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MICRO-ORGANISMES

Bactéries
Levures- Moisissures
Champignons
Virus
Cellules animales
Cellules végétales
Cellules souches
Algues
M.Nonus 1
Disciplines
• Biologie
• Biochimie
• Microbiologie
• Génie métabolique
• Génie chimique
• Génie génétique
• Génie mécanique
• Génie informatique

M.Nonus 2
Métabolisme
• Catabolisme
– Biodégradation
– Énergie
– Croissance
– Maintenance
• Anabolisme
– Biosynthèses
– Croissance –Multiplication cellulaire
– Productions

M.Nonus 3
Composition cellulaire

• Biomasse Humide : 20% de MS


• Ex: Levure Boulangerie
– Matière organique: 90% /MS:
• C : 45%, N:8,5%,O:32,4%, H: 14,1%
– Minéraux : 10%/MS : P, K, S , Na, Mg, Ca…
– Composition cellulaire
• Protéines : 55% , RNA: 20,5%, Lipides : 9,1%
• Lipo-polysaccharides :3,4% , DNA: 3,1%
• Glycogène : 2,5% ,polysaccharides 2,5%

M.Nonus 4
Matières premières
• Sources Carbonées
– Amidon, sucres, hydrocarbures…
• Sources azotées
– Minérales
– Organiques
• Phosphore
• Soufre
• Oligo-éléments
• Facteurs de croissance

M.Nonus 5
Sources carbonées
• Sucres simples
– Glucose, saccharose, lactose ….
– Mélasses , cannes
• Polymères
– Amidons : blé , maïs, cellulose?
• Hydrocarbures
– Méthanol, fractions pétrolières

M.Nonus 6
Sources azotées
• Minérales
– NH3, NH4 OH, (NH4 )2 SO4, (NH4)2 HPO4 ,
– NH4 NO3 …
• Organiques
– Protéines
– Peptones
– Acides aminés
– Urée …

M.Nonus 7
Autres matières premières

• Phosphore: phosphates
• Soufre : sulfates
• Potassium : Kcl
• Magnésium : MgO, MgSO4
• Calcium: Ca CO3 , Ca Cl2, Ca SO4
• Oligo-éléments : sels métalliques etc…

M.Nonus 8
CULTURES-MISE EN OEUVRE
Cellules viables
Source d’énergie
Apports nutritionnels
Conditions de cultures
Paramètres physico-chimiques
Paramètres physiologiques
Cinétiques
Usine cellulaire
Génie métabolique
M.Nonus 9
CONSERVATION
• Souches
– Obtention :
• Collections (ATCC, NRRL, DSM…)
• Isolements ,Sélection , criblage, Mutagenèse
• Génie génétique
• Méthodes de conservation
– Repiquages
– Cryo-préservation (- 80°C, Azote liq …)
– Lyophilisation

Viabilité . Pureté Micro-biologique. Activités


M.Nonus 10
Réalisation des cultures
Micro-organismes
Conservation, pré-cultures , cultures , contrôles
Milieux
Formulation, Préparation , stérilisation
Matériels
Calibration, stérilisation
Management
suivi des paramètres et conduite

M.Nonus 11
M.Nonus 12
Agitateur

M.Nonus 13
M.Nonus 14
M.Nonus 15
M.Nonus 16
M.Nonus 17
M.Nonus 18
M.Nonus 19
M.Nonus 20
M.Nonus 21
M.Nonus 22
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M.Nonus 24
M.Nonus 25
M.Nonus 26
M.Nonus 27
M.Nonus 28
M.Nonus 29
DIVISION BACTERIENNE

M.Nonus 30
Croissance microbienne
• Augmentation du nombre
• Division par scissiparité
• Allongement des cellules
• ADN répliqué
• Dédoublement du chromosome
• Division de la paroi et membrane plasmique
• Formation d’un septum
• Séparation en deux cellules

M.Nonus 31
Croissance microbienne
• Convention internationale
– N = nombre de cellules N0: nb cell initiales
– Symboles pour les masses mises en jeu
– X = biomasse nombre de cellules ou MS
– S = Substrat
– P = Produit
– 0 = di-oxygène
– C = C02

M.Nonus 32
Croissance microbienne
• Temps de génération
– Temps que met une bactérie ou la population
dont elle est issue à se diviser.
– Très variables : minutes, heures, jours.
• L’augmentation du nombre de bactéries d’une
population qui double à chaque génération peut
s’exprimer sous forme de puissance de 2

2 m N0 cellules
m : nombre de doublements de la bactérie mère

M.Nonus 33
Croissance microbienne
III
X
N
IV
II

I
I

M.Nonus
t 34
M.Nonus 35
Croissance microbienne
• 4 phases principales
– Latence I
– Croissance exponentielle II
– Stationnaire III
– Décroissance (exponentielle ou non ) IV
• 3 phases transitoires
– Démarrage : début phase exponentielle
– Ralentissement: fin phase exponentielle
– Déclin : fin de phase stationnaire

M.Nonus 36
Croissance microbienne
• Phase de latence ou démarrage
– Ensemencement , adaptation au milieu et
conditions de l’environnement , premières
divisions , activité métabolique intense ( ADN,
ARN , enzymes….)
• Phase de croissance exponentielle ou log.
– Multiplication cellulaire maximale
– Temps de génération le plus court
– Taux de croissance maximal
– Activité métabolique maximale
– Limitation par le transfert d’O2 ( cult. aérobies)

M.Nonus 37
Croissance microbienne

• Phase exponentielle (suite )


– Fin :
• Limitation d’un substrat C, N , P, 02…
• Accumulation de produit (toxicité)
• pH , T ,
• Flore compétitive
• Inhibiteurs Conservateurs, antibiotiques

M.Nonus 38
Croissance microbienne
• Phase stationnaire
– Nb. de cell. Appa. = Nb de cell. Disp.
– Cellules fragiles meurent
– Arrêt de la reproduction
– Utilisation des réserves cellulaires
– Changements morphologiques
– exp Sporulation , modif. du cytoplasme

M.Nonus 39
Croissance microbienne
• Phase de décroissance ou déclin
– Nombre bactéries qui meurent > nouvelles
bactéries qui apparaissent
– Mortalité des cellules restantes peut suivre une
progression géométrique ou non : déclin
exponentiel ou non
– Bactéries adaptées à l’environnement peuvent
se multiplier sur les déchets métaboliques ou
produits des réactions de conversion, voire les
produits de lyse des cellules mortes
(cannibalisme)
M.Nonus 40
Cinétique de Croissance
• Phase de latence : x = cte dx/dt = 0
• Phase de démarrage : x dx/dt µ
• Phase logarithmique: x dx/dt µ = cte
• Phase ralentissement : x dx/dt µ
• Phase stationnaire: x= cte dx/dt µ=0
• Phase de déclin :x

M.Nonus 41
Terminologie
• Batch
– Opération unitaire, traitement par lot , fournée
• Fed-batch : batch alimenté
– Ajout en cours de culture d’éléments nutritifs ,
source de C , N , précurseur etc ….
• Culture continue
– Renouvellement du milieu de culture par
apport et retrait

M.Nonus 42
Cinétique de Croissance

M.Nonus 43
BATCH

M.Nonus 44
Cinétique de Croissance

M.Nonus 45
Cinétique de Croissance

M.Nonus 46
Cinétique de Croissance

M.Nonus 47
M.Nonus 48
M.Nonus 49
Cinétique de Croissance

M.Nonus 50
Croissance microbienne
x : concentration en biomasse kg/m3
s : concentration en substrat
p: concentration en produit
rx: vitesse de production de la biomasse par
unité de volume en kg / m3 /h
rs:vitesse de consommation du substrat par
unité de volume en kg/ m3 /h

M.Nonus 51
Cinétique de Croissance

M.Nonus 52
Cinétique de Croissance

M.Nonus 53
RENDEMENT

M.Nonus 54
Croissance microbienne

Log X

dx/dt
VII
µ=1/x III
dx/dt
II

t
M.Nonus 55
t
Cultures
• Métabolite primaire
– Associé à la croissance microbienne

• Métabolites secondaire
– Dissocié de la croissance microbienne

M.Nonus 56
Cultures
• Batch
– Modification permanente des paramètres de
culture (X, S, P …) jusqu’à épuisement de
nutriments : limitations
– sauf ceux régulés , (pH, temp…)
– Pas d’ajouts sauf air, anti-mousse, OH-
régulation pH
– Métabolite primaire
– Métabolite secondaire

M.Nonus 57
Cultures
• Batch ou opération unitaire
• Fed Batch ou Batch alimenté
• Culture continue
• Production T, kg, U
• Productivité volumique: kg/m3/h, g/l/h,U/l/H
• Productivité spécifique: kg/kg , g/g , U/g
• Productivité vol. spécifique: kg/m3/kg/h, g/g/l/h

M.Nonus 58
Cultures
• Limitations : équation de MONOD
– Nutriments : substrat limitant
• O2, OUR=OTR
• S : C, N, P etc…
• µ= µmax S
Ks + S
Ks :coefficient de demi saturation
Relie le taux de croissance µ à la nutrition
Empirique ,proche de la réalité

M.Nonus 59
Cultures
• Quand une source de Carbone est utilisée
comme source d’énergie et élément de
croissance , sa concentration en phase
liquide a une grande influence sur la vitesse
de croissance.
• Ks est numériquement égal à la valeur de la
concentration qui correspond à une vitesse
de croissance égale à la moitié de µ max.
• Plus Ks est petit plus la vitesse de
croissance est grande

M.Nonus 60
Cultures

µ
µ
µ
µmax

µmax/2

Ks S

M.Nonus 61
Cultures
• Constantes de saturation
µ-organisme substrat Ks mg/l
E.coli glucose 6,8 10-2
E.coli mannitol 2
E.coli lactose 20
E.coli tryptophane 4,9 10-4
Candida oxygène 4,5 10-2
Pseudomonas méthanol 0,7

M.Nonus 62
CULTURES FED BATCH
• Fed batch : batch alimenté
– Ajout milieu, S, f. croissance …
– Facile à mettre en œuvre
– Aug. la productivité et production
– Peut permettre de dissocier les phases de
croissance et production
– Maintenir certaines constantes
– Production Penicilline
• (C ) Glucose trop élevée  favorise X
• (C) glucose trop basse  pénalise P

M.Nonus 63
CULTURES FED BATCH
CO2, N2 , O2 res, Volatils …

Pas de sortie de milieu

Air, air enrichi, gaz

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M.Nonus 65
M.Nonus 66
M.Nonus 67
CULTURES FED BATCH
• V: volume du milieu de culture
• F : débit d’alimentation
• S0: concentration du substrat à l’entrée t = 0
• S: concentration du substrat dans le réacteur
àt
• X0: concentration de biomasse entrée
• X : concentration de biomasse à t

M.Nonus 68
CULTURES FED BATCH
Biomasse
V d X /dt = µVX
XdV/dt + VdX/dt = µXV
VdX/dt = µXV – XdV/dt
Ajout de liquide = débit d’alimentation
= dV/dt = F
dX/dt = X (µ- F/V )
F/V = D taux de dilution

M.Nonus 69
CULTURES FED BATCH
Substrat
SdV/dt = S0 F – µXV 1/Y x/s max
VdS/dt + SdV/dt = S0 F – µXV 1/Y x/s max
dS/dt = (S0 – S) F/V - µXV 1/Y x/s max
À l’équilibre
dS/dt = 0 F = µXV/ Yx/s max ( S0 – S)
XV = X0 V0 e µt

F = µ X0 V0 e µt / Yx/s( S0 – S)
M.Nonus 70
CULTURES CONTINUES

M.Nonus 71
CULTURES CONTINUES
• Notion de CSTR : CHEMOSTAT
– Continuous Stired Tank Reactor
– Réacteur continu agité
– Homogénéité : stabilité
• Distribution
• (X,S,P = constante) distribution
homogène dans l’ensemble du volume
du réacteur
• Volume constant alimentation et
soutirage en continu
M.Nonus 72
CULTURES CONTINUES
• Batch puis alimentation continue
• A l’équilibre les variables du batch deviennent
constantes : état stable
• étude de l’influence de paramètres sur la culture :
recherche des conditions limites de conduite
• Améliore la productivité pour X et métabolites
primaires
• Exp utilisation :
– Traitement d’eau
– Bioconversion ( resting cells)
– Produits instables ou à faible productivité

M.Nonus 73
CULTURES CONTINUES
• Peu utilisées en milieu industriel
– Risques de contamination
– Stabilité génétique des souches
– Beaucoup de métabolites secondaires ( pas
associés à la croissance)
– Logistique et fiabilité

M.Nonus 74
CULTURES CONTINUES
CHEMOSTAT
- croissance cellulaire est limitée par un nutriment
essentiel les autres sont en excès
- à l’état d’équilibre les concentrations en S, X P
sont constantes
- le CSTR est alimenté en milieu neuf à la même
vitesse que le milieu du réacteur est soutiré.
V = Constante
- les autres paramètres de la culture restent
constant (T, pH, 02 dissous , ….)

M.Nonus 75
M.Nonus 76
CULTURES CONTINUES
• Bilan matière
F X0 – FX + V µX – V kdX = V dX/dt (0)

F = Débit d’alimentation en l/h


V = milieu de culture l
X = concentration cellulaire g/l
µ = taux de croissance h-1
kd = taux de mortalité h-1

M.Nonus 77
CULTURES CONTINUES
dX/dt = D X0 + ( µ- kd - D)X (1)
taux de dilution
D = F/V
Inverse du temps de séjour
milieu d’alimentation est stérile X0 = 0
taux de mortalité négligeable / taux de
croissance kd <<µ
A l’équilibre dX/dt = 0
µ=D (2)
M.Nonus 78
CULTURES CONTINUES
Si D0 X S0 Yx/s S0 D µmax X0 S S0

C en
X, S td DX

S
D h-1
M.Nonus 79
CULTURES CONTINUES
Limitations physiologiques

-synthèse des enzymes


-excrétion des enzymes
-transport des substrats
-transport des métabolites
-inhibition par excès de substrat
-inhibition par le métabolite excrété
-inhibition par accumulation de composés toxiques
dans le cellule

concerne l’analyse d’un type de micro-organisme.

M.Nonus 80
CULTURES CONTINUES
Limitations technologiques
- pH
- température
- Aw
- force ionique
- Oxygénation
- Présence de CO2
- Concentrations en précurseurs
- Élimination des calories
concerne une population de micro-organismes
M.Nonus 81
CULTURES CONTINUES
µmax sur glucose
Organisme T°C µmax h-1 td h

A.niger 30 0,2 3,46


P.chrysogenum 25 0,123 5,65
A.nidulans 20 0,090 7,72
A.nidulans 30 0,215 3,23
a.nidulans 37 0,360 1,96
E.coli( glc) 30 0,28 2,48
E.coli( malt.) 30 0,22 3,15
E.coli( maltotriose) 30 0,18 3,85

M.Nonus 82
CULTURES CONTINUES
• Influence aw sur µmax de Saccharomyces
µ

1 0,98 0,96 0,94 0,92 aw


M.Nonus 83
CULTURES CONTINUES
• S’il y a au moins une limitation par un élément
nutritif : équation MONOD substitue dans (2)
µ = D = µmax S / Ks + S (3)

S = substrat limitant g/l


Si D > µmax la culture ne peut se reproduire
assez vite pour se maintenir c’est le lavage (
wash out)
Graphe 1/µ par rapport 1/S on peut estimer Ks et
µmax

M.Nonus 84
Cultures

µ
µ
µ
µmax

µmax/2

Ks S

M.Nonus 85
CULTURES CONTINUES
Si D0 X S0 Yx/s S0 D µmax X0 S S0

C en
X, S td DX

S
D h-1
M.Nonus 86
M.Nonus 87
CULTURES CONTINUES
• Pour D < µmax la concentration en substrat de
l’effluent
• S = Ks D/ µmax - D (4)
Le bilan matière en l’absence de métabolisme
endogène
F S0 - FS -V µ X 1/Yx/smax – VqpX 1 /Yp/s max = V dS/dt (5)
S0 et S concentration en S de l’alimentation et l’effluent
qp est le taux spécifique de formation du produit extra
cellulaire
Yx/s Yp/s sont les rendements en cellules et produits g X/g S
g P/ g S
M.Nonus 88
CULTURES CONTINUES
Si D0 X S0 Yx/s S0 D µmax X0 S S0

C en
X, S td DX

S
D h-1
M.Nonus 89
CULTURES CONTINUES
• Quand la formation en produit est négligeable
et la culture en état stable dS/dt = 0
D (S0 - S) = µX/Yx/s max (6)
si µ=D à l’équilibre et kd = 0
X = Yx/s max (S0 -S) (7)
à partir de (4) la concentration cellulaire à l’état d’équilibre

X = Yx/s max (S0 - Ks D / µmax – D) (8)


approximation : Yx/s est considéré comme constant du fait
que la formation en produit est négligeable

M.Nonus 90
CULTURES CONTINUES
• En (7) et( 8) Yx/s est considéré comme constant( approximation)si on ne
prend pas en compte le métabolisme endogène
• Yx/s Varie avec le taux de croissance et la limitation en substrat
• si on le prend en compte, le métabolisme endogène(2) devient

D = µ- kd = µnet (9) ou µ = D + kd (10)


On substitue (10) le bilan du substrat à l’état stable et on considère
qu’il n’y a pas de produit formé

D (S0 -S) –1/ Yx/s max ( D+ kd) X= 0 (12)


Yx/s max rendement maximum ( pas de métabolisme endogène et
d’énergie de maintenance) valeur constante indépendante du taux
de croissance

M.Nonus 91
CULTURES CONTINUES
(12 ) peut être arrangée

D (S0 -S/X) – 1 / Yx/s max (D+kd ) = 0 (13)


D(1 / Yx/s ) – D/ Yx/s max - kd / Yx/s max = 0 (14)
1/ Yx/s max + kd / Yx/s max D = 1 / Yx/s (15)
I/ Yx/s = 1/ Yx/s max + ms/D (16)
ms=kd / Yx/smax (17)

On obtient les valeurs de Yx/s max et ms à partir d’essais en


chemostat en traçant 1/ Yx/s max par rapport à 1/D
pente ms interception 1/ Yx/s max

M.Nonus 92
CULTURES CONTINUES
1/ Yx/s

3 ms = pente = 0, 2 gS/gX h

2,5

2 1/ Yx/smax = 2 Yx/smax = 0,5g de X/ g de S

0 1 2 3 4 1/D h
M.Nonus 93
CULTURES CONTINUES
• En présence d’un métabolisme endogène
µnet = µmax S / (Ks +S )
On montre que
S= Ks (D+ kd ) / µmax – D - kd (18)

X = Yx/s max (S0 -S) D/D+ kd (19)


Si on considère la transformation du substrat en produit
Le bilan masse du produit associé à la croissance
DP= qp X (20)
qp= taux spécifique de conversion en produit
M.Nonus 94
CULTURES CONTINUES
• Pour les produits non associés qp est une constante β alors
que pour la produits associés à la croissance c’est une
fonction de µ
• Pour le bilan substrat (5) devient :

• D (S0 -S) = 1 /Yx/s max (D+kd )X=1/ Yp/s qp X (21)


• (21) peut être résolue pour X

X= Yx/s max (S0 –S)( D/ D+kd + qp Yx/s max / Yp/s )( 22)


productivité d’un chemostat Pr s’exprime en terme de
production de produit DP ou de biomasse DX
le taux de dilution qui permet d’atteindre la productivité
maximale et obtenu d(DP)/dD = 0 ou d(DX)/dD = 0

M.Nonus 95
CULTURES CONTINUES
• La valeur optimale de D ( Dopt)pour la biomasse :

• Dopt= µmax ( 1- )
Ks

(Ks + S0 )
S0 est >>>> à Ks , Dopt approche D = µmax
ou point de lavage
D doit être légèrement < à Dopt stable et productivité
maximale
Dopt pour la production optimale ne l’est pas forcément
pour le produit
M.Nonus 96
CULTURES CONTINUES

A chaque valeur de D X = Yx/s (S0 –S)


La culture continue permet
de travailler avec des µ donnés ou choisis
Yx/s peut être testé pour différents µ
l’effet de chaque substrat peut être testé

M.Nonus 97

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