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Enzymologie

Biochimie
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Plan
Introduction
1. Historique et définitions
2. Nomenclature et classification des enzymes
3. Structure des enzymes
4. Catalyse enzymatique
5. Cinétique enzymatique
6. Facteurs modifiant la cinétique enzymatique
7. Dosage enzymatique
8. Réactions enzymatiques à deux substrats
9. Régulation des enzymes
10. Applications cliniques des enzymes
Conclusion
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7- Dosage enzymatique

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Définition et intérêt
• Le dosage des enzymes est une mesure d’activité catalytique

• Évaluer dans des conditions opératoires déterminées, la


quantité de substrat transformé ou la quantité de produit
formé lors de la réaction enzymatique

• Double intérêt:
– Clinique:
• Diagnostic et surveillance de certaines maladies (hépatites, souffrance
cardiaque,…)
• Réactif pour dosage substrats: urée, créatinine, glucose
– Recherche: étude des voies métaboliques
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Dosage des enzymes
• Parfois dosage par technique immuno-chimique
– Dosage de la protéine: exemple CK-MB masse

• Le plus souvent dosage indirect:


– par mesure de l’activité catalytique
– Conditions expérimentales standardisées
– Possibilité de comparaison des résultats des différents
laboratoires

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Conditions opératoires
• Phase stationnaire

• Température optimale: 37°c

• pH optimum

• Protecteurs enzymatiques: agents protégeant les fonctions thiols


(cystéine , glutathion,..), agents complexants les métaux lourds (EDTA),
activateurs métalliques (Mn, Mg,…)

• Activité enzymatique proportionnelle à la concentration en


enzyme: substrat en excès

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Conditions opératoires
K1 K2
E+S ES EP
K-1

[S ]
V = V
K m + [S ] m ax

[S] très supérieure à Km


Vi= Vmax = K2 [ET]

La vitesse mesurée est proportionnelle à la


quantité d’enzyme présente dans la solution
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Vitesse initiale

[P ]

 [P ]

 [P ]
In itia l s lo p e = v o = = K2 [Et]
t
t

0 T im e ( t )

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Effets de la concentration d’enzyme sur la vitese initiale

Plus [E] est grande plus la Vitesse initiale est grande

P Vi
Vi4

Vi3

E4 E3
E2 Vi2

E1 Vi1

Vi2 Vi3 Vi4


Vi1

E1 E2 E3 E4 E
T
Méthodes d’études des réactions enzymatiques
• Méthodes discontinues ou point par point (peu utilisées)
• Méthodes continues
– Évolution de la réaction enregistrée directement en fonction du temps
– Détection par spectrophotométrie d’absorbance:
• si substrat ou produit ont des spectres d’absorption caractéristiques et déplacés
l’un par rapport à l’autre
• exemple dosage de l’urée par l’uréase (voir TP)
– Détection par fluorescence
• méthodes enzymatiques couplées
– Produit de la réaction lui-même substrat d’une enzyme qui donne un
produit dosable par méthode continue
– 2 réactions enzymatiques consécutives couplées
– Exemple: dosage glucose par la glucose oxydase/ peroxydase (voir TP)

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Mode d’expression d’activité enzymatique

• Katal (kat en abrégé): quantité d’enzyme qui


transforme 1 mole de substrat par seconde

• L’Unité Internationale (U ou UI en abrégé) :


quantité d’enzyme qui transforme 1 µmole de
substrat par minute
– Utilisée en pratique
– 1UI= 16,67 nKatal (1nKatal= 10-9 Katal)
– 1 kat = 6x107
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Plan
Introduction
1. Historique et définitions
2. Nomenclature et classification des enzymes
3. Structure des enzymes
4. Catalyse enzymatique
5. Cinétique enzymatique
6. Facteurs modifiant la cinétique enzymatique
7. Dosage enzymatique

8. Réactions enzymatiques à deux substrats


9. Régulation des enzymes
10. Applications cliniques des enzymes
Conclusion

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3 principaux mécanismes

• Bibi ordonné

• Bibi aléatoire

• Ping- pong

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Mécanisme bibi ordonné
• Les substrats ( Sa et Sb) s’associent à l’enzyme selon
un ordre défini
• Sb ne peut se fixer que sur le complexe Esa
• Les produits de la réaction sont libérés selon une
séquence définie

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Exemple de bibi ordonné:
alcool déshydrogénase

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Mécanisme bibi aléatoire
• Les deux substrats peuvent indifféremment se
fixer à l’enzyme.

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Exemple de bibi aléatoire

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Mécanisme ping- pong

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Exemple de mécanisme ping- pong

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Plan
Introduction
1. Historique et définitions
2. Nomenclature et classification des enzymes
3. Structure des enzymes
4. Catalyse enzymatique
5. Cinétique enzymatique
6. Facteurs modifiant la cinétique enzymatique
7. Dosage enzymatique
8. Cinétique à deux substrats
9. Régulation des enzymes
10. Applications cliniques des enzymes
Conclusion

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Objectifs de la règulation
• Maintien de l’homéostasie métabolique

• Conservation de l’énergie

• Ajustement rapide des réactions métaboliques


aux situations physiologiques (jeun, stress, effort
musculaire…)

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• La capacité catalytique est la résultante de:
– la concentration de l’enzyme
– son efficacité catalytique intrinsèque.

• L’étape clé du processus: réguler


– l’activité enzymatique
– la quantité de l’enzyme.

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A- Régulation de l’activité enzymatique

• Modification structurale de l’enzyme:


1- Irréversible: Protéolyse
2- Réversible: Phosphorylation

• Régulation cinétique:
3- Inhibiteurs compétitifs et non compétitifs
4- Inhibiteurs allostériques

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1- La protéolyse irréversible
• Certaines protéines sont synthétisées et secrétées
sous forme d’un precurseur inactif, appelé zymogène:
– Une protéolyse sélèctive entraine un changement de la
conformation et une activation des ces enzymes.
– Le changement de la conformation entraine la formation
du site actif ou son exposition aux substrats.
• Objectifs:
– Protection contre une protéolyse délétère
– Assurer la fonction enzymatique durant un temps définie
et une localisation déterminée
– Forme de réserve de l’enzyme
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Exemple de zymogènes

• Hormones: proinsuline

• Protéines digestives: prochymotrypsine1 13 14 15 16 146 149 245


P ro -C T

1 13 14 15 16 146 149 245


−C T

1 13 16 146 149 245


−C T

S S S S

• Protéines fonctionnelles: facteurs de la coagulation

• Protéines tissulaires: procollagène

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2- Modification covalente réversible
• Mécanisme qui aboutit à l’activation ou l’inactivation des
enzymes : nécessite de l’énergie

• Modification catalysée par des enzymes de conversion: d’où


l’appelation de règulation par interconversion

• Régulation soumise à un contrôle hormonale. On parle


aussi de régulation hormonale

• Enzyme sous 2 formes: moins active, plus active

• Cascade enzymatique aboutissant à la régulation

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Modifications fréquentes

Phosphorylation – dephosphorylation+++
- Se produit sur les résidus sérine ou thréonine ou tyrosine
- Phosphorylation catalysée par une protéine kinase
- Déphosphorylation catalysée par une phosphatase
adenylation – deadenylation
methylation - demethylation
uridylation - deuridylation
ribosylation - deribosylation
acetylation - deacetylation

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Phosphorylation

ATP ADP

M g 2+
p h o s p h o r y la t io n
p r o t e in
k in a s e

E -O H E -O -P O 3H 2

p h o s p h a ta s e

d e p h o s p h o r y la t io n

Pi H 2O

Les enzymes du catabolisme glucidique (glycolyse) sont actifs sous forme déphosphorylée

Les enzymes de la néosynthèse glucidique sont actifs sous forme phosphorylée


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3- Inhibiteurs compétitifs et non compétitifs

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4- Régulation allostérique+++
• La réponse cellulaire à la régulation allostérique
est rapide et fine aux variations des conditions
intracellulaires

• La régulation allostérique module l’activité des


enzymes situées au carrefours des voies
métaboliques à une étape clé

• Ces enzymes représentent une classe particulière


d’enzymes: les enzymes allostériques

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Les enzymes allostériques
• sont des protéines allostériques:
– Protéines complexes constituées de nombreuses sous unités identiques
ou différentes
– Existence d’un site autre que le site catalytique (allos)

• Les sous unités multiples comprennent:


• Sites catalytiques (C): lieu de fixation du substrat
• Sites règulateurs (R): lieu de fixation des inhibiteurs et activateurs

• Deux modèles de comportement allostérique proposés:


– Modèle symètrique concerté de Monod, Wyman et Changeux 1965
– Modèle séquentiel de Koshland 1966

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1- Modèle symétrique

Conformation “T” Conformation “R”


Tense= tendue Relaxed= relachée
Peu d’affinité pour S Affinité élevée pour S
Forte valeur du Km Faible valeur de Km
Peu d’affinité pour A Affinité élevée pour A
Haute affinité pour I Peu d’affinité pour I
Equilibre en faveur de T en l’absence de ligand
A: activateur, I: inhibiteur

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Modèle symétrique

La liaison de S: S
-augmente l’abondance forme R
-Favorise liaison nouvelles molécules S
S

S
S
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2- Modèle "SEQUENTIEL"

La liaison du ligand induit progressivement des changements conformationnels


dans les sous-unités 35
Effecteurs allostériques
• Régulent les enzymes allostériques

• Se lient à une sous unité au niveau site régulateur et la


stabilisent
– Si stabilisation forme relachée: activateur
– Si stabilisation forme tendue: inhibiteur

• Exemple d’inhibiteur allostérique: Produit final


– Produit final d’une cascade de réactions enzymatiques
– Rétro-inhibition= inhibition par feed-back

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37
38
Effet des activateurs et des inhibiteurs

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Cinétique allostérique: coopérative

A llo s te r ic a c tiv a tio n


Courbe sigmoïde
A llo s te r ic e n z y m e

A llo s te r ic r e p r e s io n

[S ]
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3 domaines dans la sigmoïde de Hill
• Domaine de latence où V0= 0 quelque soit [S]

• Domaine d’amplification où:


– V0 croit très vite avec [S] à partir d’un certain seuil
– V0 très supérieure à celle d’une enzyme Michaellienne
– Fixation coopérative de S par l’enzyme

• Domaine de saturation:
– V0 = Vmax si [S] très élevée, comme pour une enzyme
Michaellienne

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Équation Hill
• On peut quantifier l’effet coopératif grâce à
l’équation de Hill.

• Cette équation exprime la relation entre la


quantité de ligand lié en fonction de la
quantité totale de ligand.

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L'équation de Hill
A.V. Hill a caractérisé le comportement coopératif des enzymes oligomériques
en 1910

E + nS ESn
n
[E][S]
K =
[ ESn]

E = enzyme, S = ligand, n= n° sous-unités

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n
[S]
Ys = L'équation de Hill
K + [S]
n

n
Vmax [S]
Vo = Courbe sigmoïde
Km + [S]
n

La valeur de n, la constante de Hill, augmente avec le degré de coopérativité


de fixation du ligand

Si n = 1, la liaison du ligand est non coopérative, et la courbe de saturation est


celle d'une hyperbole

Quand n > 1, la liaison est à coopérativité positive 44


Représentation de Hill

[S]n v
v = V log = n.log [S] - n.log S0.5
max
Vmax- v
Km/ [S]n + 1

v
log
Vmax- v Pente = n

0
log[S]

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Exemple de protéine allostérique: l’Hb

• Hb: protéine tétramèrique allostérique


– rôle: transport de l’O2 vers tissus et retour CO2 vers
poumon transport O2
– Interactions coopératives entre sous unités en fonction
concentration en O2
– Courbe de saturation en O2 de l’Hb est une sigmoïde
• O2: favorise sa propre liaison

• Myoglobine: protéine monomèrique, non allostérique


– Rôle: stockage O2 dans muscle
– Cinétique Michaellienne hyperbolique

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- La myoglobine fixe l ’oxygène avec une forte affinité: courbe hyperbolique
- L’hémoglobine fixe l’oxygène avec une affinité modulable: courbe sigmoïde

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Représentation de Hill

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Enzymes allostériques
de type K et de type V
• Si la valeur de KM est modifiée par l’effecteur:
l’enzyme allostérique est dite de type K: cas le
plus fréquent+++

• Si l’effecteur modifie la vitesse maximale de


l’enzyme, la valeur de KM reste identique:
l’enzyme allostérique est dite de type V

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Régulation allostérique

Vmax
v

+ Activateur

+ Inhibiteur

Substrat

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Exemple de régulation d’enzyme:
glycogène phosphorylase

• La glycogène phosphorylase participe à la


glycogénolyse dans foie et muscles.

• PM= 500 000 daltons.

• Formée de:
– 4 sous-unités dans le foie
– 2 sous-unités pour le muscle

(Glycogène)n + Pi ↔ (Glycogène)n-1 + Glucose1P


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Glycogène phosphorylase musculaire
2 types de Régulation:
– Allostérique rapide
– Modification covalente: très rapide

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Glycogène phosphorylase musculaire
(Glycogène)n + Pi ↔ (Glycogène)n-1 + Glucose1P

• Début exercice: régulation allostérique


– Présence d’AMP: État R

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Glycogène phosphorylase musculaire (2)

• Prolongation exercice: activation covalente


• Phosphorylation par action kinase de la
forme dite "b" en forme " a "

• Forme « a »: très active, insensible à la


régulation allostérique

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B- Régulation de la quantité d’enzymes
• Assurée par le contrôle de l’expression des gènes:
régulation transcriptionnelle

• Fait intervenir des protéines régulatrices qui


interagissent directement sur l’ADN
– Si la quantité d’enzyme on parle d’induction
– Si la quantité d’enzyme on parle de repression

• Certaines hormones lipophyles (cortisol) se fixent sur


recepteur nucleaire et participent au contrôle
transcriptionnel.
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3- Autre système de régulation:
Compartimentation cellulaire des enzymes
organelle Enzyme/voie metabolique
Cytoplasme Aminotransferases, peptidases, glycolyse, synthèse des acides gras,
catabolisme des purines et des pyrimidines
Mitochondrie Oxydation acides gras, oxydation acides aminés, cycle de krebs,synthèse
de l’urée, phosphorylation oxydative et chaine de transport des électrons
Nucleole Biosynthèse de l’AND et de l’ARN

Réticulum Synthèse protéines, synthèse des phospholipides et triacylglycerol,


endoplasmique synthèse steroides, cytochrome P450
Lysosomes Lysozyme, phosphatases, phospholipases, proteases, lipases, nucleases

Appareil de Glucose 6-phosphatase, 5’-nucleotidase, glucosyl- et galactosyl-


golgi transferase
Peroxisomes Calatase, urate oxidase, D-amino acid oxidase, oxydase des acides gras à
longue chaine

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3- Autre système de régulation:
Iso Enzymes

• Groupe d’enzymes:
– catalysent la même réaction
– différent entre eux par: structure, affinité pour
le substrat, Vmax, et régulation.
• Présentes dans des cellules différentes
• Liées à une differenciation de gènes: produit
par des gènes différents ou par des parties
différentes d’un même gène
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Exemple d’isoenzymes
Lactate deshydrogenase (LDH)
• 5 isoenzymes, LDH1 – LDH5
• Tetramères
– M sous unités (M pour muscle)
– H sous unités (H pour coeur)

LDH 1 LDH 2 LDH3 LDH 4 LDH 5

H4 H 3M 1 H 2M 2 H 1M 3 M4

H s u b u n it M s u b u n it

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O
LD H
H
H 3C C COOH H 3C C CO
OH

OH
+
NAD NADH + H
L a c ta te P y r u v a te

• LDH1 (H4) dans le muscle cardiaque convertit le


lactate en pyruvate

• LDH5 (M4) dans le muscle squelettique convertit le


pyruvate en lactate

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10-Applications cliniques des enzymes:

Diagnostic et traitement

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Enzymes: Diagnostic et suivi de pathologies

• Enzymes: équipement intracellulaire

• Libération dans circulation générale: lésions


cellulaires

• Diagnostic et suivi de traitement:


– Infarctus du myocarde: Créatine kinase (CK), Lactate
deshydrgenase (LDH), Aspartate aminotransférase
(ASAT)
– Hépatite: ALAT (alanine amino transférase), ASAT
– Pancréatite: amylase, lipase
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Enzymes for disease diagnosis

Serum enzymes Diseases


(elevated)
Amylase Acute pancreatitis

Serum glutamate pyruvate Liver diseases (hepatitis)


transaminase (SGPT)
Serum glutamate oxaloacetate Heart attack (myocardial infarction)
transaminase (SGOT)
Alkaline phosphatase Rickets, obstructive jaundice

Acid phosphatase Cancer of prostate gland

Lactate dehydrogenase (LDH) Heart attack, liver diseases

γ-glutamyl transpeptidase (GGT) Alcoholism

5’-nucleotidase Hepatitis

Aldolase Muscular dystrophy


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Enzymes: applications thérapeutiques

• Steptokinase: traitement précoce de l’IDM

• Asparaginase: traitement anti tumoral

• Allopurinol: traitement de la goutte

• Thérapie génique: gène codant l’enzyme déficitaire dans


certaines maladies métaboliques héréditaires sévères

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Conclusion

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Les enzymes: les points clés
• Réactions enzymatiques à 2 substrats:
– 3 principaux mécanismes

• Régulation des enzymes par 4 modes principaux


– Protéolyse, modification covalente, allostérie, contrôle de
l’expression des gènes

• L’activité enzymatique:
– est proportionnelle à la concentration en enzyme
– utilisation clinique pour le diagnostic de lésions d’organes
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