriellement on distingue plusieurs technologies de l'aération
- Fermentation à agitation et aération
-Fermentation à air lift Fermentation à venturi III.3 Transfert de l'oxygene dans les milieux de culture
L'oxygène étant très peu soluble dans l'eau (loi de Henry), l'étape limitante du transfert de l'oxygène depuis la bulle de gaz vers la cellule microbienne est celle du transfert de l'oxygène de l'interface air -liquide (étape 2) Ce transfert s'effectue au travers de plusieurs films, chacun d'eux exerçant sur lui une certaine résistance.
Etape 1= interface gaz-liquide, côté bulle, est doublé film gazeux
Etape 2= côté liquide, d'un film liquide, ce dernier exerce une grande influence sur le transfert Etape 3= oxygène dissous diffuse vers les cellules Etape 4= au contact des cellules se trouve un nouveau film liquide Etape 5= l'O2 doit pénétrer dans la cellule
On peut figurer alors ce qui se passe dans la cellule :
- Diffusion vers le site d'utilisation : les enzymes respiratoires dans les mitochondries => diffusion à travers le cytoplasme et la paroi. III.4 Paramètres de la respiration microbienne
vitesse de respiration
r O2 = est la vitesse de respiration ou de consommation d'O2 (vitesse volumique)
ou demande en O2 en g par litre de milieu et par heure ou en ml O2 par litre ou en mmoles O2 par litre
Vitesse spécifique de respiration
et QO2 = r O2 / X (vitesse spécifique de respiration en g O2 / g de cellule sèche / heure) X = (concentration cellulaire en g/1) III. 5 Influence de l'oxygène dissous sur la respiration
La courbe suivante montre qu'il existe une concentration en O2 critique au-delà de laquelle la vitesse spécifique de respiration est indépendante de (O2)
En considérant l'O2 comme un aliment (substrat) soumis à la loi de la cinétique de croissance, ce
phénomène suit le modèle de Monod. Rappel sur la loi de monod
L'équation de Monod décrit le taux de croissance μ comme une fonction de la concentration
en substrat S de la façon suivante
où : μ est le taux de croissance spécifique; μmax est le taux de croissance maximale des micro-organismes; S est la concentration du substrat limitant la croissance; Ks est la constante de demi-vitesse c'est-à-dire la valeur de S quand μ/μmax vaut 0,5. Les coefficients μmax et Ks sont empiriques. Ils diffèrent selon les espèces et sont basés sur les conditions de milieu. d'où µ = Qx = µ max (O2/(KO2+O2))
Le rendement de croissance microbienne par rapport
à l'aliment oxygène étant :
r x = YFx/O2.r O2 et X = (r x / µ)
A partir du rendement on exprime QO2 en fonction O2 dissous
III.6 Flux de transfert de l'oxygène A- LA LOI DE FICK DONNE : en absence de cellule :
- Flux de transfert d'oxygène (mole/h. m2) :
J"O2= r O2=KL(O2* - O2L) mole/ h. m2
- Vitesse de transfert d'oxygène (oxygen transfert rate, OTR) par unité de
volume de milieu
OTR = r O2= KLa (O2* - O2L) mole/ h. m2 ou mol/ h. m3
a = aire inter faciale de transfert (m2 / m3)
O2* = la concentration en oxygène du milieu saturé en air O2L = la concentration en oxygène au temps t dans la phase liquide KL a = coefficient de transfert volumique caractérise la capacité de transfert d'oxygène de l'installation d'aération et donc c’est la capacité que on a à oxygéner un milieu de culture en biréacteur dans des conditions données. L'équation peut s'écrire aussi:
KLa O2* = coefficient de transfert maximal
O2L/O2* : pression d'oxygène dissout dans le milieu, PO2
En présence de cellules :
L'équation globale en présence de cellules microbiennes tient compte de la vitesse de
consommation d'O2 : B- LA LOI DE HENRY DONNE :
PO2= H . C* => C* = O2* (mole/m3)
C* = concentration en oxygène dissous en équilibre avec la pression partielle dans la phase
gazeuse III.7 Mesures des différents paramètres d 'aération
1) Mesure de la solubilité de l'oxygène dans un milieu (méthode de Cooper)
Le principe est basé sur l'oxydation du sulfite de sodium (Na2SO3)
Dosage en retour par un excès d'iode
Globalement, la quantité de thiosulfate est proportionnelle à la quantité d'oxygène présent
2) mesure du coefficient de transfert KLa d’un fermenteur
La mesure du KL.a d’un bioréacteur permet d’évaluer ses capacités à transférer l’O2. Les sondes à oxygène permettent d’enregistrer en continu, la concentration en O2 dissous.
En utilisant la méthode de Cooper, il est possible de mesurer l'évolution de la concentration
en oxygène dans le fermenteur. Le fermenteur est désaéré par injection d'azote ou du sulfite de sodium
On obtient : Mesurer kLa offre des avantages importants: - assurance que la croissance biologique n'est pas entravée par une concentration insuffisante en oxygène - meilleure capacité à ajuster avec précision la concentration en oxygène pour un traitement optimal - prévention du gaspillage d'énergie et des coûts associés à des concentrations d'oxygène inutilement élevées
C* En absence de culture
La courbe Log ((C* - CL)/C*) = f (t) donne une droite de pente KLa
La même technique peut être utilisée avec une sonde PO2 : dans ce cas comme précédemment :
log (1 – PO2) = KLa t
La courbe log (1 - PO2) = f (t) donne une droite de pente KLa
En présence de culture
on suppose que la croissance microbienne est nulle pendant la durée (brève) de la
manipulation. Les états initiaux et finaux sur le graphique correspondent à un état dynamique stationnaire du bioréacteur pour lequel [O2]milieu culture ≈ constante = O2Leq. on peux écrire : O2leq - O2L Log = - KL a t O2leq - O20
Avec O20 = concentration en dioxygène dissous à l'instant t=0 en début de la phase de
reprise d'aération. Ici O20 ≠ 0% car sinon il y aurait mort cellulaire. 3- mesure du coefficient KLa C* d’un couple fermenteur A- milieu hors fermentation
- Saturation du milieu en oxygène,
- Ajout de sulfite de sodium ( et ions Cu++ ou Co ++) en excès - A l'aide d'une sonde PO2, on a le profil suivant :
Pendant un temps T la PO2 reste nulle =
transfert de l'O2 nécessaire pour réagir avec l'excès de sulfite de sodium :
126 (g) Na2SO3 16 (g) O2
Na2SO3 KLa C* T KLa C* = (Na2SO3/126) × (16/T) B- milieu en fermentation
En fermentation, quand sont mesurés à la fois l'OUR et PO2, on obtient :
Le processus de fermentation est assez lent on peut écrire :
Exercice 01
1- Quel est le rôle principal de l’O2 dans le métabolisme bactérien ?
2- Le document suivant décrit l’évolution de la consommation en O2 dans un
réacteur pendant la croissance (les valeurs précisées en ordonnée sont celles correspondant à ln X avec X en g/L) - Repérer les différentes phases de croissance - Préciser comment évolue la consommation en O2 et la demande en O2 pendant les différentes phases de la croissance - Quel est l’intérêt de déterminer la demande en O2 ?
Exercice 02 (utiliser Excel)
Avec un fermenteur de laboratoire contenant 1L de milieu de culture LB à 35°C. La vitesse de
rotation de la turbine rushton est de 200 rpm, le débit d'aération est de 1 VVM (60 L/h, 0,3 bar). Le temps de réponse de la sonde ampérométrique à dioxygène utilisée a été mesuré : pour un passage de 0 à 100%, on obtient 98 % en moins de 20 s. On verra ainsi par la suite que ce temps est suffisamment faible pour valider les mesures pendant la phase de reprise d'aération.Voici les résultats obtenus : Exercice 03 (utiliser Excel)
Un fermenteur de laboratoire contenant 1L de milieu de culture LB à 37°C est ensemencé
avec une souche E. Coli de 18 heures sur milieu LB. La vitesse de rotation de la turbine rushton est de 200 rpm, le débit d'aération est de 1 VVM (60 L/h, 0,3 bar). Les mesures ont été conduites environ 40 minutes après l'inoculation. Le temps de réponse de la sonde ampérométrique à dioxygène utilisée a été mesuré : pour un passage de 0 à 100%, on obtient 98 % en moins de 20 s. On verra ainsi par la suite que ce temps est suffisamment faible pour valider les mesures pendant la phase de reprise d'aération.Voici les résultats obtenus : Déterminer le Kla et r O2 dans les conditions ci-dessus
