Universidad de Valparaíso

Laboratorio de Virología
Departamento de Química y Bioquímica
Facultad de Ciencias

Profesora coordinadora: Yoanna Eissler Parada

Profesores colaboradores: Marcela Ruiz
Bioquímica Aplicada, Tecnología Médica, TMD - 323

LABORATORIO Nº3

INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROFOTOMETRÍA

1.- Antecedentes generales

La región visible (400 nm a 700 nm) y las adyacentes no visibles
(UV e IR) del ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO, tienen amplio uso en
química analítica y bioquímica para identificar o determinar la
concentración de numerosas sustancias en solución. Estas aplicaciones
se basan en que las sustancias coloreadas absorben en regiones del
espectro visible pero dejan pasar las longitudes de onda que
corresponden al color de la solución. Así, una solución es azul porque
transmite este color y absorbe en cambio, las longitudes de onda
diferentes al azul. A mayor intensidad de color azul, mayor será el grado
de absorción a longitudes de onda diferentes a las de ese color. Esta
relación CONCENTRACIÓN DE ABSORBENTE-ABSORCIÓN DE LUZ,
permite utilizar la intensidad de la absorción a determinada longitud de
onda, como una medida directa de la concentración de la sustancia en
solución. Para obtener máximo beneficio de esta relación, es de
fundamental importancia conocer las características espectrales (EL
ESPECTRO DE ABSORCIÓN) de la sustancia a investigar. Ello permite
seleccionar la región de máxima absorción del espectro, la que por ser
más sensible a los cambios de concentración, es la más conveniente de
utilizar para medir intensidades de absorción. NUNCA DEBE USARSE LA
LONGITUD DE ONDA, O BANDA DEL ESPECTRO, QUE CORRESPONDE AL
COLOR DE LA SOLUCIÓN; YA QUE ES LA QUE PRESENTA MÁXIMA
TRANSMISIÓN Y MÍNIMA ABSORCIÓN. La intensidad de absorción de la
longitud de onda seleccionada se mide con instrumentos tales como el
FOTOCOLORÍMETRO, y el ESPECTROFOTÓMETRO.

2.- Ley de Lambert y Beer

El ESPECTRO DE ABSORCIÓN, obtenido por medidas
espectrofotométricas cuantitativas, es característico de cada sustancia.
El espectro se expresa, asignando a la abscisa (horizontal) de un sistema
de coordenadas, la LONGITUD DE ONDA y a la ordenada (vertical) la
TRANSMISIÓN expresada en porcentaje de transmitancia o unidades de
ABSORBANCIA. La forma de la curva (es decir, la posición de los
máximos y mínimos) sirve para identificar los tipos de sustancias; en
tanto que las intensidades de absorción, sirven para determinar
cuantitativamente la concentración de ellas.
La TRANSMITANCIA (T) se define como el cuociente entre la
cantidad de la luz que emerge (I) de una cubeta transparente que
contiene una solución absorbente y la intensidad de la luz que incide (Io)
sobre la misma. Una porción de la luz que incide sobre la cubeta será
absorbida y otra porción es transmitida:

T = __I__
Io

1
 El valor de la transmitancia se expresa en porcentajes (30%, 45%,
80%, etc.). Siempre es menor que 100%, excepto cuando no hay
material absorbente en solución, en que se hace igual al 100%.
La ABSORBANCIA (A) denominada también Densidad Óptica (D.O.),
corresponde al logaritmo negativo de la transmitancia:
D.O. = A = - log T

Para evitar la dificultad que significa medir intensidades de luz que

penetran e intensidades de luz que emergen de una solución, en la
práctica sólo se miden las intensidades que emergen (I), tanto en la
cubeta que contiene la solución problema, como de otra cubeta, idéntica
a la primera, el BLANCO que contiene todos los componentes excepto el
compuesto químico a investigar.
La transmitancia depende de:
- La naturaleza del compuesto en solución,
- La longitud de onda de la luz utilizada, y
- La cantidad de material absorbente. Este factor depende a su vez, de
la concentración de la sustancia y del espesor de la solución a través de
la cual pasa la luz.
Las relaciones entre estos factores para una determinada longitud
de onda, están establecidos por la Ley de Lambert-Beer:

T = __I__ = e- k·b·c
Io

En donde T = Transmitancia
k = Constante característica del compuesto en solución o
coeficiente de extinción
b = Espesor de la solución a través de la cual pasa la luz o
longitud atravesada por la luz en el medio.
c = concentración del compuesto

Esta ecuación es exponencial debido a que si un haz de luz atraviesa el

medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente, a
medida que el espesor del medio absorbente aumenta y la
concentración del medio absorbente aumenta.
Al aplicar logaritmo a la ecuación se obtiene:

loge__I__ = loge T = - k x b x c
Io
2.303 log 10 __I__ = - k x b x c
Io
log 10 _ I __ = - __k__ x b x c
Io 2.303

log _ Io __ = __k__ x b x c
10 y se obtiene finalmente:
I 2.303
log _ Io __ = D.O. = as x b x c en donde
I

as= k / 2.303 y se le denomina Índice de Absorbancia o

Coeficiente de Extinción

log I o/I = - log I/Io = - log T = Densidad Óptica (D.O.) = Absorbancia

(A)

c = concentración de la solución, la cual si se expresa en moles/litro (M),

el coeficiente de extinción se convierte en coeficiente de extinción molar
(extinción molar). Si se expresa en gramos/litro, as será el coeficiente de
absorción específica (en ambos casos b se expresa en centímetros).

2
 En la práctica se mantiene constante el espesor de la cubeta
utilizada en las determinaciones, por lo que el valor b en la última
ecuación se convierte en constante. En tal caso, y dado que el producto
de dos constantes es siempre constante, la ley de Lambert-Beer se
reduce a: D.O.= as x c

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3.- Aplicaciones prácticas de la ley de Lambert-Beer: Curva de
Calibración

Como se mencionó anteriormente, Lambert y Beer demostraron que la

absorbancia ( A ), también llamada densidad óptica (D.O) de una
sustancia es directamente proporcional a la concentración ( C ) de la
sustancia absorbente, la longitud ( l ) ( espesor de la solución) y una
constante denominada coeficiente de extinción ( ε ), que es
característico para cada sustancia a una longitud de onda ( λ )
determinada.

A = ε ·l·C

3.1.- Curva de Calibrado:

Se obtiene la curva de calibrado midiendo la absorbancia de una

serie de soluciones de concentraciones conocidas de una misma
sustancia tratadas con un mismo método y medidas en el mismo
instrumento.

El resultado se expresa en una gráfica de la absorbancia ( A ) en

función de la concentración (C). Se obtiene una línea recta que pasa por
el origen; de la pendiente se puede obtener él ε , coeficiente de
extinción si el sistema sigue la Ley de Lambert-Beer.

Se determina la concentración de una muestra desconocida (Cx)

midiendo la absorbancia de la muestra (Ax) e interpolando en la curva
de calibrado.

La concentración se puede obtener, a partir de la ecuación de la

recta de calibrado:

Y=m• x +b

Donde : Y = Absorbancia
m = pendiente = ε • l
x = concentración
b = intercepto

3.2.- Factor de Calibración:

Si llamamos factor de calibración (K) a la pendiente de la curva de

calibración, la concentración de una solución estaría dada por:

A A
A =K•C C = =
K ε • l

Donde: K es el producto del coeficiente de extinción y la longitud del

paso de luz.

Conociendo el valor del factor de calibración (K) para determinada

sustancia, se puede calcular cualquier concentración desconocida de la
misma sustancia, tratada con el mismo procedimiento, sólo
determinando su absorbancia.

4
 De la misma forma, si se conoce el coeficiente de extinción de una
sustancia y la longitud del paso de luz se pueden calcular las
concentraciones.
Esta ley se cumple rigurosamente cuando se usa una radiación
monocromática.

A = ε · l· C

Cuando la concentración de la sustancia y la longitud del paso de

la luz se hacen iguales a la unidad, la absorbancia se hace igual al
coeficiente de extinción. Las unidades del coeficiente de extinción
dependen de la unidad de concentración y la de longitud.

C = moles/lt ó gr/100ml
l = cm

Si se mide la absorbancia de una solución 1M de una sustancia

colocada en una celda de 1 cm se obtiene el coeficiente de extinción
molar ( ε ). Cuando ( C )se expresa en gr/100 ml se obtiene el
coeficiente de extinción específico ( E).

Estos coeficientes son una propiedad específica de las partículas

absorbentes y su valor es referido a un determinado solvente y a una
determinada longitud de onda.

Para medir la ( C ) de una sustancia se elige en general, la región

de máxima absorción del espectro, denominada longitud de onda
analítica.

3.3 ANALISIS FOTOCOLORIMETRICO:

Todo método colorimétrico se basa en la comparación de la

absorbancia de una sustancia de concentración desconocida con la de
una solución de la misma sustancia cuya concentración se conoce y a la
cual se denomina solución Patrón o Estándar.

La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia

del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros
componentes del sistema que absorben a esa longitud de onda que se
denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las otras
sustancias (solvente, reactivos, etc. ) por lo tanto, es necesario hacer
siempre una muestra que contenga todas las sustancias de la reacción
menos aquella que se desea medir. Esta muestra se llama Blanco y la
absorbancia de ésta debe restarse a las muestras y a los patrones, o
bien, se calibra el instrumento con el blanco a A = 0, o sea 100% de
transmisión.

La ecuación que relaciona porcentaje de transmitancia con la

absorbancia es :

A = 2 - log % T

3.3.1.- Fórmula del Estándar :

La concentración desconocida puede determinarse en base a un

solo estándar, de acuerdo a la siguiente ecuación :

Vi Vi
As • Cmp • = Amp • Cs •

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 Vf mp Vf s

As y Cs son la absorbancia y concentración del estándar,

respectivamente.

Amp y Cmp son la absorbancia y concentración (desconocida) de la

muestra problema.

Vi y Vf son el volumen inicial y final respectivamente.

Cs y Cmp corresponden a las concentraciones iniciales de las

alícuotas sin dilución, que multiplicadas por el factor ( Vi/Vf)
correspondiente da la concentración final en el ensayo.

3.4.- Unidades :

Absorbancia (A) : Adimensional (sin unidades)

Coeficiente de
Extinción - Molar : ε ( M-1 cm-1) ( lt moles-1 cm-1) ó ( ml
milimoles-1 cm-1 )
-Milimolar: ε ( mM -1
cm-1 ) , ( lt mmoles-1 cm-1 ) ,
( ml moles-1 cm-1 )
-Específico: E ( dl grs-1 cm-1 ), ((grs/100ml)-1· cm-1)

Concentración ( C ) : Molar, milimolar, grs/100 ml, etc. De la

concentración depende
las unidades del coeficiente de extinción.

4.- Instrumentos de medida

Para constatar o medir la absorción de la energía radiante del
ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO se utilizan instrumentos tales como: el
ESPECTROSCOPIO, el FOTOCOLORÍMETRO y el ESPECTROFOTÓMETRO.

El ESPECTROSCOPIO: en este instrumento, la luz blanca es

dispersada en su espectro a su paso por un prisma. Al ubicar una
solución coloreada (oxihemoglobina, por ejemplo) en la trayectoria de
este haz espectral, puede constatarse que las longitudes de onda
absorbidas que son características para esa sustancia aparecen como
líneas o bandas negras en el espectro visible transmitido (la
oxihemoglobina da dos bandas negras en la región verde del espectro).

El FOTOCOLORÍMETRO: permite medir intensidades de absorción

en la región visible del espectro electromagnético. Este instrumento
utiliza FILTROS COLOREADOS; sin embargo, no proporcionan una sola
longitud de onda determinada, por lo que la luz que incide en la solución
absorbente no es monocromática, estos filtros permiten transmitir
longitudes de onda de un rango que varía entre 30nm a 70nm. Cada
filtro tiene un número que indica el centro de las longitudes de onda que
selecciona; así por ejemplo, filtro Nº 54, significa que tiene un máximo
de transmisión para longitudes de onda de 540nm (el rango de
transmisión en este caso es de 500nm a 570nm y permite medir color
rojo, púrpura y anaranjado).

Filtro Nº Color del filtro Rango transmitido Para

medir color
42 Azul 400-465 Rojo, anaranjado, amarillo

6
54 Verde 500-570 Rojo, púrpura,
anaranjado
66 Rojo 640-700 Azul, verde

El ESPECTROFOTÓMETRO: permite medir intensidades de

absorción a longitudes de onda del espectro visible o del ultravioleta
(UV). En forma simplificada, este instrumento trabaja como sigue: la luz
blanca es dispersada en su espectro por un prisma. Angostas bandas de
este espectro – altamente monocromáticas – se aislan mediante una
ranura para permitir su paso, una a una, a través de la solución
problema. La intensidad de la luz transmitida por la solución se mide por
medio de células fotoeléctricas (en porcentaje de transmitancia o D.O.).
Las partes principales de un espectrofotómetro son: la fuente de
radiación electromagnética, el monocromador (permite obtener luz
monocromática), el compartimento de la celda, el detector fotoeléctrico
y un aditamento para captar la señal del detector (medidor eléctrico,
potenciómetro o potenciómetro registrador) ver figura 1, extraída de
Lehninger 2008.

5.- CUANTIFICACION DE PROTEINAS DE SOLUCION:

En general, no hay método completamente satisfactorio para

medir la concentración de proteínas en una muestra. La elección del
método depende de la naturaleza de la proteína, de los otros
componentes, de la rapidez y sensibilidad deseada. En este trabajo
práctico veremos dos de los métodos que se usan corrientemente para
medir concentraciones de proteínas: Biuret y Lowry.

METODO BIURET

Los componentes que tienen dos o más uniones peptídicas (por

ejemplo: péptidos y proteínas) dan color púrpura característico cuando
se tratan con solución de sulfato de cobre diluida. El color se debe
aparentemente al complejo de coordinación de Cu con cuatro átomos de
N, ubicados a una determinada distancia. Este método es reproducible
para una proteína, pero requiere grandes concentraciones de proteínas
para la formación de color. La sensibilidad del método es de 0,25 – 200
mg de proteínas por ml de solución.

REACTIVOS:

1.- Reactivo de Biuret:

- 6 grs de tartrato de Na y K disueltos en 500 ml de H2O.

- 1,5 grs. de sulfato de cobre.
- Agregar agitando 300 ml de NaOH al 10%, completar a 1
L con H2O.

2.- Solución estándar de seroalbúmina (BSA = bovine serum albumin)

Concentración patrón = 1 mg/mL

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PROCEDIMIENTO:

Prepare una batería de tubos enumerados de acuerdo a la

siguiente tabla:

TUBO SEROALBUMINA H2O R. BIURET

(1 mg/ml) (ml) (ml)
Blanco 0,0 1,0 4,0
1 1,0 0,0 4,0
2 0,8 0,2 4,0
3 0,6 0,4 4,0
4 0,4 0,6 4,0
5 0,2 0,8 4,0
6 1,0 MP1 0,0 4,0
7 1,0 MP2 0,0 4,0

Después de agregado el reactivo Biuret, agitar y esperan 20

minutos a temperatura ambiente para que se realice la reacción. Leer
absorbancia a 540 nm.

METODO DE LOWRY :

Algunos aminoácidos sufren reacciones características con ciertos

reactivos debido a la naturaleza de sus cadenas laterales. Muchas
reacciones de este tipo se caracterizan por la formación de productos
coloreados. La tirosina por ejemplo, debido a su grupo hidroxifenilo,
reacciona con una solución de ácido fosfomolíbdico tungstico en un
medio cúprico alcalino, produciendo una coloración azul.

Esta reacción (llamada originalmente Folín – Ciocalteau debido a sus

estudios iniciales) ha sido desarrollada por Lowry y colaboradores,
transformándola en un procedimiento muy sensible ampliamente usado
para la determinación cuantitativa de proteínas en una muestra.

En el método de Lowry la muestra se trata con el reactivo de Folin –

Ciocalteau modificado. Si hay proteínas presentes se produce una
coloración azul debido a la presencia de residuos de tirosina en las
proteínas.

Se mide la absorbancia a 650 nm y se compara con las medidas

obtenidas de soluciones de proteínas de concentración conocida
(patrón), tratadas de forma idéntica.

Sin embargo, debido a las diferencias en el contenido de tirosina de una

proteína a otra, cantidades iguales de proteínas distintas, producen
coloración diferente con el reactivo de Lowry, motivo por el cual no es
posible obtener la concentración real de una muestra de proteína por
este método, aún así, cuando se requiere una estimación relativa de la
concentración de proteínas, este método es ampliamente satisfactorio,
debido a su alta sensibilidad.

REACTIVOS:
- R.C.A. (reactivo de cobre alcalino).
Na2CO3 10% - Tartrato de Na y K 0,1% - CuSO 4 0,05% -
NaOH 0,5 N
Mezclar el carbonato con el tartrato. Agregar lentamente
y con agitación la solución de cobre.

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 Finalmente incorporar el NaOH. Las concentraciones
indicadas son
las finales.

- R.F. ( reactivo Folín).

0,25 ml reactivo Folín Ciocalteau + 4,25ml de H2O
destilada (o múltiplos).

Sensibilidad : 1 – 200 µ g de proteínas por ensayo.

PROCEDIMIENTO:

TUBO BSA H2O R.C.A. R.F.

(0,4mg/ml) (ml) (ml) (ml)
Blanco ---- 1,0 1,0 4,0
1 0,1 0,9 1,0 4,0
2 0.2 0,8 1,0 4,0
3 0,3 0,7 1,0 4,0
4 0,4 0,6 1,0 4,0
5 0,5 0,5 1,0 4,0
6 0,5 MP1 0,5 1,0 4,0
7 0,5 MP2 0,5 1,0 4,0
Mezcle los volúmenes indicados en la tabla anterior con el siguiente
orden :

1.- proteínas (BSA ó MP)

2.- Agua
3.- R.C.A. Mezcle bien
4.- Espere 10 minutos exactos.
5.- Agregue R.F. y mezcle.
6.- Caliente 5 min. Exactos a 55ºC.
7.- Enfríe y lea a 650 nm.

6. Ensayo Espectrofotométrico

Muchas proteínas exhiben una gran absorbancia en la región

ultravioleta del espectro, a 280nm. Esto se debe a la presencia de
cadenas laterales de Tyr y Trp de las proteínas. Sin embargo, la cantidad
de estos aminoácidos varía en las diferentes proteínas. Si se toman
algunas precauciones el valor de la absorbancia a 280nm de una
solución de proteínas puede ser proporcional a su concentración. El
procedimiento es sencillo y rápido. La solución de proteínas es
transferida a una cubeta o celda de cuarzo y se lee contra una
referencia que contenga sólo el solvente de la solución de proteína
(tampón, agua, etc.).
Los extractos celulares contienen, además de las proteínas, otros
compuestos que pueden absorber en la vecindad de 280nm, por ejemplo
los ácidos nucleicos son contaminantes comunes de los extractos
proteicos que absorben a 280nm, haciendo la salvedad que los ácidos
nucleicos presentan máxima absorción a 260nm. Warburg y Christian
desarrollaron un método para corregir la interferencia debida a los
ácidos nucleicos. Se prepararon soluciones puras de proteínas y
soluciones puras de ácidos nucleicos y se determinó experimentalmente
la razón A280/A260.
Luego calcularon un factor (F) para corregir la presencia de ácidos
nucleicos.

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 La tabla contiene los factores de corrección para diferentes
medidas de A280/A260. La siguiente ecuación se puede usar para
soluciones de proteínas que contengan hasta 20% de ácidos nucleicos.

Concentración de proteínas (mg/ml) = A280 (F)

Una ecuación modificada por Layne que da resultados similares es:

Concentración de proteínas (mg/ml) = 1.55 (A280) – 0.76 (A260).

En la misma tabla se puede estimar la cantidad de ácidos

nucleicos en la solución de proteínas. Aunque este ensayo
espectrofotométrico de proteínas es rápido, relativamente sensible y
requiere sólo de una pequeña cantidad de proteínas, se debe tener en
cuenta que sólo es una Estimación de la concentración de proteínas.
Tiene la ventaja sobre otros ensayos colorimétricos, en que la mayor
parte de los tampones y el sulfato de amonio no interfieren en la
medición. El ensayo espectrofotométrico a 280/260nm es especialmente
adecuado para una medición rápida de las soluciones de proteínas que
salen de las columnas cromatográficas, en que interesa principalmente
los cambios en la concentración de proteínas.

Tabla Protein estimation by UV absorption1

A280/260 % Nucleic Acid F

1.75 0.00 1.12
1.63 0.25 1.08
1.52 0.50 1.05
1.40 0.75 1.02
1.36 1.00 0.99
1.30 1.25 0.97
1.25 1.50 0.94
1.16 2.00 0.90
1.09 2.50 0.85
1.03 3.00 0.81
0.95 3.50 0.78
0.94 4.00 0.74
0.87 5.00 0.68
0.85 5.55 0.66
0.82 6.00 0.63
0.80 6.50 0.61
0.78 7.00 0.59
0.77 7.50 0.57
0.75 8.00 0.55
0.73 9.00 0.51
0.71 10.00 0.48
0.67 12.00 0.42
0.64 14.00 0.38
0.62 17.00 0.32
0.60 20.00 0.28
1
Adapted from E. Layne in Methods and Enzimology; S. P. Colowick
and N. O. Kaplan, Editors, Vol.III, p.447 (1957). Copyright 1957
Acadaemic Press.

7.- Bibiliografía
1. Rodney F. Boyer. Modern Experimental Biochemistry (1986).
Addison-Wesley Publishing Company, Inc. Don Mills, Ontario.
2. Irwin H. Segel. Biochemical Calculations (1976). John Wiley and
Sons, Inc. Toronto.

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 3. Conn/Stumpf. Outlines of Biochemistry. (1976). John Wiley and
Sons, Inc. Toronto.
4. Donal Voet and Judith Voet: “Biochemistry”. Ultima edición.
5. Roberto Bohinski: “ Bioquímica” , 5ª Edición, 1991.

8. Parte Experimental

1. Realice los dos ensayos propuestos Biouret y Lowry para

determinación de proteínas, como se muestra en las tablas que
indican el procedimiento de la preparación de la curva estándar y
las muestras.
2. Para los dos métodos, realice un espectro de absorción, dado
automáticamente por el equipo para la solución estándar de
Seroalbúmina (BSA) con la muestra mas concentrada. Determine
el número y longitud de onda de los máximos de absorción. Haga
un gráfico en el informe.
3. Haga una curva estándar o curva de calibración con el método de
Biouret y Lowry e interpolar los resultados para obtener las
concentraciones de las proteínas contenidas en las muestras
problema (MP). Esto implica graficar la absorbancia (D.O.) en
función de la concentración de Seroalbumina y calcular el
coeficiente de extinción (pendiente de la recta) para luego
interpolar los resultados de las muestras problema en la ecuación
de la recta obtenida.
4. Determine los parámetros (DO a 260 nm, a 280 nm, pureza, etc)
de la solución de sus muestras problema como se indica en el
punto 6 de la guía. Incluya estos datos en su Informe y
coméntelos.
5. Realice un informe con las indicaciones dadas anteriormente para
otros trabajos de laboratorio.

Nota: Los espectrofotómetros al medir en el espectro de luz visible usan

cubetas de vidrio o plástico especial, al momento de usar el instrumento
en el rango de luz ultravioleta se deben usar cubetas de cuarzo.

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