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Microbiológica
Da
Água
2004
ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUA POTÁVEL
1-Introdução
Embora possa parecer que a água constitui uma reserva natural inesgotável, isso não
representa a realidade, já que 95% da água do planeta é salgada, sendo imprópria para o
consumo humano e dos 5% restantes, 4,7% estão sob a forma de geleiras ou em regiões
subterrâneas de difícil acesso, o restante apto ao consumo humano, encontra-se em lagos,
rios e lençóis subterrâneos.
Particularmente para o Brasil, a aparente abundância é falsa, uma vez que 80%
encontra-se no Amazonas onde vivem apenas 5% da população. O nordeste com 1/3 da
população do país dispõe de apenas 3,3% das reservas hídricas do país. No mundo inteiro há
países ou regiões com graves problemas de abastecimento: ora devido a seca crônica, ora a
má distribuição dos recursos hídricos, ora a contaminação desses recursos. A água
contaminada é responsável por cerca de 70% das internações hospitalares, são pacientes
vítimas de doenças de origem hídrica (tabela1), como disenteria, hepatite, febre tifóide,
cólera e, indiretamente leptospirose e dengue (Macedo, 2001)
Além da contaminação microbiana, o desenvolvimento industrial, a ocupação
inadequada do solo e o uso de fertilizantes vêm comprometendo as águas disponíveis para o
consumo humano, recreação e agricultura, aumentando consideravelmente o risco de
transmissão de doenças de origem hídrica (figura 1). Segundo a Organização Mundial de
Saúde (OMS), 80% das moléstias que ocorrem nos países em desenvolvimento são
ocasionadas por contaminação da água: 15 milhões de crianças de 0 a 5 anos morrem devido
a enfermidades contraídas por conta da falta ou ineficiência dos sistemas de tratamento de
águas e esgotos. Apenas 30% da população utiliza água tratada, o restante faz uso de águas
de poços, rios, lagos, estando, portanto passíveis à contaminações (Macedo, 2001).
Desta forma se faz necessária a vigilância rotineira da qualidade química e
particularmente, microbiológica das águas por parte das autoridades sanitárias, órgãos de
saneamento, indústrias, clínicas de hemodiálise, hospitais, entre outros. A pesquisa de
patógenos nem sempre é fácil ou econômica para que seja feita rotineiramente. Assim, é
imprescindível o uso de microrganismos indicadores de contaminação fecal.
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Tabela 1 - Microrganismos patogênicos encontrados intermitentemente em fezes humanas e
transmissores comprovados de doenças através da água.
Shigella dysenteriae
Shigella flexneri Disenteria Bacilar
Shigella boydii
Shigella sonnei
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi Febre tifóide ou entéricas
Salmonella enteridis
Salmonella choleraesuis
Fezes Humanas
Água de
drenagem Esgotos Fossas
Águas Produtos
Moluscos recreacionais agrícolas Aerossóis
potável
Homem
As bactérias do grupo coliforme fazem parte da flora normal do intestino, onde não
causam doenças, na realidade são fundamentais ao funcionamento normal desse órgão. No
entanto, esses microrganismos mostram-se patogênicos quando fora do trato intestinal,
colonizando outros tecidos, como trato urinário, peritônio, meninges, entre outros e,
dependendo das condições de defesa do indivíduo, podem causar doenças e morte.
No caso de águas minerais, além dos indicadores de contaminação fecal
(Coliformes totais e fecais), é recomendada a pesquisa Streptococcus faecalis, Pseudomonas
aeruginosa e Clostridium perfrigens.
Não existe um indicador ideal ou universal, que reúne todos os requisitos necessários,
de modo que a sua ausência ateste uma água de puríssima qualidade. Assim, vários autores
preconizam a pesquisa de bactérias do gênero Pseudomonas aliada à bactéria E. coli, uma
vez que essa bactéria, em determinadas concentrações, inibe o crescimento da Escherichia,
no entanto segundo portaria publicada no Diário Oficial em vigor (Nº518 - 25/03/2004), esse
cuidado não é necessário.
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2.1 Grupo Coliforme
1. Escherichia: E. coli
2. Proteus: P. vulgaris
3. Klebsiella: K.pneumoniae
4. Citrobacter:
5. Serratia: S. marcescens
6. Enterobacter : E. aerogenes
7. Salmonella: S. typhi
8. Shigella: S. sonnei
Alguns microrganismos entéricos, por ex.: Escherichia coli, fazem parte da flora
normal do intestino e, acidentalmente causam doenças, enquanto outros, Salmonella e
Shigella, são sempre patógenos aos seres humanos. Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella,
além de serem encotrados nas fezes, também encontram-se em vegetais e solo, onde
persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal. A E. coli é o
subgrupo mais importante, sendo escolhido como microrganismo indicador. Consegue
hidrolizar o dissacarídeo lactose e, conseqüentemente, fermentar este açúcar com produção
de gás, quando incubado a 35-37ºC, por 48h.. Espécies relacionadas, fermentadoras da
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lactose também são encontradas no solo e em desenvolvimento sobre plantas e material
vegetal. O E. aerogenes, principal representante desse subgrupo, também fermentador da
lactose, é encontrado tipicamente no solo e em plantas. Pode ocorrer igualmente no trato
intestinal do homem e de animais de sangue quente, não parecendo, contudo, ser ali seu
habitat regular, por isso se atribui pouca importância à sua presença na água. Não obstante, a
presença de qualquer tipo de organismo coliforme na água potável sugere, um tratamento
inadequado ou acesso de material indesejável à água, após o tratamento.
A velocidade de morte de uma população de Escherichia coli em água, em geral,
acompanha a taxa de mortalidade das bactérias patogênicas como S. typhi nesse mesmo
meio. Os outros membros do grupo coliforme, como o E. aerogenes, têm resistência um
pouco maior.
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3. Análise Microbiológica da água
♦ Frasco de Amostragem
Dá-se preferência a frascos com capacidade para recolher pelo menos 100 ml de água
deixando espaço para o ar, tornando possível a homogeneização da amostra. Os mais
indicados são frascos de vidro transparente, incolor, com capacidade nominal de 250 ml
dotados tampa de vidro esmerilhada.
Os frascos devem ser lavados e esterilizados. Para a coleta de água clorada, deve-se
adicionar ao frasco 0,1ml de solução de tiossulfato de sódio a 10%. Esta solução tem a
função de eliminar a ação do cloro residual na amostra. No entanto, este teor não tem
qualquer ação nociva aos germes porventura existentes.
Na preparação do frasco coloca-se entre a tampa e o gargalo uma tirinha de papel
alumínio, para permitir a saída livre do ar e circulação do vapor saturado durante a
esterilização no autoclave. Protege-se ainda a tampa do frasco com um papel ou folha
metálica e autoclava-se a 120ºC durante 20 minutos.
♦ Técnica de Coleta
Procedimento:
1. Não tocar o interior ou a tampa do frasco; o papel deve ser afrouxado, devendo o
operador segurar a tampa, para abri-lo, sem remover o papel deixando entretanto cair a
tirinha inserida no gargalo por não ser mais necessária.
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3. Em seguida com a torneira aberta moderadamente, colhe-se a amostra até o volume de
2/3 do frasco, de modo a permitir a sua homogeneização.
4. Registro de dados:
Devem ser anotados:
Data e hora da coleta
Temperatura e pH da água
Localização da tomada de amostra
Sempre que possível medir o teor residual de cloro no momento da coleta. Deve-se
considerar as condições sanitárias do local onde foi feita a amostragem, anotando-se
detalhes como profundidade do poço, tempo de funcionamento, proximidade de fossas,
matadouros, curtumes.
Cuidados:
Na tomada de amostras de rede do abastecimento público, não efetuar a coleta
em torneiras que não estejam ligadas diretamente ao sistema distribuidor.
Na coleta de amostras de uma fonte superficial como rio, açude, etc, a
amostragem deverá ser feita em um ponto que esteja o mais próximo possível da
estação de tratamento.
Poços com bombas manuais são operados de maneira semelhante,
bombeando-se por 5 minutos antes da tomada da amostra. Se o poço não tem bomba,
faz-se descer o frasco esterilizado, ligado a um peso e com um dispositivo que
permita abri-lo debaixo d’água. Existem frascos e dispositivos especiais para a coleta
de amostras de água abaixo da superfície, a profundidade desejada.
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3.3 TÉCNICA DO EXAME:
Princípio do método
1º Etapa:
ENSAIO PRESUNTIVO
Geralmente são usadas três séries de 5 tubos grandes dotados dos respectivos tubos
de Durham ou ampolas de injeção ( para recolher os gases). A primeira série contém, cada
tubo, 10 ml de meio de caldo lactosado em concentração dupla(CLD). As duas outras,
compostas de 10 tubos menores, também com tubos de Durham, contêm em cada, 10 ml de
caldo lactosado em concentração simples (CLS) (figura - 2).
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Técnica:
Com pipeta estéril de 10 ml, inocular cada um dos 5 tubos grandes ( C.L.D.) com 10
ml da amostra;
Com uma outra pipeta de 1 ml estéril, inocular 1 ml da amostra em cada um dos 5
tubos menores com caldo lactosado simples
Transferir 1 ml da amostra para um tubo de diluição com 9 ml de água destilada
estéril ou água tamponada estéril. Desta diluição (1/10), inocular 1 ml em cada um dos 5
tubos com caldo lactosado simples restantes.
Técnica:
Faz-se a primeira diluição (1:10) colocando 1 ml da amostra em 9 ml de água estéril ;
agita-se bem e transfere-se 1 ml desse tubo para outro contendo 9 ml de água estéril
(1/100) e assim, sucessivamente até que se tenha todas as diluições desejadas.
De cada diluição transfere-se então 1 ml para Placa de Petri estéril (deve-se fazer
duplicatas ou triplicatas) e adiciona-se de 10 a 15 ml de meio de Agar-glicosado (GA)
fundido e resfriado a 42-45ºC.
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Agitam-se as placas com movimentos circulares nos sentidos horário e anti-horário,
evitando-se sujar a tampa da placa. Deixa-se solidificar e incuba-se em estufa a 35ºC
durante 24/48h horas.
Após incubação examina-se as placas escolhendo-se para contagem as que tenham
entre 30 a 500 colônias* (evidentemente se a placa inoculada com 1ml da amostra não
diluída tiver um número inferior a 30 colônias, esse número será registrado). Para auxiliar na
contagem é utilizado um aparelho especial munido de lupa, o Contador de Colônias tipo
Quebec.
Se as placas escolhidas forem originadas de qualquer das diluições não se deve
esquecer que o resultado final será a média do número de colônias nas placas (das
duplicatas ou triplicatas), multiplicado pela recíproca da diluição. O resultado obtido é
expresso em unidades formadoras de colônias de bactérias heterotróficas por mililitro
(UFC/ml). Contar somente as colônias que apresentarem as seguintes características:
a)colônias circulares lisa e rugosas
b)colônias ovaladas, lisas, rugosas e estreladas;
c)colônias brancas, amarelas, azuis, etc.
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10 ml
Amostr
a
Amostra
1 ml
1
1 ml
1 ml
1
1 ml
10-1
1 ml
1 ml
10-1
9 ml de água
estéril
Tubos contendo 10 ml de CLS
1 ml
1 ml
10-2
1 ml
Figura 2 – Esquema de inoculação para
10-2
ensaio presuntivo e contagem em placas
9 ml de água estéril
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2º Etapa:
ENSAIO CONFIRMATIVO
De cada um dos tubos positivos usados no ensaio presuntivo transferir com alça estéril,
após agitação, uma gota para um tubo com caldo verde brilhante lactose bile, igualmente
dotado de tubinhos de Durham. Assim serão usadas tantos tubos de caldo verde brilhante
bile quantos forem os tubos positivos no ensaio presuntivo.
Incubar todos os tubos por 48± 3 horas a 35ºC .
Proceder a leitura, considerando como teste confirmativo positivos para coliformes totais
todos os tubos que apresentarem formação de gás nos tubinhos de Durham
Anotar os resultados obtidos e calcular, recorrendo-se à tabela de HOSKINS, o número
mais provável de coliformes existentes em 100 ml da amostra.
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ENSAIO CONFIRMATIVO EM MEIO SÓLIDO
Técnica:
Com uma alça de platina espalhar uma gota do líquido (do tubo positivo) na
superfície do meio solidificado pela técnica de esgotamento na placa.(ver figura - 3).
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1
Figura 3- Técnica de espalhamento de uma gota
de líquido na superfície de meio sólido
3
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Tabela. 2 - Diferenciação entre a E.coli e o E. aerogenes em placas de EMB
3º Etapa:
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ENSAIO DIFERENCIAL PARA COLIFORMES FECAIS
Técnica:
Este ensaio é realizado a partir dos tubos positivos do ensaio presuntivo.
De cada tubo positivo, inocula-se um tubo com meio EC dotado de tubo Durham.
Incubando-se em seguida em banho-maria a 44,5º ± 0,5ºC durante 24 ± 2 horas.
A produção de gás dentro de 24 horas é considerada positiva para a presença de
coliformes fecais e sua densidade numérica é calculada pela tabela do NMP.
4º Etapa:
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b) Um tubo com caldo glicosado-fosfatado (meio de Clark Lubs), para os testes de
vermelho de metila e de Acetilmetilcarbinol ou de Voges-Proskauer.
c) Um tubo com meio citrato (o citrato de Koser) para a prova de utilização de citrato.
Pode-se também usar um meio de citrato sólido ( o meio de citrato de Simmons)
Esses testes são conhecidos pela sigla da língua inglesa I.M.Vi.C. (Indol, Methyl red,
Voges-Proskauer, Citrate). Após o semeio, os tubos serão incubados a 35ºC por tempos
variáveis.
Teste de Indol: Após incubação durante 18 a 24 horas, juntar à cultura crescida 0,2
a 0,3 ml do reagente de Kovac’s.
Aparecimento de anel sobrenadante vermelho intenso indica a presença de
Indol, teste positivo.
Se a cor do reagente permanecer inalterada: teste negativo.
Teste de Voges-Proskauer: Após incubação por 48 horas, retira-se com pipeta estéril
1ml da cultura crescida para um outro tubo de ensaio; junta-se 0,6 ml de solução de α -
naftol e 0,2 ml de KOH a 40%. Agita-se vigorosamente e deixa-se em repouso em estufa
a 35ºC. Observa-se a partir de 15 minutos até o máximo de 4 horas:
Aparecimento de coloração cereja que se estende da superfície para o fundo
do tubo indica teste VP positivo.
O aparecimento de coloração acobreada ou mesmo de coloração vermelha
após 4 horas de observação indica teste VP negativo.
Tubo 1: + + - -
Tubo 2: - - + +
Consultando-se a tabela 3, pode-se concluir que no tubo 1 foi encontrado a bactéria
Escherichia coli variedade 1 e no tubo 2, Enterobacter aerogenes.
Vermelho
Microorganismos Indol Voges Citrato
de
Proskauer
Metila
Escherichia coli
Variedade I + + − −
Variedade II − + − −
Citrobacter freundii
(intermédiarios)
Variedade I − + − ±
Variedade II + + − +
Enterobacter aerogenes
Variedade I − − + ±
Variedade II ± − + +
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AMOSTRA
Volumes Decimais Adequados
ENSAIO PRESUNTIVO
Caldo lactosado – 24/48 ± 2h / 35ºC
AUSÊNCIA DE GÁS
Prova negativa PRESENÇA DE GÁS
coliformes ausentes Prova positiva
CALDO LACTOSADO
AGAR NUTRITIVO
24/48 ± 2h 35º ± 0,5ºC
24/48 ± 2h 35º ± 0,5ºC
AUSÊNCIA DE GÁS
Ensaio completo Teste de Gram Coliformes ausentes
ou diferencial
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• BROCK,T.D. & MADIGAN, M.T., 1991, Biology of Microorganisms. 6th ed., London,
Prentice-Hall International.
• JAWETZ, E.; MELNICK, J.L.; ADELBERG, E. A.; BROOKS, G. F.; BUTEL, J. S.;
ORNSTON, L. N., 1991, Microbiologia Médica. 18a ed., Rio de Janeiro, Guanabara
Koogan.
• PELCZAR Jr., M; CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R., 1997, Microbiologia: Conceitos e
Aplicações. 2 ed., v. 1., Rio de Janeiro. Makron Books do Brasil.
• PELCZAR Jr., M; CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R., 1997, Microbiologia: Conceitos e
Aplicações. 2 ed., v. 2, Rio de Janeiro, Makron Books do Brasil.
• MACEDO, J. A B., 2001, Águas & Águas. 1ª ed., São Paulo, Varela.
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ANEXO 1
ÍNDICE DE NMP E LIMITES DE CONFIANÇA DE 95%, QUANDO SÃO
UTILIZADOS INÓCULOS DE 10ml, 1ml E 0,1ml EM SÉRIES DE 5 TUBOS*
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ANEXO 2
Meios de cultura utilizados na Análise Bacteriológica de Água
Estes meios podem ser encontrados sob forma desidratada de fabricantes como Difco,
Sigma, Merk, Oxoid, entre outros.
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9- Eosina-azul de metileno-agar EMB 10- Citrato de Simmons
Peptona - 10,0 g Citrato de sódio - 2,0 g
Lactose - 5,0 g MgSO4.7H2O - 0,2 g
Sacarose - 5,0 g NH4H2PO4 - 1,0 g
HK2PO4 - 2,0g NaCl - 5,0 g
Agar -10,0 g Azul de bromotimol -0,08 g
Coloca-se em balões de 100 ml ou 200 ml exatos. Agar (em pó) - 10 g
Esterilizar a 120ºC, 30 min. Água destilada -1 1
Quando for distribuir em placas, para uso, fundir o Fundir, colocar em tubos de ensaio e autoclavar a
meio, esfriar a 45ºC e juntar para cada 100 ml, 1 120ºC por 15 min.
ml de solução aquosa estéril de Eosina a 4 g/100
ml e 1 ml de solução aquosa estéril de azul-de
metileno (0,65 g/100 ml.)
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Soluções corantes e reagentes
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ANÀLISE BACTERIOLÒGICA
RESULTADOS:
1. PESQUISA DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME
Coliformes totais em 100 ml da amostra:
Coliformes fecais em 100 ml da amostra:
CONTAGEM PADRÃO DE BACTÉRIAS EM PLACAS:
2. PESQUISA DE Pseudomonas aeruginosa:
CONCLUSÃO:
______________________________
André Armando Perez y Palha
Engenheiro Químico
CRQ 17.379375 – 1ª Região
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M
GABINE
PORTARIA Nº 5
Estabe
relativo
água
potabil
0 Ministro de Estado
considerando o disposto no Ar
1977, resolve:
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Art. 1º Aprovar a
Humano, na forma do Anexo