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Centro de Ciências e Tecnologia

Cursos de Engenharia Ambiental e Química

Prof. Dr. Carlos Alberto Alves da Silva


Profa. Dra. Galba Maria de Campos Takaki

Recife
2011
ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUA

Prof. Dr. Carlos Alberto Alves da Silva


Profa. Dra. Galba Maria de Campos Takaki

OBJETIVO:

• Analisar bacteriologicamente de uma amostra de água utilizando


a técnica dos tubos múltiplos de fermentação.

INTRODUÇÃO:

Uma água destinada ao consumo humano deverá ser isenta


de microrganismos considerados patogênicos e de substâncias
químicas prejudiciais ao organismo humano. A água pode se
apresentar sob a forma perfeitamente límpida em sua aparência,
livre de sabores e odores peculiares, e no entanto, se apresentar
contaminada microbiologicamente. A qualidade da água só pode ser
avaliada por meio de testes laboratoriais, químicos e
bacteriológicos. A análise química pode indicar a poluição de
componentes químicos, porém não consegue detectar pequenos
graus de contaminação. Sendo, portanto, a pureza bacteriológica
que condiciona a potabilidade de uma água.

Devido a grande dificuldade de se ter resultados satisfatórios


através das pesquisas de bactérias patogênicas, a análise
bacteriológica é feita através da investigação de certas espécies
bacterianas indicadoras de poluição: a Escherichia coli e organismos
com ela relacionados, sendo denominados de coliformes, os
estreptococos fecais (Streptococcus faecalis) e o Clostridium
perfringens. Estas bactérias fazem parte da flora normal existente
no intestino grosso do homem e dos animais, estando presentes na
matéria fecal. Assim a presença de qualquer uma dessas espécies
bacterianas na água, evidencia sinais de poluição fecal de origem
humana ou animal na água analisada. Se tais microrganismos estão
presentes numa amostra de água, para os agentes patogênicos,
encontrados igualmente, nas fezes.
Os coliformes como indicadores de poluição têm sido
escolhidos mundialmente porque apresentam as seguintes
vantagens:

• têm presença constante no intestino humano, em número muito


elevado.
• cerca de bilhões destes germes são eliminados por uma pessoa
no espaço de 24 horas;
• são mais resistentes fora do habitat natural que as espécies
enteropatogênicas;
• são mais facilmente identificados em meios simples de
laboratório.

No laboratório para se analisar bacteriologicamente uma água


pode-se utilizar o método da membrana filtrante ou o método dos
tubos múltiplos de fermentação.
Nossa prática se deterá na utilização deste último. O método
de fermentação em tubos múltiplos determina a presença e o
número aproximado de coliformes, através da inoculação de uma
série de porções da amostra de água em tubos com meios de
cultura adequados para comprovar a presença de organismos
coliformes. O exame compreende três ensaios sucessivos:
(1) o ensaio presuntivo,
(2) o ensaio de confirmação
(3) o ensaio completo ou diferencial.
Meios de Cultura

Caldo Lactosado Duplo

Extrato de carne ................... 6 g/L


Peptona ............................... 10 g/L
Lactose ................................ 10 g/L
pH = 6,9 – 7,0

Caldo Lactosado Simples

Extrato de carne ................... 3 g/L


Peptona ............................... 5 g/L
Lactose ................................ 5 g/L
pH = 6,9 – 7,0

Caldo Verde Brilhante

Peptona .............................. 10 g/L


Lactose ............................... 10 g/L
Bile de boi desidratada .......... 20 g/L
Verde brilhante .................... 0,0133 g/L
pH = 7,2 – 7,4

* Pesar 40 g do meio desidratado “Brilliant Green Bile Broth” a 2%


e acrescentar 1000 mL de água destilada fria. Aquecer, agitando
freqüentemente até a completa dissolução do meio, tomando
cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição.
Distribuir em volumes de 10 mL em tubos de ensaio de 16 mm X
150 mm, tendo no seu interior tubos de Durham invertidos.
Tamponar e esterelizar em autoclave a 121 oC, durante 15 minutos.
Meio E.C (Escherichia coli)

Triptose ............................. 20 g/L


Lactose .............................. 5,0 g/L
Sais biliares ....................... 1,5 g/L
Fosfato dipotássico ............. 4,0 g/L
Fosfato monopotássico ........ 1,5 g/L
Cloreto de sódio ................... 5,0 g/L
pH = 6,9 – 7,0

* Pesar 40 g do meio desidratado “E.C. Médium” e acrescentar 1000


mL de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente até a
completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja
atingida a temperatura de ebulição. Distribuir em volumes de 5 mL
em tubos de ensaio de 12 mm X 120 mm, tendo no seu interior
tubos de Durham invertidos. Tamponar e esterelizar em autoclave a
121 oC, durante 15 minutos.

Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB)

Peptona ................................... 10 g/L


Lactose .................................... 10 g/L
Fosfato dipotássico .................... 2 g/L
Eosina ...................................... 0,4 g/L
Azul de metileno ........................ 0.065 g/L
Agar .......................................... 20 g/L

* Pesar 37,5 g do meio desidratado “E.M.B. Agar” e acrescentar


1000 mL de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente
até a completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não
seja atingida a temperatura de ebulição. Tamponar e esterelizar em
autoclave a 121 oC, durante 15 minutos.
ENSAIO PRESUNTIVO

1a ETAPA - Inoculação para o Ensaio Presuntivo e Contagem


Padrão em Placas

a. Inoculação nos tubos

Com uma pipeta de 10ml estéril, inocular 10ml da amostra de


água em cada um dos 5 tubos de caldo lactosado duplo (CD). Com
uma outra pipeta de 1ml estéril, inocular 1ml da amostra de cada 5
tubos com caldo lactosado simples (CS1).

Transferir com pipeta estéril, 1 mL da amostra para um tubo


de diluição com 9ml de água estéril ou água tamponada estéril;
agitar bem. Inocular 1mL em cada um dos 5 tubos de caldo
lactosado simples (CS2) restantes. Agitar cuidadosamente os tubos
e incubá-los a 35oC, durante 24/48 horas.

b. Contagem Padrão de Colônias em Placas

Transferir com pipeta estéril, 1 mL da suspensão para um dos


tubos de água estéril ou água tamponada estéril; agitar bem e
deste tubo retirar 1mL e transferir para outro tubo com água e
assim sucessivamente sendo realizada uma série de diluições 10-2,
10-3, 10-4.

De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de


1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 mL de meio de
Glicose-agar fundido e resfriado a 45oC. Agitar cuidadosamente,
esperar solidificar e incubá-las em aerobiose a 35oC, durante 24/48
horas.

Observe o esquema 1 de operações que conjuga o ensaio


presuntivo e a contagem em placas simultaneamente.
FIGURA 1. Esquema de Inoculação do Ensaio Presuntivo e
Contagem Padrão em Placas
2a ETAPA - Resultado do Ensaio Presuntivo e da Contagem
Padrão em Placas e Inoculação para o Ensaio Confirmativo

a) Resultado do Ensaio Presuntivo

Após 24 horas de incubação, se houver formação de gás em


qualquer quantidade, em qualquer tubo, o ensaio presuntivo é
positivo. Se não houver gás incubar por mais 24 horas na mesma
temperatura.

Após 48 horas de incubação se não houver gás em qualquer


tubo, o ensaio é negativo e a análise está encerrada quanto a
coliformes. Caso seja observada a formação de gás, o ensaio
presuntivo é considerado positivo.

b) Resultado da Contagem Padrão em Placas

Examinar as placas e escolher para contagem as que tenham


entre 30 e 300 colônias (evidentemente se a placa inoculada com 1
mL da amostra não diluída tiver um número inferior a 30 colônias,
esse número é registrado). Pode-se usar para auxiliar na contagem
um aparelho especial munido de lupa, o Contador de colônias tipo
Quebec. Se as placas forem originadas de qualquer diluição não se
esquecer que o resultado será: a média do número de colônias
multiplicada pela diluição.

c) Inoculação para o Ensaio Confirmativo

c.1) Ensaio Confirmativo para Coliformes Totais

De cada um dos tubos positivos usados do ensaio presuntivo


transferir com alça estéril, após agitação, uma gota para um tubo
com caldo verde brilhante lactose bile (VBLB), igualmente dotado de
tubinhos de Durham. Assim serão usados tantos tubos de caldo
verde brilhante quantos forem os tubos positivos do ensaio
presuntivo. Incubar a 35oC durante 24-48 horas.

c.2) Ensaio Confirmativo para Coliformes Fecais

De cada um dos tubos positivos usados do ensaio presuntivo


transferir com alça estéril, após agitação, uma gota para um tubo
com caldo E.C., igualmente contendo de tubinhos de Durham. Assim
serão usados tantos tubos de caldo E.C. quantos forem os tubos
positivos do ensaio presuntivo. Incubar a 44,5oC em banho-maria
durante 24 horas. Os tubos devem ser previamente aquecidos a
44,5oC e após inoculação colocados imediatamente no banho-maria.

c.3) Ensaio Confirmativo em Meio Solidificado

O ensaio confirmativo em meio solidificado deverá ser


realizado mediante a inoculação do em placas de Petri com meios
diferencial específicos para coliformes (Eosina Azul de Metileno -
EMB; Endo, Mac Conkey ou outros). Incubar a 35oC durante 24-48
horas.

Maiores detalhes sobre esta técnica estão no esquema


apresentado na figura 2.

FIGURA 2- Esquema de Inoculação do Ensaio Confirmativo.


3a ETAPA - Resultados do Ensaio Confirmativo

a) Resultado do Ensaio em Meio Líquido de Verde-Brilhante

Após incubação durante 24-48 horas os tubos que


apresentarem bolha de gás são aqueles em que ficou confirmada a
presença de coliformes. Devem ser anotados todos os tubos
positivos e recorrendo-se em seguida à tabela estatística de Hoskins
que indica, o número mais provável de coliformes existentes em
100mL da amostra. Este número constitui o NMP de coliformes
totais.

b) Resultado do Ensaio em Meio Líquido de E.C.

Após incubação durante 24 horas os tubos de E.C. que


apresentarem bolha de gás são aqueles em que ficou confirmada a
presença de coliformes fecais. Devem ser anotados todos os tubos
positivos e recorrendo-se em seguida à tabela estatística de Hoskins
que indica, o número mais provável de coliformes existentes em
100mL da amostra. Este número constitui o NMP de coliformes
fecais.

c) Ensaio em Meio Sólido

Observar as placas para determinar se houve ou não


crescimento de colônias típicas de coliformes. O resultado do exame
deverá ser analisado da seguinte maneira:

• O não crescimento de colônias típicas indica que o ensaio


confirmativo é negativo;
• O crescimento de colônias típicas de coliformes indica que o teste
para coliformes é positivo.

Se o ensaio confirmativo for positivo as colônias típicas


escolhidas devem ser transferidas cada uma para dois tubos, um
contendo meio de Agar-nutritivo (AN) e outro de caldo lactosado
simples ou caldo lactosado duplo.

4a ETAPA: Inoculação para o Ensaio Completo ou Diferencial


(IMViC)

O ensaio completo ou diferencial utiliza reações de


caracterização que são provas bioquímicas que se realizam para a
identificação dos microrganismos dentro do grupo dos coliformes.
Estes testes são conhecidos pela sigla IMViC.

Técnica:

Partindo-se da cultura de coliforme crescido em agar-nutritivo


(AN) obtida a partir do ensaio anterior inocula-se:

• Com uma alça em círculo, um tubo de caldo triptonado, para o


teste de Indol;

• Com uma alça em círculo, dois tubos com caldo glicosado-


fosfatado (meio de Clark Lubs), um para o testes de Vermelho de
Metila e outro para o teste de Voges Proskauer;
• Com uma alça em agulha, um tubo com meio líquido de citrato
de Koser para prova de utilização de Citrato. Pode-se também
usar um meio citratado solidificado, chamado de meio Citrato de
Simons.

Após o cultivo, todos os tubos são incubados a 35oC. Sendo o


tempo específico para cada teste.

FIGURA 3. Esquema de inoculação para o ensaio completo ou


diferencial
5a ETAPA: Resultados do Ensaio Completo ou Diferencial

1) Teste do Indol: após incubação durante 18 a 24 horas, juntar


à cultura crescida 0,2 a 0,3mL do reagente de Kovac’s.

• O aparecimento de um anel sobrenadante vermelho intenso


indica a presença de indol
• Se a cor do reagente permanece inalterada indica que o teste é
negativo.

2) Teste de Vermelho de Metila: após incubação da cultura em


meio de caldo-glicosado-fosfatado por 4 a 5 dias, juntar 2 a 3 gotas
do indicador vermelho de metila

• Cor vermelha indica teste positivo


• Cor amarela indica teste negativo

3) Teste de Voges Proskauer: após 48 horas de incubação,


retira-se com pipeta estéril 1mL da cultura crescida para um outro
tubo de ensaio; junta-se 0,6ml de solução de α-naftol e 0,2 mL de
KOH a 40 %. Agita-se vigorosamente e deixa-se em repouso em
estufa a 35oC. Observa-se a partir de 15 minutos até um máximo de
4 horas.

• O aparecimente de uma uma coloração cereja que se estende da


superfície para o fundo do tubo indica um teste Voges Proskauer
positivo.
• O aparecimento de uma coloração acobreada ou mesmo
vermelha indica teste negativo.

4) Teste de citrato: após 72 a 96 horas de incubação em meio


citratado, observa-se:

• Crescimento visível (o meio fica turvo) - prova positiva


• Ausência de crescimento (o meio permanece límpido) - prova
negativa

Observação: Quando o teste é realizado em meio solidificado de


Simons uma virada do indicador azul de bromotimol, de verde para
azul indica: citrato positivo.
Com os resultados dos quatro testes anteriores pode-se
determinar o gênero do coliforme isolado através da tabela 1, que
fornece uma interpretação dos resultados das reações do IMViC.

TABELA 1: Interpretação das reações IMViC

Microrganismo Indol Vermelho Voges Citrato


de Metila Proskauer
Eschericha coli
Variedade I + + - -
Variedade II - + - -

Citrobacter freundii
(Intermediário)
Variedade I - + - +
Variedade II + + - -

Enterobacter
aerogenes - - + +
Variedade I + - + +
Variedade II

OBSERVAÇÃO: a prática deverá ser encerrada mediante a


apresentação de um relatório e um laudo bacteriológico da
água analisada.
Expressão dos Resultados

A densidade de coliformes é expressa como NMP de


coliformes / 100 mL.
O NMP de coliformes é obtido através de um quadro em
que são dados os limites de confiança de 95%, para cada valor de
NMP determinado.
Para expressão de resultados é necessária a composição de
um código onde são utilizados apenas resultados positivos
correspondentes a 3 séries consecutivas, sendo que o primeiro
algarismo escolhido para compor o código será o de menor
volume da amostra (> diluição) em que todos os tubos
apresentem resultados positivos, desde que tenham sido
inoculados diluições subsequentes para totalizar os 3 algarismos
para o código.
Encontra-se o código no quadro e o NMP a ela
correspondente, o valor final do NMP será obtido através da
aplicação da fórmula.
Valor do NMP correspondente ao código x 10 .
Maior volume inoculado selecionado para compor o código

Tabela 1 -Quadro contendo os Códigos com o Valor do NMP, para


Cálculo da Densidade de Bactérias de uma Amostra.

Número de tubos com Índice de NMP Limites de Confiança de


reação positiva, a 95%
partir de 5 tubos de (100 mL)
10 mL

Inferior Superior

0 < 2,2 1 6,0

1 2,2 0,1 12,6

2 5,1 0,5 19,2

3 9,2 1,6 29,4

4 16,0 3,3 52,9

5 16,0 8,0 Infinito

Índice de NMP e limites de confiança de 95%, quando são inoculadas 5


porções de 10 mL da amostra.
Tabela 2 -Quadro contendo os Códigos com o Valor do NMP, para
Cálculo da Densidade de Bactérias de uma Amostra.

Número de tubos com Índice de Limites de Confiança de


reação positiva, a partir NMP 95%
de 10 tubos de 10 mL
(100 mL)

Inferior Superior

0 < 1,1 0 3,0

1 1,1 0,03 5,9

2 2,2 0,26 8,1

3 3,6 0,69 10,6

4 5,1 1,3 13,4

5 6,9 2,1 16,8

6 9,2 3,1 21,1

7 12,0 4,3 27,1

8 16,1 5,9 36,8

9 23,0 8,1 59,5

10 >23,0 13,5 Infinito

Índice de NMP e limites de confiança de 95%, quando são inoculadas 10 porções


de 10 mL da amostra.
Tabela 3 – Quadro contendo os Códigos com o Valor do NMP, para Cálculo
da Densidade de Bactérias de uma Amostra.

Número de tubos com reação Índice de Limites de Confiança de


positiva quando são utilizados, em NMP 95%
séries de 5 tubos, inóculos de 10
mL, 1,0 mL e 0,1 mL (100 mL)

Inferior Superior

0 0 0 <2 - -

0 0 1 2 <1 10

0 1 0 2 <1 10

0 2 0 4 <1 13

1 0 0 2 <1 11

1 0 1 4 1 15

1 1 0 4 1 15

1 1 1 6 2 18

1 2 0 6 2 18

2 0 0 4 1 17

2 0 1 7 2 20

2 1 0 7 2 21

2 1 1 9 3 24

2 2 0 9 3 25

2 3 0 12 5 29

3 0 0 8 3 24

3 0 1 11 4 29

3 1 0 11 4 25

3 1 1 14 6 35

3 2 0 14 6 35

3 2 1 17 7 40

4 0 0 13 5 38

4 0 1 17 7 45

4 1 0 17 7 46

4 1 1 21 9 55

4 1 2 26 12 63
4 2 0 22 9 56

4 2 1 26 12 65

4 3 0 27 12 67

4 3 1 33 15 77

4 4 0 34 16 80

5 0 0 23 9 86

5 0 1 30 10 110

5 0 2 40 20 140

5 1 0 30 10 120

5 1 2 60 30 180

5 2 0 50 20 170

5 2 1 70 30 210

5 2 2 90 40 250

5 3 0 80 30 250

5 3 1 110 40 300

5 3 2 140 60 360

5 3 3 170 80 410

5 4 0 1307 50 390

5 4 1 170 70 480

5 4 2 220 100 580

5 4 3 280 120 690

5 4 4 350 160 820

5 5 0 240 100 940

5 5 1 300 100 1300

5 5 2 500 200 2000

5 5 3 900 300 2900

5 5 4 1600 600 5300

5 5 5 ≥ 1600 - -

Índice de NMP e limites de confiança de 95%, quando são utilizados inóculos 10


mL, 1,0 mL e 0,1 mL da amostra
DESINFECÇÃO DE RESERVATÓRIO

1. Para executar esta limpeza, o reservatório deve ser esvaziado


completamente e retirado de seu interior todo material
indesejável (folhas, pedras, areia etc...).

2. O reservatório deve ser lavado com água e as paredes


escovadas. O material resultante do escovamento deve ser
retirado pela tubulação de descarga do reservatório ou
manualmente quando não existir tal tubulação.

3. Ao executar esta limpeza deve-se fechar as tubulações de


entrada e saída de água do reservatório, para evitar o
entupimento das mesmas com o material que está sendo
removido. Deve-se utilizar na limpeza materiais novos (rodos,
estopas, vassouras...).

PROCEDIMENTO PARA A DESINFECÇÃO

Quantidade de desinfetante: Numa vasilha limpa, separe a


quantidade do agente desinfetante a ser usado, levando em conta o
volume do reservatório.

a) Hipoclorito de Sódio - 500mL (½ litro) para cada 1.000 litros de


água (1m3).

b) Hipoclorito de Cálcio (cal clorada) 200g para cada 1.000 litros de


água (1m3).

Neste caso em que o agente desinfetante é sólido deve-se


dissolvê-lo em uma quantidade de água para separar o material
insolúvel.

MÉTODOS DE DESINFECÇÃO

1. Após concluída a limpeza, o reservatório deverá ser enchido com


água da rede de distribuição.
2. A seguir, lançar no reservatório a quantidade do desinfetante,
devendo ser feita uma agitação para homogeneizá-lo na água.
3. Espere no mínimo 4 horas para a desinfeção total do reservatório
e retire toda essa água armazenada. Essa água não deverá ser
utilizada em nenhuma hipótese.
4. Após retirar toda solução desinfetante do reservatório, este
deverá ser enxaguado com água limpa.
5. A partir daí seu(s) reservatório(s) estará (ão) em condições
sanitárias de armazenar água.

Obs.: Recomenda-se antes de utilizar a água do reservatório,


proceder exame bacteriológico. Caso seja encontrado a presença de
Coliformes, repetir o processo de desinfecção até a obtenção de
resultados considerados satisfatórios.

DEVE-SE PROCEDER A DESINFEÇÃO DO RESERVATÓRIO,


SEMPRE QUE HOUVER OCORRÊNCIA DE QUALQUER
POLUIÇÃO OU ANUALMENTE, PARA GARANTIR A PROTEÇÃO
ADEQUADA SOB O PONTO DE VISTA SANITÁRIO.