TD N°1 : Examen du frottis sanguin : Etablissement de la formule leucocytaire

1. Examen du frottis sanguin

L'examen du frottis de sang permet d'établir une formule leucocytaire et d'examiner la
morphologie des hématies, des globules blancs et des plaquettes.
L’examen du frottis sanguin au faible grossissement (objectif x40) permet d’apprécier la
qualité du frottis.
L’étude cytologique (objectif x100, à l’immersion) permet de réaliser :
- l’observation des éventuelles anomalies morphologiques des globules rouges : anomalies de
forme, de taille, de coloration, ou présence d’inclusions intra-érythrocytaires.
- l’observation des éventuelles anomalies morphologiques des plaquettes ;
- l’établissement de la Formule Leucocytaire.

2. Le frottis sanguin
2.1. Principe
La séparation des cellules est basée sur les différences de tailles et de gravité existant entre les
lignées cellulaires. Cette séparation se fait par étalement de sang sous forme d’un mouvement
rapide et continu. Le sang suit la lame d’étalement sans que les cellules ne soient écrasées.

2.2. Technique de confection d’un frottis sanguin

L'étalement est réalisé à partir de sang frais (prélèvement de moins de 3 heures) prélevé sur
éthylène-diamine-tétra-acétique (EDTA) ou, plus rarement, directement par prélèvement
capillaire. Les lames doivent être en verre, dégraissées, à bords rodés à 45° (figure 1).

Figure 1 : Technique d'étalement d'un frottis de sang

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La technique manuelle d'étalement est la suivante :
· Dépôt d’une goutte de sang (environ 2 à 3 mm de Ø) à 1 cm de l'extrémité d'une lame posée
horizontalement sur un plan dur (table ou paillasse);
· Le maintient de cette lame d'une main et de l'autre une seconde lame inclinée à 45°, juste à
l'avant de la goutte;
· Amener la seconde lame au contact du sang et laisser diffuser par capillarité le long de l’arête;
d'un mouvement rapide, tirer le sang vers l'extrémité de la lame horizontale;
· Identifier le frottis (nom du patient, numéro de travail...) et le laisser sécher à l'air sans accélérer
le séchage (agitation, séchoir).

Après étalement des frottis la coloration est réalisée soit manuellement soit à l’aide d’un
automate. Ce dernier réalise l’opération de coloration au cours de laquelle les lames portant le
frottis sanguin passent successivement par :
- un bain d’éthanol ;
- un bain de colorant May –Grunwald ;
- un bain d’eau neutre ;
- un bain de colorant Giemsa ;
- un bain de rinçage ;
- l’étape de séchage.

2.3. La coloration de May-Grunwald-Giemsa

Le colorant de May-Grunwald est une solution neutre d'éosine et de bleu de méthylène dans
de l'alcool méthylique, ce qui permet la fixation des éléments.
Lorsqu'on utilise ce colorant isolément, les noyaux sont colorés en bleu pâle, les
cytoplasmes en bleu très clair ou incolores, les granulations secondaires des granulocytes en
rouge clair pour la lignée neutrophile, en bleu foncé pour la lignée basophile et en rouge-
orangé pour la lignée éosinophile. Les hématies sont colorées en beige rosé.
Le colorant de Giemsa est une combinaison d'éosine et de dérivés du bleu de méthylène dont
l'azur. Il colore les noyaux en violet, les cytoplasmes en bleu plus ou moins intense ou en rose
selon les cellules et les granulations primaires des granulocytes en rouge-pourpre intense
(granulations dites alors azurophiles).

NB : Ces deux colorants, donnent des résultats complémentaires.

2.4. La qualité du frottis

La bonne qualité du frottis est un préalable indispensable à l'analyse du frottis de sang après
coloration. Le frottis obtenu doit être Mince et régulier à bord rectiligne et disant de ceux de la
lame (tendance des leucocytes à se repartir dans les parties externes du frottis). En effet, des
frottis mal faits risquent d'être à la source d'erreurs dues à une mauvaise appréciation du
pourcentage des populations leucocytaires liée à une répartition hétérogène une difficulté
d’identification des cellules anormales; une difficulté d'analyse des hématies.
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 Un frottis de bonne qualité est homogène en longueur et en largeur, légèrement plus étroit
que la lame, il diminue régulièrement d'épaisseur vers son extrémité qui ne comporte pas de
franges terminales et reste à distance du bord de lame (figure 2).

Figure 2 : cas de frottis sanguins (a, b, c, d, e, f) obtenus suite à une confection de mauvaise
qualité.

3. Examen au microscope
Le frottis doit être examiné au faible grossissement. La lecture se fait au grossissement X100
à l’extrémité arrondi la ou les globules rouges sont voisins les uns les autres sans chevauchement
ni écartement. Le décompte se fait en déplaçant la lame en escalier (figure 3).

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 Figure 3 : Lecture d’un frottis sanguin selon la méthode en cerneaux de Lord-Dube H. et al
(1983)
Dans la majorité des publications, la zone de comptage des leucocytes, lorsqu’elle est
précisée, est la zone monocouche (extrémité proche de la queue) (figure 4). C’est une zone ni
trop mince ni trop épaisse qui permet une observation plus facile, moins sujette à des erreurs
d’interprétations due à des superpositions ou des artéfacts ( Lord-Dube et al., 1983 ; Kerr., 1989 ;
Fauchet et al., 1995).

Figure 4 : représentation schématique d’un frottis sanguins

4. La formule leucocytaire
Elle correspond à la distribution des différentes variétés de leucocytes identifiés lors d’un
parcours qui tient compte de la distribution de ces leucocytes lors de l’étalement. Les
granulocytes et les monocytes se situent sur les bords et les bouts du frottis.
On doit identifier 100 à 200 leucocytes à l’aide du compte cellules.

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5. L’interprétation des résultats
Les pourcentages établis lors du comptage des leucocytes sont multipliées par la
concentration en leucocytes totaux. Les résultats de la formule leucocytaire que le clinicien
interprète sont donc exprimés en concertations (Valeurs absolue /mm3) et non en pourcentage
(%).

Types de leucocytes Interprétation

PNN Neutropénie < VN > Neutrophilie
PE VN > Eosinophilie
PB VN > Basophilie
Lymphocytes Lymphopénie <VN> Lymphocytose
Monocytes Monocytopénie <VN> Monocytose

6. Les valeurs normales chez l’adulte

Le nombre de globules blancs est normalement chez un adulte normal sont comprises entre
4000 et 10 000/mm3 de sang chez l'homme ou chez la femme (Tableau I). On parle de leucopénie
lorsque le nombre de globules blancs est à moins de 4000/mm3 de sang et de leucocytose lorsque
qu'il est supérieur à la norme.

Tableau I : Exemples de formules leucocytaires normales chez l’adulte et l’enfant

NB : Les valeurs et les proportions des leucocytes varient avec l’âge. Certains facteurs
environnementaux comme le stress peuvent jouer sur certains paramètres.