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M E S U R E S - A N A LY S E S

Ti630 - Techniques d'analyse

Chromatographie et techniques
séparatives

Réf. Internet : 42385 | 5e édition

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III
Cet ouvrage fait par tie de
Techniques d'analyse
(Réf. Internet ti630)
composé de  :

Chimie analytique : échantillonnage, instrumentation, Réf. Internet : 42379


métrologie

Études de structure et caractérisation Réf. Internet : 42386

Techniques d'analyse par imagerie Réf. Internet : 42387

Méthodes thermiques d'analyse Réf. Internet : 42384

Chromatographie et techniques séparatives Réf. Internet : 42385

Méthodes électrochimiques Réf. Internet : 42388

Méthodes nucléaires d'analyse Réf. Internet : 42389

Spectrométries Réf. Internet : 42390

Analyse des macromolécules biologiques Réf. Internet : 42380

Analyses de surface et de matériaux Réf. Internet : 42383

La science au service de l'art et du patrimoine Réf. Internet : 42579

Analyses dans l'environnement : méthodologies Réf. Internet : 42382

Analyses dans l'environnement : eau et air Réf. Internet : 42831

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IV
Cet ouvrage fait par tie de
Techniques d'analyse
(Réf. Internet ti630)

dont les exper ts scientifiques sont  :

Gwenola BURGOT
Professeur à l'université de Rennes 1

Pierre LE PARLOUËR
Docteur Ingénieur, Consultant société Thermal Consulting

Gérard DURAND
Professeur honoraire à l'École Centrale de Paris, Consultant

Patrick MAUCHIEN
Chef du Service de Chimie Physique au Commissariat à l'Énergie Atomique
Saclay

Philippe QUEVAUVILLER
Commission Européenne, DG Environnement

Jean-François HENNINOT
Professeur, université d'Artois, unité de Catalyse et de Chimie du Solide, équipe
Couches Minces et Nanomatériaux

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V
Les auteurs ayant contribué à cet ouvrage sont :

Patrick ARPINO Karine FAURE Dominique PRADEAU


Pour les articles : P1485 – Pour l’article : P1496 Pour les articles : P1450 –
P1490 – P1491 – P1492 P1451 – P1473 – P1474 – P1476
Xavier FERNANDEZ
Nathalie BARGMANN- Pour les articles : P1488 – P1489 Jean-Hugues RENAULT
LEYDER Pour l’article : J2787
Pour l’article : P1470 Jean-Jacques FILIPPI
Pour l’article : P1489 Michel SABLIER
Stéphane BLAIN Pour l’article : P1487
Pour l’article : P1510 Davy GUILLARME
Pour l’article : P1494 Morgan SARRUT
Katharina BREME Pour l’article : P1457
Pour l’article : P1488 Agnès HAGÈGE
Pour l’article : P3366 Fabienne SÉBY
Gwenola BURGOT Pour l’article : P3872
Pour les articles : P1487 – Sabine HEINISCH
P1430 – P1415 Pour l’article : P1457 Antoine-Michel SIOUFFI
Pour les articles : P1473 – P1474
Marcel CAUDE Thi Ngoc Suong HUYNH
Pour les articles : P1445 – Pour l’article : P3366 Didier THIÉBAUT
P1455 – P1470 Pour l’article : P1460
Alain JARDY
Éric CAUDRON Pour les articles : P1445 – P1455 Jean TRANCHANT
Pour les articles : P1450 – P1451 Pour l’article : P1485
Maud JEANVILLE
Sébastien CHOLLET Pour l’article : P1489 Véronique VACCHINA
Pour l’article : J2787 Pour l’article : P3872
Luc MARCHAL
Chantal DAUPHIN Pour l’article : J2787 Vincent VARLET
Pour les articles : P1473 – Pour l’article : P1488
P1474 – P1476 Valérie PICHON
Pour l’article : P1420 Jean-Luc VEUTHEY
Nathalie DELAUNAY Pour les articles : P1454 – IN187
Pour les articles : P3365 – P3367 Martine POTIN-GAUTIER
Pour l’article : P3872

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VI
Chromatographie et techniques séparatives
(Réf. Internet 42385)

SOMMAIRE

1– Méthodes chromatographiques Réf. Internet page

Méthodes chromatographiques. Introduction P1445 11

Chromatographie en phase liquide. Introduction P1454 13

Chromatographie en phase liquide. Théorie et méthodes de séparation P1455 15

Chromatographie en phase liquide bidimensionnelle (2D-LC) P1457 25

Évolutions majeures en chromatographie liquide P1494 31

Particules superficiellement poreuses en chromatographie liquide IN187 35

Chromatographie en phase supercritique P1460 39

Chromatographie en phase gazeuse P1485 45

Séparations chirales par CPL, CPS et CPG P1470 53

Chromatographie ionique minérale. Phases stationnaires et méthodes de séparation P1450 59

Chromatographie ionique minérale. Méthodes de détection P1451 63

Chromatographie planaire. Partie 1 P1473 67

Chromatographie planaire. Partie 2 P1474 73

Chromatographie planaire  : applications P1476 75

Chromatographie de partage centrifuge. Principes et applications P1496 77

Chromatographie de partage centrifuge. Mise en œuvre, modélisation et changement J2787 81


d'échelle
Couplage CG-SM/SM P1487 85

Couplage chromatographie en phase gazeuse/olfactométrie P1488 89

Chromatographie en phase gazeuse à deux dimensions : GC-GC et GCxGC P1489 95

Couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse. I P1490 99

Couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse. II P1491 103

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VII
Couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse. III P1492 109

Couplage HPLC-ICP-MS et application à la spéciation P3872 115

Analyse par injection en flux continu (FIA) P1510 121

2– Autres méthodes séparatives Réf. Internet page

Extraction sur phase solide pour l'analyse de composés organiques P1420 127

Microextraction en phase solide (SPME) P1430 131

Électrophorèse capillaire. Principe P3365 137

Electrophorèse capillaire. Applications P3367 143

Électrophorèse capillaire. Appareillage P3366 151

Décantation-Filtration P1415 155

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Chromatographie et techniques séparatives
(Réf. Internet 42385)

1
1– Méthodes chromatographiques Réf. Internet page

Méthodes chromatographiques. Introduction P1445 11

Chromatographie en phase liquide. Introduction P1454 13

Chromatographie en phase liquide. Théorie et méthodes de séparation P1455 15

Chromatographie en phase liquide bidimensionnelle (2D-LC) P1457 25

Évolutions majeures en chromatographie liquide P1494 31

Particules superficiellement poreuses en chromatographie liquide IN187 35

Chromatographie en phase supercritique P1460 39

Chromatographie en phase gazeuse P1485 45

Séparations chirales par CPL, CPS et CPG P1470 53

Chromatographie ionique minérale. Phases stationnaires et méthodes de séparation P1450 59

Chromatographie ionique minérale. Méthodes de détection P1451 63

Chromatographie planaire. Partie 1 P1473 67

Chromatographie planaire. Partie 2 P1474 73

Chromatographie planaire  : applications P1476 75

Chromatographie de partage centrifuge. Principes et applications P1496 77

Chromatographie de partage centrifuge. Mise en œuvre, modélisation et changement J2787 81


d'échelle
Couplage CG-SM/SM P1487 85

Couplage chromatographie en phase gazeuse/olfactométrie P1488 89

Chromatographie en phase gazeuse à deux dimensions : GC-GC et GCxGC P1489 95

Couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse. I P1490 99

Couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse. II P1491 103

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9
Couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse. III P1492 109

Couplage HPLC-ICP-MS et application à la spéciation P3872 115

Analyse par injection en flux continu (FIA) P1510 121

2– Autres méthodes séparatives

10
Référence Internet
P1445

Méthodes chromatographiques
Introduction
par Marcel CAUDE
1
Ingénieur du Conservatoire National des Arts et Métiers (CNAM)
Docteur ès sciences
Directeur de Recherche au Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
et Alain JARDY
Ingénieur CNAM
Docteur ès sciences
Maître de Conférences à l’École Supérieure de Physique et Chimie de Paris

1. Principe....................................................................................................... PE 1445 - 3
2. Classification selon la finalité .............................................................. — 5
2.1 Chromatographie analytique...................................................................... — 5
2.2 Chromatographie préparative .................................................................... — 7
2.3 Analyse de traces et traitement de l’échantillon...................................... — 7
Bibliographie ...................................................................................................... — 7

ien que certains historiens fassent remonter l’origine de la chromatographie


B jusqu'à l’Antiquité, on retient, généralement, les travaux du botaniste russe
Tswett, qui, en séparant les pigments de la chlorophylle sous la forme d’anneaux
colorés sur une colonne remplie de carbonate de calcium, a donné le nom de
chromatographie (séparation selon les couleurs) à la méthode (1903). Ont été
rassemblées ici quelques grandes dates de l’évolution de la chromatographie :
1903 − Séparation de pigments (Tswett)
1931 − Séparations préparatives (Kuhn et Lederer)
1938 − Chromatographie sur couche mince (Ismailov et Shraiber)
1939 − Chromatographie par échange d’ions (Samuelson)
1941 − Chromatographie de partage (Martin et Synge)
1952 − Chromatographie en phase gazeuse sur colonnes remplies (James et
Martin)
1954 − Séparation des acides aminés par chromatographie d’échange d’ions
(Moore et Stein)
1959 − Chromatographie en phase gazeuse sur colonnes capillaires (Golay)
1962 − Chromatographie en phase supercritique (Klesper)
1968 − Chromatographie en phase liquide à haute performance (Giddings et
Kirkland)
Comme on le constate, peu de techniques analytiques ont connu un essor
comparable ni aussi diversifié que la chromatographie au cours de cinq derniè-
res décennies. Ce succès tient, dans une large mesure, au fait que se trouvent
associés une méthode séparative rapide et performante et des détecteurs sensi-
bles et variés permettant non seulement, une quantification des espèces sépa-
rées, mais aussi, pour certains d'entre eux, une identification des espèces.
De ce fait, la chromatographie se prête bien à l’analyse de mélanges
complexes tels ceux que l’on peut rencontrer dans des domaines aussi différents
que les produits pétroliers, les polymères ou les fluides biologiques et à l’ana-
Parution : avril 1996

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation PE 1 445 − 1

11
Référence Internet
P1445

MÉTHODES CHROMATOGRAPHIQUES ______________________________________________________________________________________________________

lyse de traces dans des milieux aussi variés que l’étude de l’environnement
ou le contrôle de la pureté optique de molécules thérapeutiques.

Abréviations et sigles couramment utilisés

1
avec les méthodes chromatographiques
Général
HEPT Hauteur équivalente HETP Height equivalent
à un plateau théorique to a theoretical plate
CGV Chromatographie à grande HSC High speed chromatography
vitesse
Chromatographie en phase gazeuse
CPG Chromatographie en phase GC Gas chromatography
gazeuse
CGS Chromatographie gaz-solide GSC Gas-solid chromatography
CGL Chromatographie gaz-liquide GLC Gas-solid chromatography
Chromatographie en phase liquide
CPL Chromatographie en phase LC Liquid chromatography
liquide
CLHP Chromatographie en phase HPLC High-performance liquid
liquide à haute performance chromatography
CLS Chromatographie liquide- LSC Liquid-solid chromatography
solide
CLL Chromatographie liquide- LLC Liquid-liquid chromatography
liquide
CPPI Chromatographie de partage RPC Reversed-phase
à polarité de phases inversée chromatography
NPC Normal-phase
chromatography
BPC Bonded-phase
chromatography
CEI Chromatographie d'échange IEC Ion-exchange
d’ions chromatography
CI Chromatographie ionique IC Ion chromatography
CII Chromatographie IIC Ion-intersection
d’interactions ioniques chromatography
CES Chromatographie SEC Size-exclusion
d’exclusion stérique chromatography
CPG Chromatographie GPC Gel permeation
de perméation sur gel chromatography
CFG Chromatographie de filtration GFC Gel filtration chromatography
sur gel
CEL Chromatographie d’échange LEC Ligand-exchange
de ligands chromatography
FFF Fractionement flux force FFF Field flow fractionation
CP Chromatographie planaire PC Planar chromatography
CCM Chromatographie sur couche TLC Thin-layer chromatography
mince
CPC Chromatographie de partage CPC Centrifugal partition
centrifuge chromatography
CCC Chromatographie CCC Counter-current
à contre-courant chromatography
CLLC Chromatographie liquide- CLLC Centrifugal liquid-liquid
liquide centrifuge chromatography
PSC Phase stationnaire chirale CSP Chiral stationary phase

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PE 1 445 − 2 © Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation

12
Référence Internet
P1454

Chromatographie en phase liquide


Introduction
1
par Jean-Luc VEUTHEY
Professeur, Unité de Sciences Analytiques,
Section des sciences pharmaceutiques, Université de Genève, Suisse

1. Phase stationnaires en chromatographie en phase liquide ..... P 1 454 - 2


2. Instrumentation .................................................................................... — 2
3. Types de chromatographie ................................................................ — 2
4. Traitement des données ..................................................................... — 3
Pour en savoir plus ....................................................................................... Doc. P 1 454

a chromatographie en phase liquide (CPL) est devenue la technique analy-


L tique de référence dans de nombreux domaines requérant la séparation et la
quantification de composés présents dans différentes matrices (environnemen-
tales, biologiques, chimiques, etc.). Cette technique est basée sur la différence
de distribution des composés entre deux phases non miscibles : une phase
mobile constituée d’un solvant et une phase stationnaire contenue dans une
colonne. Les interactions mises en jeu, qui doivent avoir une cinétique rapide et
être réversibles, peuvent être de différentes natures telles que de l’adsorption,
du partage ou de l’échange d’ions par exemple. À la sortie de la colonne chro-
matographique, les composés séparés sont révélés en ligne au moyen d’un
détecteur approprié. De nombreux détecteurs peuvent être utilisés et leur choix
est fonction de la nature des composés séparés et des sensibilités requises. Les
deux détecteurs les plus répandus aujourd’hui sont le spectrophotomètre UV-
visible et le spectromètre de masse. Ce dernier a révolutionné l’usage de la
CPL depuis le début du XXIe siècle de par ses extraordinaires propriétés en
termes de sensibilité, de quasi-universalité, de sélectivité et d’informations struc-
turelles pouvant être obtenues. La chromatographie en phase liquide a
désormais largement remplacé la chromatographie en phase gazeuse, qui
demeure toutefois la technique de choix pour l’analyse des composés volatils
dans différents domaines tels que les produits pétroliers.
À partir du XXIe siècle, la CPL a également connu une importante évolution
en termes d’instrumentation avec des systèmes de pompes pouvant délivrer la
phase mobile à de très hautes pressions (jusqu’à 1 500 bar aujourd’hui), des
volumes extra-colonne très réduits et des phases stationnaires de petite taille
permettant de réaliser des séparations très rapides (moins d’une minute) ou/et
avec une très grande capacité de pics. Cette technologie connue sous le nom
de chromatographie liquide à ultra haute performance UHPLC (Ultra
High Performance Liquid Chromatography) permet de répondre aux exigences
requises par les autorités en termes de rapidité, de sensibilité et de coût d’ana-
lyse et elle est désormais répandue dans tous les domaines allant de l’analyse
des fluides biologiques à celle des matrices environnementales.
Cet article se propose de faire le point sur cette nouvelle technologie en dis-
cutant la nature des phases stationnaires, l’amélioration de l’instrumentation,
les types de séparation développés pour de nouvelles applications ainsi que le
traitement des données en termes de logiciels d’optimisation de méthode et de
Parution : mars 2020

critères de validation.

Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservés P 1 454 – 1

13
1

14
Référence Internet
P1455

Chromatographie en phase liquide


Théorie et méthodes de séparation
par Marcel CAUDE
1
Ingénieur du Conservatoire National des Arts et Métiers (CNAM)
Docteur ès Sciences
Directeur de Recherche au Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
et Alain JARDY
Ingénieur CNAM
Docteur ès Sciences
Maître de Conférences à l'École Supérieure de Physique et Chimie de Paris

1. Grandeurs fondamentales ..................................................................... PE 1 455 - 2


1.1 Grandeurs de rétention ............................................................................... — 3
1.2 Sélectivité ..................................................................................................... — 3
1.3 Efficacité d'une colonne .............................................................................. — 4
1.4 Résolution .................................................................................................... — 4
1.5 Perte de charge et facteur de résistance à l'écoulement.......................... — 4
1.6 Capacité disponible ..................................................................................... — 5
2. Cinétique .................................................................................................... — 5
2.1 Grandeurs réduites...................................................................................... — 5
2.2 Mécanismes de dispersion d'un pic d'élution........................................... — 6
2.3 Équation de Knox ........................................................................................ — 7
3. Classification et sélection des solvants ............................................ — 7
3.1 Propriétés des solvants ............................................................................... — 7
3.2 Sélection des solvants................................................................................. — 10
4. Séparation de solutés moléculaires ................................................... — 10
4.1 Chromatographie d'adsorption .................................................................. — 10
4.2 Chromatographie de partage sur phases stationnaires polaires ............ — 16
4.3 Chromatographie de partage sur phases apolaires ................................. — 18
5. Séparation de solutés ionisés .............................................................. — 25
5.1 Chromatographie d'échange d'ions........................................................... — 26
5.2 Chromatographie de paires d'ions............................................................. — 30
6. Séparation de solutés donneur ou accepteur de doublets
électroniques............................................................................................. — 34
6.1 Chromatographie d'échange de ligands ................................................... — 34
6.2 Chromatographie par transfert de charges ............................................... — 36
7. Choix d'une méthode de séparation................................................... — 38
7.1 Guide de sélection ....................................................................................... — 38
7.2 Exemple : analyse des sucres..................................................................... — 41
8. Optimisation.............................................................................................. — 41
8.1 Optimisation de la résolution ..................................................................... — 41
8.2 Optimisation multiparamètre ..................................................................... — 44
9. Analyse quantitative ............................................................................... — 45
9.1 Mesure de l'aire d'un pic............................................................................. — 45
9.2 Mesure des coefficients de réponse .......................................................... — 45
9.3 Détermination des concentrations ............................................................. — 46
9.4 Précautions opératoires et problèmes liés à la chromatographie en
phase liquide................................................................................................ — 47
9.5 Précision des analyses en CPL ................................................................... — 48
Parution : octobre 1994

Pour en savoir plus........................................................................................... Doc. PE 1 458

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15
Référence Internet
P1455

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE ___________________________________________________________________________________________________

L a chromatographie en phase liquide (CPL) est une méthode de séparation


mettant en œuvre différents modes représentés sur la figure 1 (les chroma-
tographies d'exclusion stérique et chirale faisant l'objet d'articles séparés de ce
traité).

1 Chromatographie
en phase liquide

Adsorption Partage Échange Paires Échange Transfert


sur phases d'ions d'ions de ligands de charge

polaires apolaires

Figure A – Méthodes de séparation en chromatographie en phase liquide

La chromatographie en phase liquide sur colonnes est devenue un outil analy-


tique performant utilisé dans des domaines variés allant de l'analyse de fluides
biologiques à celui des produits pétroliers lourds. Ce développement est dû à la
fois à une meilleure compréhension des mécanismes d'interaction - au demeu-
rant de plus en plus diversifiés -, aux grandes efficacités obtenues avec des pha-
ses stationnaires de plus en plus fines (3 µm) et enfin aux progrès importants
effectués dans le domaine de l'appareillage, en particulier pour la détection.
La CPL se présente ainsi comme une méthode de séparation complémentaire
de la chromatographie en phase gazeuse (CPG) pour l'analyse de solutés peu
volatils ou thermodégradables (cas de la majorité des molécules thérapeuti-
ques). Elle se distingue de la CPG par la variété des phases stationnaires et par-
tant des interactions mises en jeu et par une température moins élevée, ce qui
accroît la force de ces interactions et augmente la sélectivité.
En revanche, la CPL est une méthode de mise en œuvre plus délicate que la
CPG ; de plus, malgré les progrès récents, elle souffre encore de l'absence de
détecteurs aussi sensibles et universels que la détection à ionisation de flamme
de la CPG.

1. Grandeurs fondamentales bution de chaque soluté entre les deux phases par le coefficient de
distribution (ou coefficient de partage) K défini par la relation :

C
K = -------s- (1)
Les références bibliographiques sont données dans le fasci- Cm
cule [Doc. P 1 458].
Concernant les chromatographies d’exclusion stérique et chi- Cs et Cm désignant respectivement les concentrations du soluté à
rale, le lecteur se reportera aux articles [111] [112] des Techni- l’équilibre dans les phases stationnaire et mobile.
ques de l’Ingénieur, et à l’article [113] concernant la Chaque soluté injecté sur la colonne est soumis à deux effets
chromatographie en phase gazeuse. antagonistes : un effet d’entraînement par la phase mobile dans
laquelle il est soluble et un effet de rétention par la phase station-
naire avec laquelle il interagit ; on conçoit que divers constituants
En chromatographie en phase liquide [1] comme dans toute d’un mélange présentant des caractéristiques de distribution diffé-
méthode chromatographique, les séparations sont fondées sur la rentes progresseront dans la colonne à des vitesses différentes,
différence de distribution des espèces entre deux phases non misci- l’effet retardateur exercé par la phase stationnaire étant d’autant
bles, l’une stationnaire (silice vierge ou greffée, polymère molécu- plus prononcé qu’ils ont plus d’affinité pour celle-ci.
laire ou échangeur d’ions), l’autre mobile (phase liquide constituée Si les quantités injectées sont suffisamment faibles, on observe à
par un solvant pur ou plus souvent par un mélange de solvants). la sortie du détecteur des pics symétriques, sensiblement gaus-
Pour un système chromatographique donné, on caractérise la distri- siens.
Une bonne séparation en chromatographie en phase liquide
implique :

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PE 1 455 − 2 © Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation

16
Référence Internet
P1455

___________________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE

— que les divers constituants du mélange soient retenus dans la identification (en dopant l’échantillon avec le composé que l’on
colonne, donc présentent une affinité pour la phase stationnaire suf- pense avoir identifié : épreuve du mélange).
fisante pour qu'ils apparaissent dans l'effluent après un volume
supérieur au volume de phase mobile contenu dans la colonne ; Les espèces n’ayant aucune affinité pour la phase stationnaire,
— que les différents pics soient bien séparés, ce qui, pour deux donc non retenues, apparaissent dans l’effluent après le temps t0 dit
pics consécutifs, implique que les bandes de solutés se séparent temps de rétention nulle correspondant à l’écoulement du volume
entre elles (sélectivité) plus vite qu'elles ne s'étalent (efficacité) ; de phase mobile Vm contenu dans la colonne (Vm = Vi + Vp , Vi
— que l'analyse soit aussi rapide que possible. volume interstitiel et Vp volume poreux).
Nous examinerons successivement les différentes grandeurs
caractéristiques correspondantes.
Le volume de rétention VR est relié directement au coefficient de
distribution K par la relation : 1
VR = Vm + K V s

1.1 Grandeurs de rétention avec Vs volume de la phase stationnaire (ou masse Wa ou


surface spécifique du support selon les unités dans
lesquelles K est exprimé).
On appelle temps de rétention tR le temps d’élution au sommet
du pic, mesuré à partir de l’injection (figure 2).
Remarque : cette relation ne s’applique que dans le cas de
l’élution linéaire, c’est-à-dire si le coefficient de distribution est
indépendant de la concentration du soluté dans la phase
mobile.

Afin de s’affranchir des paramètres géométriques de la colonne,


tR on utilise, pour caractériser la rétention d’un composé, le facteur de
capacité k’, défini comme le rapport de la quantité de soluté dans la
phase stationnaire à la quantité de soluté dans la phase mobile ; on
a:

Cs Vs Vs
k ′ = ---------------
- = K -------
Cm Vm Vm

soit :
δ H V R Ð Vm tR Ð t0
k′ = --------------------
- = --------------
- (3)
Vm t0

Le temps de rétention est ainsi lié au facteur de capacité par la


H relation :
2
tR = t0 (1 + k’ )
Injection

ou encore, le temps de rétention t0 d’un composé non retenu étant


égal au quotient de la longueur L de la colonne par la vitesse linéaire
u de la phase mobile :
ω
L
t R = --- ( 1 + k ′ )
H hauteur du pic ω largeur à la base u
tR temps de rétention δ largeur à mi-hauteur

Figure 1 – Caractéristiques d’un pic chromatographique


Remarque : en CPL, la mesure de t0 (ou Vm ) ne peut se faire
qu’en injectant un composé dont on est sûr qu’il n’est effective-
ment pas retenu sur la colonne dans les conditions choisies. On
injecte à cet effet une petite quantité d’un solvant de force
Si D est le débit, maintenu constant, de la phase mobile, on défi- éluante inférieure à celle de la phase mobile.
nit le volume de rétention VR :
)

V R = t R D = t R u sε (2)

avec s section droite de la colonne, 1.2 Sélectivité


u vitesse linéaire de la phase mobile,
ε porosité de la colonne (≈ 0,75 pour les silices Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics
poreuses). consécutifs 1 et 2, on utilise la sélectivité α (ou rétention relative)
VR représente, à l’étalement du pic près, le volume de phase définie par la relation :
mobile nécessaire pour éluer chaque composé. Le temps de réten-
tion ou le volume de rétention sont des grandeurs caractéristiques t R2 Ð t 0 k ′2 K 2
de chaque composé, dans des conditions et pour une colonne α = ----------------- = ------- = ------ (4)
t R1Ð t 0 k ′1 K 1
données : ils peuvent servir à l’analyse qualitative en procédant par

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La sélectivité α mesure la différence de distribution thermodyna- deux composés conduisant à des pics de surface voisine, la sépara-
mique des deux composés ; on a : tion est pratiquement complète quand RS = 1, puisqu’il n’y a alors
que 2 % de recouvrement des deux pics. Pour des valeurs de RS
K2 0
∆(∆G ) inférieures à 1, les pics se chevauchent et, pour RS < 0,8, la sépara-
In α = In ------ = Ð -------------------- tion est généralement insuffisante.
K1 RT
De même, pour une valeur de RS donnée, la séparation est
avec ∆ (∆G0) différence des enthalpies libres de distribution d’autant plus mauvaise que le rapport des aires des deux pics est

1
0 0 0 plus grand.
des deux composés : ∆ ( ∆ G ) = ∆ G 2 Ð ∆ G 1 ,
En supposant les largeurs des pics à la base égales, donc dans le
R constante molaire des gaz (= 8,31 J · mol–1 · K–1),
cas de pics très voisins, on établit que la résolution RS peut être
T température (K). exprimée par la relation :
Ces différences ∆ (∆G0) dans la distribution des solutés entre les
1 αÐ1 k ′2
R S = ---  -------------  ----------------- ( N 2 )
deux phases résultent de l’ensemble des interactions spécifiques 1⁄2
ioniques ou moléculaires, auxquelles ils sont soumis de la part de la 4 α 1 + k ′2
phase stationnaire et de la phase mobile.
(l’indice 2 se rapportant au composé le plus retenu).
Cette expression constitue la relation liant la résolution aux trois
paramètres chromatographiques principaux :
1.3 Efficacité d'une colonne
— le premier terme (en α) exprime l'influence de la sélectivité,
— le second terme (en k’ ) exprime l'influence du facteur de capa-
L’efficacité d’une colonne chromatographique, dont dépend l’éta- cité,
lement des pics, est mesurée, pour chaque composé, par le nombre — le dernier terme, N2, exprime l'influence de l'efficacité de la
de plateaux théoriques N de la colonne. colonne.
En assimilant les pics d’élution à des courbes de Gauss, on établit On pourra améliorer une séparation en jouant sur l’un au moins
que le nombre de plateaux théoriques d’une colonne s’exprime, de ces trois facteurs.
pour un soluté donné, par les relations : Une autre approximation possible en CPL consiste à supposer le
2 2
nombre de plateaux identique pour chacun des deux solutés
tR tR
N = 16  ----- = 5,54  ----- (5) (N1 = N2 = N ). La résolution est alors donnée par la relation :
ω δ
1 αÐ1 k′
avec ω largeur du pic à la base, définie comme la distance R S = ---  -------------  -------------- N
2 α + 1 1 + k‘
entre les points d’intersection des tangentes
d’inflexion avec la ligne de base, k ‘ étant le facteur de capacité moyen :
δ largeur du pic à mi-hauteur.
k ′1 + k ′2
Ce paramètre, qui rend compte de la cinétique de tous les méca- k ′ = --------------------
-
nismes de partage du soluté entre les deux phases, dépend de la 2
nature et de l’intensité de toutes les interactions mises en jeu et, par
suite, des conditions expérimentales et de la nature même du On remarquera que, quelle que soit la relation utilisée, les conclu-
soluté. sions demeurent inchangées quant aux rôles des paramètres chro-
matographiques.
En pratique, on mesure directement tR et δ (ou ω ) sur le chroma-
togramme (figure 2), préférant en général la mesure de δ à celle de
ω pour des raisons de meilleure répétabilité.
Pour pouvoir comparer entre elles des colonnes de différentes 1.5 Perte de charge et facteur de
longueurs, on définit la hauteur équivalente à un plateau théorique résistance à l'écoulement
(HEPT ou H ) :
L Une autre caractéristique importante d’une colonne chromatogra-
H = ---- (6)
N phique est sa résistance à l’écoulement. La perte de charge d’une
colonne est donnée par la loi de Darcy :
avec L longueur de la colonne.
Nota : il existe d'autres méthodes de détermination du nombre de plateaux théoriques Φη Lu
contenus dans une colonne [2], y compris dans le cas de pics d'élution dissymétriques [3]. ∆ P = ---------------
2
- (8)
( dp )

avec dp (cm) diamètre moyen des particules,


1.4 Résolution L (cm) longueur de la colonne,
∆P (Pa) perte de charge (10–6 bar ≈ 10–6 atm ≈ 10–
1 Pa),
La résolution RS entre deux pics est définie par la relation :
u (cm · s–1) vitesse linéaire de la phase mobile,
( t R2 Ð t R1 )
R S = 2 ------------------------ (7) η (Pa · s) viscosité dynamique de la phase mobile,
ω2 + ω1
Φ (sans dimension) facteur de résistance à l’écoule-
ω2 et ω1 étant les largeurs à la base, déterminées comme précédem- ment.
ment par l’intersection des tangentes aux points d’inflexion des pics En pratique, la valeur de Φ dépend de la forme des particules, de
avec la ligne de base. leur réparation granulométrique autour de la valeur moyenne, de la
Il découle directement de cette définition que la séparation entre texture de la phase stationnaire et de la qualité du remplissage.
deux pics est d’autant meilleure que RS est plus grand. Ainsi, pour Ainsi Φ est voisin de 500 pour des particules poreuses de forme

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sphérique, de 1 000 pour des particules poreuses de forme irrégu- le même nombre de particules au cours de sa progression dans la
lière. colonne, et l’on montre que cela conduit à une même efficacité si
elles sont mises en œuvre avec la même vitesse réduite.
Exemple : pour l = 20 000, une colonne de 10 cm remplie avec des
1.6 Capacité disponible particules de 5 µm a une efficacité analogue à celle d'une colonne de
100 cm remplie avec des particules de 50 µm.

1
La capacité disponible CD d’une phase stationnaire est définie
comme la quantité de soluté injectée qui provoque la saturation de 2.1.2 Hauteur de plateau réduite
la phase stationnaire contenue dans la colonne dans des conditions
déterminées. On l’exprime en nombre de millimoles de solutés par La hauteur de plateau réduite h est définie par la relation :
gramme de phase stationnaire :
H l
h = ------ = ---- (12)
Q dp N
C D = ------S- (9)
m
Elle représente le nombre de couches de particules par plateau
avec QS quantité de soluté fixée à l’équilibre (à saturation) théorique. h permet de comparer entre elles les efficacités de colon-
par la phase stationnaire, nes remplies avec des particules de taille différente. Une colonne
m masse de phase stationnaire contenue dans la efficace utilisée au voisinage des conditions optimales a une hau-
colonne. teur de plateau réduite comprise entre 2 et 4 environ.
Les variations de la capacité disponible CD en fonction de la con-
centration du soluté dans la phase mobile constituent l’isotherme 2.1.3 Vitesse réduite de la phase mobile
de distribution.
On définit la vitesse réduite de la phase mobile ν par :
2
ud ld p
2. Cinétique ν = ---------p = ------------
Dm t0 Dm
- (13)

où Dm est le coefficient de diffusion moléculaire du soluté dans la


phase éluante.
2.1 Grandeurs réduites
La vitesse réduite est le rapport de la vitesse linéaire de la phase
éluante et de la vitesse de diffusion du soluté sur une distance égale
Dans la théorie des plateaux, la HEPT déduite de la variance σ 2 du au diamètre d’une particule. Les valeurs types que l’on peut prendre
pic d’élution : pour Dm dans le cas d’un soluté de masse molaire faible (voisine de
100 g) sont les suivantes :
2
L Lσ — dans l'hexane : 3 · 10–9 m2 · s–1
H = ---- = ---------
- (10) — dans l'eau : 10–9 m2 · s–1
N tR
2
— dans le propanol : 3 · 10–10 m2 · s–1.
n’apparaît que comme une mesure globale de l’influence de tous les En effet, Dm dépend à la fois de la nature du soluté et de celle de
paramètres expérimentaux mis en jeu, mais elle ne permet pas de la phase éluante. Il peut être calculé (en m2 ·s–1) à l’aide de l’équa-
préciser la part revenant à chacun de ceux-ci dans l’étalement du pic tion [4] [5] [6] :
au fur et à mesure de sa progression dans la colonne. Or l’étalement
Ð 15
dépend : 6,9 · 10 T ψ MS
D m = ---------------------------------------------------
-
— du diamètre et de la nature des particules de la phase station- ηV
0,6
naire,
— de la nature et de la vitesse de la phase éluante, T température (K),
— de la nature du soluté, ψ facteur d’association du solvant égal à 1 pour les
— de l'homogénéité du remplissage de la colonne. solvants non donneurs de liaisons hydrogène, 1,5 pour
Afin de préciser la contribution de chaque paramètre à la HEPT l’éthanol, 1,9 pour le méthanol et 2,6 pour l’eau,
globale et de permettre une optimisation aisée des conditions d’une MS masse molaire du solvant (g),
analyse, on utilise la notion de grandeurs réduites, adimensionnel-
les. Ces dernières permettent alors de comparer entre elles des V volume molaire du soluté à température ambiante
colonnes remplies avec des particules de phase stationnaire de (cm3 · mol–1),
dimension et de nature différentes et utilisées dans des conditions η viscosité du solvant (Pa · s).
opératoires variées. L’équation précédente peut également être utilisée, en première
approximation, dans le cas d’un mélange de solvants A et B en pre-
nant pour Ψ MS la moyenne pondérée des valeurs pour les solvants
2.1.1 Longueur réduite purs :

On définit la longueur réduite l d’une colonne par le rapport : ( ψM S ) A + B = x A ( ψM S ) A + x B ( ψM S ) B

L xA et xB désignant les fractions volumiques de A et B dans le


l = ------ (11)
dp mélange et η étant la valeur calculée au moyen de la relation :
yA yB
Elle représente le nombre de « tranches » de particules (d’épais- η = ( ηA ) . ( ηB )
seur dp ) contenues dans la colonne. Pour des colonnes ayant même
longueur réduite, une molécule de soluté rencontrera en moyenne yA et yB désignant les fractions molaires de A et B dans le mélange.

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2.2 Mécanismes de dispersion d'un pic 2.2.2 Résistance au transfert de masse


d'élution
Du fait du mouvement relatif des deux phases, l’équilibre de
répartition du soluté entre les deux phases n’est pas atteint et il
Pour obtenir le nombre maximal de plateaux théoriques N dans
une colonne, il faut définir les conditions où la hauteur de plateau apparaît deux profils de concentration du soluté dont le déphasage
réduite h est minimale (N = l/h ). On est ainsi conduit à étudier les s’accroît avec la vitesse réduite ν, d’où un élargissement progressif

1
différents mécanismes d’élargissement d’une bande de soluté au du pic. Ce déphasage résulte de la limitation de la cinétique du pro-
cours de sa progression au sein d’une colonne chromatographique cessus d’adsorption-désorption, ou transfert de masse, par la diffu-
et à préciser l’influence de chacun de ceux-ci sur la valeur de h. sion du soluté, principalement dans la phase stationnaire (phase
On peut considérer, dans le cas du développement par élution mobile intraparticulaire et phase liquide stationnaire contenue dans
linéaire, que l’étalement d’une bande de soluté a trois origines : les pores). La figure 3d et e schématise l’étalement de la bande de
— la dispersion des molécules par diffusion longitudinale ; soluté dû à ces deux phénomènes. Celui-ci dépend du chemin par-
— l'existence de « chemins multiples » dus au remplissage (ani- couru dans la phase éluante pendant le temps de séjour moyen t
sotropie d'écoulement) ; d’une molécule de soluté dans la phase stationnaire. Pendant ce
— la résistance au transfert de masse dans chacune des deux temps, les molécules de soluté entraînées par l’éluant ont parcouru
phases ; une distance proportionnelle à sa vitesse linéaire. Le terme
Si on calcule la variance correspondant à chacun de ces facteurs, htransfert de masse est proportionnel à cette distance et, par suite, à la
la variance totale étant égale à la somme des variances dans le cas vitesse réduite ν :
de processus indépendants, la HEPT globale apparaîtra comme la
somme de plusieurs termes, chacun de ceux-ci représentant la
htransfert de masse = Cν
contribution d’un facteur déterminé :

H = ∑ H i = H diff. long. + H flux + H transfert de masse


i Largeur initiale
de la bande
et par suite, pour la hauteur de plateau réduite :

h = ∑ hi = h diff. long. + h flux + h transfert de masse


i

À la suite des travaux de Giddings [7] sur la théorie dynamique de a au sommet de la colonne,
à l'injection
la chromatographie, différents modèles ont été élaborés sur ce prin-
cipe. Parmi ces derniers, le modèle de Knox [8] présente l’avantage
d’être simple – même si des corrections lui ont été apportées – et de ANISOTROPIE D'ÉCOULEMENT : TERME A
permettre de s’affranchir de la dimension des particules ; il permet
une optimisation aisée des conditions d’une analyse et il est en bon
accord avec un grand nombre de résultats expérimentaux. C’est Étalement
celui que nous utiliserons ici. À l’aide de ce modèle, on peut explici-
ter chacun des termes des équations précédentes représentant la
contribution d’un facteur d’élargissement du pic.
b différents chemins c profil de vitesse au sein
d'une même veine
2.2.1 Diffusion moléculaire longitudinale RÉSISTANCE AU TRANSFERT DE MASSE : TERME C

Ce terme, de la forme hdiff. long. = B/ν traduit l’influence de la dis-


persion des molécules du soluté par diffusion longitudinale, c’est-à-
dire dans une direction parallèle à l’axe de la colonne. Dans toute Dm
,,,,,,,,,,,,
,,,,,,,,,,,,,,,,,,
,,,,,,
,,,,,,,,,,,,,,,,,,
,,,,,,,,,,,,
,,,,,,,,,,,,
,,,,,,,,,,,
,,,,,,,,,

bande de soluté, il apparaît un gradient de concentration, parallèle à


,,,,,,,,,,

Ds
,,,,

l’axe de la colonne, lors de sa migration. Il en résulte une diffusion Étalement


du soluté des régions de fortes concentrations vers celles de faibles
concentrations ; cette diffusion intervient aussi bien dans la phase
d phase mobile e phase liquide
mobile circulant dans et autour des particules de la phase station- intraparticulaire stationnaire
naire que dans la phase liquide stationnaire tapissant les pores. La
contribution de ce phénomène à l’élargissement de la bande de
soluté fait intervenir : Figure 2 – Différents facteurs d’étalement des pics d’élution

Dm le coefficient de diffusion du soluté dans la phase éluante,


Ds le coefficient de diffusion du soluté dans la phase liquide
stationnaire dont la composition est différente de celle de la Le coefficient C est souvent compris entre 0,01 et 0,2 mais peut
phase mobile. prendre des valeurs plus élevées dans le cas des phases stationnai-
de même que le temps passé par le soluté dans chacune de ces pha- res polymères [11] ou encore de solutés très volumineux tels que les
ses, lui-même inversement proportionnel à la vitesse linéaire u de la protéines lorsque les dimensions des pores ne sont pas nettement
phase éluante. supérieures à celles des molécules de solutés [12].
La valeur B est très souvent prise égale à 2 bien qu’il ait été mon-
tré qu’elle dépende faiblement de la rétention du soluté et de la Comme dans le cas de B, la valeur de C varie avec la rétention du
nature de la phase stationnaire [9] [10]. soluté et la nature de la phase stationnaire [9] [10].

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2.2.3 Anisotropie d'écoulement


lg h
Il existe, pour la phase mobile, plusieurs chemins possibles à tra-
vers le lit de particules de la phase stationnaire et un profil de
2
vitesse au sein de chaque veine liquide (figure 3c). La vitesse
moyenne au sein de chaque veine liquide varie et ce d’autant plus
que les chemins sont plus différents (figure 3b). Alors que le temps

1
de rétention est régi par la vitesse moyenne u, ces différences 1
entraînent un certain étalement du profil de concentration du soluté,
h Aν1/3
c’est-à-dire un étalement du pic. Cependant, ce phénomène se
B/ν
trouve atténué par le fait que les molécules de soluté ne sont pas
prisonnières d’une veine liquide, mais au contraire peuvent changer 0

de veine par diffusion transversale. Cela contribue à une relaxation
du profil des vitesses et limite la dispersion du soluté d’autant
mieux que le remplissage de la colonne est plus homogène. Cette –1 0 1 2 3 lg ν
dernière condition implique une méthode de remplissage efficace et
une distribution étroite du diamètre des particules de la phase sta-
tionnaire. a coordonnées logarithmiques
Le calcul de la contribution du spectre de vitesses résultant de ce A=1 B=2 C=0,1
couplage à la hauteur de plateau réduite est difficile car, pour deux
facteurs non indépendants, les variances ne sont plus additives [7].
Néanmoins, Knox [8] a montré que l’on pouvait prendre avec une h
bonne approximation :
30
hflux ≈ Aν1/3
La valeur de la constante A dépend beaucoup de la régularité du
remplissage et de l’uniformité de la répartition granulométrique de 20
la phase stationnaire utilisée. Pour une colonne bien remplie avec
des particules homogènes, A est compris entre 0,5 et 1. En pratique,
des valeurs plus élevées, par exemple supérieures à 3, sont l’indice
d’un mauvais remplissage de la colonne ou d’une répartition granu- 10
lométrique trop large des particules du support.

2.3 Équation de Knox 0 10 20 30 40 50 ν

b coordonnées linéaires
Finalement la hauteur de plateau varie avec la vitesse réduite
selon l’équation :
Figure 3 – Variation de la hauteur de plateau réduite h en fonction de
1⁄3 B la vitesse réduite ν
h = Aν + ---- + Cν (14)
ν
La variation de h en fonction de ν, avec les valeurs moyennes l’une au voisinage de ν = 3 (généralement proche de l’optimum),
A = 1, B = 2 et C = 0,1, est représentée en coordonnées logarithmi- l’autre pour ν = 10 ou 20.
ques et linéaires sur la figure 4. Aux faibles valeurs de ν, le terme
B/ν prédomine (la courbe devient asymptotique à une droite de
pente – 1) et explique la perte d’efficacité vers les très faibles vites-
ses. Aux grandes vitesses réduites, le terme Cν prédomine (la
courbe devient asymptotique à une droite de pente 1) et explique 3. Classification et sélection
la perte d’efficacité aux très grandes vitesses. Dans la région inter-
médiaire, le terme Aν1/3 est prépondérant et h passe par un mini- des solvants
mum hmin = 2,4, pour une vitesse réduite optimale égale à 2,7.
La valeur de h varie peu autour du minimum ; cependant, seules
les valeurs de vitesse réduite supérieures à 2,7 présentent un intérêt 3.1 Propriétés des solvants
pratique. En effet, le choix de valeurs inférieures entraîne à la fois
une diminution de l’efficacité, une augmentation de la quantité
minimale détectable et de la durée de la séparation. Il convient donc La réussite d’une séparation dépend de l’adéquation soluté-phase
de considérer cette partie de la courbe h = f (ν ) comme une zone stationnaire-phase mobile.
sans intérêt. En revanche, l’augmentation de la vitesse réduite de
νopt = 2,7 à ν = 10, par exemple, permet de diviser par quatre envi- En principe, de très nombreux solvants (généralement en mélan-
ron la durée d’une analyse avec une perte acceptable en efficacité ges) peuvent être utilisés, mais de nombreuses limitations existent.
et, encore plus, en résolution (h passant de 2,4 à 3,35, le nombre de
plateaux théoriques contenus dans la colonne diminue de 39,6 % et
la résolution de 18 %). 3.1.1 Interactions soluté-solvant
Le comportement chromatographique d’une colonne peut être
testé à partir d’une simple détermination de la hauteur de plateau On distingue trois groupes d’interactions. Le premier comprend
réduite pour 2 vitesses réduites différentes de la phase mobile : les forces intermoléculaires de dispersion (dipôle instantané - dipôle

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instantané), d’induction (dipôle permanent - dipôle induit) et des interactions dipôle-dipôle (mesurée par xn , colonne 4). Le carac-
d’orientation (dipôle permanent - dipôle permanent) qui sont plus tère accepteur de protons xe a été mesuré en prenant l’éthanol
ou moins spécifiques. Au deuxième groupe appartiennent les forces comme solvant test, le caractère donneur de protons xd avec le
de liaison hydrogène et de transfert de charge qui sont spécifiques dioxanne et les interactions dipôle-dipôle avec le nitrométhane.
du couple soluté-solvant. Enfin, le dernier groupe renferme les inte-
ractions électrostatiques entre les espèces ionisées en solution. Les Pour chaque solvant, on a :
énergies de ces différentes interactions sont rassemblées dans le
tableau 1. xe + xd + x n = 1

1 xe représente la part des interactions par liaison hydrogène dans la


polarité globale P’, le solvant agissant par son caractère accepteur
de protons. On a : p’e = P’ xe et de même pour xd et xn. On peut ainsi
Tableau 1 – Énergies des différentes
scinder la polarité globale en polarités partielles associées à des
interactions rencontrées en CPL interactions spécifiques. Par exemple, le chloroforme a une polarité
globale P’ de 4,1 que l’on peut scinder ainsi :
Énergie
Nature de l’interaction
(kJ · mol–1) p e′ = 4,1 × 0,25 = 1,025 (polarité correspondant au caractère accep-
teur de protons)
Dipôle instantané - dipôle instantané 5 à 20
p d′ = 4,1 × 0,41 = 1,681 (polarité correspondant au caractère don-
Dipôle permanent - dipôle induit 8 à 25 neur de protons)
Dipôle permanent - dipôle permanent 25 à 40
p n′ = 4,1 × 0,33 = 1,353 (polarité correspondant aux interactions
Liaison hydrogène 25 à 40 dipôle-dipôle).
Ionique 250 à 1 050 Pour une polarité globale P’ donnée, on pourra choisir des sol-
vants ayant des interactions spécifiques d’intensité différente, ce qui
permettra, comme nous le verrons, de gouverner la sélectivité d’une
séparation.
3.1.2 Force éluante, polarité et paramètre
de solubilité des solvants
3.1.2.3 Paramètre de solubilité de Hildebrand
En chromatographie, le terme polarité d’un solvant est la résul-
La polarité d’un solvant peut être mesurée par la valeur de son
tante des différentes interactions que nous venons d’évoquer. Cette
paramètre de solubilité introduit par Hildebrand et Scott [15] lors de
polarité s’exprime soit par la force éluante du solvant ε0, soit par sa
l’étude thermodynamique des solutions régulières apolaires ou peu
polarité selon Rohrschneider, désignée par le symbole P’, soit enfin
polaires.
par son paramètre de solubilité de Hildebrand δ.
Le paramètre de solubilité δ d’un solvant S (tableau 2, colonne
3.1.2.1 Force éluante d'un solvant ε0 no 8) est défini par la relation :
Elle est définie dans le cadre de la chromatographie d’adsorption.
v
C’est l’énergie libre d’adsorption des molécules de solvant par unité ES
de surface de solvant adsorbé dans les conditions d’activité stan- δ = ------
-
VS
dard et s’exprime par le rapport :
v
0 VS étant le volume molaire du solvant S et E S l’énergie moléculaire
∆ GM
ε 0 = -------------------------
- (15) de cohésion représentative de toutes les interactions. C’est l’énergie
2,3 RT A M nécessaire pour transformer une mole de solvant de l’état liquide à
l’état gazeux idéal dans les conditions normales. Cette énergie peut
avec AM surface occupée sur l’adsorbant par une molécule être calculée à partir de l’enthalpie molaire ∆h de vaporisation ; en
de solvant, supposant la vapeur idéale, il vient :
R constante molaire des gaz,
T température (K), ∆ h Ð RT
δ = ----------------------- (16)
0
∆ GM énergie d’adsorption des molécules de la phase VS
mobile.
∆h peut être mesuré à partir des variations de la pression de vapeur
ε0 est une énergie réduite, nombre sans dimension, divisée par
saturante du solvant avec la température (relation de Clausius-Cla-
une aire.
peyron), à partir de sa température d’ébullition (selon une équation
Le tableau 2 rassemble les valeurs de ε0 mesurées sur alumine et empirique proposée par Hildebrand) ou à partir de sa pression
sur silice pour différents solvants utilisés en CPL (colonnes no 6 et interne. Ce paramètre de solubilité à un seul terme ou paramètre de
7). solubilité total a été développé initialement par Hildebrand et Scott
[15] pour des solvants où prédominent les interactions de disper-
3.1.2.2 Polarité d'un solvant sion, c’est-à-dire des solvants apolaires ou peu polaires ; puis il a été
étendu aux solvants polaires.
La polarité d’un solvant peut être définie de plusieurs façons ;
nous avons choisi ici de développer la polarité P' calculée par Sny- Les paramètres de solubilité sont moins utilisés en chromatogra-
der [13] à partir de mesures expérimentales des coefficients de dis- phie que les polarités globales et partielles proposées par Rohrsch-
tribution de solutés tests effectuées par Rohrschneider [14] en neider et développées par Snyder. Cela peut s’expliquer par le fait
chromatographie en phase gazeuse. Le tableau 2 rassemble les que les paramètres de solubilité sont issus de mesures enthalpi-
valeurs de P’ (colonne no 1) pour des solvants variés. Une caractéri- ques, ce qui soulève un doute quant à leur validité lors d’applica-
sation plus fine consiste à chiffrer leur aptitude à former des liaisons tions chromatographiques. Pourtant, il existe une bonne corrélation
hydrogène (leur pouvoir accepteur ou donneur de protons est [16] entre le paramètre de solubilité de Hildebrand δ , l’énergie
mesuré respectivement par xe et xd , colonnes no 2 et 3) ou à donner d’adsorption ε0 et la polarité P’ selon Rohrschneider.

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Tableau 2 – Propriétés des principaux solvants utilisés en chromatographie en phase liquide
no 1 no 2 no 3 no 4 no 5 no 6 no 7 no 8
Longueur
Indice de Température Viscosité Solubilité Constante Pouvoir Pouvoir Interactions δ
Solvant
d’onde
réfraction d’ébullition à 25° C Polarité accepteur donneur dipôle- Groupe ε0 ε0
dans l’eau diélectrique
minimale
à 25° C (oC) (cP) (% m/m) à 20° C du solvant de protons de protons dipôle de sur sur (cal1/2 ·cm– 3/2)
(nm) P’ sélectivité alumine silice (2)
xe xd xn
FC-78 (1) ................................. 210 1,267 50 0,4 1,88 <–2 – 0,25
FC-75 ........................................ 210 1,276 102 0,8 1,86 <–2 – 0,25
FC-43 ........................................ 210 1,291 174 2,6 1,9 <–2 – 0,25
sooctane ................................ 197 1,389 99 0,47 0,011 1,94 0,1 0,01 0,02
n-Heptane ............................... 195 1,385 98 0,40 0,010 1,92 0,2 0,01 0 7,4
n-Hexane ................................ 190 1,372 69 0,30 0,010 1,88 0,1 0,01 0 7,3
n-Pentane ............................... 195 1,355 36 0,22 0,010 1,84 0,0 0,00 0 7,0
Cyclohexane........................... 200 1,423 81 0,90 0,012 2,02 – 0,2 0,04 8,2
Cyclopentane ......................... 200 1,404 49 0,42 0,014 1,97 – 0,2 0,05
-Chlorobutane ...................... 220 1,404 78 0,42 7,4 1,0 VI 0,26
Tétrachlorure de carbone.... 265 1,457 77 0,90 0,008 2,24 1,6 0,18 0,11 8,6
Éther n-butylique ................... 220 1,397 142 0,64 0,19 2,8 2,1 0,44 0,18 0,38 I 0,25
Triéthylamine ......................... 1,398 89 0,36 2,4 1,9 0,56 0,12 0,32 I 0,54
Bromoéthane ......................... 1,421 38 0,38 9,4 2,0 VI 0,35 9,6
ÉTher isopropylique .............. 220 1,365 68 0,38 0,62 3,9 2,4 0,48 0,14 0,38 I 0,28 0,32
Méthyltertiobutyléther.......... 215 1,369 55 0,27 I 0,47
n-Octanol ................................ 205 1,427 195 7,3 3,9 10,3 3,4 0,56 0,18 0,25 II 0,5 10,3
Fluorobenzène ....................... 1,460 85 0,55 5,4 3,1 0,24 0,32 0,45 VII
23

Chlorure de méthylène ......... 233 1,421 40 0,41 0,17 8,9 3,1 0,29 0,18 0,53 V 0,42 9,7
2-Pentanol .............................. 1,405 130 3,5 9,2 14,7 3,7 0,56 0,19 0,26 II 0,61
,2-Duchloroéthane .............. 228 1,442 83 0,78 0,16 10,4 3,5 0,30 0,21 0,49 V 0,44 9,8
ert-Butanol ............................ 1,385 82 3,6 miscible 12,5 4,1 0,56 0,20 0,24 II 0,7 0,51
n-Butanol ................................ 210 1,397 118 2,6 20,1 17,5 3,9 0,59 0,19 0,25 II 0,7 11,4
n-Propanol .............................. 240 1,385 97 1,9 miscible 20,3 4,0 0,54 0,19 0,27 II 0,82 11,9
Tétrahydrofuranne ................ 212 1,405 66 0,46 miscible 7,6 4,0 0,38 0,20 0,42 III 0,57 0,53 9,1
Propylamine ........................... 1,385 48 0,35 miscible 5,3 4,2 I
Acétate d’éthyle .................... 256 1,370 77 0,43 9,8 6,0 4,4 0,34 0,23 0,43 VI 0,58 0,48 9,1
2-Propanol .............................. 205 1,384 82 1,9 miscible 20,3 3,9 0,55 0,19 0,27 II 0,82 0,60 11,5
Chloroforme............................ 245 1,443 61 0,53 0,072 4,8 4,1 0,25 0,41 0,33 VIII 0,40 0,26 9,3
Méthyléthylcétone ................ 329 1,376 80 0,38 23,4 18,5 4,7 0,35 0,22 0,43 VI 0,51 9,3
Dioxanne ................................. 215 1,420 101 1,2 miscible 2,2 4,8 0,36 0,24 0,40 VI 0,56 10,0
Méthoxyéthanol..................... 210 1,400 125 1,60 miscible 16,9 5,5 0,38 0,24 0,38 III
Carbonate de propylène....... 1,421 240 6,1 0,31 0,27 0,42 VI 13,3

Référence Internet
Éthanol .................................... 210 1,359 78 1,08 miscible 24,6 4,3 0,52 0,19 0,29 II 0,88 12,7
Acide acétique....................... 1,370 118 1,1 miscible 6,2 6,0 0,39 0,31 0,30 IV 10,1
Acétonitrile ............................. 190 1,341 82 0,34 miscible 37,5 5,8 0,31 0,27 0,42 VI 0,65 0,52 11,9

P1455
Diméthylsulfoxyde ................. 268 1,477 189 2,00 miscible 4,7 7,2 0,39 0,23 0,39 III 0,75 12,0
Méthanol................................. 205 1,326 65 0,54 miscible 32,7 5,1 0,48 0,22 0,31 II 0,95 0,70 14,5
Eau ........................................... 1,333 100 0,89 78,5 10,2 0,37 0,37 0,25 VIII >> 0,95 >> 0,70 23,4
FC = alcane fluoré.
Unité la plus couramment utilisée, parfois appelée le « Hildebrand » [1 cal1/2· cm–3/2 = (4,18)2 · (MPa)1/2].

1
Référence Internet
P1455

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE ___________________________________________________________________________________________________

Remarques : on considère, en première approximation, que le


facteur de capacité d’un soluté varie d’un facteur 10 lorsque la Accepteur de protons
polarité globale P’ varie de deux unités ; c’est dire l’intérêt d’une 0,2 éther isopropylique
éther de méthyltertiobutyle
variation continue de P’ accessible seulement par la mise en (propylamine)
œuvre de mélanges de solvants. II
Les paramètres P’ et δ d’un mélange binaire se calculent par méthanol
éthanol
la règle des mélanges. En revanche, l’évaluation est plus déli- 0,3 propanol I 0,5

1
cate pour ε0, dans la mesure où le solvant « fort » se concentre
à la surface de l’adsorbant. Il existe cependant des relations per- III
xd tétrahydrofuranne
xe
mettant un calcul approché [1]. (méthoxyéthanol)
0,4 0,4
VIII VI
dioxanne
chloroforme
(dodécafluoro-
acétonitrile V
chlorure de
3.2 Sélection des solvants 0,5
heptanol méthylène
0,3
1,2-dichloro-
éthane

Le tableau 2 rassemble les propriétés des solvants les plus fré-


quemment utilisés en CPL (au nombre de 37 ici). Pourtant, en prati-
que, la plupart des séparations effectuées en chromatographie 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
d’adsorption et de partage sont réalisées avec une dizaine de sol- Donneur de Interactions
vants. protons dipôle-dipôle
xn
De grandes variations de la sélectivité sont généralement obser- a classement en groupes de sélectivité des principaux solvants
vées lorsque l’on modifie la nature et l’intensité des interactions utilisés en chromatographie d'adsorption, de partage normal ( )
soluté-solvant. Par exemple, le remplacement dans une phase et à polarité de phases inversée ( )
éluante du méthanol (solvant polaire) par l’éthanol n’entraîne pas
de modification notable de la sélectivité car ces deux solvants sont
essentiellement accepteurs de protons, alors que l’addition de chlo-
rure de méthylène (fortes interactions dipôle-dipôle) ou de chloro-
forme (donneur de protons) provoque d’importantes modifications xa

car
MTBE

act
de la sélectivité. On conçoit ainsi tout l’intérêt de classer les solvants

ne

ère

en huit groupes selon leurs aptitudes à donner des types différents dro
d’interactions (tableau 2 colonne no 5). Les solvants les plus cou-

acc
hy

CH3OH

ep
ramment utilisés en chromatographie d’adsorption et de partage
ns

teu
normal appartiennent aux groupes I, V et VIII ; en chromatographie
so

rd
liai

de partage à polarité de phases inversée, on choisira les solvants xd

e li
de

des groupes II, III et VI (figure 5a).

ais
THF
r

on
eu

Les facteurs de capacité sont ajustés en choisissant, dans le pre-

sh
nn
do

mier cas, un solvant de base de type alcane ou cycloalcane n’entraî-

yd
rog
ère

nant aucune sélectivité particulière et, dans le second cas, l’eau qui CH3CN

èn
act

n’a aucune affinité pour les chaînes alkyle des silices greffées. On

e
CH2Cl2
car

peut ensuite, pour une polarité globale fixée, faire varier la sélecti-
vité en sélectionnant un solvant (ou des solvants) appartenant à un CHCl3
(ou aux trois) groupe(s) de sélectivité (figure 5b).
caractère donneur d'interactions dipôle-dipôle

xn

4. Séparation de solutés Phase stationnaire apolaire

moléculaires Phase stationnaire polaire

b place des différents solvants sélectionnés dans le triangle


de sélectivité de Snyder

4.1 Chromatographie d'adsorption


Solvants Adsorption et partage Partage à polarité
classique de phases inversée
La chromatographie d’adsorption encore appelée chromatogra-
sélectifs éther isopropylique ou méthanol ou éthanol
phie liquide-solide (CLS) utilise comme phases stationnaires des de méthyltertiobutyle (MTBE)
gels de silice et d’alumine.
chloroforme acétonitrile
Elle s’applique bien à la séparation de composés présentant des
groupements fonctionnels polaires différents (cas de nombreuses chlorure de méthylène ou tétrahydrofuranne (THF)
molécules thérapeutiques) et des isomères de position. 1,2-dichloroéthane

de base alcanes eau


(hexane, isooctane)
4.1.1 Phases stationnaires

Nous ne décrirons ici que les gels de silice qui sont les phases sta-
tionnaires les plus utilisées en CLS. Figure 4 – Sélection des solvants

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24
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P1457

Chromatographie en phase liquide


bidimensionnelle (2D-LC)
1
par Sabine HEINISCH
Ingénieur de recherche, Responsable d’équipe de recherche
à l’Institut des sciences analytiques
Université de Lyon, Institut des sciences analytiques, CNRS, UMR5280, 69100 Villeurbanne,
France
et Morgan SARRUT
Responsable de laboratoire
Solvay, Centre de recherche et innovation, 69190 Saint-Fons, France

1. Principe de la chromatographie en phase liquide


bidimensionnelle (2D-LC) ................................................................... P 1 457 - 3
1.1 Différents modes de 2D-LC ..................................................................... — 3
1.2 Instrumentation........................................................................................ — 4
1.3 Différents couplages ................................................................................ — 5
2. Quand préférer la LC×LC à la LC ? .................................................. — 6
2.1 Critères de performance en chromatographie ...................................... — 7
2.2 Performance limite en LC et en LC×LC en ligne .................................... — 9
3. Développement de méthodes en LC×LC ........................................ — 11
3.1 Recherche d’orthogonalité entre les deux dimensions ........................ — 11
3.2 Problèmes liés à l’injection en seconde dimension .............................. — 11
3.3 Optimisation en LC×LC en ligne ............................................................. — 12
4. Applications en 2D-LC ........................................................................ — 13
4.1 Secteur biopharmaceutique : anticorps conjugués par HIC×RPLC...... — 14
4.2 Secteur pharmaceutique : sLC×SFC-achiralxchiral ............................... — 14
4.3 Secteur agro-alimentaire : composés phénoliques .............................. — 17
4.4 Analyse quantitative ................................................................................ — 18
5. Conclusion.............................................................................................. — 18
6. Glossaire ................................................................................................. — 19
Pour en savoir plus ....................................................................................... Doc. P 1 457

a chromatographie liquide (LC) est une technique analytique de choix dans


L de nombreux domaines (se reporter aux articles [P 1 655] [P 1 494] et
[P 1 460]). En effet, les différents modes LC (RPLC, IEX, SEC, HIC, HILIC, etc.)
permettent d’adapter le pouvoir de séparation aux propriétés physico-
chimiques des molécules à analyser. Toutefois, le besoin croissant de caracté-
risation fine de milieux complexes associé aux exigences réglementaires
toujours plus poussées requiert un pouvoir de séparation (ou capacité de pics)
que ne peut pas atteindre la LC unidimensionnelle (1D-LC). Cela malgré l’utili-
sation de systèmes à ultra-haute pression (1 200 à 1 500 bar) associés à des
colonnes équipées de diamètre de particules inférieur à 2 µm (UHPLC). La
chromatographie en phase liquide bidimensionnelle (2D-LC) permet de
répondre à ces enjeux. En effet, la 2D-LC combine deux dimensions de sépara-
tions complémentaires, ce qui accroît l’espace de séparation et donc le pouvoir
de résolution global. De plus, ajouter une deuxième séparation chromatogra-
phique rend plus facilement accessible le couplage à la spectrométrie de
masse à des modes de chromatographie incompatibles ou difficilement com-
patibles (IEX, HIC, NPLC, etc.) permettant l’accès à une dimension
Parution : août 2020

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25
Référence Internet
P1457

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE BIDIMENSIONNELLE (2D-LC) ________________________________________________________________________

d’information supplémentaire. Ce même raisonnement s’applique pour des


méthodes existantes, qui peuvent difficilement être modifiées (cas de
méthodes pharmaceutiques).
Cet article expose le principe de la 2D-LC, les différentes approches envisa-
geables (ciblées/non ciblées, hors ligne/en ligne) et définit des critères de choix
quant à son utilisation par rapport à une méthode 1D-LC. Les paramètres clés

1
pour le développement de méthodes en 2D-LC sont décrits en se focalisant sur
le mode 2D-LC « comprehensive » en ligne qui est la technique à plus fort
potentiel mais dont le développement de méthodes demeure complexe. Enfin,
plusieurs exemples d’applications sont présentés dans de nombreux
domaines.
Comme il est d’usage dans la profession, les pourcentages indiqués sont,
sauf précision contraire, volumiques.

Sigle Développé Sigle Développé


ACN Acetonitrile sLC×LC 2D-LC intégrale sélective selective comprehensive
2D-LC
ADC Anticorps conjugués (antibody-drug conjugate)
SM (MS) Spectrométrie de masse (Mass Spectrometry)
DAR Drug to Antibody Ratio
TFA Acide trifluoroacétique (trifluoro acetic acid)
1D Première dimension
2D Deuxième dimension
Unité
2D-LC Chromatographie en phase liquide Symboles Définition
usuelle
bidimensionnelle (two-dimensional liquid
chromatography) DF – Facteur de dilution

FA Acide formique (formic acid) Composition volumique en solvant


C –
fort de la phase mobile
HIC Chromatographie d’interaction hydrophobe
Concentration du soluté à
(Hydrophobic Interaction Chromatography) Ci µg/mL
l’injection
HILIC Chromatographie d’interaction hydrophile CF – Facteur de préconcentration
(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)
F mL/min Débit de la phase mobile
IEX Chromatographie d’échange d’ions (Ion-Exchange
Chromatography) k – Facteur de rétention

IPC Chromatographie d’appariement d’ions (Ion-Pair neff – Capacité de pics effective


Chromatography) n – Capacité de pics
LC Chromatographie en phase liquide (Liquid Ncol – Nombre de plateaux de la colonne
chromatography)
S – Pente de ln(k) vs C
LC-LC 2D-LC à coupe à cœur heart-cut 2D-LC Sdet variable Sensibilité propre du détecteur
LC×LC 2D-LC intégrale comprehensive 2D-LC Temps de cycle (durée d’analyse
tc min
en seconde dimension)
mLC-LC 2D-LC à coupe à cœur multiples multiple heart-
cut 2D-LC tG min Temps de gradient

MeOH Méthanol tD min Temps de délai de l’appareillage

MSA Acide méthanesulfonique (methanesulfonic acid) t0 min Temps mort de la colonne


Vi µL Volume à l’injection
NPLC Chromatographie liquide en phase normale
(Normal Phase Liquid Chromatography) V0 – Volume mort de la colonne
RPLC Chromatographie liquide en phase inverse Largeur d’un pic gaussien à 13,8 %
wpic variable
(Reversed Phase Liquid Chromatography) de sa hauteur

SEC Chromatographie d’exclusion stérique (Size- α, β – Coefficients correctifs de n


Exclusion Chromatography) Taux d’occupation de l’espace de
γ –
séparation
SFC Chromatographie en fluide supercritique
(Supercritical Fluid Chromatography) τ – Taux d’échantillonnage

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_________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE BIDIMENSIONNELLE (2D-LC)

1. Principe 1.1 Différents modes de 2D-LC


de la chromatographie Il existe deux grands modes en 2D-LC. Le premier est dit « coupe
à cœur » (heart-cut) dénoté LC-LC, tandis que le second mode est
en phase liquide dit « intégral » (comprehensive) dénoté LC×LC. Pour faciliter le lien
avec la littérature en langue anglaise, les termes heart-cut et com-
bidimensionnelle (2D-LC) prehensive sont utilisés dans la suite de cet article. La figure 1
illustre ces deux modes. Le tableau 1 résume leurs avantages et
leurs inconvénients.

1.1.1 Mode heart-cut


1
Le principe de la 2D-LC réside dans le fait que des fractions Le mode heart-cut noté LC-LC (figure 1a) consiste en l’injection
issues d’une première dimension (notée 1D) sont transférées dans la seconde dimension d’une plage d’élution relativement
vers une deuxième dimension (notée 2D) pour subir une deu- large (au moins une largeur de pic) d’une ou plusieurs portions du
xième séparation. Idéalement, les deux séparations sont com- chromatogramme de première dimension. Lorsque plusieurs por-
plémentaires et apportent ainsi des sélectivités différentes aux tions (ou fractions) sont injectées, on parle de heart-cut multiples
composés à séparer. noté mLC-LC (figure 1b).

1D 1D

2D 2D

a heart-cut (LC-LC) b heart-cut multiple (mLC-LC)

1D 1D Cartographie
1D

2D
2D 2D

c comprehensive sélectif (sLC×LC) d comprehensive intégral (LC×LC)

Figure 1 – Illustration des quatre modes en 2D-LC

Tableau 1 – Comparaison entre les différents modes de 2D-LC


LC-LC&mLC-LC sLC×LC LC×LC
Approche ciblée Approche non ciblée
Augmentation du pouvoir de
Pouvoir de séparation similaire à LC Très grand pouvoir de séparation
séparation par rapport à LC
Facilite l’identification de pics Cartographie 2D (double information en temps de rétention)
Meilleur degré de confiance pour déterminer la pureté d’un pic Facilite I’identification de pics (réduction des effets matrices)
Développement de méthode relativement simple Développement de méthode complexe

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CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE BIDIMENSIONNELLE (2D-LC) ________________________________________________________________________

Le mode heart-cut peut être utilisé pour améliorer en 2D la sépa-


ration d’une paire de pics donnée, insuffisamment séparée en 1D. Tableau 2 – Comparaison des approches hors ligne
Il est très souvent utilisé pour éliminer la matrice et ainsi isoler des et en ligne en 2D-LC
composés d’intérêt avant de les envoyer dans un spectromètre de Caractéristique Hors ligne En ligne
masse. Il est exclusivement dédié à des approches ciblées.
Pouvoir de séparation 
 
1.1.2 Mode comprehensive Temps d’analyse  

1 1.1.2.1 Comprehensive sélectif


Le mode 2D-LC comprehensive, dit sélectif, noté sLC×LC
Automatisation
Risque de dégradation/
 

(figure 1c), a été introduit récemment [1]. La sLC×LC est une contamination de l’échantillon/  
approche ciblée sur une ou plusieurs plages du chromatogramme perte d’échantillon
de 1D comme en LC-LC ou en mLC-LC. La différence entre ces
Simplicité de l’appareillage 
 
modes se situe au niveau du fractionnement (ou échantillonnage)
de la plage ciblée. Contrairement à la LC-LC où des fractions relati- Facilité pour le développement
vement larges sont collectées (au moins la taille d’un pic), les frac-  
de méthode
tions en sLC×LC sont fines. Cela a pour conséquence majeure de
conserver globalement la séparation acquise en 1D contrairement 
 = Très avantageux,  = Avantageux,  = Peu avantageux.
à la LC-LC où deux pics préalablement séparés en 1D sont remé-
langés dans l’interface. Le pouvoir de séparation réel est ainsi
conservé en 1D et donc sur la globalité de la séparation bidimen- Automatisation : l’approche en ligne est par principe facile-
sionnelle. La technique sLC×LC est une approche qui se situe entre ment automatisable contrairement à l’approche hors ligne qui
les modes heart-cut et comprehensive intégral. Cette technique est nécessite une intervention manuelle entre les deux dimensions.
destinée à des analyses ciblées et son utilisation va dépendre de la Risque de dégradation/contamination de l’échantillon :
complexité de l’échantillon. l’approche hors-ligne implique la manipulation des échantillons et
un temps de stockage plus long entre les deux dimensions. Les
1.1.2.2 Comprehensive intégral risques de dégradation et de contamination sont donc plus élevés
La technique 2D-LC en mode comprehensive intégral (full com- qu’en ligne. Par ailleurs, comme en LC, il peut y avoir des effets
prehensive) (figure 1d) permet de gagner significativement en mémoire sur le système d’injection qui sont moindres, en ligne,
pouvoir de séparation. En LC×LC, la totalité de l’échantillon est avec des boucles balayées en permanence par la phase mobile.
analysée dans les deux dimensions en transférant des fractions Simplicité de l’appareillage : (§ 1.2).
courtes (de 1 à 3 par pic de 1D) de la première vers la deuxième
Développement de méthode : du fait de l’interdépendance
dimension. Le grand nombre de fractions qui en résulte permet de
entre les deux dimensions, le développement de méthode est
maintenir la résolution acquise en première dimension en évitant
beaucoup plus complexe en 2D-LC en ligne.
le mélange au sein de l’interface de composés préalablement
séparés. La LC×LC fournit donc un pouvoir de séparation générale-
ment bien plus élevé qu’en 1D-LC (§ 2). En résumé, la LC×LC en ligne présente l’avantage d’être faci-
De fait, la LC×LC est utilisée pour obtenir un maximum d’infor- lement automatisable, ce qui permet de fournir une grande
mation sur des échantillons complexes dans un but d’identification capacité de pics en un minimum de temps tout en limitant
mais également de comparaison directe d’échantillons grâce aux l’altération de l’échantillon. Néanmoins, cette approche néces-
cartographies 2D détaillées générées par cette technique. site un appareillage complexe et requiert une stratégie de
développement de méthode spécifique tandis que l’approche
hors ligne utilise des pratiques similaires à celles de 1D-LC tra-
1.1.3 Choisir entre le mode hors ligne et en ligne ditionnelle. Le développement de méthode en LC×LC en ligne
Si le mode heart-cut est presque toujours utilisé en ligne, avec le fait l’objet du paragraphe 3.
mode comprehensive, les deux dimensions peuvent être couplées
hors ligne ou en ligne. Dans l’approche hors ligne, les fractions de
première dimension sont collectées puis stockées dans des flacons 1.2 Instrumentation
avant l’injection dans la deuxième dimension. Dans l’approche en
ligne, les étapes successives de collecte, stockage et injection sont L’approche hors ligne autorise l’utilisation du même instrument
réalisées en continu. (pompe, injecteur, compartiment colonne, détecteur) pour chacune
Les approches hors ligne et en ligne présentent chacune des des deux dimensions en changeant seulement la phase station-
avantages et des inconvénients qui sont bien détaillés dans la naire et/ou phase mobile. Un collecteur de fraction adapté doit
littérature [2] [3]. Ceux-ci sont résumés dans le tableau 2 et briève- bien sûr être inclus à la chaîne analytique.
ment explicités ci-après. L’approche en ligne nécessite une instrumentation plus
complexe qui est cependant disponible commercialement. Elle
requiert deux systèmes chromatographiques couplés entre eux via
Pouvoir de séparation : hors ligne, il est généralement plus une interface (figure 2). Cette interface est constituée d’une ou
important car les deux dimensions sont indépendantes contraire- deux vannes 2-positions équipées de deux boucles d’échantillon-
ment à l’approche en ligne où le temps d’analyse en 2D corres- nage identiques (1 boucle peut suffire en LC-LC) afin d’assurer
pond au temps de collecte en 1D, ce qui nécessite un compromis alternativement la collecte de la 1D puis le transfert vers la 2D.
entre pouvoir de séparation et temps d’analyse (§ 2.1.2). Concrètement, pendant que l’une des deux boucles collecte une
Temps d’analyse : en ligne, le temps d’analyse global corres- fraction de 1D, la seconde boucle envoie la fraction de 1D, préala-
pond au temps d’analyse de 1D. Hors ligne, le temps d’analyse glo- blement stockée, vers la 2D. Lorsque l’analyse en 2D est terminée,
bal correspond à la somme des temps d’analyse de chacune des le rôle des boucles est inversé. La figure 3 présente des exemples
deux dimensions à laquelle il faut également ajouter le temps d’interfaces. Certains fournisseurs proposent, pour les modes
nécessaire au transfert, le plus souvent manuel, des fractions vers mLC-LC et sLC×LC, un système de vannes permettant d’utiliser
la 2D. jusqu’à douze boucles pour augmenter la capacité de stockage

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Pompe 1
Poubelle

Passeur Détecteur UV 1
Vanne Colonne 1

1
d’échantillon
Té n° 1

Té n° 2
Détecteur MS Détecteur UV 2 Colonne 2 Interface Pompe 2

Poubelle

Figure 2 – Schéma de l’instrumentation en 2D-LC en-ligne

Rotation Rotation
Détecteur 1D Détecteur 1D Détecteur 1D Détecteur 1D

Boucle 1 Boucle 2 Boucle 2


2 Déchets 2 Déchets Boucle 1
3 1 3 1 1 1
2 10 2 10
3 3
4 8 4 8 9 9
45 8 45 8
5 7 5 7 6 7 6 7
6 6 Pompes Pompes
Pompes Pompes 2D Colonne 2D Colonne 2D
2D 2D 2D
Colonnes 2D Colonnes 2D
Déchets Déchets

Position A Position B Position A Position B

a b

Rotation

Collecte de la 1D
Boucle 1 Déchets Boucle 1
Déchets
Transfert vers la 2D
2 1 2 1 2 1 2 1
3 6 Pompes 3 6 3 6 Pompes 3 6
2D 2D
4 5 4 5 4 5 4 5
Colonne 2D Colonne 2D
Détecteur 1D Boucle 2 Détecteur 1D Boucle 2

Position A Position B

Figure 3 – Schéma des différentes interfaces utilisées pour la LC×LC en-ligne

et/ou la finesse des fractions tout en facilitant le développement de débit de 2D et ainsi permettre une meilleure compatibilité avec la
la méthode. spectrométrie de masse (MS).
Il est possible de remplacer les boucles de stockage par des
colonnes dites de piégeage (trapping column) pour assurer une
meilleure compatibilité entre les solvants des deux dimensions. 1.3 Différents couplages
Ces aspects sont discutés dans le paragraphe 3.2.
Du fait de l’interconnexion entre les deux dimensions, une divi- En fonction de la nature de l’échantillon et des propriétés des
sion du débit à l’aide d’un té est souvent utilisée pour réduire le molécules, différents couplages peuvent être envisagés
débit de première dimension et donc réduire le volume injecté vers (figure 4). Selon la compatibilité des modes chromatographiques,
la 2D (§ 3). De même, un second té peut être utilisé pour réduire le le développement de méthode peut s’avérer plus ou moins

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1

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Évolutions majeures
en chromatographie liquide
1
par Davy GUILLARME
Chargé d’enseignement
Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique, École des Sciences pharmaceutiques,
Université de Genève

1. Analyse rapide ou à haute résolution en chromatographie...... P 1 494 - 2


1.1 Différentes stratégies................................................................................ — 2
1.2 Instrumentation......................................................................................... — 6
2. Stratégies alternatives à la RPLC ..................................................... — 8
2.1 Mode HILIC ................................................................................................ — 8
2.2 Chromatographie avec fluide subcritique/supercritique ....................... — 9
3. Analyse de protéines thérapeutiques par RPLC ........................... — 10
3.1 Caractérisation des protéines thérapeutiques........................................ — 10
3.2 Possibilités offertes par la RPLC .............................................................. — 11
3.3 Cas des anticorps monoclonaux thérapeutiques................................... — 12
4. Conclusion .............................................................................................. — 13
Pour en savoir plus ......................................................................................... Doc. P 1 494

a chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une


L technique analytique clé, utilisée dans de nombreux secteurs d’activité,
pour l’analyse de matrices agroalimentaires, environnementales et pharma-
ceutiques. Cette technique séparative peut être utilisée aussi bien pour des
analyses purement qualitatives, que pour des applications quantitatives.
Durant ces dernières années, les technologies employées en HPLC (phases
stationnaires, phases mobiles, instrumentation...) ont évolué de manière très
rapide, afin de répondre à certaines exigences des utilisateurs. Trois axes
principaux d’amélioration ont été suivis.
Le premier axe de développement de l’HPLC est l’augmentation du débit
d’analyse, afin d’obtenir des séparations cinq à dix fois plus rapides qu’aupara-
vant, ainsi que la possibilité d’atteindre des séparations à plus haut pouvoir de
séparation (à haute résolution). Pour cela, il est possible d’utiliser des supports
chromatographiques innovants tels que les colonnes monolithiques, les
colonnes remplies de particules poreuses de moins de 2 µm ou les colonnes
remplies de particules superficiellement poreuses de moins de 3 µm. Il est
également important de garder en tête qu’une augmentation de la température
de la phase mobile permet une amélioration significative des performances
chromatographiques. Cependant, afin de tirer tous les bénéfices de la
chromatographie rapide et/ou à haute résolution, une instrumentation adaptée
est nécessaire et des développements importants ont été réalisés dans ce sens
au cours des dix dernières années.
Un autre axe de développement concerne l’utilisation de modes alternatifs
de chromatographie. En effet, la chromatographie liquide à polarité des phases
inversées (RPLC) est de loin la plus utilisée aujourd’hui mais il peut être inté-
ressant d’avoir recours à des modes de séparations alternatifs pour moduler
les sélectivités et rétentions de certains composés problématiques. Deux
Parution : juin 2014

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ÉVOLUTIONS MAJEURES EN CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE _________________________________________________________________________________

modes peuvent avoir de l’intérêt, il s’agit de la chromatographie d’interaction


hydrophile (HILIC) et de la chromatographie supercritique (SFC). La première
de ces deux approches est particulièrement adaptée à l’analyse de composés
très hydrophiles (sucres, acides aminés) et/ou ionisables (molécules pharma-
ceutiques), difficilement analysable en RPLC. La seconde convient à une
gamme plus large d’analytes, dont en particulier les composés très lipophiles
(lipides, vitamines liposolubles...) difficiles à éluer en RPLC classique.

1 Enfin, Le dernier axe de développement est plus spécifique du domaine


pharmaceutique et concerne l’analyse de protéines et anticorps monoclonaux
thérapeutiques ayant des masses molaires comprises entre 5 et 150 kDa. Pour
ce type d’analyse, les techniques historiques, telles que la chromatographie
d’exclusion stérique (SEC) et la chromatographie d’échange d’ions (IEX) sont
désormais fortement concurrencées par les nouveaux supports chromatogra-
phiques à large taille de pores disponibles en RPLC et offrant une meilleure
compatibilité avec la spectrométrie de masse (MS).
Le but de cet article est d’exposer les évolutions majeures de la chromato-
graphie liquide, afin que les utilisateurs puissent appliquer ces nouvelles
méthodologies dans leurs laboratoires respectifs. Pour la théorie et les diffé-
rents méthodes, se reporter aux articles [P 1 445] et [P 1 455].

1. Analyse rapide ou à haute pharmaceutiques classiques telles que les contrôles de pureté ou
les études pharmacocinétiques, des analyses rapides (< 5 min) ou
résolution ultrarapides (< 1 min) sont nécessaires.
Les analyses à très haute résolution sont quant à elles utiles
en chromatographie dans des domaines tels que la métabolomique humaine, la protéo-
mique ou l’analyse d’extraits de plantes pour lesquels les matrices
sont très complexes (fluides biologiques, produits naturels) et
1.1 Différentes stratégies nécessitent un haut pouvoir de séparation.

La chromatographie en phase liquide est une technique bien 1.1.1 Phase mobile à haute température (> 60 oC)
établie permettant l’analyse d’un grand nombre de substances
dans des domaines divers et variés. L’impact de la température de la phase mobile a souvent été
négligé en chromatographie liquide alors que ce paramètre peut
avoir un rôle non négligeable sur la qualité de la séparation,
À titre d’exemple, l’HPLC peut être utilisée pour la détermination
puisqu’il s’agit d’un paramètre thermodynamique influençant
de résidus de pesticides dans des fruits et légumes, la caractérisation
directement la rétention et la sélectivité. Ces dernières années, des
précise d’un échantillon de thé afin d’en déterminer le contenu en
séparations à hautes températures (60 à 100 oC), voire très hautes
polyphénols, la détermination de substances prohibées (diurétiques,
températures (100 à 200 oC) ont été réalisées en HPLC [1].
bétabloquants, stimulants...) dans des urines de sportifs, ou encore le
contrôle qualité de médicaments. En règle générale, la polarité de la phase mobile diminue avec
une élévation de température. Ainsi, il devient possible de rempla-
Cependant, les temps d’analyse obtenus en HPLC avec une cer une partie du solvant organique par de l’eau, afin d’obtenir des
colonne classique de 150 mm × 4,6 mm, 5 µm peuvent parfois être rétentions proches de celles obtenues à température ambiante,
relativement longs (en moyenne, une analyse dure entre 30 et tout en rendant l’HPLC plus écologique/économique.
60 min) et dans certains cas, le pouvoir de séparation d’une telle Excepté la polarité, la température va aussi provoquer une nette
colonne peut s’avérer trop limité pour la caractérisation d’échan- diminution de la viscosité de la phase mobile η qui a un effet
tillons complexes. Comme décrit ci-dessous, diverses approches bénéfique sur la pression générée par la colonne ∆P, en accord
ont été développées afin de pouvoir analyser un plus grand avec la loi de Darcy :
nombre d’échantillons dans le temps imparti ou pour augmenter
de façon significative le nombre de composés pouvant être ηLu Φ
∆P = (1)
séparés par unité de temps. d p2
Il y a en effet une demande croissante pour des analyses plus avec L longueur de colonne,
rapides en HPLC. Cela est particulièrement vrai dans certains domai-
nes tels que la toxicologie forensique et clinique, les analyses anti- Φ résistance à l’écoulement de la phase stationnaire,
dopage ou encore l’analyse environnementale, pour lesquels les u vitesse linéaire de la phase mobile,
temps de réponse doivent être minimisés. Excepté ces domaines
particuliers, l’industrie pharmaceutique est également très intéres- dp diamètre des particules.
sée par les hauts débits d’analyse, puisque l’HPLC y est largement La pression générée par le support chromatographique étant
utilisée et il y a une véritable course à la productivité et à la réduc- réduite à haute température, il devient possible d’utiliser de plus
tion des coûts dans ce domaine. En effet, à cause du grand nombre longues colonnes permettant un gain non négligeable en termes
d’échantillons qu’il est nécessaire d’analyser pour les applications d’efficacité et de résolution.

P 1 494 − 2 Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservés

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__________________________________________________________________________________ ÉVOLUTIONS MAJEURES EN CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

Il est également important de noter que la vitesse linéaire comparable à celle obtenue avec une colonne remplie de particules
optimale de la phase mobile est directement proportionnelle au de 11 µm [5]. Récemment, une nouvelle génération de supports
coefficient de diffusion Dm en HPLC, selon la relation suivante : monolithiques a été commercialisée. Cette dernière possède des
macropores de taille réduite (1,3 µm au lieu de 2 µm) et des méso-
ν Dm pores légèrement plus grands (15 nm au lieu de 12 nm). Ainsi, les
uopt = (2) nouveaux supports monolithiques deviennent bien plus compétitifs
dp
par rapport aux technologies décrites dans les paragraphes 1.1.3 et
1.1.4, puisque les performances cinétiques sont désormais

1
avec ν constante, quelle que soit la température.
comparables à celles obtenues avec des colonnes remplies de parti-
Puisque Dm est inversement proportionnel à la viscosité, il est cules 2 à 2,5 µm, mais toujours avec une pression plus restreinte.
donc recommandé d’utiliser de grandes vitesses linéaires (et donc
de grands débits de phase mobile) permettant une réduction signi- Du fait de la très faible pression générée, l’utilisation de mono-
ficative du temps d’analyse à plus haute température, tout en lithes reste l’approche la plus performante, d’un point de vue théori-
maintenant une pression raisonnable et des efficacités que, pour atteindre des nombres de plateaux extrêmes
comparables à celles obtenues à température ambiante. (N > 100 000) mais dans ce cas, des colonnes de plusieurs mètres
sont requises. Tanaka a par exemple réalisé une séparation de
composés modèles avec une efficacité de 1 000 000 de plateaux en
Exemple : dans le cas d’un mélange 50:50 eau:acétonitrile, la vis- 16 h mais nécessitant une colonne de plus de 11 m [6]. Au contraire,
cosité de la phase mobile est réduite d’un facteur ~ 2,5 entre 20 et pour les séparations rapides, cette approche reste moins perfor-
100 oC, et d’un facteur ~ 5 entre 20 et 200 oC. mante que les autres stratégies commercialement disponibles.
Le gain de performance observé avec des phases mobiles de type Un des problèmes majeurs lié à l’utilisation des monolithes est
50:50 eau :méthanol est nettement plus prononcé, puisque la visco- le monopole commercial de Merck qui limite le développement de
sité est réduite d’un facteur ~ 7 entre 20 et 100 oC, et d’un facteur ce type de support. Ainsi, la diversité est trop restreinte en matière
~ 15 entre 20 et 200 oC [2]. de géométrie de colonnes et surtout de nature de phase station-
naire (seulement C18 et C8). Une étude a récemment démontré
Cette approche permet des gains de performance importants en que les monolithes n’étaient utilisés en routine que par 1 % des
HPLC, particulièrement lorsque de très hautes températures sont spécialistes de la chromatographie dans le milieu industriel [7]. À
employées (> 100 oC). Cependant, dans de telles conditions, il est l’inverse, de très nombreux groupes de recherche travaillent sur
nécessaire de s’assurer de la stabilité thermique des phases ces matériaux dans les laboratoires académiques.
stationnaires et des solutés. En règle générale, les solutés sont
stables du fait des temps d’analyse ultracourts pouvant être obte- 1.1.3 Technologie UHPLC
nus (1 à 2 min tout au plus) mais ce point reste à vérifier au cas
par cas. Du côté de la colonne, les phases stationnaires à base de Une approche très prometteuse consiste à utiliser des colonnes
silice sont difficilement compatibles avec les températures les plus remplies de particules poreuses de diamètres inférieurs à 2 µm,
extrêmes, le produit de solubilité de la silice augmentant avec la qui ont été commercialisées dès 2004. Cette approche est connue
température. Il faut donc utiliser de préférence des matériaux plus sous l’acronyme UHPLC qui signifie chromatographie liquide à
exotiques tels que des phases à base de carbone, de zircone, d’alu- ultra-haute pression (ou performance). L’utilisation de telles parti-
mine ou de titane, qui offrent souvent des performances cinétiques cules correspond à une suite logique initiée depuis les années
et des sélectivités inférieures à celles à base de silice. De plus, il 1970, où les meilleures particules avaient un diamètre d’environ
est aussi primordial d’utiliser un système permettant le préchauf- 10 µm. Dans les années 1980, les particules de 5 µm sont apparues
fage de la phase mobile avant son entrée dans la colonne et son et se sont très vite imposées comme un standard. Puis, vers la fin
refroidissement préalablement à la détection UV. Des modules des années 1990, des particules de 3 à 3,5 µm ont été
spécifiques ont ainsi été développés par certains fabricants mais commercialisées. Ces dernières n’ont pas eu autant de succès que
ne sont pas disponibles en série sur tous les systèmes HPLC. les particules de 5 µm, du fait que les pressions générées étaient
assez importantes (1) et que les volumes des systèmes chromato-
graphiques dans les années 1990 n’étaient pas optimaux pour de
Il apparaît au final que les très hautes températures en HPLC telles colonnes.
apportent plus de problèmes que de solutions. Pour cette rai-
son, il semble bénéfique de se limiter à des températures plus L’intérêt de réduire la taille des particules peut être résumé par :
raisonnables (60 à 90 oC), qui permettent d’ores et déjà un gain L
intéressant de performances. De plus, ces températures éle- N= (3)
vées peuvent être combinées avec l’utilisation des colonnes hd p
innovantes décrites dans les paragraphes 1.1.3 et 1.1.4 [3].
avec N efficacité,
h constante généralement comprise entre 2 et 3.
1.1.2 Supports monolithiques Il apparaît de façon évidente que l’efficacité (donc le pouvoir de
la séparation) est inversement proportionnelle au diamètre des
Ces supports ont été développés il y a presque 20 ans et font particules. Donc, plus la taille des particules est réduite en HPLC,
l’objet d’une offre commerciale depuis 2000. Il existe deux grandes plus l’efficacité est élevée. Ainsi, si l’on souhaite obtenir des
familles de monolithes : les monolithes organiques à base de polys- performances équivalentes avec des particules de 1,7 µm qu’avec
tyrène-divinylbenzène ou méthacrylate et les inorganiques à base des particules 5 µm, la longueur de la colonne peut être réduite
silice, titane ou carbone [4]. Actuellement, seuls les monolithes d’un facteur 3, puisque la granulométrie à été réduite du même
inorganiques à base de silice présentent des performances accepta- facteur. Donc le temps d’analyse est trois fois plus court.
bles en HPLC pour la séparation de petites molécules (masse
molaire < 500 g/mol). Les avantages des monolithes ont été très lar- De plus, d’après l’équation (2), la vitesse de travail est augmen-
gement décrits par le passé et sont dus à leur structure bimodale, tée d’un facteur 3 lorsque la taille des particules est réduite d’un
constituée de macropores et mésopores, permettant à la fois d’obte- facteur 3. Ainsi, le temps d’analyse entre l’HPLC et l’UHPLC est
nir une bonne surface spécifique (rétention et capacité de charge- réduit d’un facteur 9 pour des efficacités identiques [8].
ment suffisantes) et de bonnes performances chromatographiques
avec des pressions raisonnables. Il a été démontré qu’un support Ce gain est illustré sur la figure 1 qui démontre une réduction du
monolithique générait des performances équivalentes à une temps d’analyse de cet ordre de grandeur entre la méthode HPLC ini-
colonne remplie de particules de 3 à 3,5 µm pour une pression tiale et la méthode transférée en UHPLC (27 vs 3 min).

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INNOVATION

Particules superficiellement
poreuses en chromatographie 1
liquide
par Jean-Luc VEUTHEY
Professeur ordinaire, Laboratoire de chimie analytique pharmaceutique,
Section des sciences pharmaceutiques, Université de Genève, Université de Lausanne,
Genève, Suisse

Points clés

Domaine : techniques d’analyse.


Degré de diffusion de la technologie : croissance
Technologies impliquées : chromatographies
Domaines d’application : analyses pharmaceutique, environnementale, biolo-
gique, etc.
Contact : Jean-Luc.Veuthey@unige.ch

L es particules superficiellement poreuses (PSP), plus connues sous


leur dénomination anglaise « superficially porous particles, SPP » (ou
encore core-shell, fused-core, partially porous particles, pelicular ou solid-
core) ont été imaginées par Horvàth en 1967 [1] et largement développées
ensuite par Kirkland [2] (qui leur a donné le nom de fused-core) en particu-
lier pour l’analyse des molécules de grande taille telles que les peptides et
les protéines. En effet, de par les faibles coefficients de diffusion de ces
macromolécules, les performances chromatographiques (en termes ciné-
tiques) des supports poreux conventionnels ne sont pas acceptables,
induisant des pics très larges limitant ainsi la sensibilité de l’analyse ainsi
que le pouvoir résolutif. Les premiers développements de ces particules
superficiellement poreuses ont été effectués avec des particules présentant
des diamètres externes de quelques dizaines de micromètres. Le corps des
particules était alors constitué d’une phase non poreuse enrobée d’une très
fine couche de support poreux (moins de 1 µm d’épaisseur) de même nature
que les supports chromatographiques traditionnels. Plus tard, ces particules
superficiellement poreuses ont été commercialisées avec un diamètre
externe de 5 µm afin d’en améliorer les performances cinétiques et toujours
dans le but d’analyser des protéines ou autres molécules de grande taille.
Dans le domaine pharmaceutique, mais également dans d’autres domaines
tels que l’environnement, la toxicologie ou l’agro-alimentaire, il est
aujourd’hui nécessaire de développer des méthodes d’analyse de plus en
plus performantes en termes de vitesse et de pouvoir séparatif. De plus, la
nature des composés devant être analysés est très diverse allant de petites
molécules (100 à 1 000 Da) à des macromolécules de grande taille (proté-
ines, anticorps monoclonaux de l’ordre de 150 kDa) et les matrices
pouvant être très complexes. Différents supports chromatographiques ont
Parution : septembre 2016

ainsi été développés au XXIe siècle afin de pouvoir répondre à ces


demandes. Des phases stationnaires monolithiques à base de silice ou de
polymères ont été développées dans les années 1990 [3] [4]. Ces supports
ont rapidement connu un large succès, principalement pour les séparations
rapides des petites molécules d’intérêt pharmaceutique avec les monolithes

9-2016 © Editions T.I. IN 187 - 1

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IN187

INNOVATION

à base de silice et pour les biomolécules avec les monolithes polymériques.


Toutefois, ces phases stationnaires présentent des inconvénients en termes
de performances chromatographiques, de stabilité au pH, à la pression et à
1 la température ainsi qu’en termes de disponibilité (type de greffon et
dimensions des colonnes). Il ne fait cependant aucun doute que ces phases
monolithiques présentent un grand intérêt pour l’analyse des petites et
grosses molécules, mais des développements sont encore nécessaires afin
de pallier les désavantages susmentionnés.
En 2004, la commercialisation de petites particules poreuses (sub-2 µm) et
d’appareils chromatographiques performants en termes de pression
(1 000 bar) et de volumes extra-colonnes a permis de réduire les dimen-
sions des colonnes chromatographiques et donc les temps d’analyse. Cette
technologie commercialisée par Waters sous le nom d’UPLC (Ultra Perfor-
mance Liquid Chromatography ) a rapidement connu un très grand succès
pour l’analyse des petites molécules en chromatographie en mode phase
inversée. Dès 2005, de nombreux fabricants ont alors également mis sur le
marché des appareils chromatographiques permettant de travailler à haute
pression (600 à 1 500 bar) et limitant les volumes extra-colonnes. De plus,
des colonnes de différentes dimensions et des supports de natures diverses
ont permis à cette technique de connaître un très grand succès non seule-
ment pour l’analyse rapide, mais également pour des séparations
nécessitant des hautes résolutions. Elle est maintenant connue sous l’acro-
nyme UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography ).
C’est dans ce contexte que les particules superficiellement poreuses
de petites tailles sont apparues sur le marché en 2006. Avec
la commercialisation de ces nouvelles phases stationnaires possédant un
diamètre externe de 2,6 à 2,7 µm, l’emploi de ces supports a connu un
nouveau développement et un large succès aussi bien pour l’analyse des
macromolécules que pour des substances de tailles plus
conventionnelles [5]. Ces supports commercialisés à l’origine par Advanced
Materials Technologies avec des chaînes alkyles conventionnelles (C18 ou
C8), contrairement aux premières PSP qui contenaient des groupes échan-
geurs d’ions, ont permis de séparer des petites molécules en polarité des
phases inversées avec des performances proches de celles obtenues en
UHPLC avec des particules sub-2 µm, mais avec des pressions deux à trois
fois plus faibles, de par la taille de ces supports. Ainsi, et comme pour
l’UHPLC, cette technologie a rapidement connu un large succès et actuelle-
ment de nombreux supports sont disponibles avec des greffons variés, des
tailles de particules et de porosité diverses et des dimensions de colonnes
permettant de séparer soit rapidement, soit avec une haute résolution tous
les types de molécules.

Symbole Unité Description


1. Particules superficiellement
poreuses
Hauteur équivalente de plateau
H m
théorique
Les particules superficiellement poreuses (PSP) sont consti-
h – Hauteur de plateau réduite tuées d’un corps solide à base de silice non poreuse enrobé
d’une couche de silice poreuse présentant des propriétés chro-
Vitesse linéaire de la phase
u mm/s matographiques identiques aux supports conventionnels
mobile
(figure 1). Différentes technologies ont été développées par
v – Vitesse linéaire réduite les fabricants pour synthétiser ces supports. La plus courante
est effectuée par l’empilement de couches de particules colloï-
Rapport du diamètre de la partie dales jusqu’à l’obtention de la taille de couche poreuse
non poreuse de la particule au désirée [6] [7].
ρ –
diamètre externe de cette parti-
Comme indiqué précédemment, les premiers développe-
cule
ments de ces particules superficiellement poreuses étaient

IN 187 - 2 © Editions T.I. 9-2016

36
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IN187

INNOVATION

rétention de l’analyte, le terme B augmentant avec la réten-


tion étant donné que le composé passe plus de temps en
contact avec la phase stationnaire. Le terme C correspond à la
Couche poreuse somme des contributions au transfert de masse dans les par-
ticules (CP) et dans la phase mobile (le film) se situant à la
surface des particules (CF). Lors de l’élaboration des pre-
1
mières particules superficiellement poreuses, l’idée première
était de réduire le terme Cp par rapport aux particules
1,7 µm poreuses. Cependant, les travaux de Guiochon et Gritti [8] ont
démontré pour des molécules de petite taille que la réduction
Corps solide non poreux de ce terme était négligeable pour expliquer les meilleures
2,7 µm performances cinétiques observées avec les PSP sub-3 m,
mais qu’il demeurait essentiel pour les biomolécules.
Selon la théorie, la diffusion intraparticulaire dépend du
rapport entre le diamètre du corps non poreux et le
diamètre externe de la particule. Lorsque ce rapport aug-
mente, le transfert de masse des petites molécules dans les
0,5 µm particules augmente et CF qui dépend également de la struc-
ture des particules est plus fortement affecté que CP . Ainsi,
des valeurs de C réduites d’un facteur 2 ont été reportées
avec les PSP par rapport aux particules poreuses de même
Figure 1 – Morphologie d’une phase stationnaire
diamètre pour l’analyse des petites molécules [8].
superficiellement poreuse de de diamètre La présence d’un noyau non poreux dans la particule a par
contre un impact sur le terme B. Ce dernier diminue sa contri-
bution à l’élargissement du pic chromatographique d’au moins
dédiés à la séparation des macromolécules possédant de 20 % lorsque ρ est égal à 0,63, comme démontré pour diffé-
faibles coefficients de diffusion. En effet, l’efficacité de la sépa- rentes PSP [6] [8]. Par rapport à des particules poreuses de
ration peut être améliorée en réduisant la distance où ces même diamètre, le gain en efficacité totale dû au facteur B est
molécules peuvent diffuser dans les pores des particules et alors de l’ordre de 10 %. Enfin, le facteur le plus important
ainsi diminuer la résistance au transfert de masse [6] [8]. expliquant les meilleures efficacités obtenues avec ces parti-
Aujourd’hui, avec la commercialisation de nombreux supports cules superficiellement poreuses est le paramètre A qui est 30
sub-3 m dont le corps non poreux est de l’ordre de 1,7 m et à 40 % plus faible que celui observé avec les supports poreux
est recouvert d’une couche de silice poreuse (de l’ordre de de même diamètre, comme démontré par Guiochon et
0,5 m) contenant des motifs organiques variés, cette tech- Gritti [11] [12] [13]. Cette meilleure performance peut être
nique n’est plus limitée aux grosses molécules (voir plus loin). due à une distribution de tailles de particules plus homogène
Cette géométrie de support et ces rapports de silice poreuse ou/et à une densité et à une rugosité plus importante des par-
et non-poreuse offrent un excellent compromis, permettant de ticules, ces trois facteurs influençant positivement la qualité
conserver les avantages des silices non poreuses en termes du remplissage (figure 2).
cinétiques et une bonne capacité de chargement puisque
75 % du volume de ces phases stationnaires reste poreux. Afin de pouvoir comparer des supports chromatographiques
Aujourd’hui, de nombreux fabricants ont toutefois mis sur le de différentes structures et dimensions, il est préférable d’uti-
marché diverses PSP avec des diamètres variant entre 1,3 et liser les grandeurs réduites h et ν :
5 m et différentes épaisseurs de couche poreuse, telles que
reportées dans le tableau 1. (2)

(3)
1.1 Performances cinétiques
Afin de caractériser les performances cinétiques d’une avec h hauteur de plateau réduite,
colonne chromatographique, il est d’usage de faire appel à la ν vitesse linéaire réduite,
notion du nombre de plateaux théoriques (N ) et plus spécifi-
quement à l’équation de van Deemter [9] permettant de dp diamètre externe des particules,
reporter la hauteur équivalente d’un plateau théorique (H ) à DM coefficient de diffusion de l’analyte dans la phase
la vitesse linéaire de la phase mobile. D’autres modèles déri- mobile.
vés de cette équation ont été proposés pour la chromatogra-
phie en phase liquide, tels que l’équation de Knox [10] : Il peut alors être démontré sur la figure 3 que les colonnes
remplies de PSP donnent des performances nettement supé-
(1) rieures aux colonnes remplies de supports poreux avec res-
pectivement des valeurs minimales de h de 1,5 et de 2,0.
avec u vitesse linéaire de la phase mobile,
A, B, C constantes déterminées par l’élargissement du
pic chromatographique dû à l’anisotropie 1.2 Meilleure dimension d’une PSP
d’écoulement (A), à la diffusion longitudinale Comme reporté dans le tableau 1, il y a aujourd’hui de
(B) et à la résistance au transfert de masse (C). nombreuses géométries de phases stationnaires superficielle-
La constante A dépend de la qualité du remplissage de la ment poreuses et il peut être difficile de choisir la morphologie
colonne qui est elle-même fonction de l’homogénéité de la la plus adaptée à une séparation donnée. Comme indiqué pré-
structure des particules, de la disposition des particules dans cédemment, une fine couche de support poreux est avanta-
la colonne et de la distribution homogène des tailles de parti- geuse en termes cinétiques, mais sa capacité de charge et son
cules. Les constantes B et C dépendent quant à elles de la pouvoir de rétention diminuent.

9-2016 © Editions T.I. IN 187 - 3

37
1

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Référence Internet
P1460

Chromatographie en phase
supercritique
1
par Didier THIÉBAUT
Directeur de recherche au CNRS
UMR 8231 Chimie Biologie Innovation
Laboratoire sciences analytiques bioanalytiques et miniaturisation
ESPCI Paris, PSL, Paris

1. Fluides supercritiques en chromatographie .................................. P 1 460v3 - 3


1.1 Propriétés thermodynamiques ................................................................ — 3
1.2 Propriétés physico-chimiques.................................................................. — 4
1.3 Principaux fluides utilisables en CPS ...................................................... — 6
2. Propriétés chromatographiques des phases mobiles
à base de dioxyde de carbone ........................................................... — 7
2.1 Aspect thermodynamique........................................................................ — 7
2.2 Aspect cinétique........................................................................................ — 9
3. Colonnes et phases stationnaires..................................................... — 10
3.1 Colonnes remplies .................................................................................... — 10
3.2 Colonnes capillaires.................................................................................. — 11
4. Appareillage............................................................................................ — 11
4.1 Préambule.................................................................................................. — 11
4.2 Colonnes remplies .................................................................................... — 11
5. Applications............................................................................................ — 13
5.1 Applications générales ............................................................................. — 13
5.2 Chiralité...................................................................................................... — 13
5.3 Lipides........................................................................................................ — 16
5.4 Produits pétroliers et dérivés (CPS avec du dioxyde
de carbone seul)........................................................................................ — 16
6. Conclusion............................................................................................... — 18
7. Glossaire .................................................................................................. — 20
Pour en savoir plus ........................................................................................ Doc. P 1 460v3

a chromatographie en phase supercritique, CPS (ou SFC pour Super-


L critical Fluid Chromatography), met en œuvre une phase mobile
constituée d’un fluide ou d’un mélange de fluides généralement porté au-delà
du point critique par un contrôle adéquat de la température et de la pression.
Cette technique est complémentaire des chromatographies en phases
liquide, CPL (ou LC Liquid Chromatography), et gazeuse, CPG (ou GC Gas
Chromatography), car elle possède des caractéristiques propres, liées aux
propriétés des fluides supercritiques : la masse volumique du fluide super-
critique, comparable à celle d'un liquide, associée à une plus faible viscosité et,
pour le dioxyde de carbone, une grande compatibilité avec les détecteurs de
la CPG et de la CPL, en font une technique très performante, principalement
avec les colonnes remplies de la CPL (les applications mettant en œuvre les
colonnes capillaires de la CPG étant devenues rarissimes). Ainsi :
Parution : septembre 2016

– de grandes efficacités par unité de temps sont atteintes en raison de la


diffusion rapide des solutés dans les fluides supercritiques du fait de leur faible
viscosité ; aussi, des séparations peuvent-elles être obtenues en des temps

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P1460

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE _________________________________________________________________________________________

d'analyse environ 5 à 10 fois plus courts qu'en CPL, pour une granulométrie de
phase stationnaire identique ;
– on peut aussi, pour la même raison, augmenter la longueur de la colonne
et disposer alors d'une très grande efficacité, même avec les colonnes
remplies ; cela est beaucoup plus difficile à réaliser en CPL à cause de la perte
de charge élevée ;
– des sélectivités importantes sont observées en raison des interactions
1 entre les solutés, la phase stationnaire et la phase mobile que l'on peut faire
varier par l'ajout de faibles quantités de modificateurs polaires à la phase
supercritique ; la CPS s'apparente donc à la chromatographie de partage en
phase normale, même si la plupart des phases stationnaires de la CPL, y
compris celles de la phase inverse et de la chiralité, peuvent être employées
avec succès ;
– la CPS est une technique « verte » du fait qu'elle utilise comme phase
mobile majoritairement du dioxyde de carbone, atoxique, à la place de sol-
vants organiques. La consommation des solvants organiques est donc réduite
et, pour les applications à l'échelle industrielle, le CO2 peut être facilement
recyclé et purifié ;
– la CPS préparative présente, par ailleurs, l'avantage de permettre une
récupération des solutés par simple détente de la phase mobile, les seules
traces de solvants résiduels provenant des additifs polaires éventuellement
ajoutés. Cela a aussi son importance en extraction en phase supercritique dans
le domaine alimentaire par exemple ;
– contrairement à la CPL, la CPS, avec une phase dioxyde de carbone pur,
autorise le couplage avec le détecteur à ionisation de flamme (DIF) de la CPG.
On peut donc avantageusement la mettre en œuvre pour la séparation d'un
mélange complexe de solutés peu ou non volatils solubles dans le CO2 super-
critique et non aisément détectables comme les hydrocarbures saturés par
exemple.
Aussi, on comprend que la CPS trouve ses applications dans le domaine
pétrolier lorsqu'elle est couplée à la détection DIF – domaine pour lequel les
colonnes capillaires ont encore un intérêt – et, surtout, dans le domaine phar-
maceutique, en particulier pour les séparations des énantiomères où elle est
utilisée en routine depuis le milieu des années 1990. Depuis 2010, le renouvel-
lement de l’offre en chromatographes performants pour la CPS par des
grandes sociétés d’instrumentation constitue un facteur très favorable à son
extension dans tous les domaines pour lesquels la CPL est la technique de
choix.
Cet article expose le principe et les avantages de la CPS dans les domaines
où elle trouve des applications en incluant les dernières avancées techno-
logiques et pratiques.

P 1 460v3 – 2 Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservés

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__________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE

Symbole Unité Description 1. Fluides supercritiques


ASTM American Society for Testing and Materials en chromatographie
CPL Chromatographie en phase liquide (LC)
CPG Chromatographie en phase gazeuse (GC)
Chromatographie en phase supercritique
Aperçu historique
CPS

1
(SFC)
Dès 1962, Klesper, Corwin et Turner [1] utilisent la CPS pour
D m2 · s–1 Coefficient d’autodiffusion la séparation de porphyrines non volatiles. Toutefois, le déve-
loppement de cette méthode a d’abord été éclipsé par celui,
Coefficient de diffusion d’un soluté dans la
Dm m2 · s–1 très rapide, de la chromatographie en phase liquide (CPL) bien
phase mobile que, périodiquement, des exemples d’utilisation et des mises
Détecteur évaporatif à diffusion de la au point aient été publiés. Il faut attendre 1982 pour assister à
DEDL un regain d’intérêt pour la CPS, 1988 pour la parution du pre-
lumière (ELSD)
mier ouvrage [2] et les années 1990 pour les applications
Diamètre des particules de phase industrielles significatives.
dp m
stationnaire
mm ou Diamètre de la colonne
dc
m 1.1 Propriétés thermodynamiques
DIF Détection à ionisation de flamme (FID)
EC Électrophorèse capillaire 1.1.1 Fluide pur
CPG intégralement bidimensionnelle
GC GC Pour un composé pur, le diagramme pression (P ) température
(comprehensive 2D GC )
(T ) (P, T ) (figure 1) [3] précise les domaines des trois états de la
H m Hauteur équivalente à un plateau théorique matière, solide s, liquide , ou vapeur v, déterminés par l’équation
d’état. Les raccordements de ces différents domaines corres-
h Hauteur de plateau réduite pondent aux transitions de phase, s’accompagnent de disconti-
Infrarouge à transformée de Fourier nuité de certaines propriétés physiques, la masse volumique ρ en
IRTF particulier, et correspondent aux équilibres liquide-vapeur ,
(détection)
solide-liquide et solide-vapeur (s-v ). Au point triple T
k ou k Facteur de rétention coexistent les trois phases solide-liquide-vapeur.
–1
KT Pa Compressibilité
N Nombre de plateaux théoriques
Pression (bar)
P Pa Pression
PC Pa Pression critique
80
Résolution entre deux pics chromatogra- C
Rs
phiques
S g · L–1 Solubilité d’un soluté 60
SM Spectrométrie de masse (MS)
s-ᐉ

T °C Température 40 Solide Liquide Vapeur

Tc °C Température critique
ᐉ-v

t0 min ou s Temps de rétention nulle 20


–1 Vitesse linéaire de la phase mobile dans la
u mm · s T
colonne s-v
0
uopt mm · s–1 Vitesse linéaire à l’optimum d’efficacité
–100 –50 0 50
UV Ultraviolet (détection) Température (oC)

Ultra High Performance Liquid Chromato- ᐉ phase liquide


UHPLC
graphy v phase vapeur
s phase solide
Ultra High Performance Supercritical Fluid
UHPSFC C point critique (PC = 73,8 bar et TC = 31 oC)
Chromatography
1/2 T point triple (PT = 5,2 bar et TT = –56,6 oC)
δ MPa Paramètre de solubilité de Hildebrand
Les lignes en tiretés au-delà du point C sont
ρ g · cm–3 Masse volumique traversées sans discontinuité. Ainsi, un fluide peut
être à une température supérieure à TC et à une
ρc g · cm–3 Masse volumique au point critique pression inférieure à PC ou bien à une pression
supérieure à PC et à une température inférieure à TC ;
η Pa · s Viscosité
il est alors dans l’état subcritique.
Vitesse réduite de la phase mobile dans la
ν
colonne Figure 1 – Diagramme (P, T ) du dioxyde de carbone [3]

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P1460

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE _________________________________________________________________________________________

On remarque que l’on ne peut passer de l’état solide à l’état


liquide sans traverser un segment, donc sans qu’il y ait disconti-
Pression (bar)
nuité de la masse volumique des phases. Par contre, il est possible
de passer de l’état liquide à l’état gazeux continûment, sans traver-

C
0o
ser le segment , à la condition de contourner le point C,

60
appelé point critique ; il lui correspond une température critique
TC , une pression critique PC et une masse volumique ρC . 740

0
1

30
Au point C, on a un état intermédiaire entre l’état liquide et l’état Gaz
gazeux que l’on appelle état critique ou, si l’on s’éloigne notable-

0 0
ment de C, état supercritique. Cet état correspond donc à des 400

15 20
températures et des pressions supérieures à celles de C. 370
300
La figure 2 représente le diagramme de phase pression, masse

0
volumique (P, ρ ) du dioxyde de carbone. Plusieurs isothermes ont

10
220
été tracées et la zone d’utilisation habituelle de la CPS a été grisée.
Pour toute température supérieure à Tc , on constate qu’à une 150 60
augmentation continue de la pression correspond une augmen- 40 Liquide
tation continue de la masse volumique. 38
La compressibilité KT : 74 32
20 Solide
50
0 oC
36

augmente lorsque la température se rapproche de TC ; au point cri- Équilibre


tique, KT tend vers l’infini : une faible augmentation de la pression liquide - gaz –30
provoque un accroissement important de la masse volumique ; ce
phénomène est, comme nous le verrons, largement exploité en
CPS, aussi bien avec les colonnes capillaires que les colonnes
remplies.
–60

1.1.2 Mélanges binaires 0,25 0,50 0,75 1 1,25


Masse volumique (g · cm–3)
L’ajout au fluide supercritique d’un solvant polaire entraîne
des déplacements importants du point critique [4]. Si on se limite à
courbe de démixtion
une fraction molaire en solvant inférieure à 0,1, ce qui est souvent
La zone utile en CPS apparaît en grisé.
le cas en CPS, il est aisé de maintenir le mélange à l’état supercri-
tique. En revanche, pour des teneurs supérieures, les températures
critiques atteignent très vite des valeurs incompatibles tant avec la Figure 2 – Diagramme de phase du dioxyde de carbone
stabilité thermique des phases stationnaires greffées qu’avec celle
des solutés. C’est la raison pour laquelle l’emploi de phases
mobiles subcritiques (généralement du point de vue de la tempé-
rature) est couramment réalisé. Si le fait de travailler à l’état
1.2 Propriétés physico-chimiques
subcritique plutôt que supercritique a régulièrement fait l’objet de
discussions animées, en pratique cela n’a guère d’impact tant que Le tableau 1 [5] rassemble les ordres de grandeur des trois
l’un des deux paramètres excède la valeur au point critique et que paramètres masse volumique, viscosité et coefficient de diffusion,
la phase mobile reste monophasique. Cependant, en fonction des pour les trois états d’un même fluide. On remarque que, malgré
conditions, la masse volumique et la viscosité varient ce qui a une des valeurs élevées de masse volumique, proches de celles des
influence sur le comportement chromatographique comme on le liquides, les fluides supercritiques sont peu visqueux et, de ce
verra plus loin. point de vue, se rapprochent des gaz.

Tableau 1 – Ordre de grandeur de la masse volumique, de la viscosité et du coefficient


d’autodiffusion pour les gaz, liquides et fluides supercritiques [5]
D
État du fluide
(g · cm–3) (Pa · s) (m2 · s–1)

Gazeux 1 bar, 15 à 30 °C 0,6  10–3 à 2  10–3 1 10–5 à 3 10–5 1 10–5 à 4 10–5

Supercritique à TC , PC 0,2 à 0,5 1 10–5 à 3 10–5 5 10–8

Supercritique à TC , 4 PC 0,4 à 0,9 3 10–5 à 9 10–5 10–8

Liquide (solvants organiques-eau) 1 bar, 15 à 30 °C 0,6 à 1,6 0,2 10–3 à 3 10–3 0,2 10–9 à 3 10–9

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__________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE

1.2.1 Masse volumique et compressibilité


Masse volumique
Beaucoup des propriétés remarquables des fluides au voisinage (g · cm–3)
du point critique sont une conséquence de leur très forte compres-
sibilité (tableau 1). 1,2

Ainsi, une légère augmentation de la pression provoque un 1


accroissement de la masse volumique (figure 3). Dans la zone du

1
0,8
point critique, la compressibilité est environ 500 fois plus forte que
celle des liquides. Par conséquent, contrairement à la CPL, il est 0,6
possible de faire varier la masse volumique de la phase mobile en
0,4
agissant sur la pression et (ou) la température.
0,2 PC
À température constante, la masse volumique augmente avec la
pression (figure 3), tandis qu’à pression constante, la masse volu- 0
mique diminue lorsque la température augmente. Comme la 0 200 400 Pression (bar)
masse volumique influe à la fois sur le pouvoir solvant et sur la
polarité du fluide (§ 1.2.5), on comprend que la rétention des solu- Figure 3 – Variation de la masse volumique du CO2 en fonction
tés peut être modifiée par des changements de pression (et de de la pression à 40 °C
température). C’est là un point où la CPS diffère de la CPL : en
phase liquide, la compressibilité n’a que des effets négligeables
pour des pressions inférieures à 300 bar et la masse volumique est
constante. Viscosité (10–2 cP)

1.2.2 Viscosité 12

10
La viscosité des fluides supercritiques est 5 à 20 fois inférieure à
celle des liquides (tableau 1). Cela est important, car la viscosité de 8
la phase mobile est en partie responsable de la faible vitesse de
diffusion des solutés et du fort gradient de pression dans une 6
colonne chromatographique. La viscosité augmente avec la pres- 4
sion (figure 4), mais elle approche celle du liquide plus lentement
que ne le fait sa masse volumique. La viscosité ne diminue que 2 PC
légèrement avec une augmentation de la température dans la
gamme habituelle de pression (100 à 400 bar) et de température (0 0
1 cP = 10–3 Pa · s 0 200 400 Pression (bar)
à 60 °C) de la CPS.

Figure 4 – Variation de la viscosité du CO2 en fonction


de la pression à 40 °C
1.2.3 Coefficient d’autodiffusion

Il caractérise la diffusion des molécules de fluide dans le fluide 1.2.5 Polarité d’un fluide supercritique
lui-même et le tableau 1 montre qu’il est intermédiaire entre celui
d’un liquide et celui d’un gaz. Il diminue avec la pression et aug- La polarité d’un solvant peut être mesurée par son paramètre
mente avec la température. de solubilité de Hildebrand δ [7] :

1.2.4 Coefficient de diffusion des solutés

Le coefficient de diffusion Dm est un paramètre important en avec Ev énergie de cohésion du solvant,


chromatographie puisqu’il régit les processus de transfert de
Vm volume molaire.
masse entre les phases solide et mobile.
Pour un fluide supercritique, δ augmente avec la masse
■ Fluide supercritique pur volumique [8], ce qui permet de disposer d’un paramètre supplé-
mentaire pour la mise au point des séparations par simple varia-
Pour un fluide comme le CO2 , les valeurs de Dm sont comprises tion de la pression et/ou de la température. Par ailleurs, un
entre 10–8 et 5  10–8 m2 · s–1 et sont d’autant plus faibles que la gradient de pression permet aussi d’augmenter la masse volu-
masse molaire du soluté et la masse volumique du fluide sont mique du fluide lors de la séparation et, partant, d’éluer des solu-
grandes à température constante [5] [6]. Elles diminuent lorsque la tés de plus en plus polaires.
viscosité augmente et augmentent avec la température à masse
volumique constante. Elles peuvent être calculées [6], comme en
CPL, par la relation de Wilke et Chang. 1.2.6 Solubilité dans un fluide supercritique
La solubilité S d’un soluté dépend, en première approximation,
■ Mélange fluide supercritique-modificateur polaire de deux facteurs [9] [10] :
Les coefficients de diffusion diminuent lorsque la teneur en – le pouvoir solubilisant du fluide lié à sa nature et à sa masse
modificateur polaire dans la phase mobile augmente, mais ils volumique ;
demeurent néanmoins très supérieurs à ceux mesurés en phase – la volatilité éventuelle du soluté qui varie en fonction de la
liquide pour des teneurs inférieures à 20 % [6]. température.

Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservés P 1 460v3 – 5

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1

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P1485

Chromatographie en phase gazeuse

par Jean TRANCHANT


1
Ancien Président du GAMS (Groupe pour l’avancement des méthodes scientifiques
d’analyse)

1. Description d’un chromatographe en phase gazeuse .................... PE 1 485 - 2


2. Symbolique. Grandeurs de rétention .................................................. — 2
3. Appareillage ............................................................................................... — 4
3.1 Four................................................................................................................ — 4
3.2 Alimentation en gaz vecteur........................................................................ — 4
3.3 Systèmes d’injection .................................................................................... — 4
3.4 Détection ....................................................................................................... — 6
3.5 Alimentations et sorties électriques ou électroniques .............................. — 9
3.6 Accessoires divers........................................................................................ — 9
3.7 Tendances actuelles de l’appareillage ........................................................ — 10
4. Éléments théoriques indispensables au praticien........................... — 10
4.1 Efficacité des colonnes................................................................................. — 10
4.2 Résolution des colonnes.............................................................................. — 11
4.3 Variation de l’efficacité en fonction du débit du gaz vecteur.................... — 11
4.4 Cas des colonnes capillaires........................................................................ — 12
4.5 Variation de l’efficacité en fonction de la température ............................. — 12
4.6 Autres facteurs influant sur l’efficacité d’une colonne.............................. — 12
5. Matériaux de la séparation chromatographique.
Mise en œuvre ........................................................................................... — 13
5.1 Généralités sur les colonnes ....................................................................... — 13
5.2 Supports chromatographiques ................................................................... — 13
5.3 Phases stationnaires .................................................................................... — 13
5.4 Adsorbants.................................................................................................... — 14
5.5 Imprégnation des supports et remplissage des colonnes ........................ — 15
5.6 Colonnes capillaires ..................................................................................... — 15
5.7 Performances des colonnes ........................................................................ — 16
6. Analyse qualitative. Identification....................................................... — 17
6.1 Utilisation des grandeurs de rétention ....................................................... — 17
6.2 Détecteurs sélectifs. Couplages .................................................................. — 18
6.3 Méthode des empreintes digitales.............................................................. — 22
6.4 Pièges de l’analyse qualitative .................................................................... — 22
7. Analyse quantitative................................................................................ — 22
7.1 Mesure de l’aire des pics ............................................................................. — 23
7.2 Coefficient de proportionnalité ................................................................... — 23
7.3 Performances de l’analyse quantitative ..................................................... — 25
8. Préparation de l’échantillon .................................................................. — 25
9. Évolutions et applications...................................................................... — 26
9.1 Diverses formes de chromatographie ........................................................ — 26
9.2 Développement des colonnes capillaires. Commentaires........................ — 26
9.3 Automaticité des analyses........................................................................... — 27
9.4 Applications non analytiques ...................................................................... — 27
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. PE 1 485
Parution : juillet 1996

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation PE 1 485 - 1

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Référence Internet
P1485

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE __________________________________________________________________________________________________

L a chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une méthode de séparation


dont les principes généraux sont les mêmes que ceux énoncés pour la chro-
matographie en général, c’est-à-dire fondés sur la migration différentielle des
constituants du mélange à analyser au travers d’un substrat choisi. La particula-
rité du procédé est d’opérer en totalité sur des produits volatilisés, ce qui impli-
que de maintenir une température minimale convenable, mais sans qu’il y ait
volatilisation du substrat, et de travailler en circuit étanche aux gaz.

1 Prévue en 1941 par Martin et Synge, la CPG s’est surtout développée à partir
de 1952, sous l’impulsion de James et Martin. Elle a pris un essor considérable,
notamment entre 1960 et 1970, pour devenir l’une des méthodes de séparation
les plus utilisées. Nullement concurrente de la chromatographie en phase
liquide à haute performance, ni de la chromatographie sur couche mince (cf. arti-
cles spécialisés de ce traité), elle a son domaine propre. En particulier, le déve-
loppement considérable des colonnes capillaires ces dernières années en fait le
procédé de choix pour la recherche des ultratraces, thème de base des études de
pollution. Pour ce faire, on y adjoint souvent en couplage des méthodes spectro-
métriques de détection et d’identification.
Aucun chromatographiste ne peut, à l’heure actuelle, suivre tous les articles
concernant la CPG. La bibliographie ne peut s’effectuer qu’à l’aide d’un ordina-
teur au sein des deux ou trois cent mille références qui constituent le fonds
général. Pour une première démarche, pour des renseignements généraux sur la
technique, on peut utiliser les indications données en fin de cet article, concer-
nant des titres de livres récents et de quelques mémoires permettant de s’orien-
ter pour des recherches plus détaillées.

1. Description 2. Symbolique. Grandeurs


d’un chromatographe de rétention
en phase gazeuse
Les solutés, introduits dans le flux de gaz porteur, sont retenus par
le matériau contenu dans la colonne (cf. § 4). Il s’établit un équilibre,
Les différentes parties du chromatographe (figure 1) sont explici- ou pseudo-équilibre, entre la concentration des molécules du soluté
tées dans les paragraphes 3 et 5. Celui-ci traite spécialement de sa dans la phase fixe et la concentration des molécules du même
pièce maîtresse, la colonne, dans laquelle est enfermé le substrat soluté dans la phase gazeuse, ou phase mobile, le rapport des deux
qui va engendrer le processus de migration différentielle des élé- s’appelant coefficient de partage K.
ments du mélange à analyser. Ces éléments, appelés solutés, sont
obligés de parcourir la colonne par la poussée d’un gaz inerte, inti- Si les conditions d’équilibre thermodynamique sont remplies de
tulé gaz porteur ou gaz vecteur. C’est donc le cœur du chromatogra- façon idéale, les molécules du soluté se dispersent de façon gaus-
phe, puisque c’est ici que se feront, ou ne se feront pas, les sienne et leur distribution à la sortie de la colonne peut être figurée
séparations recherchées. par une courbe de Gauss, qui est un pic. On utilise des détecteurs
(cf. § 3) dont le signal donne directement de tels pics sur l’enregis-
Nous verrons au paragraphe 3 comment un injecteur approprié treur.
permet d’introduire le mélange à analyser dans le circuit gazeux,
sans rupture de celui-ci. Nous verrons aussi comment un détecteur Comme les conditions d’équilibre thermodynamique ne sont que
permet le repérage sur un enregistreur, avec tracé du chromato- rarement idéales, les pics sont légèrement déformés soit vers l’aval
gramme, des solutés au fur et à mesure de leur sortie de la colonne, (traînée), soit vers l’amont (front diffus). La figure 2 illustre ces for-
celle-ci étant conditionnée à des températures données à l’aide d’un mes de pics.
four. L’appareillage utilisé permet de maîtriser à la fois les conditions
Les paragraphes 6 et 7 montreront comment on dépouille les de température et les conditions pneumatiques, tandis que l’enre-
chromatogrammes qualitativement et quantitativement. gistreur déroule son papier suivant une fonction linéaire du temps.
Il en résulte que le chromatogramme peut fournir beaucoup d’indi-
cations sur le comportement du soluté dans le chromatographe,
pour le type de colonne considéré.
Sur la figure 3, on note que l’abscisse du chromatogramme peut
être exprimée en temps, et on appelle temps de rétention t R celui
qui s’est écoulé entre le moment d’injection du soluté et le moment
où le maximum de concentration du soluté est sorti de la colonne
(sommet du pic). C’est le temps de sortie du soluté, par convention,
ou encore le temps de séjour du produit concerné dans l’appareil.

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
PE 1 485 - 2 © Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation

46
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P1485

__________________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

Figure 3 – Grandeurs de rétention brutes et réduites (sur le papier


enregistreur)
Figure 1 – Principe du chromatographe

Notons que, si de telles interactions sont nulles, il faut quand


même un certain temps tm pour que le soluté parcoure tous les élé-
ments ci-dessus, pendant lequel s’est écoulé un volume de gaz por-
teur Vm = tm Ds , qui est la mesure du volume mort de l’appareil. Un
tel produit donne un pic de distance de rétention dm . On l’appelle
souvent pic de l’air, car, dans un très grand nombre de cas, ni l’azote
ni l’oxygène ne sont retenus par les matériaux de remplissage des
colonnes, et, n’étant pas séparés, ils donnent un seul pic qui permet
de calculer Vm. On peut être amené à choisir le méthane comme
repère du volume mort quand le détecteur ne donne pas de signal
au passage de l’air.
Si l’on soustrait Vm de VR, on introduit une correction qui permet
de calculer le volume de gaz vecteur lié à la rétention du soluté par
le remplissage même de la colonne. C’est le volume de rétention
corrigé (ou réduit) V R¢ = V R Ð V m , auquel on associe le temps de
rétention corrigé t R¢ = t R Ð t m et la distance de rétention corrigée
d R¢ = d R Ð d m .
La colonne introduisant une perte de charge dans le circuit,
l’écoulement gazeux n’est pas constant tout au long de la colonne,
et, pour en tenir compte, on doit faire une correction supplémen-
taire, qui procure le volume de rétention net (ou absolu) V N = jV R¢ ,
où j est le coefficient de perte de charge (appelé encore facteur de
James et Martin) calculé par :
Figure 2 – Forme des pics suivant la forme de l’isotherme 2
d’absorption 3 P Ð1
j = --- ----------------
2 P3Ð1
p
Comme le papier de l’enregistreur se déroule avec un mouvement avec P = -----e- ,
ps
d’horlogerie, avec une vitesse ue , la distance mesurée sur le chro- pe pression d’entrée du gaz vecteur dans la colonne,
matogramme entre le point d’injection et le sommet du pic est pro- ps pression de sortie (très souvent, pression
portionnelle à tR. On l’appelle distance de rétention d R : atmosphérique).
dR = ue tR On peut ramener le volume de rétention net à l’unité de masse du
remplissage actif dans la colonne et à 0 ˚C, et l’on obtient le volume
Si le flux de gaz vecteur dans la colonne est constant (ce qui est le
de rétention spécifique :
cas en chromatographie isotherme et isobare) et mesuré par son
débit Ds en sortie de la colonne, au temps tR est associé un volume 273
de gaz porteur, le volume de rétention VR tel que : V g = V N ---------------
mf Tc
VR = tR Ds = Ds ´ dR / ue
avec mf masse de remplissage actif,
C’est le volume de gaz vecteur nécessaire pour que le soluté tra- Tc température de la colonne, en kelvins.
verse tout l’appareil (injecteur + colonne + détecteur + raccords),
compte tenu du freinage provoqué par les interactions entre le com-
posé et le contenu de la colonne.

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CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE __________________________________________________________________________________________________

Suivant la théorie chromatographique, Vg est une caractéristique sion contenant du produit de pureté connue. Un manodétendeur à
physique du soluté considéré vis-à-vis de la nature du remplissage deux ou trois étages permet d’obtenir la pression d’entrée cherchée,
actif (uniquement en chromatographie isotherme et isobare). souvent de l’ordre de quelques bars, avec une régulation du débit
Si, comme c’est souvent le cas, on peut assimiler le volume qui doit être très bonne quand on travaille en chromatographie iso-
gazeux de la colonne VG au volume mort Vm de l’appareil, on peut therme, notamment avec un détecteur à conductivité thermique.
relier le volume de rétention au coefficient de partage K par Un manomètre, placé en amont de l’injecteur, permet d’avoir une
l’équation : indication, peu précise, de la pression d’entrée dans la colonne.

1
VR = Vm + KVf À l’aide de systèmes pneumatiques ou électroniques, on peut,
inversement, appliquer au débit de gaz une loi de variation donnée,
avec Vf volume du remplissage actif de la colonne, pour obtenir la chromatographie à débit programmé.
c’est-à-dire que : On note que, sans un régulateur spécial de débit, ce dernier varie
également quand on opère en programmation de température.
V R¢ = K V f
On peut avoir avantage à sécher le gaz vecteur, en le faisant tra-
verser une petite colonne de tamis moléculaire, ou à le purifier des
hydrocarbures grâce à une colonne de charbon actif. Il ne faut pas
oublier de régénérer périodiquement ces colonnes.
3. Appareillage
En reprenant les diverses parties notées sur la figure 1 nous décri- 3.3 Systèmes d’injection
rons successivement les pièces essentielles du chromatographe,
sauf la colonne qui est traitée au paragraphe 5.
Le mélange à introduire dans un chromatographe, sans interrom-
pre le flux gazeux, peut être sous forme d’un gaz, d’un liquide ou
quelquefois même d’un solide, pourvu que, dans ces deux derniers
3.1 Four cas, la vaporisation totale soit assurée de façon aussi instantanée
que possible. On va donc dessiner des systèmes d’injection accom-
plissant toutes ces fonctions.
Sauf pour quelques appareils de recherche, le four des chromato-
graphes (ou l’enceinte à température contrôlée des colonnes) est à
bain d’air, pourvu de résistances chauffantes et d’un système de 3.3.1 Injecteurs pour colonnes à remplissage
ventilation et de brassage pour l’homogénéisation de la tempéra-
ture. La régulation de cette dernière est assurée à l’aide d’un régula- ■ Injecteur pour mélange gazeux
teur électronique, par l’intermédiaire d’un couple thermoélectrique, On appelle fréquemment vannes d’injection les systèmes de robi-
ou d’une sonde équivalente, autour duquel la variation n’excède pas nets à voies multiples qui permettent, par un simple mouvement de
± 0,2 ˚C, pour un intervalle de fonctionnement allant de la tempéra- rotation, de faire passer un échantillon de gaz, soit d’une pipette à
ture ambiante jusqu’à 500 ˚C. En fait, ce système n’empêche pas le gaz, soit d’un circuit parallèle, dans le circuit gazeux du chromato-
développement d’un gradient thermique dans le four, qui peut être graphe. Le volume de la boucle d’échantillonnage est de quelques
de quelques degrés vers 250 ˚C. centimètres cubes au maximum (figure 4).
Une alimentation cryogénique peut permettre de régler l’enceinte
à une température inférieure à la température ambiante.
Au lieu de maintenir la température constante dans l’enceinte, on
peut l’astreindre à suivre une loi de variation donnée, qui comporte
souvent des paliers à température constante encadrant une ou plu-
sieurs montées généralement linéaires (gradient constant), pour
obtenir une chromatographie à température programmée. Cela
implique un système de refroidissement, qui peut être la simple
ouverture de la porte du four, en fin d’analyse, pour revenir à la tem-
pérature de départ. On note que, dans ce cas de programmation de
température, il y a souvent un décalage entre la température affi-
chée à un instant donné dans le four et la température réelle de la
colonne.
Un chromatographe comporte souvent une enceinte complémen-
taire pour assurer la régulation de la température de l’injecteur, et
quelquefois une autre pour contenir le détecteur, notamment quand
il s’agit d’un catharomètre (§ 3.4.1).
Les parois du four doivent être traversées par les tubulures
d’entrée et de sortie du gaz vecteur. Nous verrons au paragraphe 3.6
les systèmes de connexion utilisés.
Figure 4 – Vanne d’injection à six voies

3.2 Alimentation en gaz vecteur


On peut aussi utiliser une seringue à gaz, en conjonction avec une
chambre d’injection telle que celle décrite au paragraphe suivant.
Hydrogène, hélium, azote sont les gaz vecteurs les plus utilisés
(les paragraphes 3.4.1 et 3.4.2 expliquent le choix à faire suivant les
cas). Ils sont de toute façon prélevés dans une bouteille sous pres-

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■ Chambre d’injection pour liquides ou solutions Les seringues à gaz sont du même type, d’une capacité d’une cen-
C’est le système le plus utilisé. La figure 5 le décrit dans son prin- taine de microlitres. Leur piston est simplement muni d’un embout
cipe essentiel : le gaz vecteur, de préférence préchauffé, entre dans en Téflon, qui assure une certaine étanchéité au gaz.
une chambre chauffée, obturée par une pastille d’élastomère, le
septum, qui assure l’étanchéité. À l’aide d’une seringue hypodermi-
Remarque : dans tous les cas, il ne faut jamais oublier de bien
que de petite capacité, on pique au travers de la membrane, de telle
nettoyer les seringues avec un solvant volatil entre chaque
manière que l’extrémité de l’aiguille arrive au-dessous du niveau de
injection, puis de les sécher convenablement.

1
l’arrivée du gaz porteur, puis on pousse le piston pour réaliser
l’injection.

3.3.2 Injecteurs pour colonnes capillaires

Le film de phase stationnaire dans les colonnes capillaires classi-


ques est très mince, son épaisseur est de l’ordre du micromètre. Il
en résulte des échanges presque instantanés entre la phase mobile
et la phase fixe, d’où des pics très étroits avec une efficacité unitaire
élevée et des possibilités d’analyse très rapide (cf. § 4). La contrepar-
tie est un facteur de capacité, c’est-à-dire la limite de saturation de la
colonne, très petit. Les masses injectables, qui sont de l’ordre de 0,1
à 1 mg pour les colonnes à remplissage, ne sont plus ici que de 0,01
ou 0,001 mg. Il est évident qu’aucune seringue ne permet de telles
injections de façon non aléatoire.

Figure 6 – Utilisation d’une seringue de 10 mL

On est par conséquent conduit à utiliser des techniques plus


sophistiquées, qui ne sont pas exemptes d’inconvénients.
■ Systèmes à division de flux
Connus sous le terme anglais de splitter, ils comprennent une
chambre d’injection à septum du même type que décrit par la
figure 5, mais une vanne à aiguille montée sur un évent placé avant
l’entrée de la colonne permet de ne diriger sur cette dernière qu’une
Figure 5 – Injecteur à liquides classique fraction du produit injecté. Ces systèmes sont simples, mais il existe
un risque non négligeable de ségrégation des constituants de mas-
ses différentes de la composition à analyser (figure 7).
Une condition demandée à la chambre d’injection est d’avoir un
volume interne aussi petit que possible, pour limiter les volumes
morts de l’appareil. Pour assurer la vaporisation instantanée de
l’échantillon, l’injecteur est habituellement maintenu à une tempéra-
ture au moins 30 ˚C plus élevée que celle du four contenant la
colonne.
Le septum doit avoir une bonne résistance à la température maxi-
male choisie, en particulier garder le plus longtemps possible l’apti-
tude à se refermer dès que l’aiguille de la seringue est retirée. Si l’on
observe des fuites dans le circuit gazeux, il faut changer le septum
suivant une périodicité qui est fonction du traitement thermique et
mécanique qu’on lui fait subir.
Les seringues à liquide sont présentées de diverses façons, dont
la figure 6 donne un exemple. Elles ont une capacité s’échelonnant
de 10 à 0,5 mL, les quantités injectées étant de l’ordre du microlitre
ou même d’une fraction de microlitre (moins de 1 mg de substance). Figure 7 – Injecteur diviseur ou splitter : principe

■ Systèmes sans division


Les injecteurs split-splitless évitent en principe le risque de ségré-
gation au prix d’une manœuvre un peu plus compliquée qui permet

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d’évacuer une partie de l’échantillon vers l’extérieur, soit en pié-


geant à froid les solutés en tête de colonne avant de les volatiliser,
soit en utilisant un effet solvant. Il est assez difficile d’obtenir une
bonne reproductibilité des temps de rétention par cette méthode,
surtout pour les produits situés au début du chromatogramme.
■ Injection dans la colonne
Connus sous le nom d’injecteurs on-column, ce sont sans doute

1 les plus populaires actuellement pour les colonnes capillaires classi-


ques. La figure 8 en donne une représentation schématique.

Figure 9 – Injecteur à aiguille de verre

greffée, dont le film est plus épais que dans les capillaires classi-
ques, permettant des injections de volume un peu plus important.

3.3.3 Automaticité. Robotisation

À la fois dans un but d’amélioration de la reproductibilité de


l’injection et dans un but d’accroissement de la productivité, la plu-
part des chromatographes de laboratoire sont équipés de passeurs
d’échantillons, robots qui effectuent toutes les opérations
successives : prélèvement de l’échantillon, injection, nettoyage de la
seringue, etc. Cela permet, par exemple, d’analyser la nuit, en
l’absence du personnel, les produits fabriqués au cours de la jour-
née.
Des vannes-tiroirs (figure 10) sont utilisables, entre autres, pour
l’automaticité du prélèvement dans les analyses en ligne. Dans ce
Figure 8 – Injecteur on column
cas, il est nécessaire de prévoir des contrôles périodiques à l’aide
d’étalons pour tenir compte de la dérive éventuelle des colonnes. La
méthode du standard différé est bien adaptée à ce problème.
Grâce à une seringue dont le diamètre extérieur de l’aiguille
métallique est de 0,23 mm, on injecte l’échantillon au travers de la
vanne d’arrêt rotative dans une zone refroidie de la tête de colonne.
On utilise environ 5 mL de solution dans un solvant qui sera éliminé
avant que le produit lui-même ne soit volatilisé dans la colonne. Des
variantes permettent de s’adapter aux différents types de colonnes.
Les avantages de cette méthode comprennent une bonne reproduc-
tibilité de l’injection, une moins grande exposition de l’échantillon à
des températures élevées, et la suppression des effets du septum,
quelquefois indésirables.
■ Autres types d’injecteurs
Nous citons simplement l’injecteur à aiguille de verre sur laquelle
on dépose avec une seringue classique l’échantillon à analyser ; on
vaporise le solvant par un courant de gaz, puis on pousse l’aiguille
dans la zone chauffée de la tête de colonne (figure 9).
L’injecteur à température programmée (PTV) permet des injec-
tions avec ou sans division, avec élimination du solvant avant
l’entrée dans la colonne. Il est très efficace, mais peu adapté aux
analyses très rapides.
Figure 10 – Vanne tiroir pour injection de liquide
■ Commentaires
La diversité des techniques proposées montre à elle seule la com-
plexité du problème, en particulier quand on veut faire des analyses 3.4 Détection
quantitatives. C’est le risque de modification de la composition pon-
dérale de l’échantillon qui subsiste et qui conduit certains à préférer
les colonnes à remplissage dans ce cas. C’est aussi ce qui a conduit Les effluents sortant à tour de rôle de la colonne doivent être repé-
à développer des colonnes macrocapillaires, à phase stationnaire rés et ce repère transformé en un signal électrique que l’on puisse
enregistrer pour constituer le chromatogramme. C’est la fonction du

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détecteur. Dans certains cas, on s’attache à ce que cet appareil


donne un signal proportionnel à la quantité globale de chacun des
éléments du mélange séparé : c’est un détecteur intégral ; ou alors,
et c’est en pratique le système utilisé, il donne un signal suivant
l’évolution de la concentration massique ou volumique du soluté
qui le traverse, en fonction du temps : c’est le détecteur différentiel,
qui donne un tracé idéalement sous forme d’une succession de
courbes de Gauss, qui sont les pics.
Pratiquement toute propriété physique, et quelquefois chimique,
des solutés peut servir à constituer un système de détection. Mais
un certain nombre seulement de procédés ont reçu un développe-
1
ment industriel, soit qu’il s’agisse de détecteurs universels, ou pres-
que universels, soit qu’il s’agisse d’appareils ne donnant un signal
(une réponse) que pour une ou plusieurs familles de produits bien
déterminés, ce sont les détecteurs sélectifs.
Parmi les premiers, nous décrirons les deux détecteurs les plus
courants : le catharomètre et le détecteur à ionisation de flamme.
Nous citerons ensuite quelques modèles de détecteurs sélectifs
avec leurs principes. Puis nous énumérerons d’autres systèmes (cf.
aussi [Doc. PE 1 485]), avant d’indiquer quelques éléments nécessai-
res à la pratique de la détection.

3.4.1 Détecteur à conductivité thermique.


Catharomètre

C’est un appareil simple et robuste, à réponse universelle, mais


relativement peu sensible [Doc. PE 1 485, Tableau A].
Il est fondé sur une comparaison continuelle entre le flux de cha-
leur emporté par le gaz vecteur pur et le flux de chaleur emporté par
le gaz vecteur chargé des molécules du soluté. Ces flux de chaleur Figure 11 – Dispositions possibles des filaments dans un
sont produits par des résistances électriques, ou des thermistances, catharomètre
parcourues par un courant continu très stable et placées dans un
environnement tel que les pertes par conduction soient constantes,
donc en enceinte thermostatée avec précision (si possible à ± 0,1 ˚C Il a aussi l’inconvénient, contrairement au catharomètre, de
près). La réponse du catharomètre est proportionnelle à la concen- détruire le soluté qui le traverse, car son principe est de brûler, dans
tration du soluté dans le gaz vecteur qui passe dans le détecteur. une flamme d’hydrogène, l’effluent apporté par de l’azote. Sous
La figure 11 schématise un catharomètre de modèle simple, avec l’effet d’un champ électrostatique, il se forme des ions carbone de
divers montages des filaments. charge positive qui sont précipités sur une électrode où ils créent un
Les résistances sont montées en pont de Wheatstone et celui-ci courant d’ionisation que l’on amplifie grâce à un électromètre
permet de suivre l’évolution du courant en fonction de la variation amplificateur. Sur un enregistreur, on obtient un signal proportion-
ohmique consécutive aux variations de température autour des fila- nel au débit-masse de soluté dans le détecteur. En fait, il n’est pas
ments. Un galvanomètre ou un potentiomètre enregistreurs suivent exactement proportionnel au nombre d’atomes de carbone du com-
le courant dans le pont. posé concerné, car il y a une influence défavorable des autres ato-
mes que C et H.
Pour obtenir la plus grande réponse pour un soluté donné, il est
donc nécessaire qu’il y ait la plus grande différence possible entre la On peut représenter simplement un tel système par la figure 13.
conductivité thermique de ce soluté et celle du gaz vecteur. Pour Par rapport au catharomètre, il est donc nécessaire d’avoir une
cette raison, on utilise pratiquement toujours l’hydrogène ou bouteille d’hydrogène en plus de celle du gaz vecteur. Il faudra aussi
l’hélium comme gaz vecteur avec le catharomètre, car leur conduc- souffler un peu d’air ou d’oxygène pour assurer la combustion de
tivité thermique est respectivement environ onze fois et dix fois plus l’hydrogène. Généralement on utilise de l’air reconstitué.
grande que celle de presque tous les autres gaz ou vapeurs. Par contre, le détecteur à ionisation de flamme n’est pas sensible
À signaler, un catharomètre plus sensible, vendu par Hewlett Pac- aux faibles variations de température (de l’ordre de quelques degrés
kard, et ne comportant qu’un seul filament alternativement balayé Celsius), et il est inutile de le placer dans une enceinte thermostatée.
par le gaz de référence et par l’effluent de la colonne grâce à un sys- À ce point de vue, il est particulièrement favorable aux analyses en
tème de commutation pneumatique (dix fois par seconde). Une programmation de température, notamment en utilisant deux
démodulation synchrone du signal y est adjointe. La figure 12 en colonnes en parallèle, dont l’une n’est parcourue que par le gaz vec-
donne un schéma. teur et dont les deux détecteurs sont montés en opposition.
Par ailleurs, MTI présente un catharomètre à très petit volume
mort (230 nL), permettant son utilisation avec une colonne capil-
laire. 3.4.3 Détecteurs sélectifs

■ Nous ne ferons que citer le détecteur à capture d’électrons, dans


3.4.2 Détecteur à ionisation de flamme lequel on crée des électrons libres grâce à une source telle que le tri-
tium ou le 63Ni. Quand ce détecteur est traversé par des substances
C’est un détecteur beaucoup plus sensible que le catharomètre, ayant une affinité pour les électrons libres, il se produit des ions qui,
mais moins universel, car il ne donne pas de réponse aux composés comme pour le détecteur à ionisation de flamme, dans le champ
inorganiques, ni aux gaz permanents. électrostatique existant, sont recueillis par une électrode et forment
un courant d’ionisation à amplifier convenablement (figure 14).

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1

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P1470

Séparations chirales
par CPL, CPS et CPG
1
par Marcel CAUDE
Ingénieur du Conservatoire National des Arts et Métiers (CNAM)
Docteur ès Sciences
Directeur de Recherche au Centre National de la Recherche Scientifique
et Nathalie BARGMANN-LEYDER
Ingénieur de l’École Supérieure de Physique et Chimie Industrielles de Paris

1. Généralités................................................................................................. P 1 470 - 2
1.1 Chiralité et structure moléculaire ............................................................... — 2
1.2 Nomenclature R,S autour d’un centre de chiralité.................................... — 3
1.3 Règle des trois points.................................................................................. — 3
2. Formation de diastéréoisomères par dérivation précolonne....... — 4
2.1 Chromatographie en phase gazeuse ......................................................... — 4
2.2 Chromatographies en phases liquide et supercritique ............................ — 4
3. Formation de diastéréoisomères labiles dans la phase mobile .. — 11
3.1 Chromatographie d’adsorption .................................................................. — 11
3.2 Chromatographie de partage à polarité de phases inversée................... — 11
3.3 Chromatographie d’échange de ligands.................................................... — 12
3.4 Chromatographie de paires d’ions............................................................. — 12
4. Formation de diastéréoisomères labiles à la surface de phases
stationnaires chirales (PSC) .................................................................. — 12
4.1 Chromatographie en phase gazeuse ......................................................... — 12
4.2 Chromatographies en phases liquide et supercritique ............................ — 13
5. Conclusion ................................................................................................. — 23
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 470

L es séparations chirales ont une grande importance dans des domaines


variés :
— pharmacologique (l’activité d’une molécule thérapeutique peut varier d’une
configuration absolue à une autre ; le cas le plus tragique fut celui de la thalido-
mide utilisée comme sédatif chez la femme enceinte dont l’une des formes s’est
avérée tératogène) ;
— agrochimique (de nombreux herbicides et pesticides possèdent un ou plu-
sieurs centre(s) d’asymétrie et l’une des formes peut être plus active que l’autre ;
son utilisation permettrait de diminuer les quantités épandues et ainsi la
pollution) ;
— arômes et parfums...
Aussi n’est-il pas surprenant que le contrôle de la pureté optique et l’étude des
propriétés des énantiomères deviennent une nécessité, en particulier pour les
molécules médicamenteuses.
Parution : mars 2001

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SÉPARATIONS CHIRALES PAR CPL, CPS ET CPG ______________________________________________________________________________________________

Différentes techniques de détermination de la pureté optique ou énantiomé-


rique existent, elles peuvent être séparées en deux groupes selon que la sépara-
tion effective des énantiomères est réalisée ou non.
Les méthodes sans séparation non développées ici sont la polarimétrie (utili-
sant la propriété pour un composé chiral de faire tourner le plan de polarisation
de la lumière), la RMN (on distingue les méthodes indirectes consistant à dériver

1
les énantiomères en diastéréoisomères des méthodes directes consistant à utili-
ser un solvant chiral comme le (R) - (I) - 2,2,2-trifluoro-1-phényléthanol ou un
réactif optiquement actif type complexe de lanthanide, la dilution isotopique, la
calorimétrie et enfin les techniques enzymatiques.
Les méthodes avec séparation sont la recristallisation fractionnée et les chro-
matographies. La recristallisation fractionnée a longtemps été la technique de
choix pour préparer des composés optiquement purs. Cette méthode est basée
sur des différences de comportement thermodynamique des deux antipodes
d’un racémique : en présence d’un agent résolvant chiral, ils donnent des com-
plexes ayant des solubilités distinctes. Elle présente certains inconvénients : lon-
gue à mettre en œuvre, elle n’est pas à l’abri d’erreurs résultant de vitesses de
réaction différentes, de la racémisation du réactif chiral ou de racémisation lors
de l’étape finale de libération du réactif chiral.
Les développements des chromatographies en phase gazeuse (CPG) puis en
phase liquide (CPL) et plus récemment en phase supercritique (CPS) ont permis
la mise au point de techniques de plus en plus performantes. Les propriétés phy-
sico-chimiques de deux énantiomères sont identiques sauf lorsqu’ils sont placés
dans un environnement dissymétrique. Ce dernier peut être obtenu avant la
colonne chromatographique (méthode 1) ou dans la colonne chromatogra-
phique par l’intermédiaire de la phase mobile (méthode 2) ou de la phase sta-
tionnaire (méthode 3).
Méthode 1 : les énantiomères sont transformés chimiquement en diastéréoi-
somères et séparés ensuite avec des phases stationnaires et mobiles achirales.
Méthode 2 : un agent chiral est ajouté à la phase mobile dans laquelle vont se
former des complexes diastéréoisomères labiles.
Méthode 3 : la séparation repose sur la formation de complexes diastéréoiso-
mères labiles entre chaque énantiomère et la phase stationnaire chirale : la
sélectivité de la séparation chirale est alors directement liée à la différence de
stabilité des complexes ainsi formés.
Ce sont ces trois méthodes qui seront développées dans cet article après avoir
défini les notions utiles à leur compréhension.

1. Généralités Si des stéréoisomères ne sont pas images dans un miroir, ils sont
dits diastéréoisomères (les formes cis et trans d’une même molé-
cule sont, par définition, des diastéréoisomères). Les diastéréoiso-
mères, contrairement aux énantiomères, présentent des énergies
internes différentes et peuvent être séparés en exploitant leur diffé-
1.1 Chiralité et structure moléculaire rence de propriétés physicochimiques (point de fusion, solubilité,
etc.). Précisons enfin que l’énantiomérie ou la diastéréoisomérie
sont des relations liant deux configurations : pour un même com-
La chiralité est la propriété géométrique qui caractérise le fait posé, la forme A peut être énantiomère de la forme B et diastéréoi-
qu’un objet et son image dans un miroir ne sont pas superposables. somère de la forme C ou D, comme le montre la figure 1 pour une
Des isomères pour lesquels seul l’arrangement spatial des ato- molécule comportant deux centres d’asymétrie. On distingue les
mes diffère sont appelés stéréoisomères. Deux stéréoisomères sont molécules asymétriques (possédant un carbone ou un hétéroatome
dits énantiomères si et seulement si ils sont images l’un de l’autre asymétrique) des molécules symétriques pour lesquelles il peut
dans un miroir. La molécule originelle et son image sont dites s’agir de chiralité axiale (allènes, spirannes...), planaire (dérivés
antipodes ; un mélange équimolaire d’antipodes est appelé racé- « ansa », paracyclophane...) ou d’hélicité (atropoisomérie : hexahéli-
mate. cène, trans-cyclooctène...).

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______________________________________________________________________________________________ SÉPARATIONS CHIRALES PAR CPL, CPS ET CPG

Figure 2 – Nomenclature des molécules chirales

doublet électronique libre). Si on observe (en se plaçant face au


volant) la séquence GMP distribuée dans le sens des aiguilles d’une
montre, on lui attribue la configuration R (figure 2 a ). Dans le cas
contraire, celle-ci est dite S. Pour les atropo-isomères (isomérie pro-
voquée par un empêchement stérique à la rotation), on utilise la
nomenclature M (minus) et P (plus) associée respectivement à des
hélices droites ou gauches (figure 2 b ).
Figure 1 – Relation existant entre les quatre configurations absolues Rappelons que, pour un composé ayant n centres d’asymétrie, on
d’une molécule comportant deux centres d’asymétrie compte 2n stéréoisomères, soit 2n–1 couples d’énantiomères. Pour
une molécule renfermant 5 centres d’asymétrie, on peut prévoir
32 stéréoisomères se composant de 16 couples d’antipodes.
1.2 Nomenclature R,S autour d’un centre Il est cependant possible que des éléments de symétrie molécu-
de chiralité laire et/ou une interdépendance configurationnelle entre les centres
de chiralité réduisent le nombre des stéréoisomères.

Cahn, Ingold et Prelog ont proposé une nomenclature unifiée R


(Rectus), S (Sinister) pour désigner la configuration absolue des
molécules asymétriques. Considérons un atome A asymétrique 1.3 Règle des trois points
entouré de quatre groupements différents. La nomenclature retenue
nécessite deux opérations. On classe tout d’abord les groupements
par la comparaison des numéros atomiques des atomes liés au cen- La séparation des énantiomères repose sur la formation de com-
tre d’asymétrie. Par exemple : plexes diastéréoisomères entre le racémate et un sélecteur chiral. La
stéréosélectivité dépend de la différence de stabilité des diastéréoi-
I > Br > Cl > F somères ainsi formés. La règle des trois points d’interaction (dite
Pour les chaînes carbonées commençant toutes par un carbone, il règle de Dalgliesh) [1] permet, à partir de considérations purement
y a indétermination ; elle est levée grâce à un certain nombre de géométriques, de montrer que deux énantiomères seront séparés si
règles qui ne seront pas détaillées ici [121]. Nous dirons seulement au moins trois interactions simultanées (AA’, BB’, CC’) dont l’une de
que la comparaison entre deux groupes est poursuivie dans les nature stéréosélective, ont lieu avec l’un des énantiomères
chaînes carbonées jusqu’à la levée de l’indétermination. Par exem- (figure 3). L’obtention d’une stéréosélectivité n’implique pas obliga-
ple, —CH2—CH3 a priorité sur —CH3 car le second carbone du radi- toirement la perte d’une interaction avec l’un des énantiomères
cal éthyle l’emporte sur l’hydrogène correspondant dans le mais des énergies d’interaction différentes tout en restant du même
groupement méthyle. On aboutit alors au classement suivant pour ordre de grandeur. Cette règle, qui a le mérite de la simplicité, ne
les principaux substituants : s’applique bien que pour des processus bimoléculaires ; elle est en
cela très réductrice. La réalité s’avère souvent plus complexe car il
—C6H5 > —C(CH3)3 > —CH(CH3)2 > —CH2—CH3 > —CH3 faut aussi prendre en considération les états conformationnels
—OH > —NH2 > —COOH > —CHO > —CH2OH > —C6H5 adoptés par le soluté et la phase stationnaire chirale. De plus, lors-
que celle-ci est un polymère chiral, aux interactions attractives clas-
On imagine ensuite que les groupements G (gros), M (moyen), siques s’ajoute un phénomène de reconnaissance de forme qui met
P (petit) sont répartis sur un volant dont l’axe serait A-I (I étant le en jeu la géométrie globale du soluté (comparable aux processus de
plus petit des quatre groupements, il peut s’agir quelquefois d’un reconnaissance enzymatique de type clef-serrure).

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55
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P1470

SÉPARATIONS CHIRALES PAR CPL, CPS ET CPG ______________________________________________________________________________________________

De nombreux réactifs de dérivation chiraux possédant différents


groupements fonctionnels sont disponibles, les plus couramment
utilisés sont rassemblés dans le tableau 1.

2.1.2 Exemples

1 Des progrès considérables ont été faits dans la compréhension


des mécanismes de séparation des diastéréoisomères en CPG
par Karger et al. [7] [8] notamment. Le chlorure de N trifluoroacétyl
de L-proline (N-TFA) L-proline) est le plus utilisé des réactifs de déri-
vation chirale pour les amines primaires et secondaires (amines
cycliques incluses) [9] [10] ainsi que pour les acides aminés sous
forme esters [6] [7]. Cependant, ce réactif n’est pas toujours le plus
Figure 3 – Modèle des trois points d’interaction selon Dalgliesh efficace pour la résolution des amines. Souter et al. [11] ont comparé
la résolution d’amphétamines et d’amines diverses dérivées par dif-
férents chlorures d’acides aminés ou par le classique chlorure de N-
2. Formation TFA L-proline. Comme le montre la figure 4, la (1-méthyl -3-phényl)
propylamine est mieux résolue lorsqu’elle est dérivée par le chlo-
de diastéréoisomères rure de N-TFA L-leucine que par le chlorure de N-TFA L-proline. De
même, les dérivés N-penta-fluoropropionyl ou N-heptafluorobutyryl
par dérivation précolonne donnent, dans la majorité des cas, des résolutions équivalentes aux
dérivés N-TFA analogues mais avec un temps d’analyse beaucoup
plus court.
Cette méthode consiste à faire réagir de façon préalable le
racémate avec un réactif optiquement pur de manière à former
des diastéréoisomères ; ceux-ci ont des propriétés physico-chi-
miques différentes et peuvent donc être séparés avec des pha- 2.2 Chromatographies en phases liquide
ses stationnaires et mobiles classiques. Cette méthode est et supercritique
limitée aux molécules ayant des fonctions réactives (amines,
acides, alcools, etc.). Pour des séparations préparatives, le
retour à l’énantiomère initial peut s’accompagner d’une racémi-
sation partielle, ce qui constitue une autre limitation de cette En chromatographie en phase liquide ou supercritique, les avan-
méthode. tages et les inconvénients de la dérivation précolonne sont les
mêmes qu’en CPG. Cette méthode était, avant le développement
des phases stationnaires chirales, très utilisée. Actuellement elle est
encore appliquée mais, le plus souvent, pour améliorer simultané-
2.1 Chromatographie en phase gazeuse ment la détection des solutés.

Dès 1960, des séparations d’énantiomères après dérivation préa- 2.2.1 Réactifs
lable en diastéréoisomères ont été réalisées. On trouve dans [6] une
mise au point détaillée de cette technique rassemblant les procédu-
res utilisées en fonction des classes de racémates à résoudre, les De nombreux réactifs de dérivation chirale sont disponibles com-
applications ainsi que certaines données mécanistiques. mercialement. Les plus utilisés sont regroupés dans le tableau 2.
Cette méthode est encore très utilisée en CPG malgré les contrain-
tes dues, en particulier, aux réactifs chiraux.
2.2.2 Exemples
2.1.1 Réactifs
Un exemple significatif concerne la séparation de stéréoisomères
de 17 acides aminés préalablement dérivés par le (+) -1- (9-fluorényl)
La formation de diastéréoisomères par dérivation précolonne doit
respecter certaines contraintes : éthylchloroformiate (FLEC). Elle est effectuée par chromatographie
de partage à polarité de phases inversée sur gel de silice greffée
— le réactif chiral doit être optiquement pu ou, dans le cas con- octyle avec élution graduée et détection fluorimétrique et UV [12]
traire, sa pureté optique doit être connue avec précision (si ces con- (figure 5). Le principal intérêt de cette méthode est la très grande
ditions ne sont pas respectées, elles peuvent entraîner des sensibilité de détection.
incertitudes importantes sur le résultat) ;
— la réaction de dérivation doit être rapide et quantitative ; Un autre exemple est fourni par la séparation des énantiomères
— les diastéréoisomères formés doivent être suffisamment vola- d’un bronchodilatateur, l’imoxitérol, possédant deux centres d’asy-
tils (sinon la volatilité doit être introduite par une réaction métrie. Macaudière et al. [13] ont en effet démontré qu’il était possi-
supplémentaire) ; ble de séparer sur une colonne achirale les quatre formes après
— le comportement chromatographique des dérivés diastéréoi- dérivation préalable au moyen du (R ) - (+) -1-phényl éthylisocyanate
somères doit être approprié (séparation aisée, stabilité dans les con- (figure 5) alors que l’utilisation d’une phase stationnaire chirale ne
ditions de la CPG...). permet pas la séparation de l’un des couples de diastéréoisomères.

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Tableau 1 – Principaux réactifs de dérivation chiraux utilisés en chromatographie en phase gazeuse [3]
Transformation du groupement
Réactif de dérivation chiral Structure après dérivation Type de soluté
fonctionnel

1
Acides aminés
Chlorure de 2-chloro-isovaléryle Amines

Chlorure de drimanoyle Acides aminés


Amines

Acides aminés
Chlorure de chrysanthémoyle Amines

Chlorure N-TFA-prolyle Acides aminés


Amines

Chlorure
Amines
N-(pentafluorobenzoyl) prolyle

Chlorure N-TFA-alanyl
et homologues
(R1 = CH3, CH(CH3)2, Amines
CH2CH(CH3)2, C6H5)

Chlorure
(S )-2-méthoxy-2-trifluoro-
méthyl acétyl (MTPA-Cl)
Amines

Acides aminés
Chloroformiate de menthyle (–)
Amines

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Tableau 1 – Principaux réactifs de dérivation chiraux utilisés en chromatographie en phase gazeuse [3] (suite)
Transformation du groupement
Réactif de dérivation chiral Structure après dérivation Type de soluté
fonctionnel

1 Chlorure de 2-phényl propionyl Hydroxy-acides


Alcools

Chlorure de 2-phényl butyryl Alcools

Chlorure d’acide
O-acétyllactique Alcools

Hydroxy-acides
Chlorure de drimanoyle Alcools

Hydroxy-acides
Chlorure de chrysantémoyle
Alcools

MTPA-Cl Amphétamines

Hydroxy-acides
Chloroformiate de menthyle (–)
Alcools

(1-phényl) éthyl isocyanate Hydroxy-acides

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P1450

Chromatographie ionique minérale


Phases stationnaires
et méthodes de séparation 1

par Eric CAUDRON


Docteur de l’Université Paris Sud
Pharmacien A ssistant Hospitalo-Universitaire
Laboratoire de Développement Analytique – Établissement Pharmaceutique
des Hôpitaux de Paris
Laboratoire de Chimie Analytique – Faculté de Pharmacie Paris XI
et Dominique PRADEAU
Docteur ès Sciences Pharmaceutiques
Pharmacien des Hôpitaux
Laboratoire de Développement Analytique – Établissement Pharmaceutique
des Hôpitaux de Paris

1. Principe de la séparation d’échange d’ions ...................................... P 1 450 - 3


1.1 Équilibre d’échange d’ions .......................................................................... — 3
1.2 Échange d’ions en chromatographie ......................................................... — 3
1.3 Rétention des ions ....................................................................................... — 4
2. Phases stationnaires en chromatographie ionique ........................ — 4
2.1 Structure et composition chimique de l’échangeur .................................. — 5
2.2 Groupements fonctionnels de l’échangeur ............................................... — 6
3. Phase mobile ............................................................................................. — 6
3.1 Nature chimique de l’éluant pour une détection en conductimétrie ....... — 6
3.2 Caractéristiques de l’éluant ......................................................................... — 7
4. Évolutions ................................................................................................... — 9
4.1 Colonnes ....................................................................................................... — 9
4.2 Autres modes de séparation ....................................................................... — 9
5. Outils de modélisation ............................................................................ — 10
6. Conclusion.................................................................................................. — 10
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 450

a chromatographie ionique (CI) est l’évolution moderne de la chromatogra-


L phie par échange d’ions. Elle a été introduite en 1975 avec l’apparition de la
détection conductimétrique combinée à la réduction de la conductivité chimique
par Small, Stevens et Bauman [1]. Elle s’est peu à peu imposée comme appella-
tion générale pour qualifier les techniques de séparation rapides de
chromatographie liquide d’ions sur des colonnes en couplage « on line » avec
un détecteur à cellules continu permettant détection et quantification aussi bien
des ions organiques qu’inorganiques. Son succès tient à ses caractéristiques de
rapidité, de sensibilité, sa souplesse, sa relative simplicité de mise en œuvre, sa
fiabilité, son coût abordable, ainsi que ses possibilités d’automatisation.
À l’origine, la CI est une chromatographie d’échange d’ions couplée à une
détection conductimétrique. Elle s’est rapidement diversifiée. Elle recouvre
actuellement un ensembIe de techniques séparatives d’analyse d’espèces ioni-
Parution : mars 2010

ques par chromatographie liquide, développées grâce à la mise au point de


phases stationnaires de plus en plus performantes, associées à des méthodes

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P1450

CHROMATOGRAPHIE IONIQUE MINÉRALE _______________________________________________________________________________________________

de détection variées. Son champ d’application intéresse des secteurs aussi


divers que l’énergie, l’environnement, la microélectronique, les industries
chimiques, pharmaceutiques et agroalimentaires.
Dans le domaine du dosage des éléments inorganiques qui fait l’objet de cet
article, la chromatographie ionique joue un rôle primordial principalement
dans l’analyse des eaux où elle est très performante pour la détermination
d’anions (fluorures, chlorures, sulfates...) et de certains cations comme ceux de
1 la famille des alcalins et alcalinoterreux (lithium, sodium, magnésium, cal-
cium). II est à noter, cependant, que le couplage de la CI avec des méthodes
spectroscopiques d’absorption ou d’émission atomique permet l’analyse des
éléments de transition, des lanthanides et des actinides. Par ailleurs, son carac-
tère séparatif lui permet de résoudre certaines difficultés posées par les
techniques spectrométriques directes telles que les effets de matrice, les inter-
férences ou les études de spéciation. Néanmoins, dans une grande majorité
des cas, la détermination des cations fait préférentiellement appel à des techni-
ques de spectrophotométrie directes et, en particulier, le couplage d’une
méthode d’émission atomique dans un plasma à couplage inductif avec une
détection en spectrométrie de masse (ICP/MS).
L’appareillage comporte les mêmes éléments que tout système chromato-
graphique ; les composantes particulières de la CI sont :
– la colonne chromatographique garnie d’une phase stationnaire le plus
souvent spécifique ;
– le détecteur conductimétrique et les dispositifs de suppression ionique
dans certaines applications ;
– les matériaux constitutifs du système chromatographique comme, par
exemple, l’utilisation de matériaux totalement inertes [polyéthylène éthyl-
cétone (PEEK) ou polytétrafluoroéthylène (PTFE)] pour l’analyse des cations
inorganiques à l’état de traces.
L’article « Chromatographie ionique minérale » se compose de deux
fascicules :
– [P 1 450] Phases stationnaires et méthodes de séparation ;
– [P 1 451] Méthodes de détection.

Principaux sigles et acronymes utilisés


Sigle Anglais Français
IC Ion chromatography Chromatographie ionique
ICP/MS Inductively coupled plasma/mass Émission atomique par plasma induit
spectrometry couplé à la spectrométrie de masse
PEEK Polyethylene ethyl ketone Polyéthylène éthylcétone
PTFE Polytetrafluoroethylene Polytétrafluoroéthylène
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid Acide éthylènediamine tétraacétique
LPIC Low pressure ion chromatography Chromatographie d’échanges d’ions
à basse pression
CIC Capillary ion chromatography Chromatographie ionique capillaire
UPLC Ultra performance liquid Chromatographie liquide ultraperfor-
chromatography mante
RFIC Reactive free ion chromatography Chromatographie ionique sans réactif
IPC Ion-pair chromatography Chromatographie par paire d’ions
HPLC High pressure liquid chromatography Chromatographie liquide à haute
performance
ZIC Zwitterion ion chromatography Chromatographie utilisant des zwitte-
rions

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P 1 450 – 2 est strictement interdite. – © Editions T.I.

60
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P1450

________________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE IONIQUE MINÉRALE

1. Principe de la séparation
[B+]
d’échange d’ions e
ex
nv
Co
Des ouvrages généraux [2] et des mises au point [3] [4] [5]
[6] ont été consacrés à la CI. re
ai

1
Li
C’est une technique analytique qui permet l’analyse qualitative av
e
et quantitative des espèces ioniques présentes dans un échantillon nc
Co
liquide dépourvu de matières en suspension. Le principe de sépa-
ration fait appel, dans la majorité des cas, à l’échange d’ions [7]
[8]. Cependant, certaines techniques récentes utilisent des artifices [B+]
comme la formation de paires d’ions ou de zwitterions.
L’interprétation du chromatogramme obtenu par CI fait appel aux Figure 1 – Isotherme d’échange
mêmes grandeurs que celles utilisées en chromatographie classi-
que (grandeurs de rétention (t, V ), facteur de capacité (Q), résolu-
tion, efficacité) malgré un mécanisme de séparation différent. L’isotherme définit la relation, à I’équilibre, entre la
concentration de I’ion dans la résine et la concentration du même
ion en solution à I’équilibre, soit pour I’ion B+ :
1.1 Équilibre d’échange d’ions
– si I’isotherme est convexe (1) : [B] < [B], I’ion B a plus d’affinité
La séparation en CI se fait principalement par échange d’ions. pour I’échangeur que l’ion initialement fixé sur la résine (A+). C’est
C’est une réaction chimique hétérogène d’échange de particules, le cas le plus général ;
entre une phase solide (l’échangeur d’ions encore appelé résine) et
– si I’isotherme est linéaire (2) : [B] = [B] , l’affinité des ions est la
une phase liquide (I’éluant).
même ;
La réaction d’échange d’ions entre deux cations monovalents
(A+ et B+) est : – si l’isotherme est concave (3) : [B] > [B] , l’ion B+ a moins d’affi-
nité que l’ion A+ initialement fixé sur la résine.
A+ + B+ $ B+ + A+
II est important de noter que, si de très petites quantités d’ions
sont échangées (comme c’est le cas en CI), I’isotherme peut être
considéré néanmoins comme linéaire ; dans ce cas, le rapport
Les symboles surlignés se rapportent aux ions présents
dans la phase stationnaire et les symboles non surlignés à [B]/[B] doit être considéré comme constant.
ceux de la phase mobile.

La constante d’échange d’ions s’écrira : 1.2 Échange d’ions en chromatographie


En chromatographie d’échange d’ions, I’éluant sert seulement
[B+ ] [A+ ] au transport des espèces ioniques injectées jusqu’au site
KBA =
[A+ ] [B+ ] d’échange. De plus, la phase stationnaire agit essentiellement
comme échangeur d’ions, bien que le phénomène d’adsorption
[A+ ] et [B+ ] correspondent aux concentrations à l’équilibre des ions existe. Dans un tel système, la séparation entre les espèces ioni-
sées dépend uniquement de l’affinité des ions vis-à-vis de I’échan-
A+ et B+ dans I’échangeur (ou la phase solide). geur et de leur vitesse de déplacement dans la colonne.
[A+] et [B+] correspondent aux concentrations à l’équilibre des ions Les grandeurs de rétention fondamentale VR et tR sont donc
A+ et B+ dans la phase liquide (ou I’éluant). fonction du phénomène d’échange d’ions.
La constante d’échange d’ions (K ) est aussi appelée coefficient Le volume de rétention (VR) d’une particule chromatographiée
de sélectivité, car elle exprime de façon quantitative l’affinité préfé- (ici un ion) est égal à :
rentielle pour I’échangeur de l’un ou l’autre ion (A+ ou B+ dans
notre exemple) : VR = DVS + Vm
– siKBA> 1, l’ion B+en solution a une plus grande affinité que avec Vm volume mort ou volume de rétention nulle du système
l’ion A+ pour l’échangeur : la réaction est déplacée vers la droite ; chromatographique, qui correspond à la somme du
– si KBA < 1, A+ a plus d’affinité que B+ : processus inverse au volume interstitiel de la colonne et de l’ensemble des
précédent ; volumes morts extérieurs à la colonne,
– si KBA = 1, l’affinité de A+ et B+ pour I’échangeur est la même. D coefficient de distribution,

Quand la charge (z ) de I’ion est différente de 1, les ions poly- VS volume de I’échangeur d’ions.
chargés ont, en règle générale, plus d’affinité pour I’échangeur que On peut définir un volume de rétention corrigé :
des ions monovalents.
Par ailleurs, on définit un coefficient de distribution (D) pour VR′ = VR − Vm
caractériser l’échangeur. Par exemple, pour I’ion B+ :
D’où :
[B+ ] VR′ = DVS
D=
[B+ ]
Ainsi, plus le coefficient de distribution est élevé, plus I’ion a
La cinétique de l’échange caractérise l’isotherme de distribution, d’affinité pour I’échangeur, plus son volume de rétention est élevé
encore appelée I’isotherme d’échange d’un ion (figure 1). et plus sa vitesse moyenne sera faible sur la colonne.

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61
1

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P1451

Chromatographie ionique minérale


Méthodes de détection
1
par Eric CAUDRON
Docteur de l’Université Paris Sud
Pharmacien Assistant Hospitalo-Universitaire
Laboratoire de Développement Analytique – Établissement Pharmaceutique
des Hôpitaux de Paris
Laboratoire de Chimie Analytique – Faculté de Pharmacie Paris X I
et Dominique PRADEAU
Docteur ès Sciences Pharmaceutiques
Pharmacien des Hôpitaux
Laboratoire de Développement Analytique – Établissement Pharmaceutique
des Hôpitaux de Paris

1. Généralités ................................................................................................. P 1 451 - 2


2. Conductimétrie ......................................................................................... — 3
2.1 Principe ......................................................................................................... — 3
2.2 Détection sans suppression d’ions ............................................................. — 5
2.3 Détection avec suppression de la conductivité de l’éluant ...................... — 5
2.4 Comparaison de la détection avec et sans suppresseur chimique.......... — 8
3. Détecteurs électrochimiques ................................................................ — 9
3.1 Détecteurs ampérométriques et coulométriques...................................... — 9
3.2 Détecteurs polarographiques...................................................................... — 10
3.3 Détecteurs potentiométriques .................................................................... — 10
4. Méthodes de détection spectroscopiques ........................................ — 10
4.1 Réfractométrie .............................................................................................. — 10
4.2 Spectrophotométrie UV-visible (200 à 800 nm) ........................................ — 10
4.3 Fluorescence................................................................................................. — 12
4.4 Chimioluminescence ................................................................................... — 13
5. Méthodes de détection spectrale avec couplage............................ — 13
5.1 Techniques de couplage spectrométrique atomique ............................... — 13
5.2 Techniques de couplage à la spectrométrie de masse ............................. — 14
6. Conclusion.................................................................................................. — 15
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 451

es principaux systèmes de détection, couplés aux séparations des ions


L inorganiques en chromatographie ionique, sont présentés dans cette
seconde partie. Même si de nombreux détecteurs ont été développés ces der-
nières années, le plus courant reste le conductimètre, avec ou sans
suppression de la conductivité de l’éluant, en raison de son caractère universel
pour les substances ioniques. L’apport d’un dispositif de suppression ionique
conduit le plus souvent à une meilleure détectibilité des ions. Cependant,
progressivement, d’autres systèmes de détection complémentaires et plus spé-
cifiques ont été introduits. Ces techniques sont souvent associées à un
réacteur post-colonne permettant la détectabilité de l’analyte, ou du moins,
Parution : mars 2010

d’en abaisser le seuil de détection. Il s’agit de méthodes électrochimiques

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63
Référence Internet
P1451

CHROMATOGRAPHIE IONIQUE MINÉRALE _______________________________________________________________________________________________

(ampérométrie, coulométrie, polarographie) de méthodes spectrophoto-


métriques (réfractométrie, absorbance, fluorescence, chimioluminescence),
ainsi que de méthodes spectrales de couplage (spectrophotométrie d’absorp-
tion et d’émission atomique à flamme ou à plasma induit, spectrométrie de
masse). Ces dernières permettent d’atteindre des performances inégalées en
termes de sensibilité et de spécificité. Toutefois, il n’existe pas de détection
universelle et toutes ces techniques, spécifiques ou non de chromatographie

1 ionique, apparaissent complémentaires les unes par rapport aux autres.


L’article « Chromatographie ionique minérale » se compose de deux
fascicules :
– [P 1 450] Phases stationnaires et méthodes de séparation ;
– [P 1 451] Méthodes de détection.

Principaux sigles et acronymes utilisés


Sigle Anglais Français
AAS Atomic absorption spectroscopy Spectroscopie d’absorption atomique
AES Atomic emission spectroscopy Spectroscopie d’émission atomique
Spectroscopie d’émission à plasma
ICP Inductively coupled plasma
induit
Spectroscopie d’émission à plasma
Inductively coupled plasma atomic
ICP-AES induit par haute fréquence et détection
emission spectroscopy
de photons
MS Mass spectrometry Spectrométrie de masse
Inductively coupled plasma/mass spec- Émission atomique par plasma induit
ICP/MS
trometry couplé à la spectrométrie de masse
API Atmospheric pressure ionization Ionisation à pression atmosphérique
ESI Electrospray ionization Ionisation par électrospray
Atmospheric pressure chemical ioniza- Ionisation chimique à pression atmos-
APCI
tion phérique
TOF Time of flight Détecteur de masse à temps de vol
SIM Selected ion monitoring Détection en mode sélection de l’ion
Détection en mode balayage par
Scan Scan mode mesure des rapports masse sur charge
(m/z)

1. Généralités La réponse du détecteur à une espèce donnée s’exprime par la


différence ΔY entre la réponse Y du détecteur lors de l’élution de
l’analyte et la réponse YE de l’éluant sans l’analyte, soit :
Afin de décrire et de classer les différents modes de détection, il
est nécessaire de rappeler brièvement les principes généraux de la ΔY =Y − YE
détection, inhérents à la chromatographie d’échange d’ions.
Considérons le cas général de l’échange d’un analyte Mn+ par un On définit par kM , kE et kX les coefficients de réponse du détec-
cation éluant Ex+, en supposant que la solution injectée ait été pré- teur aux espèces Mn+, Ex+ et X–.
parée dans l’éluant et que Mn+ et Ex+ soient associés au même
anion X–. L’analyte progresse dans la colonne par échange d’ions. Lors du passage de l’analyte M :
Les ions présents dans la phase stationnaire sont surlignés pour
les différencier de ceux présents dans la phase mobile. Y = kM [Mn + ] + kE [Ex + ] + k X [X − ]

x Mn + + n Ex + $ x Mn + + n Ex + or :

L’électro-neutralité de la solution doit être maintenue durant le [X − ] = x cE


processus d’échange d’ions. Cette condition est la suivante :
et :
[X − ] = n [Mn + ] + x [Ex + ] = x cE n n+
[Ex + ] = cE − [M ]
x

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P 1 451 – 2 est strictement interdite. – © Editions T.I.

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Référence Internet
P1451

________________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE IONIQUE MINÉRALE

d’où :

 n 
Y = kM [Mn + ] + kE  cE − [Mn + ] + k X x cE
 x 
H+
Lors du passage de l’éluant au niveau du détecteur ([M n+] = 0), la Na+
S S
réponse du détecteur YE s’exprime de la façon suivante : OH–

1
Cl–
YE = kE [Ex + ] + k X [X − ]
"
YE = kE cE + k X x cE

On a alors : Figure 1 – Cellule de mesure d’un conductimètre

 n 
ΔY =  kM − kE  [Mn + ] Il est possible de réaliser des détections selon un mode direct ou
 x  indirect : en effet, le détecteur doit pouvoir réagir à un changement
de la conductivité totale provoqué par une faible quantité d’ions
Trois modes de détection peuvent être mis en œuvre, fondés analytes. La détection est obtenue directement malgré la faible
sur [1] : conductivité de l’ion analyte face à l’ion éluant. Elle peut être éga-
– une propriété spécifique de l’analyte permettant de visualiser lement réalisée après « suppression d’ions », ce qui permet de
le pic de concentration de l’analyte lui-même : c’est la détection réduire la conductivité propre de certains éluants et de parvenir à
directe. Dans ce cas, kE = 0 et ΔY > 0 ; une augmentation importante de la sensibilité.
– une propriété spécifique de l’espèce éluante, permettant de
suivre la variation de sa concentration lors de l’élution de
l’analyte : c’est la détection indirecte. Dans ce cas, kM = 0 et 2.1 Principe
ΔY < 0 ;
– les différences de propriétés entre l’analyte et l’espèce éluante, Le mouvement des ions, sous l’influence du champ électrique E,
conduisant à un signal composite lié aux variations de est équivalent à un courant d’intensité i. On définit la résistance
concentration des deux espèces : c’est la détection différentielle. R (ohms) d’un conducteur électrolytique de la même façon que celle
Dans ce cas, kE et kM sont distincts de zéro et le signal est positif d’un conducteur métallique. En pratique, la mesure de la résistance
ou négatif en fonction des valeurs de kE , kM , x et n. La détection est effectuée dans une cellule (figure 1) comprenant deux électro-
est alors d’autant plus sensible que les valeurs de kE et kM sont dif- des de surface S (cm2) séparées d’une distance z (cm) :
férentes.
z
Les méthodes universelles de détection, pratiquées selon un R =ρ
mode direct ou indirect, sont non spécifiques et correspondent en S
général à un mode de détection différentiel (conductimétrie, réfrac- Pour les électrolytes, il est d’usage d’utiliser la conductivité (χ )
tométrie). En revanche, les méthodes de détection qui utilisent une plûtot que la résistivité (ρ ) :
propriété particulière de l’analyte recherché peuvent être spécifiques 1
dans le cadre d’une détection directe. Nous pouvons citer, par exem- χ=
ple, la détection par absorbance d’un ion à une longueur d’onde qui ρ
lui est spécifique, ou encore une détection électrochimique à un La résistivité ρ s’exprime en Ω · cm et la conductivité χ en
potentiel où seul l’analyte est électronégatif. Toutefois, ces mêmes Ω–1 · cm–1 ou encore en S · cm–1.
méthodes peuvent être rendues non spécifiques dans le cadre d’une
L’accumulation des charges + et – sur les électrodes crée rapide-
détection indirecte. Dans ce cas, le signal est généré de façon spécifi-
ment un champ antagoniste qui s’oppose au mouvement des ions.
que par l’ion éluant et, ainsi, plusieurs analytes peuvent être indirec-
En conséquence, on utilise un courant alternatif permettant d’évi-
tement détectés s’ils sont transparents dans les conditions d’analyse
ter le phénomène de polarisation des électrodes. En effet, l’alter-
(kM = 0). Il est donc possible qu’une détection spécifique indirecte ne
nance s’oppose à l’accumulation, et le déplacement global des
soit pas caractéristique des analytes.
ions est nul. Toutefois, la solution reste conductrice, ce qui rend
possible la mesure de la résistance. Les conductimètres usuels
sont donc alimentés en courant alternatif, de fréquence allant de
2. Conductimétrie 300 à 2 000 Hz. Celle-ci doit être d’autant plus élevée que la subs-
tance étudiée est conductrice.
La conductivité d’une solution est fonction de la température et
La première utilisation de la conductimétrie comme méthode de de la concentration ionique. Elle correspond à la somme des
détection des ions dans un éluant chromatographique peut être cré- conductivités individuelles de tous les ions de cette solution :
ditée à James et al. en 1951 [2]. Ce n’est qu’en 1975 que la chroma-
tographie ionique est introduite par Small, Stevens et Bauman [3]. χ = ∑ χi
Ils ont, pour la première fois, décrit une séparation chromatographi- i
que d’échange d’ions pour la séparation et la détection
conductimétrique d’espèces anioniques et cationiques. La détection La conductivité équivalente d’un électrolyte Λ permet de caracté-
conductimétrique répond à un principe de détection non spécifique riser le pouvoir conducteur d’une mole d’ions, compte tenu de la
fondée sur la capacité d’une solution à conduire un courant électri- charge mesurée dans les conditions de détection :
que. Le passage de ce dernier s’effectue par migration des ions dans
un champ électrique produit par un courant alternatif. Elle présente χ
deux avantages majeurs pour l’analyse des ions inorganiques. Le Λ = 1 000
c
premier est que tous les ions sont des conducteurs électriques, la
détection par conductivité est, dans ce cas, universelle. Le second La concentration équivalente c (Eq · L–1) représente le nombre
est que les conductimètres sont des détecteurs relativement sim- de charges (+ ou –) correspondant à un litre de solution d’électro-
ples à construire et à utiliser. lytes. La conductivité équivalente est exprimée en S · cm2 · Eq–1.

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P1451

CHROMATOGRAPHIE IONIQUE MINÉRALE _______________________________________________________________________________________________

■ Électrolytes forts
Tableau 1 – Conductivité limite équivalente
des principaux ions inorganiques en solution Pour les électrolytes forts en solution diluée, la variation de la
aqueuse à 25 oC conductivité équivalente est donnée par la loi empirique de
Kohlrausch :
r0− à 25 oC r0+ à 25 o C Λ = Λ0 − k 0 c
Anion Cation
(S · cm2 · Eq–1) (S · cm2 · Eq–1) Λ0 correspond à la conductivité équivalente limite de l’électrolyte,

1
caractéristique de l’électrolyte à température donnée et pour un
OH– 198 H+ 350 solvant donné. k0 est une constante qui dépend de la nature de
l’électrolyte.
Fe (CN)64− 111 Rb+ 78 À dilution infinie, chaque ion migre indépendamment des autres
ions présents dans la solution. Il en résulte que la conductivité
équivalente limite de l’électrolyte est la somme des conductivités
Fe (CN)3− 101 Cs+ 77
6 équivalentes ioniques limites caractéristiques de chaque ion
constitutif de l’électrolyte :
CrO2− 85 K+ 74
4 Λ0 = λ0+ + λ0−

CN– avec λ0 conductivité équivalente limite de l’ion.


82 NH+4 73
Les ions inorganiques sont des électrolytes forts et leur
conductivité limite équivalente est reportée dans le tableau 1.
SO2− 80 Pb2+ 71
4 Par extension :
Br– 78 La3+ 70 Λ = λ+ + λ−

I– 77 Ce3+ 70 λ dépend de la concentration équivalente de l’ion.


■ Électrolytes faibles
CI– 76 Fe3+ 68
Pour les électrolytes faibles, la conductivité équivalente est très
petite aux concentrations usuelles (car les électrolytes sont partiel-
P2 O74− 75 Cr3+ 67 lement ionisés) et croît tèrs vite aux grandes dilutions.
Il n’existe pas de relation simple entre la conductivité équiva-
C2 O2−
4
74 Ba2+ 64 lente de l’électrolyte et la concentration. En effet, Λ varie en fonc-
tion du coefficient d’ionisation α de l’électrolyte, qui, lui-même
dépend de la concentration C de l’électrolyte.
NO2− 72 Ag+ 62
La conductivité équivalente limite d’un ion à la température
θ peut être déduite de celle tabulée à 25 oC par la relation
CO2−
3
72 Al3+ 61 (λ )t = (λ0)25 (1 + 0,01825 (θ – 25)) [4]. Les variations de température
0
au sein de la cellule de détection entraînent des fluctuations du
signal émis, une augmentation du bruit de fond du détecteur et, au
MoO2−
4
72 Ca2+ 60 final, une augmentation des limites de détection.
■ Cellule de conductimétrie
NO3− 71 Sr2+ 59
Le fonctionnement de la majorité des conductimètres repose sur
la mesure de la résistance électrique à l’aide d’un pont de Wheats-
PO3−
4
69 Cu2+ 55 tone. La grandeur analytique fournie par le détecteur est la
conductance de la solution. La conductimétrie repose sur la
mesure de la conductance électrique G (siemens ou Ω–1) de la
ClO−4 67 Cd2+ 54 solution qui traverse la cellule de mesure, la conductance étant
l’inverse de la résistance (Ω) :
SCN– 66 Fe2+ 54
1 S
G= = χ
ClO3− 65 Mn2+ 54 R z
On définit ainsi une constante de cellule kc (cm–1) :
S4 O2−
6
63 Mg2+ 53
χ
G=
5−
P3 O10 63 Co2+ 53 kc

kc dépend de la géométrie de l’appareillage :


F– 54 Zn2+ 53
z
HCO3− 45 Hg2+ 53 kc =
S
Ni+ 50 Dans le cas d’une solution suffisamment diluée, la conductance
G de la solution est :
Na+ 50
cΛ c (λ + + λ − )
G= =
Li+ 39 1 000 k c 1 000 k c

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P1473

Chromatographie planaire. Partie 1

par Antoine Michel SIOUFFI


1
Docteur ès Sciences
Professeur émérite à l’Université Paul Cézanne, Aix Marseille III
Chantal DAUPHIN
Docteur ès Sciences Pharmaceutiques
Maître de conférences à l’université Paris XI
et Dominique PRADEAU
Docteur ès Sciences Pharmaceutiques
Pharmacien responsable de l’Établissement pharmaceutique des Hôpitaux de Paris

1. Processus chromatographique............................................................. P 1 473 – 2


1.1 Comparaison de la chromatographie liquide sur colonne
et de la chromatographie planaire ............................................................. — 2
1.2 Domaine d’application de la chromatographie planaire .......................... — 3
2. Mise en œuvre d’une chromatographie planaire ............................ — 3
2.1 Géométrie de la couche de phase stationnaire......................................... — 3
2.2 Dépôt de l’échantillon.................................................................................. — 3
2.3 Développement des plaques ...................................................................... — 4
2.4 Méthodes de développement en chromatographie sur couche mince... — 6
2.5 Systèmes à flux forcé .................................................................................. — 8
3. Grandeurs fondamentales en chromatographie planaire ............. — 10
3.1 Caractéristiques de rétention...................................................................... — 10
3.2 Efficacité ....................................................................................................... — 11
4. Combinaisons phase stationnaire/phase mobile : mécanismes
de rétention ............................................................................................... — 15
4.1 Généralités ................................................................................................... — 15
4.2 Chromatographie d’adsorption sur gel de silice....................................... — 15
4.3 Chromatographie d’adsorption sur alumine............................................. — 17
4.4 Chromatographie sur cellulose et dérivés ................................................ — 17
4.5 Chromatographie sur polyamide ............................................................... — 17
4.6 Chromatographie sur silice greffée apolaire............................................. — 17
4.7 Chromatographie sur phases greffées polaires........................................ — 18
4.8 Chromatographie d’échange d’ions et d’appariement d’ions ................. — 18
4.9 Séparation d’énantiomères ........................................................................ — 19
4.10 Nature chimique des liants ......................................................................... — 19
4.11 Autochromatographie d’un mélange de solvants. Démixion .................. — 20
Chromatographie planaire : partie 2 ........................................................... P 1 474
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 474

es progrès réalisés dans le domaine des matériaux adsorbants, de l’instru-


L mentation, de la quantification et des possibilités de détection ont conduit à
une renaissance de la chromatographie planaire. La chromatographie en couche
mince (thin layer chromatography TLC) ne constitue pas uniquement une alter-
native économique, il s’agit d’une méthode pratique, rapide et fiable qui ne
nécessite pas des préparations d’échantillons très complexes.
Parution : mars 2007

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67
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P1473

CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE. PARTIE 1 __________________________________________________________________________________________________

Elle est utilisée pour le « screening » en toxicologie clinique, en médecine


légale, en pharmacognosie.
Elle joue un rôle important dans le contrôle des produits pharmaceutiques
(identification, pureté, stabilité, dosage) et des produits alimentaires (recherche
d’impuretés toxiques).

1 Notations et Symboles Principales abréviations


Symbole Unité Définition CCM Chromatographie sur couche mince
As cm2 surface occupée sur l’adsorbant par une
molécule CLHP Chromatographie liquide sur colonne à haute
performance
B0 cm2 perméabilité de la couche
CP Chromatographie planaire
C mol · L−1 concentration du soluté
CG Chromatographie en phase gazeuse
dp µm diamètre des particules du milieu poreux

D m2 · s−1 coefficient de diffusion FID Flame ionization detection

e cm épaisseur de la couche HPTLC High performance thin layer chromatography

H (ou µm hauteur équivalente à un plateau OPLC Overpressured layer chromatography


HEPT ) théorique

κ cm2 · s−1 constante de vitesse OPMLC Overpressured multi layer chromatography

k facteur de capacité TLC Thin layer chromatography


K coefficient de distribution du soluté
AMD Automated multiple development
L cm longueur de développement

N nombre de plateaux théoriques (ou


efficacité)
1. Processus
Rf rapport frontal
chromatographique
Rs résolution de la phase stationnaire

u cm · s−1 vitesse d’avancement du solvant


1.1 Comparaison de la chromatographie
VR cm3 volume de rétention liquide sur colonne
z cm distance de migration et de la chromatographie planaire
α sélectivité
La partie la plus importante d’un chromatographe est l’ensemble
γ N· m−1 tension superficielle du solvant phase stationnaire/phase mobile. Toute opération chromatographi-
que comporte :
θ ˚ angle de mouillage — la mise en mouvement de la phase mobile ;
— l’injection des solutés ;
εt porosité totale
— le processus chromatographique ;
η Pa · s viscosité du solvant — la détection des solutés.
En chromatographie liquide sur colonne à haute performance
σ2 variance (CLHP), la phase mobile est pompée dans la colonne et l’opérateur
est maître du débit ; l’injection est effectuée par une vanne à boucle
λ coefficient de tortuosité sans interruption du débit de la pompe et les solutés sont injectés
dans un système équilibré. Le processus chromatographique se
ω cm largeur des pics à la base déroule mais il n’est pas visible par l’opérateur. Les solutés séparés
sortent de la colonne, ils sont élués et détectés en continu. L’appa-
ν vitesse réduite du soluté reillage peut être totalement automatisé.
Une chromatographie planaire (CP) peut se dérouler de deux
façons selon que l’opérateur est maître ou non du débit de phase
Indices mobile.

f : front de solvant ; m : phase mobile ; s : phase stationnaire. ■ Dans le cas le plus classique, appelé chromatographie en couche
mince (CCM), le dépôt des solutés s’effectue à la surface de la

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P1473

__________________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE. PARTIE 1

phase stationnaire. On peut donc parler d’une injection latérale, à 2.1 Géométrie de la couche de phase
la différence de l’injection centrale réalisée sur colonne. Le dépôt
est préalable au mouvement de la phase mobile qui s’effectue par
stationnaire
capillarité, et une partie de la phase stationnaire, un côté de la
surface plane, est en contact avec l’atmosphère ; on est donc en La chromatographie sur papier spécial (matière fibreuse ou adsor-
présence d’un système à trois phases du fait de la présence de cette bante) qui peut être découpé avec des ciseaux à la dimension vou-
phase gazeuse. Le processus chromatographique est visible et peut lue n’est plus guère utilisée de nos jours que dans quelques cas

1
être interrompu à tout instant par l’opérateur s’il constate une particuliers comme la chromatographie des colorants.
anomalie. La différence la plus importante entre la CLHP et la CP est
que, dans ce dernier cas, les solutés ne sont pas élués ; c’est l’opé- En CCM, les plaques prêtes à l’emploi sont disponibles chez de
nombreux fabricants. Elles sont constituées d’un support inerte
rateur qui arrête le processus. Le chromatogramme est ainsi
rigide ou souple (plaque de verre, feuille d’aluminium, de polya-
préservé et la même phase stationnaire peut être utilisée pour une
mide, etc.) sur lequel la phase stationnaire est déposée sous forme
autre chromatographie avec un autre solvant après évaporation du d’une couche mince (épaisseur de 200 à 250 µm).
premier. La détection ne se fait pas en continu et la plaque doit être
transférée vers un détecteur après avoir été débarrassée du Seules sont disponibles des couches de particules solides agglo-
solvant. La préservation du soluté permet de procéder à plusieurs mérées par un liant organique ou minéral qui sert également à assu-
détections et même à des réactions successives, opération délicate rer l’adhésion sur le support inerte. Il n’existe pas de plaques
à mettre en œuvre en CLHP. Il n’y a aucune possibilité d’automa- commerciales de phase stationnaire liquide déposée sur un support
solide. Il appartient à l’utilisateur de les préparer le cas échéant.
tisation totale.
Avec des plaques prêtes à l’emploi, on ne peut réaliser que des chro-
matographies liquide/solide. Les dimensions habituelles de la sur-
■ Dans le cas de la CP à flux forcé, la phase gazeuse présente en face de la couche sont :
CCM est totalement éliminée et le système est tout à fait analogue à
une CLHP dont la colonne serait de forme parallélépipédique. On 10 × 5 cm 2 ( L × ᐉ ) 10 × 20 cm 2 ( L × ᐉ )
peut effectuer l’injection avant mouvement de la phase mobile, 10 × 10 cm2 20 × 20 cm2
comme en CCM, ou lorsque le système est équilibré, comme en
CLHP. Il en est de même de la détection qui peut être effectuée en On appelle nanoplaques ou plaques HPTLC (High Performance
continu ou en discontinu. Le chromatogramme peut être préservé Thin Layer Chromatography) des plaques de 10 × 10 cm2 ou de
ou non à la volonté de l’opérateur. Celui-ci est maître du débit car le 10 × 5 cm2 dont le diamètre des particules est beaucoup plus res-
liquide est pompé dans la colonne. La grande différence, outre la treint (5 à 7 µm) que celui des particules des plaques TLC (11 à
forme de la colonne, réside dans l’injection latérale. Les détecteurs 13 µm). Il existe aussi des plaques de silice monolithique où la silice
de CLHP peuvent être utilisés dans la CP à flux forcé. (préparée par un procédé sol/gel) est directement greffée sur le sup-
port. Cette technique est déjà expérimentée en chromatographie
liquide haute performance depuis 2001. Ces plaques appelées UTLC
(Ultra Thin Layer Chromatography), de silice monolithique greffée
sur un support en verre ont été mises sur le marché par Merck en
1.2 Domaine d’application 2002. L’épaisseur de la couche est de 10 µm. Le monolithe est carac-
de la chromatographie planaire térisé, comme en CLHP, par deux types de pores, les macropores (1
à 2 µm) et les mesopores (13 nm).
Les supports chromatographiques en vrac peuvent être utilisés
Tous les solutés qui peuvent être chromatographiés en CLHP peu- pour la fabrication artisanale de plaques par l’utilisateur. On trou-
vera dans des ouvrages spécialisés [1] [2] le protocole expérimental
vent l’être en CP. La CCM a souvent été utilisée comme technique
pour préparer les couches minces de phase stationnaire. La repro-
pilote dans la mise au point de systèmes chromatographiques CLHP.
ductibilité est très dépendante de l’habileté de l’expérimentateur et
En mode classique, la CP n’atteint pas les efficacités obtenues à
ne peut être comparée à celle des plaques prêtes à l’emploi. Cette
l’heure actuelle avec les colonnes remplies de très petites particules opération est réservée à des cas particuliers, lorsque la séparation
ou les colonnes capillaires utilisées en CLHP. La sélectivité peut être doit être réalisée sur une phase stationnaire peu commune (c’est le
très grande car la CP se prête mieux à la modification de l’ensemble cas des phases imprégnées de nitrate d’argent) qui n’est pas dispo-
phase mobile/phase stationnaire que la CLHP. La chromatographie nible sous forme de plaques prêtes à l’emploi. Ces dernières peu-
planaire seule permet la multichromatographie, c’est-à-dire la chro- vent être utilisées pour la CP à flux forcé moyennant une
matographie simultanée de plusieurs échantillons (jusqu’à 15 ou manipulation simple et rapide de préparation des bords de plaque.
20). Le temps d’analyse peut être très court (parfois en moins d’une
Dans le cas de CP à flux forcé avec des appareils non commer-
minute). La CP permet la détection postchromatographique par
ciaux, des procédures de remplissage d’une colonne de section
transformation chimique suivie ou non d’un chauffage, par réaction parallélépipédique ont été décrites [3] [4]. Pour les plaques prêtes à
microbiologique, par couplage avec la spectrométrie de masse l’emploi, on constate que le compactage des particules est bien
(couplage TLC-MALDI par exemple) (voir Chromatologie planaire, réussi. Des mesures de perméabilité comparées avec celles des
partie 2 [P 1 474]). colonnes CLHP ont montré que les valeurs sont tout à fait compara-
bles, c’est-à-dire 10−3 cm2 (selon la loi de Darcy).
Un cas particulier est constitué par les baguettes Chromarods®
(appareillage latroscan®). La couche n’est pas disposée sur une pla-
2. Mise en œuvre que mais sur la surface externe d’une baguette de 0,9 mm de diamè-
tre et 152 mm de long. L’épaisseur de la couche est de 75 µm.
d’une chromatographie
planaire 2.2 Dépôt de l’échantillon

Nous distinguerons le cas du mouvement de la phase mobile par Dans la CCM classique, la solution d’échantillon de substance à
capillarité et le mouvement à flux forcé. analyser est déposée à l’aide d’un capillaire calibré ou d’une

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P1473

CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE. PARTIE 1 __________________________________________________________________________________________________

1 Figure 1 – Microchromatographie de spots déposés par


des micropipettes de 1 µL sur une plaque HPTLC : mélange
de colorants lipophiles dans différents solvants (doc. Merck)

seringue à une petite distance (1 cm en général) de l’extrémité de la


couche. Le volume déposé est très faible (1 à 5 µL) et il faut prendre
garde à ne pas détériorer la couche de phase stationnaire avec
l’extrémité de la seringue ou du capillaire.
La tache (ou spot) ainsi obtenue doit être aussi circulaire et petite
que possible. Le dépôt idéal est de l’ordre de 0,5 à 5 µL en CCM, de
50 à 500 nL en HPTLC (nanoplaques) et quelques nanolitres avec
des plaques UTLC. Les volumes transférables par de petits capillai-
res sont de 10 à 500 nL, ceux possibles avec les seringues vont de
10 nL à 100 µL. L’emploi d’aiguilles capillaires en silice fondue per-
met des dépôts d’un volume de 10 nL. Figure 2 – Appareil automatique de dépôt de l’échantillon
(doc Camag)

Lorsque la tache est grande, on constate une inhomogénéité


du dépôt et un début de chromatographie circulaire (figure 1).
Pratiquement, il faut effectuer le dépôt en solution dans un sol- 2.3 Développement des plaques
vant dont la force éluante est beaucoup moins forte que celle du
solvant de développement ; autrement dit lorsque la phase sta-
tionnaire est polaire, le dépôt doit être effectué dans le solvant le Dans une expérience de type CCM, la plaque est placée dans une
plus apolaire possible compatible avec la solubilité. cuve à développement avec le solvant (ou le mélange de solvants),
qui constitue la phase mobile.

Des appareils automatiques de dépôt de l’échantillon ou applica-


teurs sont commercialement disponibles (figure 2) : 2.3.1 Montée capillaire
— des déposeurs mécaniques utilisent des capillaires en verre à
usage unique à aiguille non biseautée, calibrés en volume allant de La couche poreuse peut être assimilée à une multitude de petits
0,5 µL, 1,0 µL, 2,0 µL, 5,0 µL à 10,0 µL fixés sur un stylet de manipu- capillaires interconnectés, et le liquide monte sur la couche en rem-
lation. Le dépôt doit être le plus fin possible pour les dépôts en plissant d’abord les capillaires les plus petits. On constate expéri-
bande et ne pas dépasser 6 mm de diamètre pour les dépôts mentalement que la relation entre la distance zf parcourue par le
circulaires ; front du solvant et le temps t est de la forme :
— des déposeurs automatiques utilisent une seringue calibrée
terminée par une aiguille ou un capillaire en acier inoxydable, asser- z f2 = κ t (1)
vie à une motorisation directe ou indirecte. Le dépôt est réalisé par
nébulisation sous gaz comprimé de l’échantillon au-dessus de la La vitesse du front du solvant est donc :
surface de la couche mince, sans contact. L’appareil permet d’effec-
tuer des dépôts ponctuels ou en bandes de longueur prédétermi-
née. Cette dernière technique est recommandée pour la dz κ
u f = --------f = -------- (2)
quantification. En effet, la précision du dépôt est de l’ordre de 0,5 % dt 2 zf
pour des volumes de 5 µL.
Les dépôts en forme de traits peuvent être obtenus par l’emploi La constante κ est la constante de vitesse, elle a été explicitée et
de plaques à zone de concentration (figure 3). Une couche de kiesel- s’écrit :
guhr est juxtaposée à la couche de phase stationnaire sur le côté de
la plaque qui sera placé dans la phase mobile. Cette couche de kie- κ = − 2bB0dp(γ/η)cosθ (3)
selguhr n’ayant aucune propriété de rétention, le soluté est entraîné
avec b constante de proportionnalité entre la vitesse
par le solvant jusqu’à la couche où il se rassemble sous forme de
d’avancement du front du solvant dzf /dt et la
traits. Des volumes très divers (0,5 à 500 µL) peuvent être déposés à
vitesse locale de phase mobile, b est en général
la seringue ou avec le Linomat®.
de l’ordre de 0,8,
Dans le cas d’une CP à flux forcé, le dépôt de l’échantillon peut B0 perméabilité de la couche,
être réalisé de la même façon que précédemment ou au moyen
d’une seringue (ou d’une vanne) de façon analogue à la CLHP grâce dp diamètre des particules du milieu poreux,
à l’injecteur prévu à cet effet. Les principales caractéristiques
γ tension superficielle du solvant de viscosité η,
concernant le dépôt de l’échantillon sont regroupées dans le
tableau 1. θ angle de mouillage.

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P1473

__________________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE. PARTIE 1

partie supérieure : dépôts des échantillons dans la zone de concentration et développement jusqu'au bord de la couche
partie inférieure : chromatogrammes obtenues dans les différents solvants

Distance parcourue par le front de solvant Zf = 70 mm

Figure 3 – Chromatographie dans différents solvants d’une solution de sept colorants lipophiles à 0,1 % déposés sur une plaque de gel de silice
(Silicagel 60) avec zone de concentration et développés dans une cuve sans saturation [42]

(0)

Tableau 1 – Dépôt des échantillons : caractéristiques


Utilisation du solvant ayant la force éluante la plus faible vis-à-vis de l’éluant utilisé : évite l’amorce de chroma-
Nature du solvant de dépôt
tographie lors du dépôt
Positionnement du dépôt 1 cm pour plaque CCM
par rapport au niveau 0,5 cm pour plaque HPTLC
du solvant Cela conditionne la reproductibilité des rapports frontaux
Dépôt en point : – 0,5 à 5 µL pour plaque CCM
Type de dépôt – 50 à 500 nL pour plaque HPTLC
Dépôt en trait étroit : pour toutes quantités et tous types de plaques
Analyse qualitative : un capillaire ou une microseringue
Analyse quantitative : amélioration de la reproductibilité, de la précision et de l’automatisation
Choix du mode de dépôt
3 simple dépôt (existe pour 8 plaques à la fois)
Échantillonneur
2 dépôts multiples automatiques avec une précision d’environ 1 % sur 5 nL

La constante κ dépend donc linéairement de dp (alors qu’elle La vitesse de montée du front du solvant est donnée par :
dépend de d p2 en CLHP) ; elle augmente ainsi avec la taille des
particules et est très dépendante de la répartition granulomé- 2 bB 0 ρg
trique. Le choix des solvants est également déterminé par le u f = -------------- ⎛ γ cos θ – z f d p -------⎞ (4)
rapport γ/η. η zf ⎝ 12 ⎠

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71
1

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Chromatographie planaire. Partie 2

par Antoine Michel SIOUFFI


1
Docteur ès sciences
Professeur émérite à l’Université Paul Cézanne, Aix Marseille III
Chantal DAUPHIN
Docteur ès sciences pharmaceutiques
Maître de conférences à l’université Paris XI
et Dominique PRADEAU
Docteur ès sciences pharmaceutiques
Pharmacien responsable de l’Établissement pharmaceutique des Hôpitaux de Paris

1. Détection visuelle .................................................................................... P 1 474 – 2


2. Analyse quantitative par densitométrie ............................................ — 2
2.1 Considérations théoriques.......................................................................... — 2
2.2 Instrumentation ........................................................................................... — 3
2.3 Mise en œuvre de la mesure densitométrique ......................................... — 3
2.4 Paramètres du signal................................................................................... — 4
2.5 Détection par ionisation de flamme........................................................... — 4
2.6 Mesures de solutés radioactifs................................................................... — 5
2.7 Analyse d’image : vidéodensitométrie ...................................................... — 5
2.8 Couplages avec la spectroscopie ............................................................... — 5
3. Formation de dérivés pré- ou postchromatographie ..................... — 6
4. Courbes de calibrage .............................................................................. — 7
5. Conclusion ................................................................................................. — 8
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 474

n chromatographie planaire classique, la détection des substances est une


E opération distincte de la chromatographie et elle s’effectue sur une couche
débarrassée du solvant de développement : c’est une détection en discontinu.
En chromatographie planaire à flux forcé, on peut procéder de la même façon,
mais il est également possible de réaliser une détection en continu au moyen
d’un détecteur semblable à ceux utilisés en CLHP. En détection en discontinu, la
méthode générale consiste à comparer les régions de la couche où il n’y a pas
d’échantillon aux régions dans lesquelles l’échantillon est présent. Lorsque
suffisamment de substance peut être récupérée pour procéder à une identifica-
tion par une méthode spectrale, la plaque est grattée à l’endroit où la substance
a été localisée, la phase stationnaire est séparée du soluté et il ne reste plus qu’à
réaliser la spectrométrie (infrarouge, de masse, etc.). Nous allons comparer
qualitativement et quantitativement les différentes méthodes d’analyse.
Parution : mars 2007

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est strictement interdite. − © Editions T.I. P 1 474 − 1

73
Référence Internet
P1474

CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE. PARTIE 2 __________________________________________________________________________________________________

1. Détection visuelle expression dans laquelle Rω est la réflectance d’une couche opaque
d’épaisseur infinie.
On peut considérer que le coefficient de diffraction ne varie pas
Destinée à l’analyse qualitative, la détection visuelle est très prati- lorsque le soluté est adsorbé sur la couche et :
quée dans l’analyse de stupéfiants par exemple. Dans tous les cas,
la plaque est éclairée par une source convenable : ( 1 – Rω ) 2 2 ,303
— la lumière blanche permet de repérer les substances colorées ; ------------------------ = --------------- ε C (3)

1 — la lumière ultraviolette permet de voir les substances fluores-


centes lorsqu’elles sont éclairées à ces longueurs d’onde.
avec ε
2 Rω ᏿

coefficient d’absorption molaire de l’échantillon,


Pour faciliter la détection, les fabricants de plaques CCM
mélangent un indicateur fluorescent à la couche d’adsorbant ; ce C concentration molaire.
peut être un sel inorganique qui donne à la plaque une couleur
Dans le cas d’une couche d’épaisseur finie e, les équations pro-
jaune (acétate d’uranyle) ou vert jaune (silicate de zinc). Le plus
posées par Kubelka et Munk sont les suivantes :
employé est un sulfure mixte de zinc et de cadmium fluorescent à
254 nm d’où l’appellation F 254.
sinh ( b ᏿ e )
Les sels organiques sont fluorescents à 366 nm en général ; les I r = ------------------------------------------------------------------------------ 
plus employés sont le 5,8,10-trisulfonate de 3-hydroxypyrène (sel de a sinh ( b ᏿ e ) + b cosh ( b ᏿ e ) 
 (4)
sodium), la rhodamine B, la 2,7-dichlorofluorescéine et des dérivés b
I t = ------------------------------------------------------------------------------ 
du stilbène. a sinh ( b ᏿ e ) + b cosh ( b ᏿ e ) 
Dans le cas des phases greffées, un sel de tungstène et de sodium
est utilisé. Les composés apparaissent sous forme de taches som- expressions dans lesquelles :
bres sur fond lumineux : on observe une diminution de fluorescence
mais pas une extinction. La pulvérisation d’un réactif sur la plaque ᏿+᏷
s’apparente à la détection postchromatographique par formation de a = --------------- et b = a2 − 1
dérivés et sera traitée au paragraphe 3. ᏿

La théorie de Kubelka et Munk postule que l’échantillon est distri-


bué de façon homogène dans la zone d’adsorbant où il se trouve. À
2. Analyse quantitative l’heure actuelle, aucun autre modèle mathématique n’est supérieur
à celui élaboré par Kubelka et Munk.
par densitométrie ■ Les molécules susceptibles d’émettre une fluorescence le peu-
vent par absorption d’un quantum énergétique suivi d’un passage à
un état excité. Ce dernier peut être un état singulet ou un état triplet.
Le retour à l’état fondamental s’accompagne d’une émission de
2.1 Considérations théoriques lumière. Les molécules fluorescentes absorbent généralement dans
l’ultraviolet, et le spectre de fluorescence est décalé vers les plus
grandes longueurs d’onde. Pour obtenir le meilleur rendement de
La liste des notations et des abréviations est dans le [P 1 473]. fluorescence, il faut sélectionner une longueur d’onde d’excitation
■ Quand une lumière monochromatique arrive sur un milieu opa- et une longueur d’onde d’émission. Dans le cas idéal, elles corres-
que, une partie est réfléchie de façon spéculaire (comme par un pondent aux maximums d’absorption et d’émission.
miroir), une partie est absorbée par le milieu et dissipée sous forme ■ Soit I0 l’intensité de la lumière incidente et I l’intensité de la
de chaleur et le reste est réfléchi et transmis de façon diffuse par le lumière ayant traversé la couche opaque de phase stationnaire.
milieu. C’est cette dernière partie qui intéresse le chromatogra- L’intensité de la lumière transmise est donnée par la loi de Beer-
phiste. La propagation de la lumière à l’intérieur d’un milieu opaque Lambert :
granulaire est un processus très complexe qui ne peut être formulé
par des équations ayant une solution analytique. Des simplifications I = I0 exp(− εeC)
sont nécessaires et le modèle généralement accepté est celui décrit
par Kubelka et Munk [1]. Soit e l’épaisseur de la couche et dx une avec ε le coefficient d’adsorption molaire,
portion infinitésimale dans laquelle la lumière se propage. Les flux
C la concentration molaire de substance,
de lumière dans la couche dx correspondent à la lumière transmise
It et à la lumière réfléchie Ir. L’intensité de la lumière transmise e l’épaisseur de la couche.
décroît du fait de l’absorption et de la dispersion, et elle s’accroît du
Seule une fraction de lumière absorbée est réémise du fait de la
fait de la dispersion de la lumière cheminant en sens opposé. On
perte d’énergie due à l’adsorbant. En appelant Φ le rendement quan-
peut alors écrire :
tique, l’intensité de la fluorescence émise est :
dI t dI r Ifluo = ΦI0(1 − e−εeC)
– ------- = – ( ᏷ + ᏿ )I t + ᏿I r et -------- = – ( ᏷ + ᏿ )I r + ᏿I t (1)
dx dx Quand l’absorbance de l’échantillon est faible, on peut faire
l’approximation :
avec ᏿ coefficient de diffraction par unité d’épaisseur,
᏷ coefficient d’absorption par unité d’épaisseur. e−εeC ≈ 1 − εeC
Kubelka et Munk ont proposé une solution à ces deux équations : et
Ifluo ≈ ΦI0εeC
᏷ ( 1 – Rω ) 2
---- = ------------------------ (2) Cette relation montre la linéarité entre l’intensité du signal de
᏿ 2 Rω
fluorescence et la quantité d’échantillon.

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74
Référence Internet
P1476

Chromatographie planaire :
applications
1
par Dominique PRADEAU
Pharmacien des hôpitaux
Docteur ès sciences pharmaceutiques
et Chantal DAUPHIN
Maître de conférences UFR Pharmacie-Université Paris-XI
Docteur ès sciences pharmaceutiques

1. Étude de substances naturelles ........................................................... P 1 476 - 2


1.1 La chromatographie en couche mince et les plantes ............................... — 2
1.2 La chromatographie en couche mince et les micro-organismes............. — 2
2. Interactions contenant/contenu .......................................................... — 3
3. Toxicologie d’urgence à l’hôpital ........................................................ — 4
3.1 Méthodologie analytique standard ............................................................ — 5
3.2 Apport de la chromatographie couche mince pressurisée ...................... — 6
4. Application à la recherche de traces d’explosifs après attentat — 6
4.1 Traitement des prélèvements ..................................................................... — 7
4.2 Étapes analytiques de caractérisation ....................................................... — 8
4.3 Systèmes chromatographiques utilisés en CCMHP ................................. — 8
4.4 Modes de détection ..................................................................................... — 8
4.5 Conclusion.................................................................................................... — 8
5. Produits pharmaceutiques .................................................................... — 9
Références bibliographiques ......................................................................... — 9

es applications de la chromatographie en couche mince (CCM) – thin layer


L chromatography TLC – sont multiples comme le montrent le nombre et la
diversité des publications internationales sur ce sujet. Une commission de la
Société française des Sciences et Techniques pharmaceutiques, coprésidée par
J. Rabiant et D. Pradeau, a publié les derniers développements en chromato-
graphie planaire en présentant de nombreux exemples dans des domaines
variés comme les substances naturelles, les interactions contenant-contenu,
la toxicologie d’urgence à l’hôpital, la recherche des traces d’explosifs après
attentat et les produits pharmaceutiques [1].
Les aspects théoriques de la chromatographie planaire sont traités dans l’article [P 1 475],
référence [13], dans ce même volume.
Parution : mars 2002

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P1476

CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE : APPLICATIONS _____________________________________________________________________________________________

1. Étude de substances Dans la recherche de nouvelles molécules bioactives ou origina-


les, la CCM est utilisée comme technique de routine, pour l’analyse
naturelles rapide de fractions obtenues à la suite d’une séparation initialement
basée sur le test d’activité. L’efficacité de la CCM comme technique
de séparation est souvent mise à profit dans la phase ultime de puri-
fication, au moins sur de faibles quantités, lorsque les autres techni-
La chromatographie en couche mince (CCM) s’est imposée
ques ont montré leurs limites. La chromatographie planaire sous
comme une des techniques de base dans la recherche sur les subs-
pression est utilisée dans le cas de séparations particulièrement dif-

1
tances naturelles, en raison de sa simplicité de mise en œuvre et de
ficiles [3].
sa capacité de séparation et d’analyse des mélanges complexes que
constituent les extraits bruts d’origine naturelle.
Elle permet de comparer rapidement et simultanément plusieurs
dizaines d’échantillons, dans des conditions peu onéreuses, et ce 1.2 La chromatographie en couche mince
avec une grande flexibilité par rapport aux autres techniques cou- et les micro-organismes
ramment pratiquées dans le domaine des produits naturels (chro-
matographie liquide haute pression, chromatographie en phase
gazeuse et chromatographie de partage centrifuge...). Dès son origine, la recherche sur les métabolites secondaires
Actuellement, dans l’environnement de criblage intensif visant à microbiens a largement utilisé les possibilités les plus diverses de la
découvrir de nouvelles molécules naturelles présentant des activi- chromatographie planaire soit comme méthode simple et rapide de
tés biologiques, la CCM est utilisée soit comme outil de criblage pri- suivi des différentes étapes de purification, soit comme étape finale
maire systématique (criblage chimique), soit comme méthode de de séparation à l’aide de plaques préparatives.
suivi de fractionnement d’extraits bruts initialement sélectionnés Pratiquement toutes les publications relatives à l’isolement de
pour leur activité dans un test déterminé. produits d’origine microbienne font état du rapport frontal Rf
La CCM est également pratiquée, en raison de son pouvoir de comme caractéristique de la molécule purifiée [13].
résolution, comme technique ultime de séparation de mélanges
La capacité unique de cette technique à se prêter à la réalisation
complexes lorsque les autres techniques ont échoué.
de bioautographies a grandement contribué à l’isolement de nou-
La recherche sur les métabolites secondaires produits par les veaux antimicrobiens, d’antifongiques voire d’anticancéreux. Après
plantes et les micro-organismes a ainsi grandement bénéficié des mise au point de bonnes conditions de résolution sur la couche
multiples possibilités de la CCM. mince, il est possible, par simple contact de la plaque de CCM avec
un plateau ensemencé à l’aide de germes cibles (bactéries, champi-
gnons...) suivi d’une incubation de durée choisie, de localiser la ou
les zones d’inhibition de croissance [4].
1.1 La chromatographie en couche mince
On établit ainsi une corrélation entre le Rf d’un produit et son effet
et les plantes inhibiteur, ce qui permet un suivi remarquablement efficace du frac-
tionnement jusqu’à l’isolement de la molécule active, sans avoir à
doser l’ensemble des fractions issues des essais de séparation. Il
Dans ce domaine, les applications ont été extrêmement nombreu- s’avère possible de tirer parti de cet avantage y compris dans la
ses et ont exploité, au cours du temps, les combinaisons les plus recherche de produits anticancéreux ; on coule alors directement
variées offertes par la CCM, tant pour des études qualitatives que sur la plaque de CCM une suspension gélosée de cellules de la
quantitatives. lignée KB.
On peut mentionner, à titre d’exemples non limitatifs, l’utilisation Nota : la lignée cellulaire KB est une lignée établie, d’origine humaine, dérivée d’un car-
de différents types de couches minces selon les familles chimiques cinome oral. Ces cellules contiennent des séquences du papillomavirus humain (HPV-18).
à étudier : Dans les années 1980, la chromatographie planaire a connu un
— couche mince de polyamides, dans le cas de dérivés phénoli- nouveau développement. Initialement limitée à la découverte de
ques, de tanins, de glucosides, de flavonoïdes ; nouvelles molécules présentant des activités biologiques essentiel-
— couche mince de silice, pour les stéroïdes, les dérivés lipidi- lement dans le domaine de la chimiothérapie antimicrobienne, anti-
ques (acides gras, dérivés mono, di et triglycérides, sapogénines, virale et anticancéreuse, la recherche de métabolites microbiens a
sphingolipides) ; été étendue à l’étude de produits intéressants pour leur originalité
— couche mince d’alumine, support plus rarement utilisé que le structurale sans préjuger de leur activité biologique potentielle [5]
gel de silice, mais convenant particulièrement à l’étude des terpènes [6]. Cette approche consiste à comparer au sein de groupes taxino-
et de certains alcaloïdes. miques les différents extraits de souches cultivées sur des milieux
variés. Les extraits sont déposés, à l’aide d’appareils automatiques,
La diversité des systèmes éluotropes utilisables, combinée à la
sur des plaques de silice à raison de 20 échantillons par plaque de
richesse des réactifs de révélation en CCM, a également conduit à
20 cm × 20 cm. Après migration à l’aide de différents systèmes de
l’élaboration d’« atlas » d’extraits de plantes d’intérêt thérapeutique
phase mobile, les plaques sont soumises à plusieurs modes de révé-
[2]. Les chromatogrammes correspondant à deux cent trente plantes
lation (visible, UV 254 nm, 366 nm) dont une batterie de révélateurs
médicinales ont été obtenus dans des conditions parfaitement
chimiques. Le ou les échantillons présentant une tache caractéristi-
définies (solvants de migration, méthodes de détection donnant des
que sont alors sélectionnés pour une culture à plus grande échelle,
taches colorées intenses et facilement exploitables).
afin d’isoler le produit correspondant à la tache détectée et de déter-
Ces chromatogrammes sont photographiés et enregistrés, consti- miner sa structure.
tuant ainsi de véritables empreintes archivées à partir desquelles il
On peut ainsi cribler simultanément, avec un coût réduit, des
est possible de vérifier la qualité des préparations végétales, notam-
dizaines d’échantillons.
ment dans le cas d’éventuelles falsifications souvent difficilement
décelables par d’autres méthodes analytiques. Cette application a fait ses preuves et a conduit à l’isolement de
En recherche, cet outil contribue aussi à l’étude taxinomique qua- nombreuses molécules originales.
litative de plantes non déterminées, par un criblage systématique Considérée comme une technique simple, mais difficilement
orienté des familles chimiques donnant des réactions colorées spé- automatisable et surtout peu compatible avec les méthodes de cou-
cifiques (anthrones, coumarines, alcaloïdes, flavonoïdes, sapo- plage UV, masse et RMN, la chromatographie planaire était en
nines). retrait par rapport à la chromatographie liquide sur colonne à haute

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P 1 476 − 2 © Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation

76
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P1496

Chromatographie de partage
centrifuge
Principes et applications 1

par Karine FAURE


Chargée de recherche CNRS
Université de Lyon, Institut des sciences analytiques, UMR 5280, CNRS, Université Lyon 1,
ENS Lyon, Villeurbanne, France

1. Principe de la technique...................................................................... P 1 496 - 3


1.1 Principe chromatographique ................................................................... — 3
1.1.1 Coefficient de partage...................................................................... — 3
1.1.2 Migration du soluté.......................................................................... — 3
2. Instrumentation actuelle et industrialisation ............................... — 4
2.1 Instruments hydrodynamiques CCC ....................................................... — 4
2.2 Instruments hydrostatiques CPC ............................................................. — 5
2.3 Transfert d’échelle .................................................................................... — 6
3. Différents modes d’utilisation........................................................... — 4
3.1 Élution, extrusion et gradient................................................................... — 8
3.1.1 Élution isocratique et gradient ........................................................ — 8
3.1.2 Élution-extrusion .............................................................................. — 8
3.2 Chromatographie de déplacement ou pH-zone refining ....................... — 8
3.3 Multiple dual mode................................................................................... — 10
4. Domaines d’application....................................................................... — 10
4.1 CPC : une technique préparative ............................................................. — 10
4.2 Produits naturels végétaux ...................................................................... — 10
4.3 Produits de synthèse ................................................................................ — 10
4.4 Biotechnologies......................................................................................... — 11
5. Conclusion............................................................................................... — 12
6. Glossaire .................................................................................................. — 12
Pour en savoir plus ........................................................................................ Doc. P 1 496

a chromatographie regroupe une famille de techniques permettant la sépa-


L ration de molécules selon leur affinité respective envers une phase
stationnaire et une phase mobile. Parmi les techniques chromatographiques, la
chromatographie de partage centrifuge se distingue par la nature liquide de
la phase stationnaire. Technique relativement peu connue, à l’ombre des
techniques majeures que sont la chromatographie gazeuse et la chromato-
graphie liquide, toutes les deux utilisant des phases stationnaires solides, la
chromatographie de partage centrifuge voit dans l’absence de support solide
de nombreux avantages, mais également des spécificités à prendre en compte.
Le principe permettant la séparation de solutés en chromatographie de
partage centrifuge est extrêmement simple. Un système composé de deux
Parution : septembre 2016

liquides non miscibles en constitue le cœur. L’une des phases liquides est
maintenue stationnaire par champ centrifuge tandis que la seconde phase, dite
mobile, traverse à l’aide d’un système de pompage, la colonne ainsi créée. Les
solutés d’intérêt injectés en tête de colonne vont à la fois migrer au travers de

Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservés P 1 496 – 1

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Référence Internet
P1496

CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE CENTRIFUGE __________________________________________________________________________________________

la colonne, entraînés par la phase mobile, et se distribuer tout au long de cette


colonne entre les deux phases liquides, selon leurs coefficients de partage.
La sélectivité de la colonne vis-à-vis des solutés est liée aux différents coeffi-
cients de partage de ces solutés entre les deux phases non miscibles.
Il est important de noter que la colonne biphasique nécessite une techno-
logie spécifique de type centrifuge pour maintenir une phase liquide

1
stationnaire. En revanche, le parc instrumental à la périphérie de la colonne est
en tout point commun aux techniques chromatographiques en phase liquide, à
savoir un système de pompage et un injecteur en amont, un détecteur et/ou un
collecteur en aval. Les différentes options technologiques sont exposées dans
cet article.
La nature liquide de la phase stationnaire offre à l’utilisateur des modes
d’utilisation originaux et un choix de colonne sans précédent, conduisant à une
sélectivité très pertinente de la technique à la/aux molécule(s) visée(s).
Exploités dans le domaine des produits naturels, ces avantages ne sont encore
que peu perçus dans les autres domaines où la séparation est pourtant une
étape cruciale.
Ainsi, par l’exposé des principes et une vision synthétique des domaines
d’applications, cet article permet de poser des bases de compréhension de la
technique de chromatographie de partage centrifuge et d’appréhender sa
complémentarité dans l’éventail des techniques séparatives actuelles.

Sigles notations et symboles Sigles notations et symboles (suite)

Symbole Unité Description Symbole Unité Description

CPC Chromatographie de partage centrifuge Volume de phase mobile dans la


Vm L
colonne
CCC Chromatographie à contre-courant
Vs L Volume de phase stationnaire
Chromatographie en phase liquide (sur
HPLC Vc L Volume de la colonne
phase stationnaire solide)

% Taux de phase stationnaire Espace disponible entre les pics lors


Sf mL
∆V
d’une injection de faible volume
K – Coefficient de partage/distribution
Vinjx mL Volume injecté dans la colonne x
Activité chimique dans la phase station- min Temps de rétention du soluté
as (am) – tr
naire (dans la phase mobile)
t0 min Temps mort
Solubilité du composé dans la phase
Ss (Sm) g/L
stationnaire (dans la phase mobile) F mL/min Débit
Concentration du soluté dans la phase bar Perte de charge générée par la colonne
Cs (Cm) mol/L
stationnaire (dans la phase mobile)
∆P

∆ρ g/L Différence de masse volumique


Quantité de soluté dans la phase
Qs (Qm) mol
stationnaire, (dans la phase mobile) ω tr/min Vitesse de rotation

Vitesse linéaire de phase mobile (du cP Viscosité


um (ur) m/s η
soluté)
Rsx – Résolution entre les pics sur la colonne x
Proportion du soluté dans la phase
xs (xm) %
stationnaire (dans la phase mobile) nx – Nombre de cellules dans la colonne x

Vr L Volume de rétention du soluté Poct/eau – Coefficient de partage octanol/eau

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Référence Internet
P1496

__________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE CENTRIFUGE

des molécules d’intérêt entre les deux phases non miscibles. La


1. Principe de la technique molécule d’intérêt présente une certaine solubilité dans chacune
des phases liquides en présence. Cet équilibre est régi par une
constante thermodynamique, appelée coefficient de partage K, qui
Bref historique : la CPC, cousine éloignée correspond au rapport des activités chimiques du soluté dans les
de l’HPLC deux phases :
Le principe de chromatographie est apparu en 1903 lorsque

1
le botaniste Tswett a observé la séparation des différentes (1)
formes de chlorophylle lors de la migration d’un extrait de
plante sur un milieu crayeux. Les travaux de compréhension
du phénomène conduisent en 1941 Martin et Synge (Prix
Nobel 1952) à définir et poser les bases théoriques de la chro- avec K coefficient de partage,
matographie de partage [1]. Le terme « partage » provient du as (am) activité chimique dans la phase stationnaire (dans
fait que les molécules se partagent entre deux phases la phase mobile),
liquides, l’une étant la phase mobile qui traverse le dispositif, Ss(Sm) solubilité du composé dans la phase stationnaire
l’autre étant la phase liquide qui imprègne le support solide (dans la phase mobile).
inerte (de la silice dans ce cas). Il est donc nécessaire d’avoir
en présence deux liquides non miscibles pour lesquels les Très utilisée en extraction liquide/liquide, cette constante corres-
molécules présentent des différences d’affinité. pond, dans le cas de solvants non miscibles et en cas d’absence
d’interaction solvant-soluté, aux rapports des coefficients de solu-
De ces travaux précurseurs ont découlé deux axes majeurs de bilité S et dépend de la température et éventuellement de la pres-
développement. L’un a consisté à greffer des groupements sion. Elle est indépendante des rapports volumiques de phases.
chimiques fonctionnels sur le support silice afin de remplacer
avantageusement la phase d’imprégnation, trop instable méca- Dans le cas de solutions diluées, l’activité chimique d’un
niquement, et ainsi créer des sites d’affinités entre les solutés et composé peut être assimilée à sa concentration. Le coefficient de
la phase stationnaire devenue solide. La chromatographie partage d’un composé dans deux phases liquides est alors le rap-
liquide était née, découlant par des progrès technologiques port des concentrations à l’équilibre de ce composé dans chacune
continuels vers l’HPLC que nous connaissons bien aujourd’hui. des phases :
L’autre axe mené par Lyndman Craig a cherché à approfon- (2)
dir le mécanisme de partage entre deux phases liquides non
miscibles. Le concept de distribution à contre-courant est alors
introduit et illustré par un instrument qui restera connu sous avec Cs (Cm) concentration du soluté dans la phase stationnaire
le nom de Machine de Craig dans lequel une cinquantaine (dans la phase mobile).
de tubes assurent le contact agité entre deux phases non mis- Dans le cas où le soluté peut prendre plusieurs formes (cas des
cibles avant leur transfert respectif vers un tube adjacent, dans composés ionisables par exemple), on préfère le terme de coeffi-
des directions opposées [2]. Si le mécanisme de partage est cient de distribution D qui prend en compte le partage de cha-
bien assuré par la centaine de transferts subis dans ce pro- cune des formes que peut prendre la molécule.
cess, il ne s’agit pas ici de chromatographie au sens où il n’y a Dans le cas de solutions très concentrées, il est important de
pas de phase stationnaire, c’est-à-dire complètement immobi- s’assurer que l’équilibre entre les deux phases stationnaire et
lisée. Malgré sa grande fragilité due aux tubes en verre inter- mobile n’est pas perturbé (génération d’une troisième phase, modi-
connectés, la machine de Craig a connu un succès rapide dans fication de la différence de densité, etc.) car cela peut entraîner une
l’industrie car elle proposait une méthode de séparation per- perte de phase stationnaire. Si tel n’est pas le cas, l’injection d’une
formante. Elle a cependant été tout aussi rapidement supplan- solution très concentrée aura seulement un impact sur la largeur
tée par la chromatographie liquide dès sa commercialisation des pics résultants, la chromatographie étant un processus dilutif.
en raison de la plus grande robustesse de cette dernière.
Contrairement à l’extraction liquide/liquide, qui est une opéra-
Le maintien efficace d’une phase liquide stationnaire, sans sup-
tion qui fait intervenir le transfert de matière d’un soluté entre
port solide, en contact avec une phase mobile n’interviendra que
deux phases liquides partiellement miscibles entre elles, et pour
30 années plus tard grâce aux travaux de Ito qui proposa d’appli-
laquelle on obtient, après contact et séparation deux phases, l’une
quer une force centrifuge à la phase liquide
enrichie et l’autre épuisée [J 1 073], la chromatographie de partage
stationnaire [3] [4]. Depuis, de nombreuses solutions technolo-
centrifuge a avant tout pour objectif de séparer les composés les
giques ont été proposées. Deux types d’instruments, qualifiés
uns des autres. Les systèmes solvants biphasiques sont alors choi-
d’hydrodynamiques et d’hydrostatiques selon la façon d’appli-
sis de telle sorte que la sélectivité α (rapport des coefficients de
quer un champ centrifuge à la phase stationnaire, ont émergé. Le
partage de solutés adjacents) soit maximale tout en ayant des
détail de leur conception est fourni dans la suite de cet article.
coefficients de partage peu élevés (K entre 0,2 et 10).
En 1982, la société Sanki commercialise le premier instru-
ment, de type hydrostatique. En 1984, la société PC Inc
commercialise le premier instrument de type CCC hydro- 1.1.2 Migration du soluté
dynamique. Réservée à quelques néophytes dans les années
1990, la technique de chromatographie de partage centrifuge En chromatographie, la vitesse du soluté ur correspond à la
suit une industrialisation lente et progressive depuis les vitesse de la phase mobile um modulée par la quantité de soluté
années 2000, comme outil de chromatographie préparative à dans la phase mobile xm , la phase stationnaire ayant une vitesse
l’échelle laboratoire et semi-industrielle. us nulle :
(3)
avec um (ur) vitesse linéaire de phase mobile (du soluté),
1.1 Principe chromatographique
xs (xm) proportion du soluté dans la phase stationnaire
(dans la phase mobile).
1.1.1 Coefficient de partage
En tout point de la colonne, l’équilibre de partage K définit la
Le principe permettant la séparation de solutés en chromatogra- quantité de soluté présent dans la phase mobile. En combinant la
phie de partage est extrêmement simple, basé sur la distribution définition du coefficient de partage K avec celle du volume de

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J2787

Chromatographie de partage
centrifuge
Mise en œuvre, modélisation 1
et changement d’échelle

par Luc MARCHAL


Maître de conférences HDR
Laboratoire de génie des procédés – environnement – agroalimentaire UMR CNRS 6144 –
Université de Nantes, Saint Nazaire, France
Jean-Hugues RENAULT
Professeur
Institut de chimie moléculaire de Reims UMR CNRS 7312 – Université de Reims
Champagne-Ardenne, Reims, France
et Sébastien CHOLLET
Docteur
CPC Eng – Capacités SAS, Nantes, France

1. Chromatographie liquide sans support solide............................. J 2 787 - 3


1.1 Principe de la technique .......................................................................... — 3
1.2 Choix des deux phases liquides ............................................................. — 3
2. Hydrodynamique et efficacité chromatographique ................... — 4
2.1 Régimes d’écoulements .......................................................................... — 5
2.2 Rétention de la phase stationnaire......................................................... — 6
2.3 Efficacité chromatographique................................................................. — 7
3. Modes de fonctionnement et modélisation.................................. — 8
3.1 Mode élution ............................................................................................ — 8
3.2 Mode déplacement .................................................................................. — 9
4. Dimensionnement de colonne.......................................................... — 11
4.1 Chimie et thermodynamique .................................................................. — 11
4.2 Hydrodynamique et transfert.................................................................. — 12
4.3 Définition des dimensions de la colonne............................................... — 12
5. Exemple d’application et changement d’échelle ........................ — 13
5.1 Purification d’alcaloïdes d’intérêt pharmaceutique extraits
de la pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus) — 13
5.2 Développement de la séparation à l’échelle 1 (laboratoire)................. — 13
5.3 Transposition de la séparation à l’échelle 2 (pilote industriel) ............ — 14
6. Perspectives .......................................................................................... — 15
7. Conclusion ............................................................................................. — 15
8. Glossaire ................................................................................................. — 15
Pour en savoir plus ........................................................................................ Doc. J 2 787
Parution : septembre 2016

a chromatographie de partage centrifuge (CPC) est une technique de


L séparation multi-étagée, utilisant des colonnes compactes, constituées
d’une cascade de chambres ou cellules de partage reliées entre elles par
des canaux et soumises à un champ d’accélération centrifuge. Le méca-

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CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE CENTRIFUGE __________________________________________________________________________________________

nisme de séparation repose sur la différence de distribution des composés


entre deux phases liquides non miscibles. Dans la colonne de CPC, un des
liquides est maintenu stationnaire grâce à la rotation de la colonne et donc
sans avoir recours à un support solide, tandis que la phase mobile traverse la
phase stationnaire à un débit imposé par une pompe. La chaîne de CPC et sa
gamme d’utilisation sont proches de celles d’une chaîne CLHP (chromatogra-
phie liquide haute performance) à vocation préparative.

1 Les principaux développements de la CPC ont eu lieu au cours des années


1990 et 2000 avec l’apparition de nouveaux équipementiers, portant la techno-
logie à un niveau de maturité qui la rend industrialisable (les colonnes sont
disponibles en différents matériaux, pour des volumes allant de 30 mL à 25 L).
L’absence de support solide pour réaliser des opérations de capture ou de frac-
tionnement permet d’aborder le traitement de charges complexes comme c’est
souvent le cas pour les substances naturelles (métabolites secondaires com-
plexes par exemple) ou issues de biotechnologies, sans risquer la surcharge ou
l’encrassement du support (résine, silice). Cette souplesse de fonctionnement, le
faible coût de la phase stationnaire et la réduction de la consommation de sol-
vants permettent à la CPC d’élargir le champ d’applications de la
chromatographie liquide et d’envisager la réduction du nombre d’étapes de puri-
fication. C’est la purification de substances naturelles à haute valeur
ajoutée (peptides, alcaloïdes) qui a servi dans un premier temps de cas d’étude.
Même si le changement d’échelle a longtemps été considéré comme une trans-
position linéaire, il est montré ici que la CPC est contrôlée par :
– l’hydrodynamique des phases et le transfert de matière ;
– la géométrie de la colonne, suivant des règles non linéaires.
Les outils de modélisation et d’ingénierie des colonnes de CPC, présentés
dans cet article, permettent de dimensionner ces dernières pour une applica-
tion et une productivité souhaitées ou bien de transposer une séparation d’un
équipement de R&D à un équipement de production.
Comme tous les procédés basés sur le transfert de matière entre deux
fluides, les performances d’une colonne de CPC (efficacité, résolution, produc-
tivité) résultent de l’hydrodynamique des phases, présentée dans un premier
temps.
Les modèles développés permettent de décrire et prédire les chromato-
grammes en mode élution comme en mode déplacement. Les modèles
intègrent donc les termes de transport, transfert et, le cas échéant, réactions
des espèces mises en œuvre dans la séparation. L’hydrodynamique des
phases est prise en compte dans les modèles via l’évolution du rapport de
phase, des vitesses phasiques et du coefficient de transfert de matière.
Les modèles obtenus sont alors utilisés pour optimiser la séparation à une
échelle donnée, réaliser une transposition d’échelle ou dimensionner un équi-
pement industriel. La démarche est illustrée par le changement d’échelle de la
séparation d’alcaloïdes d’une CPC de 30 mL à une CPC de 2 200 mL.

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__________________________________________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE CENTRIFUGE

colonne, à la différence de densité entre les deux phases et à la


Notations et symboles
géométrie particulière de la colonne. La phase mobile, ou éluant,
Symbole Unité Description traverse la phase stationnaire sous l’action d’une pompe. À la dif-
férence des procédés avec support solide, l’efficacité de la sépara-
a m2 · m–3 Surface spécifique d’échange tion pour un échantillon donné dépend de la qualité du mélange et
dh m Diamètre hydraulique du canal de la mise en contact des deux phases dans chacune des cellules
de partage (hydrodynamique des phases).
Ds m2 · s–1 Coefficient de diffusion du soluté

1
Le développement d’une séparation par CPC suit donc trois
G m · s–2 Accélération centrifuge étapes successives :
Coefficients de transfert de matière – le choix du type de développement chromatographique (élu-
k0a, kma,
s–1 global, côté phase mobile et côté tion, déplacement) et système liquide-liquide associé permettant
ksa
phase stationnaire d’obtenir le partage et la sélectivité de la séparation pour un
échantillon donné [P 1 496] ;
KD , Ka Constante de distribution et d’acidité – l’étude et optimisation des conditions opératoires (débit,
vitesse de rotation, charge) pour atteindre la résolution souhaitée ;
Ncell Nombre de cellules de la colonne
– la mise à l’échelle pour atteindre la productivité souhaitée.
Nombre d’étages théoriques, nombre
N, NUT
d’unités de transfert
P Pa Pression en tête de colonne La capacité et la résolution de la séparation sont directement
liées à la rétention de la phase stationnaire ; celle-ci est
Q mL · min–1 Débit d’élution variable et dépend de l’hydrodynamique des phases.
Re, Bo, Fr, Nombres de Reynolds, Bond, Froude, L’efficacité n’est pas imposée par la granulométrie d’un sup-
Ca, Sh, Sc Capillaire, Sherwood et Schmidt port ou garnissage ; elle dépend également de l’hydrodyna-
mique des phases.
S cm2 Section de la colonne
L’hydrodynamique est contrôlée par le design des cellules,
tr min Temps de rétention du soluté les propriétés physico-chimiques du système biphasique et les
conditions opératoires (débit et accélération centrifuge).
Volume de la colonne, de phase
Vc , Vm ,
mL mobile, de phase stationnaire, et de La sélectivité dépend du mélange de solvants utilisé pour
Vs , Vinj
l’injection générer le système biphasique liquide-liquide, pour une appli-
cation donnée.
Taux de rétention de la phase
εs = Sf %
stationnaire
µ mPa · s Viscosité dynamique 1.2 Choix des deux phases liquides
ρ kg · m–3 Masse volumique La chromatographie de partage centrifuge a pour principe l’utili-
σ mN · m–1 Tension interfaciale sation de deux phases liquides non miscibles. Elles sont préparées
en mélangeant au moins 2 solvants. La plupart des systèmes
τ s Temps de passage dans une cellule biphasiques utilisés sont des mélanges de 3 à 5 solvants permet-
tant ainsi d’ajuster la polarité des phases mobile et stationnaire à
kg · m–3 Différence de masse volumique entre
l’application.
∆ρ
les deux phases
Les systèmes de phases de référence sont réalisés à partir de
solvants traditionnels allant de l’eau aux alcanes. L’échelle de pola-
Indices rité couverte est large, allant de l’heptane-acétonitrile pour les
c colonne ou critique composés les moins polaires (acides gras, stérols, terpènes...) au
n-butanol-acide acétique-eau pour les peptides ou certains hétéro-
cell cellule sides très polaires, en passant par des mélanges acétate
d’éthyle-n-butanol-eau ou méthyl-tert-butyl éther-acétonitrile-eau
m mobile ou des mélanges quaternaires de type heptane-acétate
s stationnaire d’éthyle-méthanol-eau. La tendance est à la substitution par des
phases moins volatiles et/ou biosourcées.
La problématique du choix des phases est double et dépend
avant tout de la nature des molécules cibles et de la complexité de
1. Chromatographie liquide la charge à traiter :
– solubilité de l’extrait (pour obtenir une colonne capacitive) ;
sans support solide – sélectivité du système vis-à-vis des molécules à purifier (pour
la résolution de la séparation).
1.1 Principe de la technique La sélection d’un système biphasique pour une application don-
née en CPC correspond au choix de la colonne ET de la phase
La chromatographie de partage centrifuge (CPC) fait partie de la mobile en CLHP. Deux stratégies simples à mettre en œuvre [1] ont
famille des procédés de chromatographie liquide [P 1 455]. La CPC été développées pour guider les opérateurs dans leur choix d’un
est une technique de séparation liquide-liquide sans support solide système biphasique adapté.
basée sur la distribution des solutés entre deux phases liquides La première stratégie, celle du « bon solvant », débute par la
non miscibles. La colonne est constituée d’une suite de chambres recherche d’un solvant permettant une solubilisation optimale de
ou cellules de partage reliées en série par des canaux [P 1 496]. l’échantillon à fractionner. Le système biphasique est ensuite généré
Dans chaque cellule, la phase stationnaire liquide est retenue en ajoutant deux autres solvants, l’un moins polaire, l’autre plus
grâce au champ d’accélération généré par la rotation de la polaire (ce dernier étant souvent l’eau). Pour la plupart des systèmes

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CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE CENTRIFUGE __________________________________________________________________________________________

ternaires, le diagramme de phases est disponible à température Exemple de la gamme « Arizona » : mélanges de deux sys-
ambiante et permet un ajustement simple de la composition. tèmes biphasiques binaires : eau-acétate d’éthyle (polaire) et heptane
méthanol (apolaire). Si un composé x se partage préférentiellement
En mode de développement par élution, des coefficients de distri- dans le méthanol du système heptane-méthanol et dans l’acétate
bution recherchés sont compris entre 0,5 et 2,0. Ces conditions d’éthyle du système acétate d’éthyle-eau, alors il existe un mélange
quaternaire conduisant à un partage adapté pour une séparation par
assurent un bon compromis entretemps et qualité de séparation. Les
CPC en mode élution.
coefficients de distribution peuvent être évalués qualitativement par

1
chromatographie sur couche mince ou quantitativement par CLHP. Pour les biopolymères comme les protéines, une gamme de sys-
tèmes aqueux biphasiques ATPS (Aqueous Two-Phases Systems)
Dans le cas des systèmes biphasiques de type 2 (ternaire pour a été introduite. Ces systèmes de phases sont obtenus en mélan-
lequel deux des trois mélanges binaires présentent une solubilité geant de l’eau, des polymères de poids moléculaires et de polarité
partielle – exemple heptane/n-butanol/eau) [J 1 073], il est possible variables (polyéthylène glycol (PEG) et dextran par exemple) et des
de pratiquer un gradient de polarité au niveau de la phase mobile. sels (citrate, phosphate) pour obtenir le déphasage [5]. Comme
À l’inverse, les systèmes de type 0 (tétrahydrofurane/diméthylsul- souvent pour la séparation de biopolymères, le choix du système
foxide/eau) ou 1 (ternaire pour lequel un des trois mélanges chromatographique est complexe mais la sélectivité obtenue peut
binaires présente une solubilité partielle – exemple heptane/acé- être remarquable. Par ailleurs, ces milieux sont connus pour per-
tate d’éthyle/acétonitrile) ne peuvent être utilisés qu’en mode iso- mettre le maintien des protéines dans leur conformation active
cratique. Il convient d’éviter de travailler avec des compositions (pas de dénaturation).
trop proches de l’isotherme de solubilité. Plusieurs revues donnent
des exemples de purifications spécifiant les systèmes biphasiques Le choix du système n’est pas sans effet sur le comportement du
utilisés [2]. Enfin, il est possible de modifier le pH, la force ionique, procédé. Pour cela, les phases supérieures et inférieures sont
d’ajouter un quatrième solvant, etc. pour ajuster au mieux la caractérisées par leurs caractéristiques physiques : masses volu-
composition des deux phases liquides. miques (ρsup et ρinf en kg · m–3), viscosités dynamiques (µsup et µinf
en mPa · s) et tension interfaciale (σ en mN · m–1). Les propriétés
La seconde approche utilise des gammes de systèmes bipha- des systèmes les plus courants sont résumées dans le tableau 1.
siques prédéfinis. Elles sont largement utilisées et décrites dans la
littérature pour la séparation des petites molécules car elles per-
mettent simplement de parcourir de larges gammes de polarité. Ce
sont les gammes nommées « Arizona » ou « HEMWat », constituées 2. Hydrodynamique
d’hexane (ou d’heptane), d’acétate d’éthyle de méthanol et d’eau qui
sont plébiscitées, en raison de leur polyvalence. Les différentes et efficacité
gammes répertoriées dans la littérature sont les suivantes :
– Oka et al. [3] : 16 mélanges de n-hexane, acétate d’éthyle,
chromatographique
butan-1-ol, méthanol et d’eau ;
– Foucault et al. [4] : 7 mélanges de n-heptane, butan-1-ol, acéto- Technique chromatographique, la CPC s’apparente dans sa mise
nitrile et d’eau ; en œuvre plutôt à de l’extraction liquide-liquide sur colonne (sans
– Margraff et al. [4] : 23 mélanges de n-heptane, acétate d’éthyle, plateaux, ni garnissage) [J 2 760]. En effet, chaque cellule de par-
méthanol et d’eau (gamme « Arizona ») ; tage peut s’apparenter à une petite colonne dont la phase station-
naire et la phase mobile sont respectivement la phase continue et
– Maciuk et al. [1] : 7 mélanges d’acétone, toluène, n-heptane et
la phase dispersée.
d’eau.
L’écoulement se déroule en trois étapes (figure 1a) :
Ces méthodes de criblage sont intéressantes, mais le développe-
ment de méthodes en CPC ne doit pas se réduire à la recherche du – la phase mobile arrive par un canal (section circulaire ou paral-
bon système biphasique dans une gamme donnée, le champ lélépipédique) et entre dans la cellule (1) avec une vitesse liée au
d’exploration de la sélectivité et de la solubilité étant alors relative- débit ; c’est l’étape de formation de l’interface qui conditionne la
ment restreint. configuration d’écoulement obtenue en (2) ;

Tableau 1 – Caractéristiques physiques de quelques systèmes biphasiques courants en CPC


(valeurs données à environ 20 °C)

Système
(kg · m–3) (kg · m–3) (kg · m–3) (mPa · s) (mPa · s) (mN · m–1)

Heptane-méthanol-eau
696 808 112 0,49 0,96 3,5
(4 % d’eau en volume)
Heptane-acétate d’éthyle-méthanol-eau
774 925 151 0,45 1,81 3,2
(1-1-1-1 en volume)
Toluène-acétonitrile-eau
856 982 126 0,60 1,16 17,3
(4-1-5 en volume)
n-butanol-acide acétique-eau
875 983 108 2,77 1,63 1,2
(4-1-5 en volume)
ATPS 1
1 070 1 130 60 14,1 2,43 < 1,0
(PEG 2000 – phosphate, 10,7 à 12,0 % en masse)
ATPS 2
1 080 1 170 90 65,0 2,30 < 1,0
(PEG 6000 – phosphate, 11,6 à 13,0 % en masse)

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Couplage CG-SM/SM

par Michel SABLIER


1
Docteur de l’université Pierre-et-Marie-Curie – Directeur de recherche au CNRS
Centre de recherche sur la conservation, Muséum National d’Histoire Naturelle, CNRS,
Paris, France

1. Concepts et définitions ...................................................................... P 1 487v2 - 3


1.1 Principe de la spectrométrie de masse tandem SM/SM....................... — 3
1.2 Définitions................................................................................................. — 3
1.3 Couplage................................................................................................... — 4
2. Instrumentation pour le couplage CG-SM/SM ............................. — 5
2.1 Spécificités du couplage CG-SM/SM et du balayage du rapport m/z.. — 5
2.2 Évolution instrumentale du couplage CG-SM/SM ................................ — 5
2.3 Types d’appareils ..................................................................................... — 6
2.4 Processus de collision ............................................................................. — 7
2.5 Méthodes d’ionisation ............................................................................. — 8
3. Intérêt du couplage CG-SM/SM ........................................................ — 10
3.1 Comparaison entre couplage CG-SM/SM et analyse en tandem
SM/SM ...................................................................................................... — 10
3.2 Couplage CG-SM/SM comparé au couplage CL-SM/SM...................... — 10
3.3 Approche alternative au couplage CG-SM/SM : CG-HRMS ................. — 11
3.4 Approche alternative au couplage CG-SM/SM : CGxCG-TOFMS ........ — 11
3.5 Traitement des données pour l’identification des composés .............. — 11
4. Domaines d’applications du couplage CG-SM/SM...................... — 13
4.1 Exemple de l’analyse des pesticides et de leurs résidus...................... — 13
4.2 Exemple de l’analyse des métabolites de HAP ..................................... — 15
5. Conclusion et perspectives ............................................................... — 16
6. Glossaire ................................................................................................. — 17
Pour en savoir plus ....................................................................................... Doc. P 1 487v2

L a complexité des mélanges à analyser dans des domaines aussi différents


que ceux concernant l’analyse de polluants environnementaux, de
coupes pétrolières ou de milieux biologiques a conduit au développement
de techniques de plus en plus sélectives pour permettre la caractérisation de
composés souvent présents à l’état de traces. Les avancées obtenues dans ces
domaines d’analyse tiennent principalement à deux facteurs :
– dans le domaine de la séparation chromatographique et, en particulier, de
la chromatographie en phase gazeuse, au développement de colonnes chro-
matographiques capillaires à très haute résolution ;
– dans le domaine de la détection, au développement en routine de tech-
niques de couplages d’une séparation chromatographique avec la détection
par spectrométrie de masse aux qualités toujours améliorées.
Le développement de la spectrométrie de masse tandem (SM/SM) a intro-
duit une nouvelle dimension dans l’analyse de mélanges complexes en
permettant la sélection d’un seul ion dans une matrice pour ensuite le dissocier
afin de déterminer sa structure. Cette technique permet ainsi de confirmer la pré-
sence d’un composé de façon spécifique sans préparation particulière de
l’échantillon à analyser. La sélectivité de la spectrométrie de masse tandem est
cependant accrue par une séparation chromatographique préalable des consti-
Parution : août 2018

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P1487

COUPLAGE CG-SM/SM ______________________________________________________________________________________________________________

tuants de l’échantillon. C’est pour cette raison que le couplage de la


chromatographie en phase gazeuse à la spectrométrie de masse tandem a été
introduit.
La totale maîtrise du couplage chromatographique avec la spectrométrie de
masse depuis le début des années 1980 et la mise au point de spectromètres
de masse tandem commerciaux a permis l’utilisation des propriétés de sélecti-
vité de ces deux techniques pour pousser plus avant les potentialités
1 analytiques attendues de la combinaison de celles-ci, laissant au couplage de
la chromatographie en phase gazeuse à la spectrométrie de masse
tandem (CG-SM/SM) toute latitude pour affirmer sa sélectivité.
L’analyse par spectrométrie de masse de mélanges complexes pour des ana-
lytes particuliers est ainsi facilitée par la spectrométrie de masse en tandem
(SM/SM) ainsi que par des mesures de haute résolution/haute précision de
masse. La valeur de la spectrométrie de masse tandem est bien établie, pour la
caractérisation de composés particuliers en utilisant des balayages ioniques de
produits et pour reconnaître les membres de classes de composés en utilisant
les pertes de fragments neutres et les balayages d’ions précurseurs. La disso-
ciation induite par collision CID « Collision Induced Dissociation » a été
étudiée pour sa capacité à réaliser l’étape indispensable d’activation des ions
moléculaires et pour générer des fragments caractéristiques dans les expé-
riences SM/SM. Une mesure de masse précise, associée à une résolution
suffisante, permet de restreindre considérablement le nombre de formules
moléculaires possibles qui pourraient correspondre à une masse moléculaire
particulière.
L’analyse des échantillons environnementaux représente souvent une tâche
difficile pour la chimie analytique. Les composés cibles sont généralement pré-
sents à l’état de traces dans un cocktail complexe de composés naturels et
anthropiques. Afin de quantifier avec précision de tels composés à l’état de
traces, il est essentiel de réduire le bruit de fond, mais également de séparer
efficacement les composés cibles les uns des autres et de la matrice résiduelle.
Dans cet article, les évolutions récentes de la CG-SM/SM sont abordées au
travers des développements instrumentaux des appareils permettant de
conduire des expériences de spectrométrie de masse tandem (§ 2) gardant à
l’esprit que si le premier défi concerne l’efficacité de la dissociation, le second
défi concerne les capacités à acquérir un signal porteur d’information suffi-
sante pour l’identification des composés ciblés (§ 2). Il existe des alternatives à
la CG-SM/SM qui sont proposées à titre de comparaison (§ 3). Enfin, des appli-
cations dans les principaux domaines d’intérêt de la CG-SM/SM (§ 4) sont
abordées pour illustrer les potentialités de cette technique en spectrométrie de
masse moderne.

Pour de plus amples renseignements sur les techniques, le lecteur pourra se reporter aux
articles Spectrométrie de masse [P 2 645], [P 2 647] et Couplage chromatographique avec la
spectrométrie de masse [P 1 490], [P 1 491].

Sigles Sigles

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization CG-SM/SM Couplage de la chromatographie gazeuse à la


(processus d’ionisation à pression atmosphérique spectrométrie de masse tandem
par ionisation chimique)
CID Collision Induced Dissociation (dissociation
API Atmospheric Pressure Ionization (processus induite par collision)
d’ionisation à pression atmosphérique)
CL Chromatographie liquide
APPI Atmospheric Pressure Photoionization (processus ESI Electrospray Ionization (processus d’ionisation à
d’ionisation à pression atmosphérique par pression atmosphérique par électronébulisation)
ionisation photonique)
FWHM Full Width Half Maximum (largeur de pic à
CG Chromatographie gazeuse mi-hauteur)

P 1 487v2 – 2 Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservés

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_______________________________________________________________________________________________________________ COUPLAGE CG-SM/SM

Pour illustrer le principe de fonctionnement de la spectrométrie de


Sigles masse tandem SM/SM, considérons un ion à caractériser (de même
HAP Hydrocarbures aromatiques polycyliques rapport m/z = 223 que celui du phtalate de diéthyl). Cet ion, noyé
dans le spectre de masse du bruit de fond, peut correspondre à diffé-
HR Haute résolution (de la mesure en masse du rentes structures distribuées de façon aléatoire et même la réalisation
rapport m/z) d’une analyse par spectrométrie de masse haute résolution ne per-
met pas nécessairement de le distinguer, étant donné le nombre de
HR/AM High Resolution/Accurate Mass (haute structures susceptibles de correspondre à ce rapport m/z. Le spectre

1
résolution/masse précise) de masse SM/SM de cet ion de rapport m/z = 223 ne donne pas
d’information sur sa structure puisqu’il ne retraduit qu’aléatoirement
IE Ionisation électronique la somme des pics correspondants aux différents spectres SM/SM de
ITD Ion-trap Detector (appareils de type pièges à ions) l’ensemble des structures présentant un rapport m/z égal à 223
(figure 1a). L’introduction d’un analyte caractérisé par un ion de rap-
LOD Limit Of Detection (limite de détection) port m/z = 223 modifie l’intensité du pic correspondant au niveau de
l’analyseur SM-I et surtout donne cette fois, sous la forme de son
MRM Multiple Reaction Monitoring (suivi de réactions spectre SM/SM une information sur sa structure, car la présence de
multiples) cet analyte modifie la distribution aléatoire observée précédemment
où prédomine maintenant la contribution de cet ion de rapport
POP Polluants organiques persistants m/z = 223 (figure 1b). L’identification du composé est rendue pos-
sible par la détection caractéristique de ses ions de fragmentation
Q Appareil quadripolaire ou filtre de masse
après CID m/z = 149 et m/z = 177.
quadripolaire
QqQ Appareil quadripolaire tandem

RF Radiofréquence
SM Spectrométrie de masse (MS pour Mass
Spectrometry)
SRM Selected Reaction Monitoring (suivi de réactions CID
sélectionnées) m /z = 223

TOF Time Of Flight (appareil à temps de vol)

m /z = 223
a bruit chimique

1. Concepts et définitions
Avant d’aborder les techniques et les applications du couplage m /z = 149
CG-SM/SM, il est nécessaire d’introduire un certain nombre de
concepts et de définitions auxquels il est fait référence dans le CID
développement de cet article. Le lecteur souhaitant se documenter m/z = 223 m /z = 177
sur les développements historiques de la CG-SM/SM peut consul-
ter les ouvrages de référence sur le sujet [1] [2].

m /z = 223
SM – I SM – II
1.1 Principe de la spectrométrie spectre SM spectre SM/SM
de masse tandem SM/SM b analyte

Figure 1 – Illustration du principe de la spectrométrie de masse


La spectrométrie de masse tandem SM/SM peut être tandem dans le cas de l’ionisation chimique positive du phtalate
présentée comme la technique offrant le moyen d’obtenir le de diéthyle
spectre de masse d’un ion présent dans un spectre de masse.
En résumé, le principe de la spectrométrie de masse SM/SM
repose donc, après ionisation dans la source du spectromètre de
Grâce au fonctionnement indépendant de chaque filtre de
masse, à sélectionner un ion au niveau du premier analyseur SM-I,
masse, cette technique permet d’augmenter la sélectivité de l’ana-
à le dissocier en région de réaction, pour finalement obtenir un
lyse et, par voie de conséquence, d’abaisser les limites de détec-
spectre de masse au niveau de l’analyseur SM-II permettant de
tion.
déterminer sa structure.

Exemple : une représentation conceptuelle de son principe est


reportée sur la figure 1 dans le cas de l’ionisation chimique positive 1.2 Définitions
du phtalate de diéthyle qui conduit à un ion quasi moléculaire [M+H]+
de rapport m/z = 223 (m pour masse et z pour charge). L’identification La terminologie en spectrométrie de masse tandem (SM/SM)
de ce composé par spectrométrie de masse tandem est réalisée par est directement issue de la technologie instrumentale de ces appa-
la détection des ions caractéristiques de rapport m/z = 177 et reils. Les définitions suivantes se rattachent à cette technologie et
m/z = 149 dans le spectre de masse SM/SM. sont appliquées dans le cas du couplage CG-SM/SM.

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COUPLAGE CG-SM/SM ______________________________________________________________________________________________________________

Le terme d’ion précurseur caractérise tout ion sélectionné au


niveau SM-I pour effectuer une détermination de structure par acti-
vation collisionnelle en cellule de collision. Le terme d’ion produit
caractérise tout ion résultant de décompositions (et éventuelle- m/z = 149
ment de réactions) en cellule de collision.
La cellule de collision est placée sur le trajet des ions : deux SM - I CID
petits orifices permettent, en amont, aux ions précurseurs filtrés au balaie en masse m/z = 177
niveau SM-I de pénétrer dans la cellule ; en aval, aux ions produits

1 formés dans la cellule de collision de sortir de celle-ci pour être fil-


trés en masse au niveau SM-II. Cette cellule de collision, où règne
une pression de l’ordre de 10−3 à 10−5 Torr, est le siège de colli- m/z = 223
sions dissociatives ou de réactions entre les ions précurseurs et un
gaz inerte qui y est introduit. Le vide partiel est maintenu par un SM - II
système de pompage différentiel afin de ne pas interférer avec les balaie à une valeur fixée
conditions propres de fonctionnement des filtres de masse SM-I et m/z = 149
SM-II.
Nota : on rappelle que 1 Torr = 133,3224 Pa.
a spectre de l’ion précurseur de rapport m/z = 149

Le processus d’activation collisionnelle CID (Collision O


Induced Dissociation), qui est au cœur de la technique de spectro- m/z = 177
métrie de masse tandem, consiste à dissocier un ion sélectionné C+
par un premier filtre de masse par collision avec un gaz neutre
inerte. C OEt – CH
2 CH2
O O
Ce processus est schématiquement résumé dans les équations O
suivantes : C OEt C
Ionisation Activation O, H+
chimique collisionnelle
C OEt C
O
O O
avec M+ ion précurseur, C OEt m/z = 149
– OEt
M+* ion précurseur excité par collision avec G, – CH2 CH2
G gaz de collision, C OEt
m/z = 223 +
F+ ion produit, OH
N fragment neutre perdu lors de la collision.
b mécanismes de fragmentation conduisant à la formation
Un spectre d’ions produits définit le spectre de masse obtenu de cet ion dans le cas de la caractérisation du phtalate
par décomposition d’un ion précurseur sélectionné (SM-I a une de diéthyle en mode d’ionisation chimique positive
valeur fixée de m/z, SM-II balaie une gamme de masse correspon-
dant aux ions formés par dissociation).
Figure 2 – Spectre et mécanismes de formation de l’ion précurseur

Exemple : dans le cas de la figure 1, le spectre représenté au


niveau SM-II est le spectre d’ions produits de l’ion m/z = 223. notamment dus à la présence de composés parasites. En corréla-
tion directe avec le concept de sélectivité vient celui de limite de
Un spectre d’ions précurseurs définit le spectre de masse détection définie comme la quantité de produit qui résulte en un
obtenu pour un ensemble d’ions précurseurs donnant un même rapport signal sur bruit permettant d’affirmer avec une probabilité
ion produit sélectionné au niveau SM-II (SM-I balaie, SM-II a une donnée la présence du produit soupçonné (une valeur minimale
valeur fixée de m/z). égale à 3 est généralement admise pour ce rapport signal sur
bruit).
Exemple : dans le cas précédent de la caractérisation du phtalate
de diéthyle, le spectre d’ion précurseur de rapport m/z = 149 aurait
l’allure du spectre reporté sur la figure 2a en accord avec les méca- 1.3 Couplage
nismes de fragmentation qui conduisent à la formation de cet ion de
rapport m/z = 149 à partir des ions de rapport m/z = 223 et m/z = 177
(figure 2b). Le couplage d’un chromatographe à un spectromètre de masse
permet d’améliorer la détection en augmentant de fait la sélectivité
Un spectre de perte de neutres définit le spectre obtenu à de la technique d’analyse. Ainsi, le couplage CG-SM présente une
partir d’ions précurseurs qui perdent un même fragment neutre sélectivité accrue par rapport à une analyse par spectrométrie de
(SM-I balaie, SM-II balaie avec un décalage en masse correspon- masse simple SM. De la même façon, le couplage d’un chromato-
dant à la masse de ce fragment neutre). graphe en phase gazeuse à un spectromètre de masse de type tan-
dem permet, par rapport à la spectrométrie de masse tandem, et
La sensibilité définit la quantité minimale de produit détecté au dans le cas où un composé donné interfère dans un mélange avec
moyen de l’appareil utilisé. La capacité à détecter un composé d’autres composés de ce mélange, d’augmenter la sélectivité de
sous forme de traces dans un mélange est plus proprement définie l’analyse par l’introduction d’une étape supplémentaire de sépara-
par la sélectivité qui consiste en la capacité à extraire le signal d’un tion chromatographique. L’utilisation d’un spectromètre de masse
analyte de celui du bruit de fond (ou bruit chimique) du spectre tandem permet, par rapport au couplage simple CG-SM, d’obtenir
de masse. une information supplémentaire sous la forme d’un spectre d’acti-
Le bruit chimique est défini comme l’ensemble des signaux vation collisionnelle, dans le cas où la détermination de la masse
présents dans le spectre de masse au niveau de l’analyseur SM-I, moléculaire du composé recherché ou l’obtention d’un spectre de
avant sélection par un nouvel étage de masse SM-II, et qui sont masse ne suffit pas pour une identification univoque.

P 1 487v2 – 4 Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservés

88
Référence Internet
P1488

Couplage chromatographie
en phase gazeuse/olfactométrie
1
par Xavier FERNANDEZ
Docteur en Sciences, HDR
Maître de conférences à l’université de Nice-Sophia Antipolis
Directeur du Master 2 professionnel Chimie Formulation, Analyse, Qualité (FOQUAL).
Laboratoire de chimie des molécules bioactives et des arômes, Institut de Chimie de Nice
(ICN)
Katharina BREME
Docteur en Sciences
Collaboratrice scientifique à la station de recherche Agroscope Liebefeld-Posieux (ALP),
Division Analytique, Groupe « Arôme et Goût », à Berne, Suisse
et Vincent VARLET
Docteur en Sciences
Ingénieur Industries agroalimentaires (ENITIAA) Nantes

1. Présentation de l’instrument ................................................................ P 1 488 - 2


2. Évaluateurs................................................................................................. — 5
3. Extraction et préparation des échantillons ...................................... — 6
4. Représentativité des extraits ................................................................ — 7
5. Méthodes d’analyse ................................................................................. — 9
6. Traitement des données ......................................................................... — 11
7. Applications ............................................................................................... — 14
8. Systèmes de GC/O préparative ............................................................. — 17
9. Conclusions et perspectives ................................................................. — 17
10. Liste des acronymes ................................................................................ — 18
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 488
Parution : décembre 2009 - Dernière validation : octobre 2019

a chimie analytique est de plus en plus présente dans notre vie quoti-
L dienne. Le nombre de contrôles faits sur les produits que nous
consommons, mais également sur notre environnement, est en constante pro-
gression. La sécurité du consommateur et de la population est ainsi devenue
un enjeu majeur de notre société.
Cette multiplication des analyses réalisées a conduit à de nombreux progrès
en chimie analytique. L’automatisation des analyses a été grandement amé-
liorée et les limites de détection repoussées.
La mise en évidence, la caractérisation et la quantification des composés
odorants ont ainsi fortement progressé. La chromatographie en phase gazeuse
(GC) s’est imposée comme la technique de choix étant donné le caractère
volatil des composés odorants.
Un composé odorant présent dans un produit ou dans notre environnement
est caractérisé par sa concentration, sa note olfactive et son seuil de percep-
tion. Bien que les techniques de chromatographie en phase gazeuse classique

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie


est strictement interdite. – © Editions T.I. P 1 488 – 1

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COUPLAGE CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE/OLFACTOMÉTRIE _______________________________________________________________________

permettent de mettre en évidence et quantifier les composés odorants, il est


bien plus difficile de caractériser l’impact olfactif et le seuil de perception du
composé identifié.
Pour cela, le couplage chromatographie en phase gazeuse/olfactométrie
(GC/O) s’avère l’outil de prédilection. Cette technique chromatographique
utilise le nez humain en tant que détecteur sensoriel, la plupart du temps

1
associé à une détection physique classique. Il est alors possible d’identifier et
de quantifier les analytes et également de déterminer leurs notes et puissances
olfactives.
En respectant certaines précautions, l’analyste peut alors obtenir des résul-
tats répétables, reproductibles et quantitatifs.
Le couplage GC/O est ainsi fréquemment utilisé pour mettre en évidence les
composés aromatisants caractéristiques d’un aliment, d’un environnement, ou
pour détecter et identifier les composés responsables d’une mauvaise odeur.

1. Présentation chromatographique, un système de division permet de scinder le


flux en deux. Une partie de ce flux est dirigée vers le détecteur
de l’instrument physique, l’autre partie est envoyée vers un port de détection
olfactive.

La mise en place d’un couplage chromatographie en phase Ainsi, deux parties de l’instrument diffèrent du chromatographe
gazeuse/olfactométrie (GC/O) ne nécessite qu’une petite modifica- couramment rencontré : le système de division du flux et le port
tion d’un chromatographe en phase gazeuse. En sortie de colonne de détection olfactive (figure 1).

Détecteur à ionisation
Injecteur de flamme (FID) Joystick

CHROMATOGRAPHE EN PHASE GAZEUSE Olfactogramme (nez)

PORT OLFACTOMÉTRIQUE

Colonne capillaire

Air

Diviseur
d'effluents

Ligne
de transfert Eau
chauffée
Chromatogramme (détecteur physique)

Flux de gaz make-up

Le couplage GC/olfactométrie (GC/O) utilise le nez humain en tant que détecteur parallèlement à un détecteur physique : en sortie de colonne, le flux est
divisé en deux. Une partie est dirigée vers un détecteur physique (généralement un FID ou un spectomètre de masse, mais l'utilisation de tout autre détecteur
est possible), l'autre vers une ligne de transfert qui se termine dans un cône nasal. Une personne, appelée juge, panéliste ou sniffer (de l'anglais « to sniff »
pour renifler, sentir, flairer) y place son nez, sent les effluents et indique, selon les informations recherchées, l'absence/la présence d'odeur, la durée,
l'intensité et décrit sa perception. On obtient ainsi de façon synchrone un chromatogramme, généré par le détecteur physique, et un olfactogramme, généré
par le panéliste.

Figure 1 – Schéma d’un couplage GC/olfactométrie (GC/O) [1]

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P 1 488 − 2 est strictement interdite. − © Editions T.I.

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_______________________________________________________________________ COUPLAGE CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE/OLFACTOMÉTRIE

1.1 Système chromatographique utilisé La capacité est également un facteur important. Le flux étant
divisé en deux en sortie de colonne, la capacité de la colonne doit
Le système chromatographique utilisé est tout à fait classique. être augmentée pour assurer une bonne sensibilité.
Cependant, pour obtenir des résultats fiables et des mesures Tous ces critères conduisent à utiliser des colonnes de 30 à 60 m
d’intensités olfactives, il est nécessaire d’avoir recours aux chro- de longueur, de diamètres internes de 0,32 à 0,53 mm (pour aug-
matographes de dernières générations (munis de régulation élec- menter la capacité) et d’épaisseur de phase généralement
tronique du débit de gaz vecteur). comprise entre 0,4 et 0,52 µm.

1
Comme toutes les méthodes chromatographiques, la GC est Le choix de la phase stationnaire est dicté par la nature des
basée sur le principe de migration différentielle des constituants composés analysés. Il est cependant très rare de pouvoir séparer
de l’échantillon à travers une phase stationnaire. tous les composés d’un mélange complexe à l’aide d’une seule
phase stationnaire. Les colonnes apolaires (polydiméthylsiloxane,
Cet article n’a pas pour objectif de décrire le principe de la chro- PDMS) sont généralement choisies pour leur robustesse et leurs
matographie en phase gazeuse et l’utilisation de cette technique banques d’indices de rétention complètes [2] [3]. Les colonnes
dans l’analyse des composés odorants, pour cela le lecteur peut se polaires, plus thermosensibles, sont utilisées dans le cas de
référer à de nombreux ouvrages et revues [2] [3] [4]. composés très volatils.
Il apparaît cependant nécessaire de décrire l’instrument utilisé
dans le cadre d’un couplage avec un port de détection olfactive. 1.1.3 Détecteur
Tous les types de détecteurs (universels, spécifiques) peuvent
1.1.1 Injecteur être utilisés en parallèle au port de détection olfactive.
Le plus utilisé est le détecteur à ionisation de flamme (FID). Ce
L’introduction de l’échantillon constitue l’étape la plus critique
détecteur universel présente de nombreux avantages : sensibilité,
en chromatographie en phase gazeuse.
linéarité, rapidité, simplicité, prix [8].
Le couplage GC/O a suivi l’évolution de la GC avec l’utilisation Les détecteurs spécifiques, en particulier ceux au soufre ou à
quasi exclusive des colonnes capillaires caractérisées par leurs l’azote, peuvent se montrer très utiles dans l’analyse des odeurs.
faibles capacités. Il est donc bien souvent nécessaire d’injecter une En effet, les composés soufrés et/ou azotés présentent souvent des
faible quantité d’échantillon. Pour cela, l’injecteur avec ou sans seuils de perception très bas et sont caractérisés de composés à
division (split/splitless) est le plus utilisé. « impact olfactif » [9] [10]. Ainsi, même à faibles concentrations, ils
Très polyvalent, il permet en mode division (split) l’injection peuvent influencer parfois fortement l’odeur globale.
rapide de l’échantillon tout en réduisant la quantité introduite dans Pour les composés azotés, on utilise le plus souvent un détec-
la colonne à l’aide de la vanne de split. Même s’il présente teur thermoionique spécifique (TSD). Pour les composés soufrés,
quelques inconvénients (vaporisation incomplète, discrimination les détecteurs les plus utilisés sont le détecteur à photométrie de
des composés selon leur température d’ébullition), ce mode flamme (FPD) et son évolution à flamme pulsée (PFPD), ou le
d’injection est le plus simple [2] [3]. Il peut également se montrer détecteur à chimiluminescence (SCD) [3] [11].
intéressant dans le cas de l’utilisation de méthodes de dilution Le spectromètre de masse peut également représenter un détec-
(CHARM, AEDA, AECA, cf. § 5.2) en étant utilisé pour réaliser les teur de choix. Il permet alors d’identifier la structure des composés
dilutions [5] [6] [7]. éluant.
Pour les solutions diluées, la fermeture de la vanne de split pen- Il est cependant courant de mettre en évidence des composés
dant quelques dizaines de secondes (splitless) permet l’injection de odorants sans pour autant les détecter par spectrométrie de masse.
la plus grande partie de l’échantillon. Le nombre de paramètres à En effet, pour de nombreux composés volatils, le nez humain est
optimiser (temps de fermeture de la vanne de split, puis débit du gaz bien plus sensible que les détecteurs couramment utilisés.
vecteur, solvants d’injection, température initiale de la colonne)
rend ce mode d’injection plus difficile [2] [3]. Il peut cependant pré-
senter un intérêt particulier dans le cas d’études d’échantillons 1.2 Division de l’éluant
contenant des composés à fort pouvoir olfactif (seuils de perception et systèmes associés
bas). Dans ce cas, l’injection en mode split conduit à l’élimination
d’une grande partie de ces composés via la vanne de split dans le La division du flux en sortie de colonne est une étape critique.
laboratoire, ce qui peut gêner les évaluateurs. Elle fait le lien entre la colonne chromatographique et les deux
colonnes (capillaires creux) menant aux détecteurs. Ce lien doit
L’injecteur à température programmée de vaporisation (PTV) être étanche avec le moins de volumes morts possible.
présente de nombreux avantages qui en font un injecteur de choix
pour la GC/O. Grâce à sa cryofocalisation puis au chauffage rapide, De nombreux systèmes sont disponibles dans le commerce
il permet l’injection de volumes importants de liquide ou de gaz. Il (figure 2). Pour éviter toute recondensation, ils sont tous placés
permet ainsi la désorption thermique de piège d’espace de tête dans le four du chromatographe.
dynamique, technique d’extraction la plus sensible pour les
composés odorants [2] [3]. 1.2.1 Systèmes simples (diviseur en verre,
ferrules double trous...)
1.1.2 Colonnes Le système le plus simple est un diviseur en verre désactivé,
communément nommé « splitter en Y ». Les colonnes sont simple-
Les colonnes utilisées en GC/O sont presque exclusivement des ment rentrées dans chaque branche du Y. Pour assurer une
colonnes capillaires. Le choix de la colonne est dicté par de meilleure tenue des colonnes, il est possible de les fixer à l’aide
nombreux paramètres. d’une résine en polyimide. C’est un système sûr et simple qui doit
Comme pour toute analyse chromatographique, la colonne choi- cependant être changé lors de l’installation d’une nouvelle colonne
sie doit conduire à une résolution, une sensibilité, une reproducti- ou ligne de transfert.
bilité et une robustesse suffisantes. Cependant, contrairement à Il est également possible d’utiliser un connecteur simple à
l’analyse par GC/MS, le temps d’analyse est critique car les évalua- ferrules. Le raccord aux deux lignes de transfert est alors assuré par
teurs ne sont dans des conditions optimales que pendant un court une ferrule à double trou. Ce dispositif nécessite beaucoup d’habi-
laps de temps (20 à 30 min maximum). lité et doit être installé avec minutie, il n’est que rarement utilisé.

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Diviseur en verre Diviseur en « croix »


Système à ferrule
(nombreux fournisseurs, reproduit avec l'accord (nombreux fournisseurs, reproduit avec
double trou
de la société Supelco) l'accord des sociétés Gerstel et SGE)

Diviseur SGE (système ODO II) Carte microfluidique Agilent


(reproduit avec l'accord de la société SGE) (reproduit avec l'accord de la société Agilent)

Figure 2 – Présentation des systèmes de division de l’éluant

1.2.2 Systèmes fixes à ferrule Ce système très performant est néanmoins coûteux et n’entre
donc pas en compétition avec les diviseurs en « Y » ou en
Les systèmes fixes à ferrule, ou « en croix » sont les dispositifs « croix ».
les plus utilisés.
De nombreux fournisseurs les commercialisent. Ils se présentent 1.3 Ligne de transfert
le plus souvent sous la forme d’une croix à quatre branches fixée à
l’intérieur du four du chromatographe.
Le GC/O comporte en réalité deux lignes de transfert, une
La colonne rentre par l’une des branches et est fixée par un sys- menant au détecteur physique, l’autre au port de détection olfac-
tème écrou + ferrule. Les deux lignes de transfert sont fixées au tive. Dans les deux cas, le transfert d’éluant est assuré par un
système à l’aide du même dispositif. La 4e branche peut permettre capillaire creux (0,1 à 0,3 mm de diamètre).
l’entrée d’un gaz auxiliaire. Les branchements doivent être réalisés La synchronisation des temps de rétention est assurée par le
minutieusement pour limiter les volumes morts. Il n’est pas rare bon choix de la longueur et/ou du diamètre des deux capillaires. Il
d’observer de légères fuites sur ces systèmes, en particulier suffit pour cela d’utiliser un logiciel de type GC Pressure/Flow Cal-
lorsqu’un spectromètre de masse est utilisé comme détecteur. culator Software (http://www.chem.agilent.com/enUS/Sup-
port/Downloads/Utilities/Pages/GcPressureFlow.aspx) [12] [13]. En
fixant la longueur d’une des deux lignes de transfert et en indi-
1.2.3 Carte microfluidique quant la nature des capillaires des deux détecteurs et la méthode
chromatographique ainsi que les autres paramètres chromatogra-
Ce système très polyvalent, commercialisé par la société phiques comme la nature de la colonne, le gaz vecteur, le débit...,
Agilent®, est le plus récent. Il est basé sur la technologie du flux le logiciel calcule la longueur de la seconde ligne de transfert pour
capillaire. synchroniser les temps de rétention.
Il se présente sous la forme d’une carte qui peut comporter Comme pour toute ligne de transfert, il faut limiter les phéno-
jusqu’à huit vannes. Les tubulures sont gravées dans un film poly- mènes de recondensation. Cela est particulièrement important
mérique qui est mis en sandwich entre deux plaques en inox sur pour la ligne de transfert menant au cône nasal. De façon à assurer
lesquelles sont connectés les effluents. La division n’est donc plus une bonne ergonomie du poste de travail pour l’évaluateur, il est
mécanique, mais pilotée par le flux de gaz auxiliaire. L’entrée d’air courant qu’elle sorte du chromatographe de plusieurs dizaines de
et les volumes morts sont alors inexistants, et le rapport de split centimètres. Il faut alors veiller à ce que le dispositif soit chauffé
peut être piloté par le logiciel à travers l’EPC (Electronic Pressure car il n’est pas rare d’observer des odeurs rémanentes avec cer-
Control ). tains composés peu volatils comme la vanilline. Tous les systèmes

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commerciaux sont dotés d’une ligne de transfert chauffée, certains


sont à une température fixe, d’autres permettent de paramétrer Rail de déplacement de l'anneau mobile
cette température. connecté à un rhéostat de 195 mm
Signal lumineux
Anneau mobile Interrupteur
pour l'index
1.4 Port de détection olfactive
Anneau fixe

1
Le port de détection olfactive constitue la partie terminale du pour le pouce
système où l’évaluateur vient sentir les éluants. Il doit être
positionné de façon à permettre à l’évaluateur d’être dans une
position confortable.
Le cône nasal vient se positionner à la fin de la ligne de trans-
fert. Cette pièce en verre désactivé doit épouser la forme du nez.
Selon l’appareillage, de l’air humidifié est ajouté aux effluents Figure 3 – Schéma du prototype finger span [18]
arrivant dans le cône nasal (ou port sniffing ) afin d’éviter le dessè-
chement des muqueuses nasales. Différentes opinions existent sur
cet ajout d’air humidifié. Hanaoka et al. constatent en 2000 que 1.5.3 Finger span
l’air est nécessaire à la bonne perception. L’humidité, par contre,
serait sans importance [14]. Afin d’automatiser la saisie des intensités, d’autres systèmes ont
été développés, comme la résistance variable ou le rhéostat, afin
de rendre l’évaluation plus instinctive. En tournant une molette
1.5 Systèmes de mesure d’intensité graduée, le juge peut exprimer l’intensité odorante qu’il perçoit en
temps réel [18] [19].
odorante
Dans le même genre, le finger span apparaît plus efficace que
l’utilisation d’échelles assistées ou non d’opérateurs. Ce système
1.5.1 Systèmes simples repose sur une mesure de l’intensité proportionnelle à l’écarte-
(indication verbale, souris...) ment entre le pouce et l’index du juge [20]. Le pouce du juge est
placé dans un anneau fixé à l’appareil tandis que l’index du juge
La plus grande difficulté de l’olfactométrie est de traduire la per- est glissé dans un anneau mobile que le juge peut bouger le long
ception odorante résultant d’un stimulus ressenti par un juge en d’un rail de 195 mm. L’intensité perçue est directement exprimée
potentiel odorant de manière quantifiable. En effet, il faut définir en centimètres par l’écartement des doigts du juge : plus une
en premier lieu un référentiel commun pour tous les juges afin odeur est intense, plus le juge devra éloigner son index de son
d’exprimer leurs perceptions en intensité odorante en utilisant une pouce (figure 3).
même unité.
Ainsi, plusieurs systèmes de mesure d’intensité odorante ont été 1.6 Systèmes multipostes
développés pour quantifier le potentiel odorant perçu par les juges.
Ces systèmes, initialement très simples, se sont complexifiés avec Ce type de système consiste à diriger les effluents vers deux (ou
les développements technologiques et informatiques. plusieurs) cônes nasaux [21] [22]. Ainsi, plusieurs juges peuvent
« sniffer » en même temps sur une même analyse. Cela ne
Lors des premières études olfactométriques, l’intensité d’une constitue pas seulement un gain de temps important, mais amé-
odeur perçue par le juge était indiquée verbalement à un opéra- liore également la fiabilité des résultats : étant donné que tous les
teur. Puis, afin d’augmenter le consensus et le caractère significatif juges travaillent en même temps sur une même analyse, on évite
des réponses, les juges ont été entraînés à l’utilisation de des facteurs d’erreur tels que la réalisation des expériences à des
systèmes de notation sur des échelles variées. Le juge devait dic- moments différents de la journée, des variations entre deux
ter à un opérateur ou marquait directement son évaluation sur ces analyses, la détérioration de l’échantillon...
échelles. De nombreux types d’échelles ont ainsi été employés
comme des échelles de catégories ou des échelles constituées de Il est cependant nécessaire d’employer une technique de prépa-
lignes non structurées [15]. Les échelles de catégories pouvaient ration de l’échantillon adaptée et une colonne chromatographique
comporter trois classes dans leur version la plus simple, et allaient de plus grande capacité.
parfois jusqu’à cinq, voire neuf classes. De même, la longueur des De tels systèmes ne sont cependant pas encore commercialisés.
échelles non structurées est très variable selon les études. Le point Le plus grand système multiposte existant à ce jour en Europe est
essentiel reste l’entraînement obligatoire des juges pour assurer celui de l’équipe du Dr. Berdagué (INRA de Clermont-Ferrand). Il
l’homogénéité du panel envers l’utilisation de ces échelles. s’agit d’un système à huit voies (8W-GC/O) permettant à huit juges
Avec le développement de l’informatique, la mesure de l’inten- de sentir simultanément [22]. Tout système multiposte doit être
sité via l’utilisation d’échelles est devenue possible en utilisant la développé pour que tous les juges perçoivent la même quantité
souris de l’ordinateur avec une notation sur des échelles visuali- d’effluents en même temps. Il faut également développer un logi-
sées à l’écran d’un ordinateur d’appoint [16]. La présence d’un ciel permettant l’acquisition des données de plusieurs évaluateurs,
opérateur n’est alors plus requise. Cependant, même si la mesure comme par exemple le logiciel AcquiSniff® [22].
de l’intensité odorante est facilitée, un entraînement des juges à
l’utilisation de ce genre d’évaluation reste nécessaire.
2. Évaluateurs
1.5.2 Joystick
Les évaluateurs sont d’une importance capitale en GC/O. Véri-
Pour faciliter la mesure d’intensité des systèmes simples, des tables détecteurs de l’instrument, ils doivent être fiables, robustes,
mesures de type joystick ou bouton pressoir (buzzer ) ont égale- répétables et reproductibles. Leurs choix, entraînement et évalua-
ment été développées. L’enfoncement du bouton par le juge est tion doivent suivre un certain nombre de bonnes pratiques. Pour
proportionnel à l’intensité odorante qu’il perçoit [17]. cela, il est courant de suivre les recommandations données pour

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93
1

94
Référence Internet
P1489

Chromatographie en phase gazeuse à


deux dimensions : GC-GC et GCxGC
1
par Xavier FERNANDEZ
Docteur en Sciences, HDR
Maître de conférences
Directeur du Master 2 professionnel Chimie Formulation, analyse et qualité (FOQUAL)
Laboratoire de chimie des molécules bioactives et des arômes
Université de Nice-Sophia Antipolis
Institut de chimie de Nice, UMR CNRS 6001
Jean-Jacques FILIPPI
Docteur en Sciences
Maître de conférences
Laboratoire de chimie des molécules bioactives et des arômes
Université de Nice-Sophia Antipolis
Institut de chimie de Nice, UMR CNRS 6001
et Maud JEANVILLE
Assistante affaires réglementaires
Robertet SA

1. Introduction à la chromatographie gazeuse bidimensionnelle ... P 1 489 - 2


2. Historique : de la GC-GC à la GCxGC.................................................. — 3
3. GC-GC ou chromatographie en phase gazeuse
bidimensionnelle par « heart-cutting ».............................................. — 3
4. GCxGC ou chromatographie en phase gazeuse
bidimensionnelle intégrale .................................................................... — 8
5. GC-heart cut versus GCxGC : un choix nécessaire
ou une complémentarité ? ..................................................................... — 14
6. Conclusions et perspectives ................................................................. — 16
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 489

’analyse des composés volatils ou susceptibles de le devenir est de nos jours


L généralement réalisée par chromatographie en phase gazeuse essentielle-
ment sur colonnes capillaires. Malgré les progrès de cette technique, l’analyse
de certains mélanges peut s’avérer encore très délicate. Il peut s’agir de
mélanges très complexes comme les extraits naturels, huiles essentielles par
exemple, les produits pétroliers ou encore certains extraits environnementaux.
Ces extraits sont souvent caractérisés par la présence de très nombreux
constituants, à des concentrations variables. Dans de tels échantillons, les co-élu-
tions peuvent donc être très nombreuses, ce qui complique l’identification et la
quantification. Il peut ainsi s’avérer très difficile d’obtenir un spectre de masse,
suffisamment net pour permettre l’identification du constituant. Même l’utilisa-
tion en parallèle de colonne de nature différente n’est pas toujours satisfaisante.
Les techniques de chromatographie à deux dimensions consistent à séparer
les analytes sur deux colonnes de nature différente montées en série. En une
Parution : décembre 2011

seule analyse, il est alors possible d’augmenter de façon très importante le


pouvoir de séparation. Ces techniques se divisent en deux grandes familles :
GC-GC et GCxGC.

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CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE À DEUX DIMENSIONS : GC-GC ET GCXGC _____________________________________________________________

Liste des abréviations 1. Introduction


AED Atomic emission Détecteur à émission à la chromatographie
detector
Electron capture
atomique
gazeuse bidimensionnelle
ECD Détecteur à capture
detector d’électrons
L’analyse des mélanges complexes (échantillons environnemen-

1 EPC Electronic pressure Contrôle électronique taux, coupes pétrolières, extraits naturels) en chromatographie en
control de pression phase gazeuse est un réel challenge pour l’analyste. Ces échantillons
sont bien souvent trop complexes pour être entièrement séparés sur
FID Flame ionisation Détecteur à ionisation une seule phase stationnaire. De plus, très souvent, les composés
detector de flamme présents à l’état de traces co-éluent avec des analytes très abondants.
GC Gaz chromatography Chromatographie Les travaux de Giddings [1] illustrent parfaitement ce phéno-
en phase gazeuse mène. Les colonnes capillaires modernes possèdent plus de 100 000
plateaux théoriques. Cependant, si on veut séparer avec une proba-
GC-GC – Chromatographie bilité de séparation de 0,99 un mélange de 100 constituants, il est
en phase gazeuse nécessaire d’employer une colonne de 500 millions de plateaux [2].
à deux dimensions L’utilisation de détecteurs spécifiques peut, en partie, apporter une
par heart-cutting solution, mais si l’objectif est d’obtenir un spectre de masse sans pol-
GCxGC – Chromatographie lution pour une analyse qualitative, le problème persiste. Pour le
en phase gazeuse résoudre, la mise en place de deux séparations consécutives sur deux
bidimensionnelle colonnes de nature différente est une alternative intéressante.
intégrale Selon l’équation de Purnell [3], la résolution (Rs ) en chromato-
graphie est définie par :
GC-MS Gaz chromatography/ Couplage
Mass spectrometry chromatographie Nb  α − 1  kb 
Rs =
4  α   1 + kb 
en phase gazeuse/
spectrométrie de masse
Dans cette équation :
GC-O Gaz chromatography/ Couplage
Olfactometry chromatographie • Nb est le nombre de plateaux théoriques associés à l’analyte
en phase gazeuse/ le plus retenu, défini par :
olfactométrie Nb = 16 (t R /w )2 = 5, 54 (t R /w h /2 )2
LMCS Longitudinally Système cryogénique avec tR temps de rétention du composé considéré,
modulated cryogenic de modulation
system longitudinale w largeur du pic à la base,
wh/2 largeur à mi-hauteur,
MS Mass spectrometry Spectrémetrie
de masse • α est le facteur de sélectivité entre 2 composés, selon
αa,b = ka/kb,
NCD Nitrogen Détecteur d’azote • kb est le facteur de capacité de l’analyte le plus retenu, défini
chemiluminescence à chimiluminescence par :
detector
kb = (tR ,b − tM ) /tM
PCB Polychlorinated Biphényls polychlorés
biphenyls et par :
PCDD Polychlorodi- Dibenzo-p-dioxines k b = K b · 4 · d f /d c
benzo-p-dioxines polychlorées avec tM temps mort,
PDMS – Polydiméthylsiloxane Kb coefficient de partage (concentration analyte phase
stationnaire/concentration analyte phase mobile),
PEG – Polyéthylèneglycol df épaisseur de phase stationnaire,
POP – Polluants organiques dc diamètre de la colonne.
persistants La résolution est donc dépendante de la racine carrée du
PTV Programmable Injecteur à program- nombre de plateaux théoriques N, de la sélectivité α, ainsi que du
temperature vaporizer mation de température facteur de capacité k. Ainsi, pour améliorer la résolution, il est pos-
sible d’augmenter la longueur de la colonne. Cependant, doubler
qMS Quadrupole mass Spectromètre la longueur de colonne (donc le nombre de plateaux théoriques)
spectrometer de masse à analyseur n’entraîne qu’une augmentation de la résolution d’un facteur 2 .
quadripolaire
Une épaisseur de phase stationnaire plus importante conduit à
SCD Sulfur Détecteur de soufre un temps de rétention accru, donc à un facteur de capacité k plus
chemiluminescence à chimiluminescence élevé, mais le terme k /(1 + k ) tend vers 1, ce qui illustre bien que k
detector n’a que très peu d’effet sur la résolution Rs .
SSL Split splitless Injecteur avec ou sans Une autre approche consiste alors à augmenter la sélectivité α du
division système, et cela peut être obtenu par le couplage de deux colonnes
de sélectivité différente. La chromatographie bidimensionnelle est
TOFMS Time-of-flight mass spec- Spectromètre de masse donc basée sur ce principe et aboutit généralement à un gain impor-
trometer à temps de vol tant en résolution car, en théorie, le pouvoir de résolution totale

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______________________________________________________________ CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE À DEUX DIMENSIONS : GC-GC ET GCXGC

RTOT du système bidimensionnel est égal au produit des résolutions


respectives des deux colonnes employées, soit RTOT = Rs1 × Rs2 . Chromatographie classique (1D-GC)
De même, quand un mélange est séparé sur deux colonnes dif-
férentes, la capacité de pic totale correspond au produit des capa-
cités de pic des deux colonnes, ce qui représente évidemment un Chromatographie bidimensionnelle « heart-cutting » GC (GC-GC)
gain de séparation important, le nombre maximal de composés
que chaque colonne peut séparer est nc,TOT = nc1 × nc2 .

1
Pour maximiser ce gain, il est donc nécessaire d’utiliser des
colonnes où les séparations sont basées sur des phénomènes phy-
sico-chimiques différents, on utilise alors le terme de « colonnes
orthogonales ».
La plus ancienne technique de chromatographie bidimension-
nelle consiste à transférer une ou plusieurs fractions cibles parmi
les analytes séparés sur la première colonne vers une seconde Chromatographie bidimensionnelle intégrale (GC×GC)
colonne. Cette technique est nommée « GC par prélèvement à
cœur », plus communément « heart-cut two-dimensional GC » et
se note GC-GC.
Pour la seconde technique, bien plus récente, « GC bidimension-
nelle intégrale (ou totale) » (« comprehensive two-dimensional
GC »), notée GCxGC, le principe est bien différent ; l’ensemble de
l’échantillon, après élution dans la première colonne, est soumis à
une séparation sur la seconde colonne.

Figure 1 – Illustration des principes mis en jeu en chromatographie


gazeuse classique (1D-GC) et bidimensionnelle (GC-GC et GCxGC)
2. Historique : de la GC-GC
à la GCxGC Depuis maintenant plus de 15 ans, de nombreuses revues ayant
pour sujet la GCxGC ont été publiées [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13]
La chromatographie en phase gazeuse à une seule dimension [14] [15] [16] [17]. Au départ, celles-ci traitaient particulièrement
(1D-GC ou tout simplement GC) est utilisée de façon routinière, des principes de la technique, de la théorie et, bien sûr, de l’équi-
pour analyser des composés volatils, dans des mélanges plus ou pement utilisé. Puis, la connexion des deux colonnes chromatogra-
moins complexes. Lorsqu’elle est couplée avec un détecteur uni- phiques est devenue une problématique clé. La plupart des
versel tel qu’un détecteur à ionisation de flamme (FID) ou encore premières applications publiées concernaient le domaine de l’ana-
un spectromètre de masse, chaque composé détecté peut être lyse pétrochimique [14], le FID étant utilisé pour la détection [18].
quantifié voire identifié. Cependant, la nature complexe de certains Ces dernières années, de grandes avancées ont été obtenues, en
échantillons requiert souvent une analyse de longue durée, et une termes de détection, d’identification et de quantification d’ana-
séparation complète de tous les constituants est parfois impos- lytes, mais surtout en termes d’applications. De nos jours, l’ana-
sible. En effet, des phénomènes de co-élution des analytes lyse par GCxGC trouve particulièrement sa place dans les
peuvent entrer en jeu et sont autant d’obstacles à une analyse qua- domaines tels que l’agro-alimentaire, la biologie, l’analyse de l’air
litative et quantitative complète, malgré l’utilisation de techniques et l’environnement [14] [15].
analytiques puissantes, telles que la spectrométrie de masse.
Pour résoudre les problèmes liés à la co-élution des pics, la
chromatographie gazeuse bidimensionnelle (GC-GC) est apparue
dans les années 1960 [4]. Cette technique consiste à coupler en 3. GC-GC ou chromatographie
série deux colonnes chromatographiques de sélectivité différente
afin d’améliorer la séparation. Le dispositif permet généralement
en phase gazeuse
de recueillir une fraction non résolue, à l’issue de la première
colonne, pour la réinjecter dans la seconde. La GC-GC utilise la
bidimensionnelle
méthode du « heart-cutting » [5], c’est-à-dire que la fraction de
l’échantillon mal résolue dans la première colonne est prélevée
par « heart-cutting »
pour être séparée dans la seconde. Cette technique nécessite donc
L’étude la plus ancienne publiée en GC-GC décrit un système à
l’installation, entre les deux colonnes, d’un système relativement
base de vannes pour connecter les deux colonnes et fractionner
complexe de vannes, de circuits de contre-pression ou de trappes
les effluents [19] [20]. Les vannes étaient des multiports métalli-
cryogéniques, permettant de dévier la ou les fractions sélection-
ques, ce qui ne permettait pas d’éviter les problèmes liés à l’activa-
nées vers la seconde colonne. La GC-GC permet le plus souvent
tion à la surface du métal, néfaste à la reproductibilité des
d’améliorer grandement le pouvoir de séparation et la résolution
analyses. De plus, les volumes morts pollués et les effets de pié-
des pics dans les fractions sélectionnées. En revanche, cette tech-
geage à froid réduisaient encore l’efficacité en conduisant à des
nique est limitée à l’analyse de quelques régions critiques du chro-
élargissements de pics.
matogramme et le temps d’analyse est rallongé en conséquence.
De nouveaux développements dans le domaine de la GC-GC ont Les travaux publiés par Deans en 1968 [4] marquent un tournant
permis d’aboutir, au début des années 1990, au développement de important pour la GC-GC. Ils introduisent un système de
la chromatographie gazeuse bidimensionnelle intégrale (GCxGC) commutation de vannes ou à déviation de flux utilisant un contrôle
par Phillips et Liu [6]. L’amélioration majeure provient du fait que de la pression.
la totalité de l’échantillon est soumise aux potentiels de séparation En utilisant un débit de gaz vecteur contrôlé au niveau de l’injec-
des deux colonnes chromatographiques. C’est probablement l’une teur et de la sortie de la colonne, les différentes fractions sont diri-
des avancées les plus prometteuses dans le domaine de la chro- gées vers la seconde colonne ou écartées vers une poubelle.
matographie en phase gazeuse (GC) depuis la découverte des Plusieurs instruments sont alors commercialisés sur ce principe [5]
colonnes capillaires (voir § 4.1) (figure 1). [21]. Les systèmes les plus performants sont dédiés et utilisent des

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CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE À DEUX DIMENSIONS : GC-GC ET GCXGC _____________________________________________________________

configurations à deux fours. Cependant, leur fonctionnement


demeure complexe et manuel, ce qui limite leur développement. Gaz vecteur
Un contrôle approximatif de la pression constitue alors le principal
problème de la technique car il ne permet pas d’assurer une bonne Injecteur
répétabilité au niveau des temps de rétention et donc d’assurer Gaz vecteur
des « cuts » efficaces.
Vanne de transfert
Ce problème a été résolu grâce à l’apport des systèmes Splitter

1
modernes de régulation électronique du débit du gaz vecteur (EPC,
Electronic Pressure Control ). De plus, l’apparition de logiciels de
pilotage conviviaux a grandement favorisé le développement de la
Colonne Colonne
technique [5]. primaire secondaire
Détecteur Détecteur
3.1 Définitions et principe 1 2
a système avec transfert direct du « heart cut »
En GC-GC, une partie de l’effluent de la première colonne est
soumis à une autre séparation au moyen d’une seconde colonne Gaz vecteur
dont la phase stationnaire possède une sélectivité différente.
La clé d’un système GC-GC est l’interface qui relie les deux Injecteur
Gaz vecteur
colonnes et qui permet d’envoyer la fraction d’élution désirée de la Pièges
première vers la seconde. Comme les deux colonnes ont globa-
lement la même capacité de pics, le temps d’analyse sur chaque Splitter
colonne est à peu près identique. C’est pourquoi, seules quelques
fractions de la première colonne peuvent être analysées à l’aide de Vannes
la seconde dans le temps nécessaire à une élution complète de de transfert
Colonne Colonne
l’échantillon sur la première colonne.
primaire secondaire
Différents développements ont permis d’augmenter le nombre de Détecteur Détecteur
fractions analysées sur la seconde dimension. Cela passe par l’utilisa- 1 2
tion de micro-pièges montés en parallèle pour conserver les effluents
b configuration avec plusieurs pièges en parallèle
de la première colonne avant analyse sur la seconde. Pour permettre
cela, la capacité de pic de la seconde colonne est souvent diminuée
pour diminuer le temps d’analyse sur la seconde dimension. Gaz vecteur Colonnes
secondaires
multiples
3.2 Équipement Injecteur
Vannes
de transfert
Le cœur du dispositif en GC-GC est l’interface qui permet de
relier les deux colonnes [5] [21]. On distingue généralement les Splitter
interfaces off-line des interfaces on-line.
Dans les systèmes off-line, la collection des fractions issues de la Détecteurs
première colonne avant re-injection vers la seconde est manuelle. Colonne multiples
Cela peut sembler relativement simple à réaliser, mais il est souvent primaire en parallèle
difficile de conserver des composés volatils et la génération d’arté-
facts est souvent importante. De plus, la répétabilité du piégeage c configuration avec plusieurs colonnes secondaires en parallèle
manuel est faible et l’automatisation difficilement réalisable.
On utilise donc plus avantageusement les systèmes on-line. Figure 2 – Différentes configurations de GC-GC on-line
Dans ce type de système, la collecte et le transfert des fractions
entre les colonnes sont réalisés par un système automatique de
division de flux via des dispositifs de switching mécanique ou par mérique a fait l’objet de l’étude : colonne 1 apolaire ou polaire,
contre-pression. La répétabilité y est grandement améliorée et colonne 2 chirale [23].
l’apparition d’artéfact considérablement réduite (figure 2).
Les deux colonnes peuvent se trouver dans le même four, elles
fonctionnent alors à la même température, ou dans deux fours dif-
3.2.1 Injecteurs et colonnes férents à des températures différentes.
Les systèmes GC-GC sont munis d’injecteurs classiques de GC. Cette dernière configuration permet une meilleure séparation et
C’est donc communément l’injecteur split-splitless (SSL) qui est le conduit à de meilleures résolutions. Cependant, cela nécessite un
plus souvent utilisé. Cependant, on retrouve dans certaines appli- investissement plus important.
cations l’utilisation d’injecteurs à programmation variable de tem-
pérature PTV (Programmable Temperature Vaporizer ) ou Ces systèmes présentent néanmoins de nombreux avantages :
d’injecteurs on-column [22]. – les colonnes dont les phases stationnaires peuvent être
Les colonnes utilisées sont des colonnes capillaires de dimen- soumises à haute température pourront donc être couplées avec
sions classiques, dont les longueurs sont comprises entre 10 et d’autres colonnes plus sensibles. Exemple : colonne 1 en polydimé-
50 m, les diamètres internes de 0,1 à 0,32 mm avec des épaisseurs thylsiloxane (PDMS), température maximale 320-350 oC et colonne
de phase stationnaire variant de 0,1 à 0,5 µm. Il est désormais cou- 2 en polyéthylèneglycol (PEG), température maximale 250-270 oC ;
rant d’utiliser une colonne plus courte sur la seconde dimension. – il est possible de maintenir les deux colonnes à deux tempéra-
Les phases utilisées sont généralement orthogonales avec tures indépendantes, ce qui permet une bonne précision sur les
comme configuration la plus classique : colonne 1 apolaire et indices de rétention ;
colonne 2 polaire. De nombreuses applications ont été publiées, – la possibilité de travailler à la température optimale pour
dans le cas d’analyses de composés chiraux, dont l’excès énantio- chacune des deux colonnes.

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Couplages chromatographiques
avec la spectrométrie de masse. I
par Patrick ARPINO 1
Directeur de recherches, CNRS ENSCP (École Nationale Supérieure de Chimie de Paris)
Ancien Président de la Division de chimie analytique, Société Française de Chimie

1. Situation actuelle..................................................................................... P 1 490 - 4


2. Architectures des couplages ................................................................ — 4
2.1 Classique, source d’ions sous vide ............................................................ — 4
2.2 Moderne, source à pression atmosphérique ............................................ — 4
3. Méthodes chromatographiques concernées .................................... — 5
3.1 Problèmes liés aux phases chromatographiques ..................................... — 5
3.2 Question d’un détecteur chromatographique auxiliaire .......................... — 5
4. Conditions de vide dans le spectromètre de masse ...................... — 6
4.1 Dispositif classique de pompage du vide.................................................. — 6
4.2 Influence de la nature des gaz évacués ..................................................... — 6
4.3 Ensembles à ligne unique de pompage du vide....................................... — 6
4.4 Ensembles à multiples lignes de pompage du vide
(pompage différentiel) et source d’ions sous vide ................................... — 7
4.5 Ensembles à pompage différentiel et source sous vide intermédiaire
(thermospray ) .............................................................................................. — 7
4.6 Ensembles à multiples lignes de pompage du vide avec source
à pression atmosphérique .......................................................................... — 7
4.6.1 Interface de raccordement à la méthode séparative ....................... — 9
4.6.2 Chambre à pression atmosphérique................................................. — 9
4.6.3 Zones d’échantillonnage et de dissociation des clusters.
Collisions induites dans la source..................................................... — 9
4.6.4 Zones de guidage ............................................................................... — 10
5. Méthodes d’ionisation en spectrométrie de masse ....................... — 10
5.1 Méthode d’ionisation dure : l’ionisation électronique (EI) ....................... — 11
5.2 Méthodes d’ionisation douces (CI, APCI, ESI) ........................................... — 12
6. Analyseurs de masses ............................................................................ — 12
7. Détecteurs d’ions..................................................................................... — 12
8. Informatique de pilotage et de dépouillement des données ....... — 13
8.1 Restitution de l’information chromatographique ..................................... — 13
8.1.1 Balayages répétés de spectres complets.......................................... — 13
8.1.2 Détection sélective d’un ou plusieurs ions (SIM) ............................ — 15
8.1.3 Détection sélective d’une transition métastable (SRM, MRM) ....... — 15
8.2 Algorithmes de purification des spectres de masse................................. — 15
8.3 Déconvolution de signaux chromatographiques insuffisamment
séparés par la colonne ................................................................................ — 16
8.4 Analyse qualitative. Identification .............................................................. — 16
8.5 Analyse quantitative. Dosage ..................................................................... — 17
9. Conclusion ................................................................................................. — 17
Références bibliographiques ......................................................................... — 17

Pourquoi ? e principe même de la chromatographie est de séparer les constituants d’un


L mélange à analyser. La colonne chromatographique retarde sélectivement
Parution : septembre 2007

la progression des solutés qui, lorsque la séparation est réussie, débouchent en


ordre successif à la sortie de la colonne.

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COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE. I _____________________________________________________________________

L’instrumentation moderne est confrontée à des analyses de plus en plus


complexes, liées au nombre important de constituants présents et aux quantités
extrêmement faibles à détecter. En outre, ces analyses doivent être de plus en
plus rapides et automatisables afin de livrer les résultats pour un très grand
nombre d’échantillons.
Les exemples classiques de milieux complexes présentant ces caractéristiques

1
sont les milieux biologiques en général, les coupes pétrolières, les huiles essen-
tielles, les polluants atmosphériques. Il n’est pas rare de vouloir identifier et
quantifier dans le mélange un seul produit, présent en traces représentant une
partie par milliard (ppb) de l’échantillon total.
Les applications sont innombrables et touchent de larges secteurs économiques,
tels le contrôle de qualité de produits industriels, la répression des fraudes, le
contrôle antidopage, celui de l’environnement, ....

Si la chromatographie permet, à elle seule, de séparer correctement les dif- Comment ?


férents constituants d’un mélange, il est néanmoins délicat de se livrer à une
interprétation structurale permettant une identification certaine car les paramè-
tres déduits de la rétention sélective des solutés, au travers de la colonne, sont
souvent lourds à manier et, dans la plupart des cas, reliés de manière complexe
et indirecte aux structures moléculaires organiques.
L’idée de coupler une autre méthode physique d’investigation, après sépara-
tion chromatographique, dans le but d’ajouter à la chromatographie une
deuxième dimension analytique s’est concrétisée dès 1960 dans la combinaison
entre la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse
(GC-MS).
Le couplage entre la chromatographie en phase liquide et la spectrométrie de
masse (LC-MS) n’a été étudié qu’à partir de 1974, en raison principalement de
difficultés techniques bien plus élevées. La mise au point de sources d’ionisation
à pression atmosphérique pour la spectrométrie de masse, à partir de 1986, a
permis de lever la plupart des obstacles au développement de la LC-MS.
La recherche de méthodes d’analyse rapides permettant de traiter un nombre
accru d’échantillons, ainsi que la nécessité parfois d’un contrôle continu en
temps réel ont également poussé au développement de méthodologies rapides
intégrées dans laquelle l’étape chromatographique est, soit accélérée, soit
purement éliminée et remplacée par des procédés automatiques de manipula-
tion d’échantillon.
Ces méthodes séparatives sont généralement associées à l’ensemble des
méthodes chromatographiques et peuvent souvent être raccordées à la spec-
trométrie de masse.

Cette explosion de méthodologies récentes rend plus difficile d’en exposer les Et demain ?
caractéristiques dans un chapitre unique. Beaucoup de méthodes séparatives
ont des caractéristiques instrumentales très différentes, tant du point de vue des
appareillages que des substances chimiques manipulées.
La spectrométrie de masse s’est également diversifiée, en fonction des per-
formances visées, en une multitude de technologies distinctes. Il n’est plus
d’actualité de chercher à concevoir « l’interface » permettant de raccorder une
méthode séparative particulière à un même spectromètre de masse.
Ce premier chapitre regroupe les caractères communs à beaucoup de méthodes
couplées, observés essentiellement du point de vue de la spectrométrie de masse.
Les chapitres suivants se focaliseront sur le couplage à une classe particulière de
méthode séparative : GC-MS, LC-MS, SFC-MS, autres couplages.

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____________________________________________________________________ COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE. I

(0)

Notations et abréviations* Notations et abréviations*


APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (Ionisation MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry
chimique à pression atmosphérique) (spectrométrie de masse à ionisation par désorption
laser à partir d’une matrice)
API Atmospheric Pressure Ionisation (Ionisation à pression
atmosphérique) MCP Multi Channel Plates (galettes de micro canaux)

1
APPI Atmospheric Pressure Photo-ionisation (Ionisation à MEKC Micellar Electro Kinetic Chromatography (électrochro-
pression atmosphérique par des photons) matographie micellaire)
CE Capillary Electrophoresis (électrophorèse capillaire) MI Membrane Introduction (introduction au travers d’une
membrane)
CEC Capillary Electro-Chromatography (électrochromatogra-
phie capillaire) MS Mass Spectrometry (spectrométrie de masse)
CEI Charge Exchange Ionisation (Ionisation par échange de MS-MS Mass Spectrometry-Mass Spectrometry (spectrométrie
charges) de masse en tandem, combinant deux ou n analyseurs :
CI Chemical ionisation (Ionisation chimique) MSn)

CID Collision Induced Dissociation (dissociation d’ion induite SFC Supercritical Fluid Chromatography (chromatographie
par des collisions) en phase supercritique)

CITP Capillary Isotachophoresis (isotachophorèse capillaire) SFC-MS Combined Supercritical Fluid Chromatography – Mass
Spectrometry (couplage chromatographie en phase
EC Electron Capture Ionisation (Ionisation par capture supercritique – spectrométrie de masse)
d’électron)
SIMS Secondary Ion Mass spectrometry (Ionisation par émis-
EI Electron ionisation (Ionisation électronique) sion ionique secondaire)
ESI Electrospray Ionisation (Ionisation electrospray) SPE Solid Phase Extraction (extraction en phase solide)
FAB Fast Atom Bombardment (bombardement, par des ato- SPME Solid Phase Micro-Extraction (microextraction en phase
mes accélérés, d’échantillons en solution dans une solide)
matrice)
TOF/MS Time Of Flight Mass Spectrometry (spectrométrie de
FI Field Ionisation (Ionisation de champ) masse à temps de vol)
FIA Flow Injection Analysis (injection directe dans un flux) TS Thermospray
FT/MS Fourier Transform/Mass Spectrometry (spectromètre de UV détecteur Ultraviolet pour la chromatographie liquide
masse à Transformée de Fourier)
Autres abréviations dans le texte
GC Gas Chromatography (chromatographie en phase
gazeuse) dc diamètre interne d’une colonne capillaire
GC-MS Combined Gas Chromatography – Mass Spectrometry ef épaisseur du film de phase stationnaire sur la paroi
(couplage chromatographie en phase gazeuse – spectro- interne d’une colonne capillaire
métrie de masse). GC-MS-MS dans le cas d’analyseurs
en tandem M masse moléculaire d’un analyte
HPLC High Performance Liquid Chromatography (Chromato- MC Mass Chromatogram (chromatogramme de masse)
graphie liquide haute performance)
MCx chromatogramme de masse de l’ion à m/z = x
ICP Inductively Coupled Plasma ionisation (Ionisation par
plasma induit) MRM Multiple Reaction Monitoring (suivi alterné de plusieurs
transitions métastables ; voir SRM)
ICP-MS Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry (Ioni-
sation par plasma induit couplé à la spectrométrie de m/z nombre sans dimension mesurant le rapport de la
masse) masse d’un ion (en unités atomiques) à son nombre de
charges
ID/MS Isotope Dilution Mass Spectrometry (dosage par dilution
isotopique) Ni Numéro d’ordre d’un spectre de masse parmi la série
des spectres acquis en mode répétitif
LD Laser Desorption (désorption par laser)
ppb part per billion (partie par milliard, 10–9)
LC Liquid Chromatography (chromatographie en phase
liquide) SIM Selective Ion Monitoring (détection sélective d’un ion)
LC-MS Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (couplage SRM Single Reaction Monitoring (détection ou suivi sélectif
chromatographie liquide – spectrométrie de masse) d’une transition métastable)
LI Laser Ionisation (Ionisation par laser) TIC Total Ion Current (courant ionique total)
LTQ Linear Trapping Quadrupole (trappe linéaire quadripo- tr temps absolu de rétention d’un soluté issu d’une
laire) colonne chromatographique
LSIMS Liquid SIMS (Ionisation, par bombardement d’ions TPN conditions normales de température (0 oC) et de pres-
accélérés, d’échantillons en solution dans une matrice) sion (1 atm)
* Conventions * Conventions
Les abréviations du chapitre sont celles dérivées des expressions anglai- Les abréviations du chapitre sont celles dérivées des expressions anglai-
ses, car elles sont majoritaires dans les articles cités en référence. ses, car elles sont majoritaires dans les articles cités en référence.
Le symbole du couplage d’éléments physiques est “-”, e.g. GC-MS, Le symbole du couplage d’éléments physiques est “-”, e.g. GC-MS,
LC-MS,... ; la barre oblique “/” est réservée à la réunion en ligne de métho- LC-MS,... ; la barre oblique “/” est réservée à la réunion en ligne de métho-
des opératoires, e.g. ESI/MS, FT/MS, TOF/MS. Les deux sont combinables des opératoires, e.g. ESI/MS, FT/MS, TOF/MS. Les deux sont combinables
dans une même abréviation, e.g. GC-CI/MS, LC-ESI/MS. dans une même abréviation, e.g. GC-CI/MS, LC-ESI/MS.

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COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE. I _____________________________________________________________________

1. Situation actuelle être complexe, d’où parfois son prix élevé jusqu’à être très supé-
rieur à la simple addition des deux parties (quelquefois dans des
proportions considérables).
Depuis la version de cet article en 1985 [32], le rôle de la spec- Cette notion d’interface distincte est beaucoup plus floue dans
trométrie de masse s’est considérablement généralisé, comme les appareils intégrés modernes.
déjà évoqué dans la précédente mise à jour en 1997 [33].
On parle de couplage en ligne (on-line coupling ) lorsque l’opé-
Plus que la simple addition de deux méthodes analytiques perfor- rateur n’intervient à aucun moment entre le dispositif chromato-

1
mantes, l’intégration et la miniaturisation des deux composantes graphique et la source du spectromètre de masse. Ce type de
ainsi réunies ont abouti à des systèmes entièrement nouveaux, très couplage se retrouve dans la majorité des systèmes commerciaux
performants pour l’analyse chimique et qui se sont rapidement impo- actuels.
sés dans tous les laboratoires d’analyse et de contrôle. En témoi-
gnent les nombreux articles du volume « Analyse et Caractérisation » Des modes de couplages discontinus (off-line coupling ) sont
des Techniques de l’Ingénieur qui décrivent le couplage d’une parfois mis en œuvre lorsqu’il n’existe aucun moyen réaliste
méthode chromatographique particulière à la spectrométrie de d’effectuer une transition directe. L’opérateur, ou un robot, doit
masse de [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45]. intervenir pour effectuer une manipulation, par exemple évaporer
un solvant, effectuer une extraction ou la préparation d’un dérivé,
avant de passer à l’étape suivante. C’est le cas des méthodes
La plupart des méthodes d’analyses et de contrôle basées sur chromatographiques sur des supports planaires, ou des méthodes
une méthode de séparation chromatographique utilisent désor- de spectrométrie de masse par désorption d’une surface ou d’une
mais un spectromètre de masse comme détecteur. C’est parti- matrice solide (MALDI).
culièrement flagrant dans l’industrie pharmaceutique où les
méthodes classiques de dosage utilisant la chromatographie en
phase liquide avec détection dans l’UV sont en passe d’être
substituées par des méthodes LC-MS. 2.1 Classique, source d’ions sous vide

Même en se limitant aux articles décrivant surtout le montage La figure 1 est un schéma simplifié de la plupart des GC-MS
expérimental du couplage plutôt que le résultat d’une application actuels et des premiers systèmes LC-MS qui, en voulant adhérer à
particulière, leur nombre est considérable, de même que les ouvra- ce modèle, ont souvent abouti à des impasses.
ges généraux et seuls les plus récents sont cités ici : [1] [2] [3] [4] [5] La source d’ions se trouve sous vide et le principal problème
[6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13]. d’interfaçage consiste à y raccorder la colonne chromatographique.
Le petit fascicule de Sparkman [14] donne une longue liste de Dans les systèmes GC-MS modernes, et pour certains types de
références d’ouvrages généraux, de sites Internet, d’adresses de colonnes, l’interface peut être extrêmement simple, voire quasi
fournisseurs de matériels et de logiciels permettant d’aiguiller son absente.
choix parmi cette vaste littérature.

2.2 Moderne, source à pression


2. Architectures des couplages atmosphérique
Le développement de la source d’ions à pression atmosphérique
Un couplage chromatographie-spectrométrie de masse (figure 2), ou « source API », (Atmospheric Pressure Ion Source ),
consiste à réaliser un appareillage, ou une méthodologie analy- introduite par Horning et coll. ([15] [16]) dès le milieu des années
tique, permettant de réunir en série plusieurs sous-ensembles 1970, et constamment perfectionnée depuis, a dédoublé le pro-
traversés successivement par les échantillons à analyser. blème de l’interfaçage physique situé entre la colonne et le spec-
tromètre de masse (figure 1), vers une première interface entre la
colonne et la source d’ions (figure 2, Interface 1), et une seconde,
La réunion de la partie chromatographique au spectromètre de entre la chambre à pression atmosphérique et l’entrée du spectro-
masse pose un ensemble de problèmes spécifiques, absents lorsque mètre de masse (figure 2, Interface 2) qui nécessite de pouvoir
chacun est utilisé indépendamment. L’idéal est de trouver au final un échantillonner des ions formés sous 105 Pa, vers l’analyseur sous
compromis permettant à chaque élément de fonctionner dans ses 10–2 à 10–4 Pa (selon les analyseurs), soit une différence pouvant
conditions optimales. atteindre 9 ordres de grandeur à réaliser le long d’une trajectoire
Classiquement, conception et réalisation de l’interface se sont linéaire de quelques dizaines de centimètres, tout en rejetant un
longtemps traduites par l’ajout d’un troisième élément pouvant débit important de vapeurs gazeuses.

Méthode séparative Spectromètre de masse

Fluide Pompage
vecteur du vide

Préparation
Injection Colonne Interface Source Analyseur Détecteur
échantillon

Informatique

Figure 1 – Schéma simplifié d’un couplage classique chromatographie-spectrométrie de masse avec source d’ions sous vide

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P 1 490 − 4 est strictement interdite. − © Editions T.I.

102
Référence Internet
P1491

Couplages chromatographiques
avec la spectrométrie de masse. II
par Patrick ARPINO
1
Directeur de recherche au CNRS
Laboratoire d’électrochimie et de chimie analytique (LECA)
École nationale supérieure de chimie de Paris (ENSCP)
Ancien président de la division de chimie analytique de la Société française de chimie (SFC)

1. Débits de gaz délivrés par la chromatographie


en phase gazeuse ..................................................................................... P 1 491 - 4
2. Séparateurs moléculaires ...................................................................... — 4
2.1 Effusion au travers d’une paroi poreuse .................................................... — 5
2.2 Séparateur à jets moléculaires ................................................................... — 5
2.3 Séparateur à membrane.............................................................................. — 5
3. Couplage en ligne directe, sans séparateur ..................................... — 6
3.1 Couplage étanche ........................................................................................ — 6
3.2 Couplage ouvert........................................................................................... — 7
4. Préparation des échantillons ................................................................ — 9
4.1 Traitements préalables ................................................................................ — 9
4.2 Accroissement de la volatilité et de la stabilité en phase gazeuse des
échantillons .................................................................................................. — 10
5. Analyses quantitatives ........................................................................... — 11
5.1 Principes de la détection ............................................................................. — 11
5.2 Limites inférieures de détection et de quantification................................ — 13
5.3 Calibrage absolu : étalonnage externe....................................................... — 13
5.4 Calibrage relatif : étalonnage interne ......................................................... — 13
5.5 Dosages par la méthode des ajouts dosés ................................................ — 17
6. Analyses qualitatives .............................................................................. — 17
6.1 Recherche aléatoire de molécules a priori inconnues .............................. — 17
6.2 Recherche ciblée .......................................................................................... — 19
7. Quelques développements récents
et applications sélectionnées ............................................................... — 21
8. Conclusion.................................................................................................. — 21
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 491

e couplage de la chromatographie en phase gazeuse à la spectrométrie de


L masse (GC-MS) est la première association réussie d’une méthode chroma-
tographique à la spectrométrie de masse. Mis au point dès la fin des années
1950, il est régulièrement commercialisé depuis 196 6 . Ce couplage est tota-
lement maîtrisé depuis 1980 et l’explosion des « petits systèmes » (« benchtop
instruments ») en 1990 témoigne de l’universalité et de la sensibilité du spec-
tromètre de masse en tant que détecteur chromatographique. On trouve ces
instruments dans la plupart des laboratoires d’analyse organique, car ils sont
devenus plus compacts et moins onéreux. Étant totalement sous contrôle infor-
matique, le couplage GC-MS est simple à mettre en œuvre, et plusieurs
appareils peuvent fonctionner simultanément sous la surveillance d’un seul
responsable.
Le domaine d’application des GC-MS se confond avec celui de la GC et tous
les progrès récents de la GC ont été transposés à la GC-MS, notamment en
Parution : mars 2008

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103
Référence Internet
P1491

COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE.II _________________________________________________________________

termes de rapidité d’analyse, grâce aux récents analyseurs de masses à temps


de vol (TOF/MS, « time of flight mass spectrometer »). Ce domaine est uni-
quement borné par la volatilité des échantillons, et non par des contraintes
instrumentales, mais il est suffisamment étendu pour le qualifier d’universel.
Cette universalité s’accompagne d’une très grande sélectivité lorsqu’il s’agit de
rechercher une molécule particulière dans un mélange complexe.
En analyse q ualitative, la GC-MS produit en routine des spectres repro-
1 ductibles, identifiables à ceux d’une bibliothèque, pour des quantités injectées
de l’ordre de 10–10 g. En analyse quantitative, des dosages exacts et précis
sont obtenus avec une très grande dynamique de réponse, et des limites infé-
rieures de détection parmi les plus basses de toutes les techniques d’analyse
chimique, à condition de connaître et de disposer au préalable des molécules à
quantifier, afin d’établir un étalonnage.
Cet article, qui ne prétend pas être exhaustif, traite essentiellement des
parties de l’interface GC-MS accessibles aux utilisateurs et qui peuvent néces-
siter d’être réglées ou modifiées au laboratoire, notamment selon la colonne
GC utilisée. Il décrit également les principes des deux principaux modes d’uti-
lisation des GC-MS : l’analyse quantitative et l’analyse qualitative.
Le couplage GC-MS est traité dans tous les ouvrages généraux de spectro-
métrie de masse [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7]. Quelques livres lui sont consacrés
exclusivement [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16]. Si le nombre d’articles sur
des applications de la GC-MS progresse moins vite que celui relatif aux
couplages LC-MS, il demeure trop important pour pouvoir en dresser une
revue exhaustive.
Le couplage GC-MS est obtenu avec des sous-ensembles disposés selon la
figure 1 de l’article précédent [P 1 490], la source du MS étant sous vide. Le
problème du couplage GC-MS se pose différemment selon le type de la
colonne utilisée et la capacité de pompage du spectromètre de masse.

Notations et symboles Notations et symboles (suite)

Symbole Unité Définition Symbole Unité Définition

surface du pic pour l’ion correspondant L m longueur de la colonne séparative


A BP
au pic de base du spectre de masse
M g · mol–1 masse molaire d’un analyte
diamètre interne d’une colonne
dc m
capillaire masse totale de l’échantillon ayant
m inj kg
pénétré dans la source d’ions du MS
dwell time, temps de résidence d’un
analyseur, pendant lequel il enregistre nombre sans dimension mesurant le
δt s le courant d’un ion choisi, au cours du m /z rapport de la masse d’un ion (en unité
balayage d’une plage ou d’un nombre atomique) à son nombre de charges
fini d’ions de rapport m/z
nombre de plateaux théoriques de la
épaisseur du film de phase stationnaire N
colonne chromatographique
ef m sur la paroi interne d’une colonne
capillaire
P1 , P2 Pa pression
facteur de réponse d’un spectromètre
F facteurs de réponses relatifs des ions K
de masse
PK , PL et L présents dans le spectre de la
F BP facteur de réponse pour l’ion pic de base molécule naturelle dosée par GC-ID/MS

g gain du détecteur d’ions P atm Pa pression atmosphérique

constante de vitesse d’une réaction pression absolue de gaz à l’entrée d’une


k USI P in Pa
d’ionisation chimique colonne GC

rendement d’ionisation dans une source pression absolue de gaz à la sortie


kr P out Pa
à ionisation électronique d’une colonne GC

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P 1 491 – 2 est strictement interdite. – © Editions T.I.

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P1491

_________________________________________________________________ COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE.II

Notations et symboles (suite) Sigles et abréviations (suite)

Symbole Unité Définition Isotope dilution mass spectrometry (dosage par


ID/MS
dilution isotopique)
facteurs de réponses relatifs des ions K
et L présents dans le spectre de la Liquid chromatography (chromatographie en phase
QK , QL LC
molécule marquée servant d’étalon liquide)

1
interne pour un dosage par GC-ID/MS
Liquid chromatography-mass spectrometry
intensité du courant d’ions mesurée en LC-MS (couplage chromatographie liquide-spectrométrie
R u.a.
sortie du détecteur de MS de masse)
temps de sortie d’un composé non LOD Limit of detection (limite inférieure de détection)
t0 s
retenu par la colonne GC
Limit of quantitation (limite inférieure de
temps de séjour des solutés dans la LOQ
tg s quantification)
phase gazeuse de la colonne GC
Membrane introduction mass spectrometry (intro-
temps absolu de rétention d’un soluté MI/MS
tr s duction dans la source au travers d’une membrane)
issu d’une colonne GC
MS Mass spectrometry (spectrométrie de masse)
temps de séjour des solutés dans la
ts s
phase stationnaire de la colonne GC Mass spectrometry-mass spectrometry (spectro-
MS-MS métrie de masse en tandem, combinant deux ou n
facteur de transmission entre la source analyseurs : MSn)
T d’ions et le détecteur d’un spectromètre
de masse MC Mass chromatogram (chromatogramme de masse)

U m· s–1 vitesse linéaire moyenne MIM


Multiple ion monitoring (détection sélective
alternée de plusieurs ions)
σ écart-type d’un pic chromatographique
Multiple reaction monitoring (détection alternée de
MRM
plusieurs transitions métastables ; voir SRM)

Nitrogen phosphorus detector (détecteur azote


Sigles et abréviations NPD
phosphore)

Atmospheric pressure chemical ionisation (ioni- PFK Perfluorokérosène


APCI
sation chimique à pression atmosphérique)
RI Retention index (Indice de rétention de Kovats)
Atmospheric pressure ionisation (ionisation à
API Supercritical fluid extraction (extraction en phase
pression atmosphérique) SFE
supercritique)
BP Base peak ion (ion pic de base)
Selective ion monitoring (détection sélective d’un
SIM
CI Chemical ionisation (ionisation chimique) ion)

Collision induced dissociation (dissociation d’ions S/N Signal to noise ratio (rapport signal/bruit)
CID
induite par des collisions)
Single reaction monitoring (détection ou suivi
EI Electron ionisation (ionisation électronique) sélectif d’une transition métastable) – Signifie aussi
SRM
standard reference material dans article
FT/MS
Fourier transform/mass spectrometry (spectromètre référence [42]
de masse à transformée de Fourier)
Solid phase micro-extraction (microextraction en
Fourier transform/infrared spectroscopy (spectros- SPME
FT/IR phase solide)
copie infrarouge à transformée de Fourier)
Time of flight mass spectrometry (spectrométrie de
Flame ionisation detector (détecteur à ionisation de TOF/MS
FID masse à temps de vol)
flamme)
TIC Total ion current (courant ionique total)
Gas chromatography (chromatographie en phase
GC
gazeuse) Conditions normales de température (0 oC) et de
TPN
pression (1 atm)
Combined gas chromatography-mass spectrometry
(couplage chromatographie en phase gazeuse –
GC-MS Les abréviations sont celles dérivées des expressions anglaises,
spectrométrie de masse). GC-MS-MS dans le cas
d’analyseurs en tandem. majoritaires dans les références bibliographiques citées. Le
symbole du couplage d’éléments physiques est - (GC-MS,
High resolution mass spectrometry (spectrométrie LC-MS...). La barre oblique / est réservée à la mise en œuvre de
HR/MS modes opératoires (EI/MS, FT/MS, TOF/MS). Les deux sont
de masse à haute résolution)
combinables dans une même abréviation (GC-CI/MS,
IR/MS Isotope ratio mass spectrometry GC-EI/HR/MS).

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P1491

COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE. II _________________________________________________________________

1. Débits de gaz délivrés 2. Séparateurs moléculaires


par la chromatographie Ces dispositifs conçus au cours des années 1960 ont contribué à
en phase gazeuse l’essor de la GC-MS [17]. Ils sont montés entre la colonne et la
chambre d’ionisation. Ils ont pour objet d’augmenter la
concentration de soluté par rapport à celle du gaz vecteur, et de
réduire le débit total de gaz entrant dans le MS. Ils sont devenus

1 Le lecteur est invité à consulter Chromatographie en phase


gazeuse [P 1 485].
aujourd’hui le plus souvent inutiles et ne sont plus proposés dans
les versions communes des appareils GC-MS commerciaux. Seuls
une application ou un montage expérimental particuliers les
justifient occasionnellement. Leurs qualités idéales sont les
suivantes :
– transmettre intégralement et quantitativement les constituants
Pour des raisons de meilleures séparations, les anciennes
à analyser. En particulier, ne pas absorber sur les parois les quan-
colonnes à garnissage ont été supplantées par les colonnes
tités faibles de produits, car cela réduit la sensibilité de l’analyse
capillaires en silice fondue (d c = 0,10 à 0,53 mm et L = 10 à 100 m)
en cours, et peut contaminer une analyse ultérieure si les échan-
dont les phases stationnaires greffées ou non s’utilisent jusqu’à
tillons adsorbés sont ensuite relargués de manière aléatoire ;
270 o C pour les phases polaires, et 320 o C pour les phases
apolaires, sans pollution excessive de la source du spectromètre – ne pas modifier la structure chimique des molécules trans-
de masse (tableau 1). mises par un temps de résidence ou par un chauffage excessif ;
– éliminer le gaz vecteur, ou au moins l’amener à des niveaux
compatibles avec le pompage du vide du spectromètre de masse ;
Les colonnes capillaires fines (d c F 0, 25 mm) procurent le
meilleur pouvoir de séparation et peuvent presque toujours être – ne pas altérer la séparation chromatographique.
raccordées directement au MS sans l’aide d’un séparateur. D’une manière générale, les séparateurs classiques jouent sur
les différences de taille et de diffusivité entre les molécules légères
Les colonnes GC capillaires de larges diamètres (d c G 0, 32 mm) du gaz vecteur et les molécules plus lourdes des solutés. Ils ont
sont moins efficaces, mais ont des capacités de charge plus éle- tous pour inconvénient de perdre une certaine quantité de soluté
vées. Ceci est utile pour analyser des mélanges complexes dans au cours du processus. Deux paramètres en décrivent les
lesquels ce sont les constituants mineurs qui sont principalement propriétés :
recherchés. L’injection des échantillons sur ces colonnes est éga- – le rendement, défini comme le rapport entre les quantités
lement plus facile et évite l’emploi de diviseurs de débits à absolues de l’échantillon respectivement à la sortie et à l’entrée du
l’entrée. Enfin, lorsque les échantillons sont assez propres pour séparateur ;
supporter une séparation médiocre, les analyses à l’aide de
– le facteur d’enrichissement, défini comme le rapport entre les
colonnes capillaires larges peuvent être très rapides et permettre
concentrations de l’échantillon dans le gaz vecteur mesurées
de traiter journellement un grand nombre d’échantillons. Leur
respectivement à la sortie et à l’entrée du séparateur.
débit en sortie dépasse cependant la capacité d’absorption des
GC-MS d’entrée de gamme, ce qui oblige d’utiliser un séparateur Ces paramètres dépendent à la fois de la nature gaz vecteur et
moléculaire (§ 2) ou un diviseur de débit (§ 3.2), sauf à disposer de l’échantillon et ne sont pratiquement jamais mesurés avec
d’un GC-MS à pompage différentiel (voir la première grande précision, c’est pourquoi nous n’en donnons pas ici les
partie [P 1 490], § 4.5) qui permet un raccordement direct. Il en va formules (voir dans [16]). Si l’enrichissement de certains modèles
de même pour les colonnes à garnissage qui s’utilisent encore est excellent, notamment les dispositifs à membrane, aucun ne
occasionnellement. montre un rendement dépassant 50 %.

Tableau 1 – Caractéristiques des colonnes capillaires pour le couplage GC-MS


Diamètre interne d c............................................. (mm) 0,1 0,22 0,25 0,32 0,53

Longueur habituelle L .............................................(m) 10 à 20 10 à 40 10 à 60 15 à 60 10 à 30

Épaisseur de film de phase e f ..............................(µm) 0,1 à 0,5 0,1 à 1,0 0,25 à 1,0 0,25 à 1,0 0,5 à 5,0

Efficacité théorique........ (plateaux théoriques/mètre) 10 000 5 000 4 170 3 330 1 670

Capacité limite d’échantillon injecté.....................(ng) 1à2 5 à 30 50 à 100 400 à 500 1 000 à 2 000

Débit d’hélium optimal TPN (1).................... (mL/min) 0,2 à 0,4 0,4 à 0,7 0,6 à 0,8 1,0 à 1,5 2à4

Pression en tête (P in) lors d’un couplage direct P in < P atm P in < P atm
P in > P atm P in > P atm P in > P atm
étanche (P out = 0) si L < 30 m ∀L

Méthode de couplage recommandée pour GC-MS à Indirect


Direct Direct Direct Indirect ouvert
ligne unique de pompage étanche
étanche étanche étanche open split
si L < 30 m

(1) Uopt = 25 à 30 cm · s–1.

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P 1 491 – 4 est strictement interdite. – © Editions T.I.

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P1491

_________________________________________________________________ COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE. II

Spectromètre
Colonne de masse
Soluté
Colonne GC Spectromètre
de masse
Verre fritté de porosité ultrafine
Gaz

1
Vide vecteur

Figure 1 – Séparateur de Biemann et Watson

2.1 Effusion au travers d’une paroi Vide

poreuse
Figure 2 – Séparateur à jet moléculaire à un étage
On ne retiendra que pour mémoire le premier séparateur dit « à
effusion » de Biemann et Watson (figure 1) [18], qui possédait de
médiocres performances tant sur le plan du rendement que sur le
plan du facteur d’enrichissement. On ne lui trouve pas de des-
cendance dans l’instrumentation actuelle. GC FID

Couvercle
Membrane
2.2 Séparateur à jets moléculaires méthylsilicone
semi-perméable
Joint d'étanchéité
en silicone
Support
Introduit dès 1964, il contribua au développement extraordinaire verre fritté
de la GC-MS à partir des années 1970. Il utilise les propriétés d’un
MS
jet de gaz en libre expansion, issu d’un injecteur étroit, et détendu
dans une enceinte évacuée sous vide. Le cœur du jet est le siège
d’un régime de type visqueux et s’enrichit en constituants du gaz Figure 3 – Séparateur à membrane
les plus lourds, car les plus légers diffusent plus rapidement vers
la périphérie du jet. L’enrichissement en constituants lourds est
fonction des différences de masses molaires et de viscosités des
composants du mélange. La séparation est obtenue en écrémant Amirav et coll. [20] ont conçu une interface GC-MS sophistiquée
les couches périphériques du jet au moyen d’un écorceur conique mettant en œuvre des jets moléculaires, afin de produire un jet
(skimmer ) placé à une distance donnée de la buse d’injection. La supersonique très froid à partir d’échantillons gazeux issus d’une
transmission ou la réjection d’une vapeur est fonction de cette colonne GC. Les échantillons sont ensuite ionisés soit par ionisa-
distance, du diamètre de l’orifice de l’écorceur et du débit du gaz tion électronique, soit par collision avec une surface (hyperthermal
porteur. surface ionisation ), et les fragments analysés par un analyseur à
temps de vol. L’objectif est ici également de pouvoir tirer profit des
Ce séparateur, initialement métallique et à deux étages, fut par TOF/MS pour des séparations chromatographiques ultrarapides,
la suite remplacé par des modèles plus inertes et plus simples, à afin de soit traiter quotidiennement un grand nombre d’échan-
un étage et en verre (figure 2). Sans limite supérieure de tempé- tillons, soit fournir rapidement un résultat ponctuel dans le cas
rature trop contraignante ni volumes morts trop importants, son d’un contrôle ou d’une alarme de sécurité.
rendement est néanmoins au mieux de 50 % pour un débit optimal
dépendant de sa géométrie, enfin, il est relativement fragile et Enfin, des variantes du séparateur à jets moléculaires ont été
difficile à nettoyer ou réparer. utilisées dans des interfaces LC-MS comme le particle beam (voir
la troisième partie [P 1 492]) ainsi que dans les dispositifs d’échan-
La société australienne SGE, qui fournit des accessoires pour tillonnage sous vide des ions formés à pression atmosphérique
GC, LC et MS, fut la dernière jusqu’en 2005 à fabriquer des dans les sources API ([P 1 490], § 4.6.3).
séparateurs à jet en verre pour la GC-MS, ainsi qu’un modèle spé-
cialement adapté aux colonnes GC macrobores (d c G 0,5 mm)
dénommé MJSC (Macro Jet Separator for Chromatography)
utilisant des tubulures de métal gainées intérieurement de verre.
2.3 Séparateur à membrane
Tous ont été retirés des catalogues en 2006, y compris chez les
Cette interface utilise la perméabilité sélective des molécules
revendeurs secondaires.
organiques au travers d’une membrane semi-perméable. On parle
Autre curiosité technologique récente utilisant un séparateur à de perméation des solutés lorsque l’échantillon est en phase
jets en GC-MS : les colonnes multicapillaires constituées d’un gazeuse, comme en GC, et de pervaporation lorsque l’échantillon
réseau parallèle de 800 à 1 000 colonnes capillaires de quelques est en solution liquide [21]. Le dispositif GC-MS initialement décrit
microns de diamètre interne (10 µm F d c F 100 µm) pour une par Lewellyn et Littlejohn en 1966 [16] [21], a connu plusieurs ava-
longueur de quelques mètres. Elles devaient permettre de cumuler tars, relatifs au nombre d’étages de séparation, au choix des maté-
les avantages des colonnes GC fines, en terme de performance et riaux de l’enveloppe (en métal, puis en verre), ou du dispositif de
de rapidité de séparation, et d’ajouter une capacité de charge support de la membrane de silicone (support en argent poreux ou
accrue. Développées au cours des années 1990 à l’Institut de en verre fritté) (voir [16] pour la description de ces premiers dis-
physique appliquée de Novosibirsk, en Russie, elles ont été un positifs). L’un des derniers modèles équipant des GC-MS de série
temps distribuées aux États-Unis et dans le monde par Alltech (figure 3) était réalisé entièrement en verre, et placé directement
Associates (MC2TM columns), mais ce produit a depuis été aban- dans le four du chromatographe. La membrane de méthylsilicone
donné. Guilhaus et coll. [19] ont toutefois construit un séparateur à est retenue par un support en verre fritté. La fraction de soluté ne
jet permettant d’étudier leurs performances avec un MS à temps traversant pas la membrane est dirigée vers un détecteur GC
de vol. classique (détecteur à ionisation de flamme : FID) pour éviter d’être

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est strictement interdite. – © Editions T.I. P 1 491 – 5

107
1

108
Référence Internet
P1492

Couplages chromatographiques
avec la spectrométrie de masse. III
1
par Patrick ARPINO
Directeur de recherche au CNRS
Laboratoire d’électrochimie, chimie des interfaces et modélisation pour l’énergie (LECIME),
ENSCP
Ancien président de la Division de chimie analytique de la Société française de chimie

1. Couplages LC-MS anciens...................................................................... P 1 492 - 4


1.1 Systèmes avec évaporation totale du solvant ........................................... — 4
1.2 Méthodes directes........................................................................................ — 5
2. Caractéristiques générales des couplages LC-MS actuels ........... — 6
2.1 Chambre d’ions à pression atmosphérique (API) ..................................... — 6
2.2 Position des nébuliseurs ............................................................................. — 7
2.3 Zone d’échantillonnage ............................................................................... — 7
2.4 Optique de guidage ..................................................................................... — 7
2.5 Collisions dans la source (in-source CID ) .................................................. — 8
3. Méthodes d’ionisation en phase gazeuse
à pression atmosphérique...................................................................... — 9
3.1 Source APCI.................................................................................................. — 9
3.2 Source APPI .................................................................................................. — 17
4. Conclusion.................................................................................................. — 23
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 492

e couplage de la chromatographie en phase liquide à la spectrométrie de


L masse (LC-MS) n’a été étudié qu’à partir de 1974 en raison de difficultés
techniques bien plus élevées que pour la chromatographie en phase gazeuse
couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), disponible en série sur les équi-
pements commerciaux dès 1968 – voir Couplages chromatographiques avec la
spectrométrie de masse. II [P 1 491]. Pendant une dizaine d’années, plusieurs
dispositifs LC-MS très divers ont été proposés, mais, à partir de 1986, la mise
au point de sources d’ionisation à pression atmosphérique pour la spectromé-
trie de masse a levé la plupart des obstacles au développement de la LC-MS.
Le couplage LC-MS offre actuellement l’un des outils d’analyse les plus puis-
sants au service des chimistes et des biochimistes. Cette révolution
technologique est intervenue au cours des années 1990 qui ont vu l’apparition
d’appareils commerciaux fiables tirant profit des méthodes d’ionisation à
pression atmosphérique (API-MS) découvertes par l’américain John Fenn au
cours de la décennie précédente. L’attribution du prix Nobel de chimie 2002 à
John Fenn, partagé avec le japonais Tanaka pour la découverte du MALDI,
témoignait de cette percée.
Aujourd’hui, ce type de couplage est majoritaire dans les ventes d’appareils
commerciaux et permet de s’attaquer avec succès aux problèmes analytiques
les plus complexes, notamment en biologie analytique (par exemple, pour la
Parution : décembre 2009

caractérisation et le séquençage des protéines). Si, comme depuis les débuts


des couplages LC-MS, les séparations en phase liquide sur colonnes de phases
inverses sont les plus fréquemment mises en œuvre, de nombreuses autres

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COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE. III ________________________________________________________________

techniques séparatives sont désormais directement couplées à la spectrométrie


de masse, notamment celles opérant à l’aide de champs électriques élevés. En
fait, les constructeurs désignent aujourd’hui par LC-MS un spectromètre de
masse capable d’échantillonner des analytes en solution liquide – issu ou non
d’une méthode séparative en ligne ou provenant d’un dispositif de préparation.
Les couplages LC-MS sont inclus comme chapitres majeurs dans tous les

1
ouvrages récents de spectrométrie de masse [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7], quelques
livres [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15], ainsi que le volume complet d’une
encyclopédie récente [16] leur sont exclusivement consacrés. Plus de 15 000
publications au cours de la dernière décennie sont parues pour les seuls cou-
plages de séparations en phase liquide aux trois principales sources d’ions
pour la spectrométrie de masse disponibles commercialement – APCI, APPI,
ESI. Les variantes et prototypes de laboratoire sont également innombrables.
En dépit de cette littérature scientifique pléthorique et des multiples
domaines d’application, il n’y a encore aucune démarche rigoureuse qui
permet de répondre à la question : quelle interface choisir pour analyser une
classe de molécules données ? Il faudra le plus souvent les tester, optimiser de
nombreux paramètres au cas par cas, avant de choisir la mieux appropriée.
Beaucoup de phénomènes physico-chimiques mis en jeu au cours d’une
analyse sont encore mal compris. Le couplage LC-MS reste donc une métho-
dologie complexe : il ne s’agit aucunement d’une méthode « presse-bouton ».
En conséquence, il n’a pas paru judicieux de présenter les couplages du
point de vue des différentes méthodes séparatives, par ailleurs déjà traitées
dans les Techniques de l’Ingénieur, mais du point de vue de la méthode d’ioni-
sation pour la spectrométrie de masse qui accepte l’une ou l’autre de ces
méthodes séparatives. Après un bref rappel des méthodes « historiques » dont
certaines ont encore des liens de parenté avec les méthodes actuelles, on trai-
tera des couplages qui mettent en œuvre des méthodes d’ionisation en phase
gazeuse : ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et photo-
ionisation à pression atmosphérique (APPI). La quatrième partie de cette série
d’articles sur les couplages chromatographiques abordera les couplages aux
méthodes d’ionisation en milieu liquide (électrospray ou ESI).

Notations et symboles Notations et symboles

Symbole Unité Définition Symbole Unité Définition

dc m Diamètre interne d’un tube PA(X) kJ · mol–1 Proton Affinity (affinité protonique
(colonne capillaire LC, tube en phase gazeuse de la molécule
de raccordement...) ou de l’ion X)

D mL · min–1 Débit de l’éluent liquide au travers RE(X) eV Recombination Energy (énergie


de la colonne chromatographique de recombinaison en phase
gazeuse de l’ion X+ à l’électron)
EA(X) eV Electron Affinity (affinité de X
pour l’électron)
ppb part per billion (partie par milliard,
IE(X) eV Ionisation Energy (énergie 10–9)
de première ionisation
de la molécule X)
t0 s Temps absolu de rétention d’un
M g · mol–1 Masse moléculaire d’un analyte soluté non retenu par une colonne
GC ou LC
m /z Nombre sans dimension mesurant
le rapport de la masse d’un ion
(en unités atomiques), tr s Temps absolu de rétention d’un
à son nombre de charges soluté issu d’une colonne GC ou LC

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_________________________________________________________________ COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE. III

Sigles et abréviations Sigles et abréviations


APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation HILIC Hydrophobic Interaction Liquid Chromatography
(ionisation chimique à pression atmosphérique) ;
APCI+ pour la production et l’enregistrement HPLC High Performance Liquid Chromatography
d’ions positifs ; APCI– pour le mode négatif (Chromatographie Liquide Haute Performance)
API Atmospheric Pressure Ion (chambre d’ionisation

1
à pression atmosphérique) LC Liquid Chromatography (chromatographie
en phase liquide)
APPI Atmospheric Pressure PhotoIonisation
(ionisation à pression atmosphérique LC-MS Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
par des photons) ; APPI+ pour la production (couplage chromatographie liquide-
et l’enregistrement d’ions positifs ; APPI– spectrométrie de masse). LC-MS-MS dans le cas
pour le mode négatif d’analyseurs en tandem
CE Capillary Electrophoresis (électrophorèse
capillaire) – terme général pour désigner LSIMS Liquid SIMS (ionisation par bombardement
l’ensemble, CZE, MEKC, MEEKC d’atomes accélérés d’échantillons en solution
dans une matrice)
CZE Capillary Zone Electrophoresis
(électrophorèse capillaire de zone) MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Mass
CEC Capillary Electro-Chromatography Spectrometry (spectrométrie de masse
(électrochromatographie capillaire) à ionisation par désorption laser à partir
d’une matrice)
CEI Charge Exchange Ionisation (ionisation
par échange de charges) MEEKC Microemulsion Electrokinetic Chromatography
CI Chemical Ionisation (ionisation chimique) (électrochromatographie cinétique
de microémulsions)
CID Collision Induced Dissociation (dissociation
d’ions induite par des collisions) MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography
(électrochromatographie cinétique micellaire)
DA-APPI Dopant Assisted Atmospheric Pressure
PhotoIonisation. APPI en présence d’un dopant
MS Mass Spectrometry (spectrométrie de masse)
EC Electron Capture Ionisation (ionisation
par capture d’électrons). EC/MS pour la capture MS-MS Mass Spectrometry-Mass Spectrometry
d’électrons en spectrométrie de masse ; (spectrométrie de masse en tandem, combinant
EC/APCI–/MS pour la capture d’électrons dans deux ou n analyseurs : MSn )
une source APCI en mode négatif ; GC-EC/MS
pour le couplage GC-MS en mode de capture NPLC Normal Phase Liquid Chromatography
d’électrons (chromatographie liquide en phase normale)
EI Electron Ionisation (ionisation électronique)
RPLC Reversed Phase Liquid Chromatography
ESCI Chambre API équipée à la fois d’une source ESI (chromatographie liquide en phase inverse)
et d’une source APCI
SFC Supercritical Fluid Chromatography
ESI Electrospray Ionisation (ionisation électrospray) ;
(chromatographie en phase supercritique)
ESI+ pour la production et l’enregistrement
d’ions positifs ; ESI– pour le mode négatif
SPE Solid Phase Extraction (extraction en phase
ESPI Chambre API équipée à la fois d’une source APPI solide)
et d’une source ESI
TS Thermospray
FAB Fast Atom Bombardment (bombardement
par des atomes accélérés d’échantillons
en solution dans une matrice) UV UltraViolet

FIA Flow Injection Analysis (injection directe UPLC Ultra High Pressure Liquid Chromatography
dans un flux) (chromatographie en phase liquide à très haute
FT/MS Fourier Transform/Mass Spectrometry pression, ⭓ 1 000 bars). UPLC-MS dans le cas
(spectromètre de masse à transformée d’un couplage avec la spectrométrie de masse
de Fourier)
VUV Vacuum UltraViolet lamp (lampe à décharge
GC Gas Chromatography (chromatographie dans l’UV utilisée en APPI)
en phase gazeuse)
CG-ECD GC Electron Capture Detector (détecteur Les abréviations, celles dérivées des expressions anglaises,
à capture d’électrons pour la GC) sont majoritaires dans les références bibliographiques citées. Le
symbole du couplage d’éléments physiques est – GC-MS,
GC-MS Combined Gas Chromatography-Mass LC-MS... La barre oblique / est réservée à la mise en œuvre de
Spectrometry (couplage chromatographie méthodes opératoires ; ESI/MS, FT/MS, TOF/MS. Les deux sont
en phase gaseuse-spectrométrie de masse). combinables dans une même abréviation ; GC-CI/MS,
GC-MS-MS dans le cas d’analyseurs en tandem LC-ESI/MS.

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COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE. III ________________________________________________________________

1. Couplages LC-MS anciens 1.1.1 Interface à transport mécanique du soluté


(moving belt )

Les premiers LC-MS commerciaux apparus au début des années


Les multiples problèmes associés au couplage en ligne de ces
1970 utilisaient un ruban mobile (moving-belt ) [19] (figure 1). En
deux techniques, aisément utilisables séparément, ont longtemps
pratique, ce système se révéla complexe, onéreux, et au final déce-
freiné le développement effectif des systèmes LC-MS. Les direc-
vant, en dépit de multiples tentatives d’amélioration. Cette appro-
tions initialement suivies pour contourner l’incompatibilité

1
che est aujourd’hui complètement abandonnée.
apparente des deux techniques ont toutes été abandonnées. Elles
avaient un temps abouti à des instruments commercialisés par
tous les constructeurs, souvent à des tarifs très élevés, et n’ont
plus aujourd’hui qu’un intérêt historique. Ces méthodologies
1.1.2 Méthode à jet de particules (particle beam )
anciennes ne sont brièvement énumérées ici que pour mémoire,
ainsi qu’un choix de références pour les lecteurs intéressés. La méthode initialement dénommée MAGIC (Monodisperse Aero-
sol Generation Interface for Combining Liquid Chromatography ) [20],
puis commercialisée sous l’appellation particle beam à partir de 1987
(figure 2), adaptait à la LC-MS les séparateurs à jets moléculaires
conçus pour la GC-MS (voir Couplages chromatographiques avec la
1.1 Systèmes avec évaporation totale spectrométrie de masse II [P 1 491], § 2).
du solvant Comme d’autres, cette interface LC-MS n’a pas résisté au déve-
loppement des méthodes d’ionisation à pression atmosphérique et
Les premiers LC-MS visaient à évaporer sélectivement le solvant n’est plus désormais proposée par les constructeurs. Néanmoins,
de l’effluent de la colonne LC, puis à vaporiser séparément le des versions expérimentales miniaturisées, potentiellement adap-
soluté dans une source classique sous ionisation électronique (EI). tables à des méthodes de micro-LC, continuent d’être étudiées
Cela devait permettre de comparer le spectre obtenu à ceux des occasionnellement, visant à enregistrer des spectres sous ionisa-
bibliothèques (par exemple, [17] [18]). Les échantillons résistant à tion électronique, comparables à ceux des bibliothèques [21] [22]
l’analyse EI pouvaient parfois être analysés sous ionisation [23]. Une technique apparentée de LC-EI/MS utilise un jet superso-
chimique en mode positif ou négatif CI+/– au moyen d’un gaz réac- nique de molécules refroidies conduisant à des ions moléculaires
tif sélectionné par l’opérateur. M+• abondants [24] [25].

MS LC

Port d'entrée

Source d’ions 2e étage 1er étage Ventilateur Pression


5 · 10–5 bar 0,2 mbar 1 à 5 mbar atmosphérique

Évaporateur
du solvant
Ruban
Source EI/CI

Nettoyeur
chauffant
Vaporiseur Roue motrice
Isolant Pompe Pompe
primaire primaire Dispositif
Évacuation
d'essuyage

Figure 1 – Schéma d’une interface à ruban mobile

Bride de raccordement Enveloppe


Source EI/CI Pompe 2 chauffante Nébuliseur
pneumatique

Chambre de
Buse désolvatation
Filtre de masses

Hélium
Pompe 1 LC

GC Écorceur 1
Écorceur 2

Figure 2 – Schéma d’une interface particle beam

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_________________________________________________________________ COUPLAGES CHROMATOGRAPHIQUES AVEC LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE. III

gazeuse et sont capables d’amorcer des réactions ions-molécules


d’ionisation chimique. Aucune source externe, notamment un fila-
Diaphragme
ment émetteur d’électrons, n’est nécessaire pour l’ionisation des
composés présents dans l’effluent. En l’absence de tampon volatil
et de solvants favorables, une source externe d’ionisation, telle
qu’un filament ou une électrode à décharge couronne, doit être
Excédent employée (figure 4). Ces deux modes ont reçu des dénominations
différentes : thermospray en mode direct (filament off ) et en mode

1
Liquide Source
Jet CI assisté (filament or discharge on ).
réfrigérant
Entrée Pour permettre d’absorber la totalité du gaz produit par la vapo-
solution
risation de l’intégralité de la solution liquide, de l’ordre de
1 cm3/min, délivrée par une colonne LC de dc ≈ 4 mm, un
pompage mécanique de 150 à 300 L/min est directement couplé à
Chambre de la source afin d’éliminer l’excès de vapeur de solvant (voir Coupla-
désolvation chauffée ges chromatographiques avec la spectrométrie de masse I
[P 1 490], § 4.6, figure 6).
Figure 3 – Schéma d’une interface DLI
Le thermospray fut une étape importante dans l’évolution des
techniques LC-MS, car il conduisit à des appareils commerciaux
exclusivement dédiés aux échantillons en solution liquide, alors
que toutes les interfaces précédentes consistaient en un accessoire
1.2 Méthodes directes adaptable à un MS d’usage général, pouvant également accepter
les effluents gazeux d’un GC-MS. Entre 1980 et 1990, avant l’arri-
Contrairement aux précédentes, les anciennes méthodes direc- vée des techniques « à pression atmosphérique », on considérait
tes ne cherchaient pas à éliminer le solvant de la solution chroma- que 75 % des couplages LC-MS utilisaient l’interface thermospray.
tographique au moment de son introduction dans le spectromètre Ces dispositifs ont depuis totalement disparu, étant remplacés par
de masse. La solution en sortie de colonne LC était nébulisée puis les appareils APCI-MS (voir § 3.1) pour l’analyse des mêmes clas-
vaporisée et l’échantillon analysé après des réactions d’ionisation ses de molécules, la vaporisation et l’ionisation ayant lieu en
chimique impliquant la participation des vapeurs de solvant. phase gazeuse sous 105 Pa, plutôt que sous 102 Pa dans le ther-
D’abord, conduite à température ambiante et sous pression réduite mospray, d’où des spectres APCI un peu plus complexes en raison
dans la méthode DLI, un apport de chaleur plus important de la fréquence plus élevée des collisions en phase gazeuse, mais
conduisit ensuite au thermospray, puis la mise au point de sources dans des conditions opératoires bien plus confortables pour l’opé-
à pression atmosphérique fit évoluer cette interface vers les rateur. Le mode filament off, qui avait tant surpris la communauté
sources APCI actuelles. des analystes en son temps, a également depuis refait surface
épisodiquement, puisqu’il n’était pas lié à l’appareillage mais à la
vaporisation thermique d’une solution ionique adéquate – il a été
1.2.1 Méthode par nébulisation sous vide reproduit dans des montages APCI ou APPI récents (voir § 3.2.2.4).
au moyen d’une restriction hydraulique
(Direct Liquid Introduction, DLI )
1.2.3 Méthode par bombardement continu
La méthode DLI (figure 3) consiste à introduire dans le spectro- (Continuous Flow Fast Atom Bombardment,
mètre de masse environ 1 à 5 % de l’effluent total d’une colonne CF-FAB)
LC classique (dc ≈ 4 mm), ou la totalité de celui d’une micro-
colonne ( d c ⭐ 1 mm ). Le flux d’éluant est dispersé sous vide
Avant l’introduction de l’ionisation electrospray, le bombar-
d’environ 100 Pa, en un courant de fines gouttelettes au moyen
dement par des atomes accélérés (Fast Atom Bombardment, FAB)
d’une restriction hydraulique (capillaire en silice de 10 µm ou
ou le bombardement par des ions accélérés (Liquid Secondary
diaphragme percé d’un trou de 2 à 5 µm) qui limite aussi le flux de
Ionisation Mass Spectrometry, LSIMS) étaient les techniques
liquide à un débit acceptable pour le système de pompage du
d’ionisation douce les plus utilisées pour la caractérisation de pro-
vide [19] [26]. Après évaporation du solvant et des solutés dans
duits polaires, ioniques, thermiquement labiles et de masses molé-
une chambre chauffée, des réactions classiques d’ionisation
culaires élevées. Au cours des années 1980, ces techniques douces
chimique sous pression d’environ 100 Pa conduisent à des ions
d’ionisation étant facilement disponibles dans beaucoup de labora-
dérivés des solutés, formés par des ions réactifs provenant du sol-
toires d’analyse, le développement de couplages LC-MS s’en
vant. La restriction hydraulique étant sujette à des bouchages fré-
trouva stimulé et aboutit au développement du CF-FAB
quents, le DLI céda assez vite la place au thermospray dont la
(figure 5) [30].
robustesse opératoire était bien meilleure.
Un faible débit de solution d’échantillon (limité à 1 à 5 µL/min),
contenant 10 à 20 % d’une matrice liquide polaire et visqueuse
1.2.2 Méthode directe par nébulisation thermique (par exemple, glycérol), est introduit au moyen d’une colonne
(thermospray, TS) capillaire en silice à travers un verre fritté (méthode dite
CF-Frit-FAB) ou directement sur le méplat d’une canne FAB. Dans
Dans l’interface thermospray (TS) conçue par Marvin Vestal [27] les deux cas, la solution liquide est bombardée directement par
[28], l’effluent LC est directement introduit au travers d’un capillaire des atomes ou des ions de hautes énergies cinétiques. La stabilité
(dc ≈ 0,1 mm), en acier inoxydable, chauffé par un courant électri- des conditions d’ionisation dépend de la formation d’un film uni-
que directement appliqué sur une longueur variant de 10 à forme de liquide sur le méplat de la canne, du type de métal utilisé
30 cm [29]. Un jet supersonique contenant un brouillard de goutte- pour le méplat, de sa forme, de la composition de la phase mobile,
lettes de solution est créé, évoluant vers un jet de vapeur contenant du débit de solution liquide [31]. Malgré quelques performances
le solvant et les solutés en phase gazeuse. Quand un tampon volatil, remarquables [32], cette interface délicate à mettre en œuvre au
tel l’acétate d’ammonium, est présent dans la phase mobile, des laboratoire, généralement réservée aux MS à analyseur magné-
ions NH+4 ou CH3CO −2 sont présents en abondance dans la phase tique, s’est progressivement effacée devant les méthodes ESI.

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MS

Filament Cône d’échantillonnage

1
des ions
Canne thermospray
LC Cryopompage additionnel

Pompage primaire

Chauffage Thermocouples

a montage de base avec filament émetteur d’électrons ionisants – filament éteint (TS direct) ou allumé (TS assisté)

Électrode de décharge

Repousseur Électrode de fragmentation

Thermocouple

b variante avec électrode de décharge et électrode inductrice de fragmentations

Figure 4 – Interface thermospray

2. Caractéristiques générales
des couplages LC-MS
actuels
Deux niveaux d’interfaces sont mis en œuvre dans tous les
LC-MS récents. L’interface 1 (voir Couplages chromatographiques
avec la spectrométrie de masse I [P 1 490], § 4.6, figure 7)
oint
anchéité
comprend un nébuliseur et un générateur d’ions à partir des solu-
tés de l’éluant chromatographique, basé sur différentes méthodes
d’ionisation APCI, APPI, ESI... et monté sur une chambre à pres-
sion atmosphérique (API). L’interface 2 associe en ligne, une zone
Capillaire Solution liquide d’échantillonnage vers le vide et une optique de guidage d’ions
silice fondue + glycérol
Septum vers l’analyseur du spectromètre de masse. Cet analyseur est plus
ou moins complexe et performant selon les modèles d’appareil et
Solution constitue la partie la plus onéreuse de l’ensemble LC-MS, pouvant
liquide Xe0 différer par un facteur 10 entre les appareils d’entrée de gamme et
+ glycérol
Fibre les ensembles à pouvoir de résolution en masse très élevé.
absorbante

Canne Orifice de Cible 2.1 Chambre d’ions à pression


d’introduction pompage inox atmosphérique (API)
Bloc source
La source API [33] [34] [35] accueille les ions formés à pression
atmosphérique et les transfère vers l’enveloppe sous vide renfer-
mant l’analyseur de masse. Jusqu’au début des années 2000,
Figure 5 – Méthode CF-FAB chaque mode d’ionisation, APCI, ESI, APPI..., nécessitait d’installer

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P 1 492 – 6 est strictement interdite. – © Editions T.I.

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Référence Internet
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Couplage HPLC-ICP-MS
et application à la spéciation
1
par Véronique VACCHINA
Ingénieur applications
UT2A, Pau, France
Martine POTIN-GAUTIER
Professeur émérite de l’Université de Pau et des Pays de l’Adour
Institut IPREM/LCABIE, Pau, France
et Fabienne SEBY
Directrice d’Ultra Traces Analyses Aquitaine
UT2A, Pau, France

1. Intérêt du couplage HPLC-ICP-MS pour l’analyse


de spéciation ......................................................................................... P 3 872v2 - 2
2. Instrumentation .................................................................................... — 3
2.1 HPLC.......................................................................................................... — 3
2.2 ICP-MS ...................................................................................................... — 6
2.3 Couplage HPLC-ICP-MS........................................................................... — 8
3. Application à l’analyse de spéciation............................................. — 10
3.1 Arsenic ...................................................................................................... — 10
3.2 Sélénium................................................................................................... — 13
3.3 Chrome ..................................................................................................... — 14
3.4 Mercure..................................................................................................... — 14
3.5 Platine ....................................................................................................... — 14
3.6 Halogénures ............................................................................................. — 15
3.7 Gadolinium ............................................................................................... — 15
3.8 Spéciation multi-élémentaire.................................................................. — 15
3.9 Limites actuelles....................................................................................... — 16
4. Assurance qualité des analyses par HPLC-ICP-MS ..................... — 16
5. Conclusion.............................................................................................. — 16
6. Glossaire ................................................................................................. — 17
Pour en savoir plus ....................................................................................... Doc. P 3 872v2

i le lien entre l’essentialité et/ou la dangerosité des éléments trace avec la


S dose apportée est connu depuis très longtemps, il est aujourd’hui établi
que ces effets bénéfiques ou toxiques sont fortement liés à la forme physico-
chimique sous laquelle l’élément est présent. De ce fait, la réglementation
récente impose de plus en plus l’analyse spécifique d’une forme chimique d’un
élément et de moins en moins sa concentration totale. C’est le cas dans des
domaines d’application comme l’environnement, l’alimentation et certaines
problématiques industrielles pour des éléments comme le chrome (chrome
hexavalent) ou l’arsenic (formes inorganiques).
Une des techniques les plus utilisées pour l’analyse des formes chimiques
des éléments trace est le couplage en ligne d’une séparation par chromato-
graphie en phase liquide haute performance (HPLC) avec une détection
par spectrométrie de masse à plasma induit (ICP-MS). Cette technique
est en train de se généraliser dans de nombreux laboratoires car elle permet
Parution : avril 2019

Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservés P 3 872v2 – 1

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Référence Internet
P3872

COUPLAGE HPLC-ICP-MS ET APPLICATION À LA SPÉCIATION _______________________________________________________________________________

de répondre aux impératifs environnementaux, industriels et réglementaires,


notamment en termes de performances analytiques.
Plusieurs types d’interactions chimiques ou physiques peuvent être utilisés
en HPLC pour séparer et donc analyser des formes chimiques d’éléments trace
avec des propriétés physico-chimiques très différentes. L’ICP-MS est un détec-
teur élémentaire performant qui permet d’atteindre de très faibles

1
concentrations avec une bonne spécificité.
Dans cet article, les principes généraux de ces deux techniques (modes chro-
matographiques et types de colonnes utilisés, technologie des ICP-MS) puis de
leur couplage et ses contraintes (systèmes d’introduction de l’éluant dans
l’ICP-MS, problèmes inhérents à la phase mobile...) sont présentés. La sépara-
tion et la quantification des différentes formes chimiques (analyse de
spéciation) des éléments les plus étudiés mettant en œuvre l’HPLC-ICP-MS
sont détaillées. Enfin, les protocoles permettant de contrôler la qualité des ana-
lyses par ce couplage sont décrits.

Réactifs Q Quadripôle
EDTA Acide éthylènediaminetétraacétique RP Phase inverse
HFBA Acide heptafluorobutyrique SEC Chromatographie d’exclusion stérique

MRC Matériau de référence certifié UPLC Chromatographie en phase liquide ultra


performance
PEEK Polyétheréthercétone
UV Ultraviolet
PTFE Polytétrafluoroéthylène
TBAH Hydroxyde de tétrabutylammonium
TBAP Phosphate de tétrabutylammonium
TFA Acide trifluoroacétique
1. Intérêt du couplage
Techniques analytiques
HPLC-ICP-MS
AFS Spectrométrie de fluorescence atomique
pour l’analyse
CE Électrophorèse capillaire de spéciation
CRC Cellule de collision/réaction L’analyse des différentes formes chimiques d’un élément trace,
CRI Interface de collision/réaction dite analyse de spéciation [1], permet d’accéder à une dimension
obligée de connaissance et son intérêt est croissant depuis une
ESI Source d’ionisation électrospray vingtaine d’années. En effet, le dosage de la teneur totale d’un élé-
ment n’est plus suffisant pour avoir une information de qualité par
GC Chromatographie en phase gazeuse rapport à sa réactivité dans un milieu donné, sa mobilité dans
l’environnement ou sa dangerosité pour les organismes vivants.
HILIC Chromatographie hydrophile et lipophile Les formes chimiques d’un élément peuvent être de nature très
HPLC Chromatographie en phase liquide haute différente : il peut s’agir des différents états d’oxydation, de com-
performance posés organométalliques, de complexes ou de biomolécules
(figure 1). De nombreuses méthodes analytiques permettent
ICP Plasma à couplage inductif d’accéder à ce niveau d’information et, parmi elles, les méthodes
couplées sont les plus utilisées actuellement [P 3 870]. Elles
ICP-MS Spectrométrie de masse à plasma induit mettent en œuvre une technique de séparation suivie d’une détec-
tion, les deux systèmes étant la plupart du temps reliés au moyen
ICP-OES Spectrométrie d’émission optique à plasma induit
d’une interface pour permettre une analyse en ligne.
IE Échange d’ions ■ La séparation peut être réalisée par chromatographie en phase
IP Appariement d’ions liquide (HPLC) ou gazeuse (GC) ou, plus rarement, par électropho-
rèse capillaire (CE). Dans le contexte des analyses de spéciation,
IRM Imagerie par résonance magnétique les espèces à doser sont le plus souvent solubles et ioniques,
réduisant ainsi le champ d’application d’une séparation par GC qui
MS Spectrométrie de masse ne s’adresse qu’à des composés volatils ou pouvant être dérivés
en composés volatils [P 3 870]. L’électrophorèse capillaire, malgré
MS/MS Spectrométrie de masse en tandem
son haut potentiel de résolution associé à des temps d’analyse très

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________________________________________________________________________________ COUPLAGE HPLC-ICP-MS ET APPLICATION À LA SPÉCIATION

1
Exemples : formes rédox Exemples : méthyl-Hg,
Exemples : acides aminés séléniés Exemples : complexes
As(III)/As(V), Se(IV)/Se(VI), butyl et phényl-Sn
sucres arséniés, métalloprotéines avec les substances humiques
Cr(III)/Cr(VI)
b organométalliques
a inorganique naturel versus anthropique c biomolécules d macromolécules

Figure 1 – Différentes formes chimiques des éléments traces

courts, est moins utilisée en raison de sa difficulté technique à être – sa capacité multiélémentaire apporte une information plus
couplée à certains détecteurs. En revanche, du fait de ses multiples complète sur le contenu en différents éléments chimiques d’échan-
mécanismes de séparation permettant d’analyser un large éventail tillons complexes ;
de composés de propriétés physico-chimiques différentes et de sa – l’analyse simultanée de plusieurs isotopes d’un élément per-
facilité à être couplée à différents détecteurs, l’HPLC est actuelle- met d’utiliser des méthodes de quantification de haut standard
ment le mode de séparation priorisé dans les analyses de spécia- métrologique comme la méthode de dilution isotopique ;
tion. – le débit d’introduction de l’échantillon est compatible avec la
chromatographie liquide, ce qui permet une mise en œuvre facile
■ Concernant la caractérisation de formes chimiques contenant du couplage.
un élément trace, peu de détecteurs sensibles et spécifiques pou-
vant être associés en ligne à la chromatographie en phase liquide Pour toutes ces raisons et malgré son coût élevé en investisse-
existent. Les détecteurs tels que l’UV, la radiométrie, l’électro- ment et fonctionnement, l’ICP-MS est le détecteur de choix après
chimie ou la fluorimétrie sont basés sur une ou plusieurs proprié- séparation des espèces chimiques par HPLC.
tés physico-chimiques des composés analysés mais leur réponse
peut être affectée par la co-élution d’autres composés. La détection
UV-visible par exemple, souvent utilisée en HPLC, présente une
spécificité et une sensibilité insuffisantes, tandis que la détection 2. Instrumentation
électrochimique, sensible et sélective, n’est applicable qu’aux
substances électroactives. En revanche, les détecteurs élémen-
taires spécifiques employant les propriétés de l’atome (spectromé-
tries d’émission, de fluorescence ou d’absorption atomique) ou
2.1 HPLC
distinguant différents rapports masse/charge (m/z) (spectrométrie
de masse) donnent des réponses distinctes pour chacun des élé- 2.1.1 Principe
ments contenus dans un échantillon. Les détecteurs élémentaires
pouvant être couplés en ligne avec la chromatographie en phase
liquide sont les spectromètres de fluorescence atomique (AFS), La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est
d’émission optique à plasma induit (ICP-OES) et de masse à une technique permettant de séparer les composés d’un
plasma induit (ICP-MS). L’AFS, bien que très sensible, est cepen- mélange par partage entre une phase mobile liquide et une
dant une technique de détection monoélémentaire. Par ailleurs, phase stationnaire.
elle ne s’adresse qu’à certains éléments comme l’arsenic, l’anti-
moine, le mercure ou le sélénium et elle demande en amont une
transformation de certains analytes car seules les formes volatiles Un appareil HPLC comprend en amont un réservoir permettant
sont détectables [2]. L’ICP-OES, malgré sa capacité de détection d’alimenter une pompe en phase mobile (solvant pur ou mélange
multiélémentaire et son large domaine de linéarité, souffre d’une de solvants) durant plusieurs heures. La phase mobile y est géné-
sensibilité de deux à trois ordres de grandeur inférieure à celle de ralement dégazée et filtrée afin d’éviter les risques de désamor-
l’ICP-MS [P 2 719]. L’utilisation de l’ICP-MS comme détecteur pour çage et/ou d’obstruction. La pompe permet de délivrer au niveau
la chromatographie en phase liquide a été proposée pour la pre- de l’injecteur un débit de phase mobile constant avec des pres-
mière fois au début des années quatre-vingt-dix. Aujourd’hui, cou- sions de refoulement allant jusqu’à des centaines de bars, tout en
plé en ligne avec l’HPLC, il est largement priorisé dans les analyses possédant un bon amortissement des pulsations et résistant à la
de spéciation pour plusieurs raisons : corrosion éventuelle due aux solvants utilisés. L’élution peut être
– c’est un détecteur élémentaire spécifique, par conséquent la isocratique (nature de phase mobile constante) ou à gradient d’élu-
présence d’autres éléments ne perturbe a priori pas l’analyse des tion (composition de phase mobile variable dans le temps avec
espèces de l’élément considéré ; une force éluante de plus en plus élevée). L’injecteur classique
– sa grande sensibilité pour une large gamme d’éléments éli- fonctionne avec une vanne d’échantillonnage à six voies munie
mine souvent le besoin d’une préconcentration post-colonne ou d’une boucle d’échantillonnage calibrée de faible volume
lors du prétraitement de l’échantillon ; (quelques dizaines à centaines de µL). Préalablement à l’injection,
– la stabilité de la ligne de base est bonne en comparaison à l’échantillon doit être solubilisé si possible dans la phase mobile
d’autres détecteurs et aucun signal négatif ne peut apparaître, ce ou dans un milieu proche. Il est ensuite injecté dans la boucle à
qui facilite le traitement du signal ; l’aide d’une seringue puis entraîné dans la colonne par la phase

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P3872

COUPLAGE HPLC-ICP-MS ET APPLICATION À LA SPÉCIATION _______________________________________________________________________________

Tableau 1 – Principaux modes chromatographiques utilisables en couplage HPLC-ICP-MS


Phase stationnaire
Mécanisme Phase mobile Solutés
(nom usuel)
Polarité de Eau et augmentation graduelle de
Composés apolaires
phases inversées solvant polaire (méthanol, acétonitrile)

1
Silice greffée par groupement alkyle : Eau et augmentation graduelle de
– octyl : (C8, MOS, RP8) solvant polaire (méthanol, acétonitrile)
Polarité de – octadécyl (C18, ODS, RP18, BDS) +
phases inversées Copolymère styrène-divinylbenzène (PS- Composés ionisés
Agent d’appariement d’ions :
avec appariement DVB, PRP1) ou ionisables
– sels d’anions tétraalkylés
d’ions
– composés perfluorés
– alkylsulphonates
Eau
+
Silice ou polymère greffé d’un Ion développeur :
groupement fonctionnel : – anionique : phosphates, acétates, Ions organiques
Échange d’ions
– anionique : borates, formiates, carbonates, et inorganiques
– cationique : citrates...
– cationique : hydronium, pyridinium,
ammonium...
Gels organiques : PS-DVB,
Exclusion
polydextranes... Tampon aqueux Macromolécules
stérique
Silice greffée
Petites molécules polaires ou
Silice greffée Solvant polaire (méthanol, acétonitrile)
HILIC molécules ionisables
Phase stationnaire zwittérionique et augmentation graduelle d’eau
hydrophiles

mobile le plus souvent maintenue à température ambiante. organique, les plus utilisés étant le méthanol et l’acétonitrile. Des
L’entrée et la sortie de la colonne sont équipées d’un fritté (1 à solutions tampons peuvent également être ajoutées pour contrôler
2 µm) qui sert à retenir le garnissage et à le protéger des impure- le pH de la phase mobile. Des sels de phosphate ou d’acétate sont
tés. Des colonnes de garde sont parfois ajoutées en amont de la communément utilisés.
colonne chromatographique pour la protéger. Le choix de la
nature de la phase stationnaire (mode chromatographique) est ■ Chromatographie à polarité de phases inversées avec
fonction de celle des solutés à analyser (§ 2.1.2.1). Les colonnes appariement d’ions
sont des tubes droits de diamètre interne variable (§ 2.1.2.2) et de Pour augmenter la rétention des composés ionisés sur les
longueur allant de 5 à 25 cm suivant les applications. Le diamètre colonnes de phase inverse, l’appariement d’ions (IP) peut être
des colonnes, la nature et la taille des particules du remplissage utilisé [4]. Les mêmes types de colonnes et de phases mobiles que
permettent un classement des colonnes chromatographiques. la chromatographie liquide en phase inverse sont retenus, à la dif-
férence qu’un contre-ion est ajouté à la phase mobile. Ce contre-
ion ou agent de paires d’ions est de charge opposée à celle du
2.1.2 Critères de classification des colonnes composé de l’échantillon. Il se combine donc avec ce dernier pour
former une paire d’ions, qui est alors retenue par la phase station-
2.1.2.1 Mode chromatographique naire. Les agents de paires d’ions les plus communément ajoutés
Les modes chromatographiques utilisables en couplage avec dans la phase mobile pour doser les cations sont des anions à
l’ICP-MS sont présentés dans le tableau 1. Il est à noter que le longue chaîne alkylée tels que les sels d’ammonium tétraalkylés
mode en phase normale n’est pas compatible avec une détection ou des composés perfluorés qui se lient à la fraction basique des
par ICP-MS du fait de la nature fortement organique des phases peptides (comme l’acide trifluoroacétique), alors que pour doser
mobiles. Par ailleurs, les modes d’affinité et d’adsorption restent les anions, ce sont généralement des alkylsulfonates (C5 à C10) qui
confidentiels dans le domaine de la spéciation. Ces trois modes ne sont employés. La concentration de l’agent de paires d’ions varie
sont donc pas détaillés ici. généralement de 0,001 à 0,005 mol · L–1. La sélectivité peut être
efficacement contrôlée en faisant varier le pH de la phase mobile
■ Chromatographie à polarité de phases inversées ou en changeant sa polarité, c’est-à-dire en faisant varier les
La chromatographie liquide à polarité de phases inversées (RP), concentrations relatives en eau et en modificateur organique.
aussi appelée chromatographie en phase inverse, est le mode de ■ Chromatographie d’échange d’ions
séparation le plus populaire en HPLC [3]. Il vise à séparer les molé-
cules en fonction de leur polarité. La séparation des solutés est La chromatographie d’échange d’ions (IE) est généralement
obtenue par partage entre une phase stationnaire non polaire et employée dans le cas de composés ioniques ou ionisables [5]. La
une phase mobile polaire. Les phases stationnaires sont typique- séparation est fondée sur une compétition entre les solutés et l’ion
ment composées de microparticules de gel de silice liées à des développeur de la phase mobile, de même charge, vis-à-vis du
chaînes alkyles hydrophobes, telles que C18 ou C8. Les phases groupement fonctionnel de la phase stationnaire, de charge oppo-
mobiles sont quant à elles composées essentiellement d’eau en sée. La phase stationnaire est donc constituée d’un support greffé
début d’élution puis d’un pourcentage croissant de solvant orga- d’un groupement fonctionnel ionisé.
nique. Les composés polaires sont donc élués les premiers. La Les supports sont traditionnellement constitués par un
sélectivité peut être améliorée en jouant sur la nature du solvant copolymère styrène-divinylbenzène (résine), qui forme un sque-

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________________________________________________________________________________ COUPLAGE HPLC-ICP-MS ET APPLICATION À LA SPÉCIATION

lette croisé, augmentant la rigidité. Des matériaux de remplissage ■ Chromatographie à interaction hydrophile
à base de silice pelliculaire peuvent aussi être utilisés, mais ils pré-
La chromatographie à interaction hydrophile (HILIC) permet de
sentent une capacité moindre. Par ailleurs, les colonnes échan-
séparer les petites molécules polaires [7]. Cependant, des molé-
geuses d’ions dont la phase stationnaire est à base polymérique
cules ionisables de plus grande taille plus ou moins hydrophiles
semblent préférables à celles à base de silice, étant donné la dété-
peuvent aussi être analysées de cette manière. Elle se situe au
rioration rapide des conditions de séparation observées sur ces
croisement de trois autres modes de séparation : chromatographie
dernières et leur gamme de pH d’utilisation plus réduite
d’échange d’ions, en phase normale et en phase inverse.
(2 < pH < 8,5).

1
La plupart des phases stationnaires sont basées sur des sup-
Les groupements fonctionnels greffés diffèrent selon que des ports de silice classique ou des gels de silice modifiés à l’aide de
anions ou des cations sont à séparer. En échange d’anions, ce sont groupes fonctionnels polaires. Des phases stationnaires à base de
généralement des amines primaires à quaternaires (échangeur polymères peuvent aussi être utilisées. Toutefois, la silice pure est
faible) ou un groupement ammonium (échangeur fort). En échange la plus largement adoptée. Cette phase permet une bonne réten-
de cations, on retrouve communément le groupement sulfonate tion des composés positivement chargés en raison des interactions
(échangeur fort) ou le groupement carboxylate (échangeur faible). électrostatiques dues aux groupements silanols chargés négative-
Les phases mobiles sont des solutions aqueuses de sels (citrate, ment. Une phase stationnaire zwittérionique peut également être
phosphate...) comprenant l’ion développeur. Une solution tampon employée. Elle est constituée d’un groupement acide fort (acide
est généralement ajoutée pour contrôler le pH. La résolution peut sulfonique) et d’un groupement basique fort (ammonium quater-
être améliorée en modifiant la concentration des sels (et donc la naire) séparés par une courte chaîne alkyle. Le partage hydrophile
force ionique) de la phase mobile, afin d’augmenter la compétition et les interactions électrostatiques permettent donc aux composés
entre l’échantillon et l’ion développeur pour les sites ioniques de la chargés (positivement ou négativement) d’être retenus.
phase stationnaire. Un changement de pH peut également affecter Contrairement au mode RP, la phase mobile initiale est riche en
l’ionisation de l’analyte et celle de l’ion développeur et donc la solvant organique et c’est le pourcentage d’eau qui augmente au
rétention. Ainsi, des gradients de force ionique et de pH sont géné- cours du gradient. Par ailleurs, étant donné que les analytes sont
ralement utilisés pour optimiser la séparation. Un modificateur chargés, comme en chromatographie d’échange d’ions, le pH de la
organique (méthanol ou acétonitrile) à une concentration de moins phase mobile a une grande influence sur la séparation. En effet, en
de 10 % peut aussi influencer le mécanisme contrôlant l’interaction fonction du pH de la phase mobile, certains analytes peuvent être
hydrophobe des solutés avec la phase stationnaire. protonés ou déprotonés et peuvent donc être plus ou moins
solubles dans la phase mobile et donc plus ou moins retenus par
■ Chromatographie d’exclusion stérique
la phase stationnaire. Le pH peut également avoir un impact sur la
La chromatographie d’exclusion stérique (SEC) est une méthode nature de la phase stationnaire. En effet, à pH entre 5 et 9, les
de séparation où la rétention du soluté dépend de son volume groupements silanol de la silice sont ionisés négativement et ont
hydrodynamique [6]. La phase stationnaire des colonnes de SEC est donc une plus forte attraction électrostatique avec les cations.
constituée de silice ou de polymères organiques dont la taille
moyenne des pores peut varier de 100 à 1 000 Å. Pour l’élution, des ■ Modes mixtes
phases mobiles de force ionique assez élevée sont utilisées afin Afin de pouvoir séparer lors d’une même analyse des molécules
d’éviter les interactions des solutés avec le matériau de remplissage. qui ont des propriétés physico-chimiques très différentes, des
Leur pH doit être proche de celui de l’échantillon. En SEC, les com- colonnes comportant une phase stationnaire unique en mode mixte
posés de volume hydrodynamique élevé sont donc exclus totale- sont aujourd’hui commercialisées [8]. Par exemple, pour séparer
ment ou partiellement des pores de la phase stationnaire et sont simultanément des molécules polaires et non polaires, le groupe-
élués en premier alors que les plus petites molécules qui pénètrent ment fonctionnel classique utilisé en phase inverse (chaîne alkyle
dans les pores sont plus retenues. Le temps moyen pour qu’une hydrophobe) peut être combiné à un groupement diol hydrophile.
substance passe dans les pores de la phase stationnaire est donc Cette association permet alors d’utiliser des interactions hydro-
déterminé par sa grosseur qui, pour une molécule donnée, peut être phobe et hydrophile pour optimiser les séparations. De la même
directement reliée à sa masse moléculaire. Pour les systèmes chro- manière, des colonnes mixtes échange de cations/échange d’anions
matographiques correctement étalonnés en masse, il doit être pos- ou échange d’ions/phase inverse sont disponibles.
sible d’évaluer les masses moléculaires des composés séparés.
Cependant, même si, en principe, la séparation par SEC doit être
indépendante de la charge de l’analyte, en pratique, la surface de la 2.1.2.2 Diamètre des colonnes
phase stationnaire possède des propriétés ioniques, de telle sorte
Les différentes tailles de colonnes disponibles et leurs caractéris-
qu’un mode de séparation mixte est souvent observé, ce qui rend
tiques sont résumées dans le tableau 2. Les colonnes de dimen-
l’évaluation de la masse moléculaire approximative.
sion analytique (diamètre interne de l’ordre de 4,6 à 2 mm) sont
La SEC a plusieurs avantages par rapport aux autres modes de les plus courantes. En effet, les débits optimaux auxquels elles
chromatographie liquide. Le temps de rétention d’un composé fonctionnent sont tout à fait compatibles avec la détection ICP-MS
inconnu est plus ou moins prévisible dans un système chromato- et l’interface à mettre en place entre l’HPLC et l’ICP-MS est donc
graphique étalonné. Elle a cependant quelques inconvénients. assez simple (§ 2.3.1). Cependant, afin de réduire la consommation
Pour obtenir une résolution adéquate, les pics doivent être suffi- des solvants ou dans le cas où la quantité d’échantillon disponible
samment étroits car la colonne a une faible capacité. Ainsi pour un est très faible (par exemple pour les analyses d’échantillons biolo-
système complexe, il est difficile d’obtenir une résolution complète giques), le diamètre interne des colonnes peut être diminué. Ainsi,
des pics. Dans un objectif de spéciation stricto sensu, cette il est possible de travailler à l’échelle microbore (colonnes avec
méthode est donc applicable seulement à la séparation d’analytes des diamètres internes compris entre 2 et 1 mm), ou à l’échelle
qui n’ont pas des tailles trop proches. Mais, étant donné que les capillaire (diamètre interne de la colonne compris entre 0,3 et
colonnes de SEC tolèrent l’injection de matrices plus chargées que 0,15 mm) voire à l’échelle nano où les diamètres internes des
les autres mécanismes discutés précédemment sans dégradation colonnes peuvent descendre jusqu’à 0,01 mm. Outre la diminution
significative de la qualité des chromatogrammes, c’est un méca- de la consommation de solvants et d’échantillons, le principal
nisme qui trouve de nombreuses applications pour isoler des frac- avantage de l’utilisation de telles colonnes est un meilleur pouvoir
tions spécifiques (haut ou bas poids moléculaire par exemple) de résolution, comme le montre la figure 2, essentiellement du fait
d’échantillons ou d’extraits complexes, avant une analyse de spé- de la diffusion transversale réduite des analytes. L’efficacité de ces
ciation finale par HPLC-ICP-MS impliquant un autre mécanisme de colonnes permet donc de diminuer la quantité minimale d’élément
séparation. détectable ainsi que d’augmenter la sensibilité [9].

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1

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Analyse par injection en flux


continu (FIA)
1
par Stéphane BLAIN
Professeur à l’Université d’Aix-Marseille II

1. Bases théoriques et principes


de l’analyse en flux continu constant ................................................ P 1 510v2 — 2
1.1 Définitions .................................................................................................... — 2
1.2 Transport et dispersion de l’échantillon .................................................... — 2
1.3 Paramètres de la dilution-dispersion de l’échantillon en FIA .................. — 3
1.3.1 Définitions ........................................................................................... — 3
1.3.2 Hauteur de pic et volume injecté....................................................... — 4
1.3.3 Géométrie du parcours et débit ........................................................ — 4
1.3.4 Dispersion et fréquence d’injection .................................................. — 4
1.3.5 Règles d’utilisation du phénomène de dispersion de l’échantillon — 5
2. Instrumentation........................................................................................ — 5
2.1 Pompe........................................................................................................... — 5
2.2 Injecteur et modes d’injection .................................................................... — 5
2.3 Réacteur (manifold) ..................................................................................... — 5
2.4 Détecteur et enregistreur ............................................................................ — 6
2.5 Appareillages de FIA disponibles............................................................... — 6
3. Applications à l’analyse ......................................................................... — 6
3.1 Typologie des méthodes d’analyse en flux continu ................................. — 6
3.1.1 Facteur de dilution .............................................................................. — 6
3.1.2 Processus réactionnels....................................................................... — 6
3.2 Modes de mesure ........................................................................................ — 6
3.3 Exemples d’analyses en flux continu......................................................... — 7
3.3.1 Réactions chimiques........................................................................... — 7
3.3.2 Réactions enzymatiques .................................................................... — 8
3.3.3 Méthodes séparatives ........................................................................ — 9
3.4 Analyse à injection séquentielle (SIA) ....................................................... — 11
3.5 Analyse avec préconcentration .................................................................. — 11
3.6 Utilisation de la FIA in situ .......................................................................... — 12
4. Conclusions ............................................................................................... — 12
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 510v2

’analyse par injection en flux continu (Flow Injection Analysis FIA) consiste,
L dans son principe le plus simple, en l’injection d’un petit volume (µL) d’une
solution échantillon dans un fluide en mouvement ; ce liquide transporteur, qui
se déplace de façon continue, n’est pas segmenté, et la zone formée par l’injec-
tion répétée de l’échantillon est ainsi transportée vers un détecteur afin d’enre-
gistrer les variations d’un paramètre physique ou physico-chimique
caractéristique de l’échantillon ou, le plus souvent, de l’un de ses éléments
constitutifs.
Dans son principe, l’analyse en flux continu se distingue cependant de l’ana-
lyse en flux segmenté puisque en effet, dans ce dernier cas, les échantillons sont
Parution : mars 2006

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie est strictement interdite.
© Techniques de l’Ingénieur P 1 510v2 − 1

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ANALYSE PAR INJECTION EN FLUX CONTINU (FIA) ____________________________________________________________________________________________

séparés par des bulles d’air et conservent leur identité. De plus, pour cette der-
nière technique, si des réactions chimiques sont mises en jeu, on s’efforce
d’atteindre l’équilibre avant le passage dans le détecteur approprié, ce qui n’est
pas toujours le cas de la FIA. L’analyse en flux continu se distingue aussi des
méthodes de la chromatographie en phase liquide car elle ne fait, en général,
pas appel à la séparation des constituants du mélange à analyser.

1
On peut ainsi dire, de façon schématique, que l’originalité de l’analyse en flux
continu et de ses possibilités analytiques [1] est définie par les deux points
suivants :
— flux non segmenté ;
— dispersion contrôlée de l’échantillon dans le fluide transporteur.
Bien que récemment développée, la FIA est déjà largement utilisée dans les
laboratoires d’analyses : en 1990, plus de 3 000 articles avaient déjà été publiés.
Depuis, cette technique a suscité de nombreux travaux, tant sur ses aspects
théoriques que sur le plan technologique ou sur celui des applications analyti-
ques et, aujourd’hui, l’analyse par injection en flux continu est devenue une tech-
nique automatique rapide, simple et élégante. Plus récemment est apparue ce
qu’on appelle l’analyse à injection séquentielle qui dérive de la FIA mais pour
laquelle les débits sont variables au cours du temps.

1. Bases théoriques D’autres réactifs (c’est-à-dire d’autres liquides transporteurs) sont


éventuellement ajoutés au premier en différents points compris
et principes de l’analyse entre l’injection et le détecteur ; les différents liquides se déplacent
dans des tuyaux de faible diamètre intérieur, et cet ensemble cons-
en flux continu constant titue ce qu’on pourrait appeler un microréacteur.

Toutes les opérations mises en œuvre correspondent à une dis-


persion-dilution de l’échantillon dans le(s) liquide(s) transporteur(s)
Historique et ont pour seul but de réaliser les conditions qui permettront
ensuite la détection spécifique de l’un des constituants de l’échan-
tillon, ou de l’un de ses dérivés, quand la zone correspondante tra-
L’expression analyse par injection en flux continu (FIA) a été
versera le détecteur vers lequel l’entraîne(nt) le(s) liquide(s)
pour la première fois employée en 1975 par Ruzicka et Hansen
[2] pour désigner l’opération qui consistait à injecter avec une transporteur(s). Sur la figure 1 est représenté un appareillage qui
seringue hypodermique une solution échantillon dans un fluide permet la mise en œuvre de ce principe dans le cas le plus simple,
en mouvement ; cet échantillon était alors entraîné vers un ainsi que le profil de concentration de l’échantillon au cours de son
détecteur, un spectrophotomètre dans le cas d’une solution de transport vers le détecteur.
phosphates ou un détecteur potentiométrique dans le cas d’une
solution d’ammoniaque. Pratiquement, le passage dans un détecteur de la zone qui corres-
Auparavant, on peut trouver une première évocation de ce pond à l’injection d’un échantillon conduit à une réponse qui pré-
type de méthode dans les travaux de Nagy et al. [3] où une sente l’allure caractéristique indiquée sur la figure 2 : on obtient un
chambre de mélange placée sur le parcours d’une solution pic dissymétrique, avec une pente initiale très grande, et qui
injectée dans un électrolyte transporteur permettait une homo- s’achève dans une décroissance d’allure exponentielle ; naturelle-
généisation rapide et complète de cette solution à analyser avec ment, le long du parcours se vérifie l’élargissement de la zone qui
l’électrolyte. correspond à l’échantillon et, pour des temps suffisamment longs et
en fonction des processus mis en jeu, le pic devient alors plus large
et symétrique et présente une allure gaussienne (figure 2 c).

1.1 Définitions
1.2 Transport et dispersion
de l’échantillon
On définit aujourd’hui l’analyse en flux continu, dans son prin-
cipe général, par l’injection d’un petit volume (µL) d’une solution Le transport et la dispersion de l’échantillon mettent en jeu un
échantillon dans un fluide en mouvement, non segmenté, avec phénomène de convection et de diffusion ; de plus, une réaction chi-
la possibilité d’imposer à cet échantillon, pendant son transport, mique peut affecter l’un des constituants A, à la concentration CA, de
sous des conditions hydrodynamiques contrôlées, tout un l’échantillon. L’équation différentielle qui prend en compte ces diffé-
ensemble de processus chimiques, physico-chimiques ou physi- rents aspects ainsi que la géométrie du microréacteur, et exprime la
ques (dilution, réactions chimiques, passage à travers des mem- concentration CA, en fonction du temps et de la position de l’échan-
branes de dialyse, extraction liquide-liquide, etc.). tillon, entre l’injection et la détection, est la suivante :

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___________________________________________________________________________________________ ANALYSE PAR INJECTION EN FLUX CONTINU (FIA)

Différentes solutions à cette équation complexe ont été pro-


posées, qui supposent des hypothèses simplificatrices (coefficients
qui traduisent la dispersion radiale D̃ RA et axiale D̃ LA indépendants
P I D du temps, vitesse du flux constante, notée <V >) et ne prennent pas
en compte, le plus souvent, une réaction chimique couplée [4].
R
S Dans ce cas, la résolution de l’équation avec des conditions aux
limites classiques conduit à une expression de la concentration en

1
L
fonction de la longueur L parcourue par l’échantillon qui est la
suivante :
Y

1 < V > L ⁄ D LA 1/2 ( < V > L ⁄ D LA ) ( 1 – θ ) 2


D détecteur en flux continu R réactif
I injection de l’échantillon C A = --- C A0 ----------------------------- exp – ------------------------------------------------------ (2)
S sortie 2 πθ 4θ
L longueur du réacteur (manifold) Y enregistreur
P pompe
avec C A0 concentration initiale du constituant A dans
a appareillage simple de FIA
l’échantillon,

θ = t <V >/L,

t temps de séjour.
Injection Détection
L’écart-type σ (unité de temps), lorsqu’on peut admettre le carac-
tère gaussien de la courbe, est donné par :
b représentation du phénomène de dispersion de l’échantillon

Figure 1 – Principe de l’analyse par injection en flux continu σ 2 = 2 D̃ LA L ⁄ < V > 3

a b c
1.3 Paramètres de la dilution-dispersion
de l’échantillon en FIA
C D
C0
1 1.3.1 Définitions
Cmax

Dans une approche plus pragmatique de l’analyse en flux continu


Cmax qui s’appuie sur les phénomènes expérimentaux, différents termes
H0 2 – temps de séjour, facteur de dilution – sont définis pour caractériser
Hmax
cette méthode. Ces termes permettent de décrire les conditions opé-
2σ 0,61Cmax
4 ratoires d’un système FIA et de comparer entre eux différents résul-
0,5 Cmax tats expérimentaux.

Le temps t écoulé entre le début de l’injection et le maximum du


4σ t pic est appelé temps de séjour.
C max concentration de l’échantillon au maximum du pic Le facteur ou coefficient de dilution (appelé aussi coefficient de
D coefficient de dilution dispersion) D, terme qui ne traduit que de façon impropre les phéno-
σ écart-type
t temps
mènes de transport, de dilution, de dispersion qui affectent l’échan-
tillon dans le liquide vecteur depuis son injection jusqu’à son
a injection de l’échantillon à la concentration C 0 passage dans le détecteur, est mesuré par le rapport :

b profil de dispersion dissymétrique


D A = C A0 ⁄ C Amax (3)
c profil de dispersion gaussien
avec C A0 concentration initiale du constituant A de
Figure 2 – Allure du signal obtenu en FIA l’analyte,

C Amax concentration du constituant A de l’échantillon


∂ CA au maximum du pic.
---------- + V ⋅ ∇ C A = ∇ ⋅ ( D̃ A ⋅ ∇ C A ) + R A (1)
∂t La dilution-dispersion de l’échantillon dans le liquide vecteur cor-
respond aussi à une dilution-dispersion de ce dernier dans l’échan-
avec V vecteur vitesse du flux de liquide, tillon comme l’indique la figure 3 ; on peut définir un facteur de
dilution du liquide vecteur DV. Pour une seule ligne de réactif et pour
RA terme correspondant à la cinétique de la réaction DA, coefficient de dilution du constituant A de l’échantillon, on mon-
chimique, tre que [5] :
D̃ A coefficient anisotrope qui traduit le phénomène
de dispersion. 1/DA + 1/DV = 1 (4)

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123
1

124
Chromatographie et techniques séparatives
(Réf. Internet 42385)

1– Méthodes chromatographiques 2
2– Autres méthodes séparatives Réf. Internet page

Extraction sur phase solide pour l'analyse de composés organiques P1420 127

Microextraction en phase solide (SPME) P1430 131

Électrophorèse capillaire. Principe P3365 137

Electrophorèse capillaire. Applications P3367 143

Électrophorèse capillaire. Appareillage P3366 151

Décantation-Filtration P1415 155

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125
2

126
Référence Internet
P1420

Extraction sur phase solide pour


l’analyse de composés organiques

par Valérie PICHON


Maître de Conférences, Dr, HDR
2
Laboratoire Environnement et Chimie analytique (LECA)
École Supérieure de Physique et Chimie Industrielles (ESPCI)

1. Extraction sur phase solide................................................................... P 1 420 — 3


2. Mode de couplage.................................................................................... — 3
3. Rendements d’extraction et analyse quantitative .......................... — 4
4. Volume de fin de fixation....................................................................... — 5
5. Présentation des supports conventionnels ...................................... — 7
6. Nouveaux supports pour une extraction plus sélective ............... — 9
7. Domaines d’applications de l’extraction sur phase solide .......... — 11
8. Méthodes d’extraction non exhaustives ........................................... — 12
9. Conclusions et perspectives................................................................. — 14
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. P 1 420

algré la mise en œuvre de techniques de séparation performantes asso-


M ciées à des modes de détection de plus en plus sensibles et spécifiques,
l’efficacité de la procédure analytique est encore limitée par l’étape de prépara-
tion de l’échantillon. Il s’agit d’une étape importante puisque l’on estime que
30 % des erreurs commises au cours de l’analyse globale lui sont imputables et
que l’analyste lui consacre 60 % de son temps. Les stratégies adoptées lors de
cette étape sont diverses et dépendent de la nature du soluté, de la nature de
l’échantillon et du niveau de concentration recherché.
Il apparaît cependant important de développer des méthodes rapides, fiables
(ce qui implique la diminution du nombre d’étapes intermédiaires : transferts,
évaporations, dérivations...), pouvant être facilement automatisées et qui per-
mettent de limiter l’utilisation de solvants organiques, conformément à la
législation en vigueur. Basées sur ces principes, des méthodes variées applica-
bles à un type d’échantillon ou facilement adaptables à des échantillons d’origi-
nes variées sont apparues et ont montré un fort potentiel.
Il n’y a plus de doute sur le fait que l’extraction sur phase solide (SPE, Solid-
Phase Extraction) soit devenue la technique la plus répandue de traitement des
échantillons liquides avant analyse ; en témoigne le nombre de fournisseurs pro-
posant actuellement des produits SPE (phases disponibles sous différents for-
mats, robots...). Cette méthode d’extraction sur phase solide est de plus en plus
mise en œuvre pour les échantillons liquides en raison de sa grande facilité d’uti-
lisation, puisqu’elle est directement applicable pour l’analyse des eaux (l’étape de
filtration étant souvent intégrée à l’étape d’extraction), ou nécessite un simple trai-
tement préalable (dialyse, ultrafiltration), notamment pour les fluides biologiques.
Son émergence est particulièrement liée aux réglementations sur les solvants
Parution : décembre 2006

organiques, mais aussi au fait que l’extraction liquide-liquide, longtemps utili-


sée, ne peut être appliquée à l’extraction de composés polaires de l’eau, du fait
de leur faible affinité pour ces solvants. Son évolution a été facilitée par la

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est strictement interdite. − © Editions T.I. P 1 420 − 1

127
Référence Internet
P1420

EXTRACTION SUR PHASE SOLIDE POUR L’ANALYSE DE COMPOSÉS ORGANIQUES __________________________________________________________________

commercialisation de phases de natures très variées et dédiées à des composés


et à des échantillons très différents, et soutenue par une évolution rapide des for-
mats disponibles (cartouches de différentes capacités, disques, plaques à 96-
puits) ainsi que des automates adaptés à ces différents formats.
Cette technique SPE tire sa richesse de la diversité des supports disponibles
actuellement ou en cours de développement, comme les matériaux à empreinte
moléculaire ou les immunoadsorbants, qui permettent d’augmenter la sélectivité
de l’étape d’extraction et ainsi facilitent la détection des composés lors de l’analyse.
Dérivée de l’extraction liquide-solide, la microextraction sur fibres (Solid-
Phase Micro-Extraction, SPME) conduit aussi à des résultats très prometteurs.

2 Dans cette méthode, les composés organiques sont extraits par une fibre de
silice enrobée d’un polymère puis directement transférés dans l’injecteur en
chromatographie en phase gazeuse (CG), l’injection en chromatographie en
phase liquide (CL) étant encore peu développée. C’est une méthode simple,
rapide, sans solvant et qui ne nécessite qu’un petit volume d’échantillon. Elle est
basée sur l’équilibre de partage de l’analyte à extraire entre l’échantillon et la
fibre recouverte d’un polymère. D’autres techniques d’extraction non exhausti-
ves basées sur ce principe sont actuellement en cours de développement.
Ce dossier a pour objectif de présenter les principes de base de ces méthodes
et d’illustrer leur potentiel par des applications à différents domaines.
(0)

Notations et symboles
Notation Désignation
ε porosité
d .i . diamètre interne
keau facteur de rétention dans l’eau
lg P constante de partage n-octanol/eau
N efficacité
Vc volume de la colonne
Vf volume de fin de fixation
V fexp volume de fin de fixation déterminé expérimentalement
Vm volume maximal
Vr volume de rétention
V rc volume de rétention calculé
Abréviations
CG chromatographie en phase gazeuse
CL chromatographie en phase liquide
DVB divinylbenzène
GCB carbone noir graphitisé
IS immunoadsorbant
LPS support à base de particules de grande granulométrie
MIP polymère à empreintes moléculaires
MSPD extraction par dispersion d’un support solide
NVP n-vinylpyrolidone
PDMS polydiméthylsiloxane
PGC carbone graphite poreux
PS-DVB polystyrène-divinylbenzène
RAM phase à accès restreint
RMN résonance magnétique nucléaire
SBSE extraction par adsorption sur barreau
SDB styrène-divinylbenzène
SM spectrométrie de masse
SPDE extraction dynamique sur phase solide
SPE extraction sur phase solide
SPME microextraction sur phase solide

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Référence Internet
P1420

__________________________________________________________________ EXTRACTION SUR PHASE SOLIDE POUR L’ANALYSE DE COMPOSÉS ORGANIQUES

1. Extraction sur phase solide En fait, le dépassement de la capacité du support est rarement
atteint lors de l’extraction de composés à l’état de traces, compte
tenu des faibles concentrations fixées. Il est admis qu’un support
peut retenir, sans dépassement de capacité, une masse totale de
composés correspondant à 5 % de sa masse. De mauvais rende-
1.1 Principe ments s’expliquent donc principalement par des volumes de fin de
fixation faibles, dus à une faible affinité du soluté pour l’adsorbant.
Une fois ce volume défini, il est donc important de choisir convena-
L’extraction liquide-solide est basée sur la distribution des compo- blement l’adsorbant, de sorte que son affinité vis-à-vis des solutés
sés entre la phase liquide (échantillon) et la phase solide (adsorbant recherchés soit maximale, et de vérifier que le volume fixé peut être
choisi). C’est, en première approximation, un processus apparenté à percolé sur cet adsorbant sans que les solutés soient élués. Parallè-
celui de la chromatographie d’élution qui utiliserait l’adsorbant lement, il apparaît important de choisir un volume d’échantillon
comme phase stationnaire : si le soluté présente une forte affinité

2
nécessaire et suffisant pour répondre à la limite de sensibilité
vis-à-vis de l’adsorbant, il y reste totalement fixé au cours de la per- attendue, souvent fixée par une réglementation.
colation de l’échantillon aqueux (figure 1). Le soluté est ensuite
désorbé par un petit volume de solvant éluant.
La connaissance des mécanismes de rétention mis en jeu en chro-
matographie en phase liquide est donc directement transposable à
cette technique d’extraction et facilite ainsi la mise au point de la 2. Mode de couplage
méthode.

Cette étape d’extraction peut être totalement dissociée de l’ana-


lyse chromatographique (préconcentration dite « en différé ») ou
1.2 Volume et facteur d’enrichissement être totalement intégrée au système chromatographique (précon-
centration dite « en ligne »).
La sélection d’un adsorbant conduisant à une forte rétention des
analytes étudiés est primordiale si l’on souhaite percoler de grands
volumes d’échantillon. Cela est indispensable pour l’analyse des
eaux pour laquelle les faibles niveaux de concentration recherchés 2.1 Extraction en différé
impliquent l’obtention, par l’étape d’extraction-concentration, de
facteurs d’enrichissement élevés. C’est aussi le cas dans le domaine
de la santé lorsqu’il est nécessaire, pour diminuer les interactions de Dans la méthode en différé, l’adsorbant est contenu dans une car-
l’analyte avec la matrice biologique, d’ajouter à l’échantillon ou au touche entre deux frittés ou incorporé dans la matrice d’une mem-
solvant de lavage un peu de solvant organique diminuant, de ce fait, brane de filtration. Après conditionnement de l’adsorbant (souvent
l’affinité de l’analyte pour l’adsorbant. par un solvant équivalent au solvant d’élution puis un passage
Pour aboutir à un facteur d’enrichissement maximal, il est néces- d’eau pure), l’échantillon est percolé (figure 1). Certaines substan-
saire d’obtenir des rendements d’extraction voisins de 100 % pour ces retenues en même temps que les analytes étudiés peuvent alors
de grands volumes d’échantillon. Or les composés à extraire peu- être éliminées par passage d’un petit volume d’eau contenant éven-
vent être perdus pendant l’étape de préconcentration et cela peut tuellement une faible proportion de solvant organique (solution de
être la conséquence de deux phénomènes distincts : faible force éluante afin de ne pas perdre les analytes). L’adsorbant
peut être ensuite séché puis les analytes sont élués de celui-ci à
— le volume de l’échantillon préconcentré est trop grand et le
l’aide d’un faible volume d’un solvant éluant qui peut être évaporé
soluté est élué par le solvant qui le constitue, l’eau par exemple, le
afin d’obtenir un extrait plus concentré. On considère que le volume
volume de fin de fixation Vf (cf. définition § 4) est alors atteint ;
d’éluant doit être supérieur ou égal à deux fois le volume mort de
— la capacité du support a été dépassée. l’adsorbant soit d’environ 0,3 mL pour 100 mg de phase. Cependant,
cette valeur n’est qu’un guide, puisque le volume nécessaire à l’élu-
tion dépend forcément de la force éluante du solvant et de l’inten-
sité de l’interaction entre l’analyte et le support. Cet extrait sec peut
être ensuite repris dans un solvant compatible avec la méthode
A B C D
d’analyse. Le principal avantage de cette méthode est qu’il n’existe
pas de contraintes de compatibilité entre la nature de l’adsorbant et
le système analytique utilisé. Seule la nature du solvant de redisso-
lution de l’extrait doit être compatible avec le système chromatogra-
phique. De plus, il n’y a pas de limite au niveau de la quantité de
phase utilisable qui peut varier entre 100 et 1 000 mg. Les volumes
percolés peuvent atteindre plusieurs centaines de millilitres. Des
cuves munies d’un système d’aspiration sous vide permettent de
traiter jusqu’à 24 échantillons simultanément. L’automatisation de
toute la procédure de préconcentration sur cartouches ou sur dis-
ques est désormais possible grâce à des robots permettant de réa-
A Conditionnement liser chaque étape en séquentiel. Néanmoins, si cette
B Percolation de l'échantillon
automatisation permet de réduire les risques de contamination et
C Élimination des interférents, séchage Évaporation d’augmenter le nombre d’échantillons traités en un temps restreint,
sous azote ou par aspiration d'air les risques de pertes au cours de l’étape d’évaporation et la perte en
D Élution Redissolution Analyse facteur d’enrichissement due à l’injection d’une fraction de l’extrait
demeurent. Le tableau 1 rassemble un certain nombre de causes de
pertes et les solutions qui peuvent être envisagées pour améliorer
Figure 1 – Description d’une procédure d’extraction les rendements.

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est strictement interdite. − © Editions T.I. P 1 420 − 3

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Référence Internet
P1420

EXTRACTION SUR PHASE SOLIDE POUR L’ANALYSE DE COMPOSÉS ORGANIQUES __________________________________________________________________

(0)

Tableau 1 – Différentes causes permettant d’expliquer les mauvais rendements obtenus par extraction
liquide-solide en différé et solutions pour y remédier
Causes de pertes en rendements Solutions
Dépassement de la capacité de l’adsorbant (rare pour l’analyse Augmentation de la quantité de phase
de traces)
Percolation d’un volume supérieur au volume de fin de fixation Vf Pour conserver le même volume percolé :
• augmenter la quantité de phase
• changer la nature de l’adsorbant
Adsorption des composés hydrophobes sur les parois Ajout d’un solvant organique dans le flacon contenant l’échantillon (5

2
des flacons, tubes... à 10 % en volume)
Perte au cours de l’étape d’évaporation (1) • Utiliser des conditions d’évaporation les plus douces possibles
• Ne pas évaporer jusqu’à sec
Mauvaise redissolution de l’extrait sec obtenu (1) • Choisir des solvants de nature adaptée à la nature des solutés
• Ne pas évaporer jusqu’à sec
(1) Tester cette étape par dopage direct du solvant d’élution à évaporer

2.2 Couplage en ligne de l’extraction avec Colonne


l’analyse Pompe

Le couplage en ligne de l’étape d’extraction avec l’analyse en CL


s’est considérablement développé, ces dernières années, avec la
commercialisation de systèmes automatisés. Dans cette méthode,
une précolonne de petite taille est installée à la place de la boucle Pompe
sur une vanne d’injection classique (figure 2).
Échantillon
Après percolation de l’échantillon via une pompe ordinaire (vanne Précolonne
en position de chargement), la précolonne est couplée à la colonne
analytique (en tournant la vanne en position d’élution). Les compo-
Poubelle
sés retenus dans la précolonne sont alors élués et transférés en tête
de colonne analytique par la phase mobile d’analyse en même
temps qu’ils sont séparés. Aucune manipulation sur l’échantillon Vanne en position de chargement Phase mobile
n’intervient, ce qui exclut tout risque de contamination ou de perte. Vanne en position d'élution
Pour ce couplage en ligne, il faut tenir compte de la force éluante de
la phase mobile utilisée pour la séparation analytique, puisqu’elle Figure 2 – Description d’un système d’extraction en ligne
doit permettre un transfert rapide des solutés de la précolonne à la
colonne analytique. Une des différences entre les deux modes de
couplage réside dans la taille des particules. Des particules de l’ordre détecteurs sensibles et sélectifs qui lui sont associés, incluant un
de 40 à 150 µm sont utilisées en cartouche en différé pour faciliter couplage facile avec la spectrométrie de masse. Cependant, l’appli-
l’écoulement des échantillons et des solvants par gravité ou simple cation de ce couplage à l’extraction de composés de matrices
aspiration par un vide peu poussé. En revanche, l’emploi de pompes aqueuses est délicate, en raison de la présence d’eau résiduelle
supportant des pressions de quelques bars permet d’utiliser des par- dans l’adsorbant qu’il est nécessaire d’éliminer. Cela explique l’utili-
ticules de plus faible granulométrie (50 à 20 µm). De plus, la quantité sation encore très académique de ce couplage [1].
de phase est limitée par la taille de la précolonne. En effet, dans un
système en ligne, la précolonne et la colonne analytique sont con-
nectées en série au moment de la réélution. Un élargissement des
pics peut avoir lieu si le couplage des deux systèmes est incorrect. Il 3. Rendements d’extraction
est alors recommandé d’utiliser des précolonnes de plus petits dia-
mètres ou d’un diamètre équivalent au diamètre de la colonne ana- et analyse quantitative
lytique soit, par exemple, l’utilisation de précolonnes de dimensions
1-2 cm × 2-4 mm de diamètre interne (d.i.) pour un couplage avec
une colonne de dimensions 15-25 cm × 4,6 mm d.i. La quantité Le rendement est défini par le rapport entre la quantité de soluté
d’adsorbant est alors d’environ 20 mg et dépasse rarement 100 mg. extraite et la quantité percolée. Ce rendement est en théorie de
Cela entraîne, comme on le verra, une limitation au niveau des volu- 100 %, si le volume percolé est inférieur au volume de fin de fixation
mes percolables. Cependant, contrairement à la méthode en différé Vf. De ce fait, le rendement d’un soluté dépend du volume percolé et
où seule une fraction de l’extrait redissous est injectée, entraînant du volume de fin de fixation de ce soluté, ces deux paramètres étant
ainsi une perte en facteur d’enrichissement, la totalité des composés liés aux propriétés physico-chimiques du soluté (coefficient de par-
retenus sur la précolonne est transférée en tête de colonne analyti- tage n-octanol/eau (lg P), pKa, solubilité...) et à la nature de l’adsor-
que et analysée, ce qui permet, à partir d’un volume d’échantillon bant choisi.
plus faible, d’atteindre une sensibilité équivalente à celle de la
■ Pour la méthode d’extraction en différé, la mesure des rendements
méthode en différé qui met en jeu de plus grands volumes.
est basée sur la comparaison du signal détecté (aire ou hauteur de
L’extraction liquide-solide peut aussi être couplée en ligne à la CG, pic) après injection de l’extrait dans le système chromatographique
l’intérêt étant de mettre à profit le grand pouvoir de séparation avec le signal obtenu par injection directe d’une quantité de solutés
qu’offre cette technique et l’utilisation d’une grande gamme de équivalente à un rendement de 100 % (en tenant compte des pertes

Toute reproduction sans autorisation du Centre français d’exploitation du droit de copie


P 1 420 − 4 est strictement interdite. − © Editions T.I.

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P1430

Microextraction en phase solide


(SPME)

par Gwenola BURGOT


Professeur honoraire des universités
Université de Rennes1, Rennes, France 2
Cet article est la version actualisée de l’article [P 1 430] intitulé « Microextraction en phase
solide (SPME) » rédigé par Gwenola Burgot et Fernand Pellerin, et paru en 2003

1. Présentation et comparaison avec d’autres méthodes ............. P 1 430v2 - 3


2. Bases théoriques .................................................................................. — 3
2.1 Aspect thermodynamique : étude de l’équilibre ................................... — 3
2.2 Aspects cinétiques ................................................................................... — 5
3. Mise en œuvre ....................................................................................... — 7
3.1 Configuration du système d’adsorption ................................................ — 7
3.2 Revêtement des fibres ............................................................................. — 8
3.3 Modalités pratiques de mise en œuvre.................................................. — 10
4. Optimisation de la microextraction en phase solide ................. — 12
4.1 Sélection du mode d’extraction.............................................................. — 12
4.2 Sélection de la nature et de l’épaisseur du revêtement de la fibre ..... — 12
4.3 Mise en œuvre d’une étape de dérivation ............................................. — 12
4.4 Optimisation du temps d’extraction....................................................... — 14
4.5 Optimisation du rendement d’extraction............................................... — 14
4.6 Optimisation de la désorption ................................................................ — 16
5. Avantages et inconvénients.............................................................. — 16
6. Applications........................................................................................... — 17
6.1 Domaine environnement......................................................................... — 17
6.2 Domaine agroalimentaire........................................................................ — 18
6.3 Domaine biologique ................................................................................ — 19
6.4 Chimie légale............................................................................................ — 20
6.5 Domaine pharmaceutique et phytothérapie.......................................... — 21
6.6 Pétrochimie............................................................................................... — 21
6.7 Détermination de constantes thermodynamiques................................ — 21
7. Conclusion.............................................................................................. — 21
8. Glossaire ................................................................................................. — 21
Pour en savoir plus ....................................................................................... Doc. P 1 430v2

et article s’adresse aux analystes qui sont concernés par la préconcentra-


C tion de composés, le plus souvent à l’état de traces, dans des matrices
complexes. Les méthodes traditionnelles demandent du temps, un volume
d’échantillon important, de grandes quantités de solvant de haute pureté ou sont
susceptibles d’extraire des impuretés qui peuvent accroître le bruit de fond des
appareils de mesure. La microextraction en phase solide (SPME) est une
méthode d’extraction sans solvant qui ne présente pas ces inconvénients. Les
composés sont extraits par adsorption sur le revêtement d’une fibre ou d’un
capillaire. Ce procédé ne correspond pas à une extraction totale du composé
mais à son équilibre entre la matrice et le revêtement de la fibre. Dans certaines
conditions, il existe une relation entre la quantité de substance adsorbée sur le
Parution : juin 2019

Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservés P 1 430v2 – 1

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Référence Internet
P1430

MICROEXTRACTION EN PHASE SOLIDE (SPME) ___________________________________________________________________________________________

revêtement et sa concentration dans l’échantillon (ou matrice) si celui-ci a subi


une pré-transformation). Le revêtement le plus utilisé est le PDMS (polydimé-
thylsiloxane) mais de nouveaux polymères (polypyrrole, vinyléthers couronnes
et polymères à empreinte moléculaire) ont élargi les applications. Le choix du
mode d’extraction par immersion dans l’échantillon ou dans son espace de
tête influence la cinétique des échanges. Les rendements d’extraction
dépendent du volume d’échantillon, du pH, de la force ionique, de la constante
d’équilibre, de la température et de l’agitation. Le couplage de la SPME à des
techniques chromatographiques, électrophorétiques et de spectrométrie de
masse permet l’exploitation quantitative du procédé. Cet article rappelle le prin-
cipe de la méthode et donne des éléments pour sa mise en œuvre avant

2
d’aborder les applications telles que le dosage de contaminants organiques dans
les sols, l’air ou les eaux, la recherche de pesticides dans les aliments. Mais
aussi le dosage de substances médicamenteuses dans les matrices biologiques.
Sont également abordées les études métabolomiques ou recherche de métabo-
lites permettant d’apprécier l’impact de substances toxiques sur les organismes.
Un glossaire en fin d’article regroupe les définitions importantes ou utiles à
la compréhension du texte.

Sigle Unité Description Principaux sigles


a m Rayon interne de la fibre de silice CW/DVB Carbowax®/divinylbenzène
Rayon total de l’ensemble fibre et CW/TPR Carbowax®/templated resin
b m
revêtement
Direct analysis in real time (analyse directe en
g · L–1 ou DART
C Concentration du composé à extraire temps réel)
mol · L–1
Desorption electrospray ionization (desorption
δ m Épaisseur de la couche statique DESI
par électrospray)
Variation d’enthalpie molaire de DVB Divinylbenzène
ΔH J · mol–1 distribution de l’échantillon entre la
fibre et la matrice Environmental Protection Agency (agence de
EPA
protection de l’environnement américaine) [27]
K – Coefficient de distribution
GBL γ-butyrolactone
n – Nombre de moles de substance
GHB Acide γ-hydroxybutyrique
R J · mol–1 · K–1 Constante des gaz parfaits
Temps nécessaire à l’obtention de Gaz chromatography (chromatographie en phase
min GC
te
l’équilibre gazeuse)

Temps nécessaire pour extraire 95 % HAP Hydrocarbure aromatique polycyclique


t95 min
de la quantité extraite à l’équilibre Chromatographie en phase liquide haute pression
HPLC
T K Température ou haute performance

V m3 Volume Headspace-SPME (microextraction en phase


HS-SPME
solide à partir de l’espace de tête)
Indices
f : revêtement de la fibre e : espace de tête Ion mobility spectrometry (spectrométrie par
: matrice liquide 0 : initiale IMS
∞ : à l’équilibre m : matrice mobilité d’ions)
IT-SPME In-tube SPME (SPME capillaire)
Principaux sigles Liquid chromatography (chromatographie en
LC
phase liquide)
Benzène, toluène, éthylbenzène et isomères
BTEX
o, m, p du xylène Matrix assisted laser desorption/ionisation
MALDI (source d’ionisation laser assistée par une
Capillary liquid chromatography matrice)
Cap-LC (chromatographie liquide capillaire ou
miniaturisée) TOF Time of flight (analyseur à temps de vol)
Coated Blade Spray (lame enduite et extraction MS Mass spectrometry (spectrométrie de masse)
CBS
par nanoelectrospray)
PA Polyacrylate
Capillary electrophoresis (electrophorèse
CE PDMS Poly(diméthylsiloxane)
capillaire)

P 1 430v2 – 2 Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservés

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Référence Internet
P1430

___________________________________________________________________________________________ MICROEXTRACTION EN PHASE SOLIDE (SPME)

Principaux sigles réutilisée une centaine de fois. L’adsorption se fait sur la fibre
revêtue qui est :
PEEK Polyétheréthercétone – soit introduite directement dans l’échantillon (on parle
PMVCS Polyméthylvinylchlorosilane d’extraction par immersion) si il s’agit de liquide ou de gaz ;
– soit exposée à l’espace de tête (on parle d’extraction à partir
Stir Bar Sorptive extraction (extraction sur de l’espace de tête) pour les échantillons liquides plus com-
SBSE
barreau d’agitation) plexes.
Solid phase extraction (extraction en phase
SPE
solide)
L’échantillon est le produit brut, par exemple de la terre ou
Solid phase microextraction (microextraction en du sang total. La matrice correspond à une portion d’échantil-
SPME
phase solide) lon qui a subi une transformation pour faciliter l’extraction

2
Thin-film microextraction (microextraction sur ultérieure d’un composé, par exemple, le plasma qui
TFME contient le composé à extraire obtenu par centrifugation du
couche mince)
sang total.
Ultra high pression liquid chromatography L’espace de tête correspond à la phase gazeuse en équi-
UHPLC
(chromatographie liquide ultra haute pression) libre avec un échantillon liquide ou solide introduit dans un
UV Spectromètre UV petit flacon (1 à 3 cm3) et chauffé à de faible température. Cela
suppose que la matrice n’est pas volatile.

La désorption des molécules se fait par voie thermique dans


1. Présentation l’injecteur d’un chromatographe en phase gazeuse ou par entraî-
nement par la phase mobile si l’analyse est réalisée par chromato-
et comparaison graphie en phase liquide. D’autres techniques d’analyse ont pu
être couplées à la SPME (électrophorèse capillaire, spectrométrie
avec d’autres méthodes de masse...). Le phénomène d’adsorption ou de partage mis en jeu
ne correspond pas à une extraction totale. Il a pu être modélisé et
l’influence de la nature et de l’épaisseur du polymère, la durée de
La microextraction en phase solide SPME (Solid Phase Micro l’extraction et les conditions de désorption ont été étudiées. La
Extraction ) est une nouvelle méthode d’extraction sans solvant SPME ne constitue pas une version miniaturisée de la SPE.
de molécules organiques plus ou moins polaires, volatiles ou Le champ d’application de cette nouvelle méthode d’extraction
non, à partir d’échantillons aqueux, solides ou gazeux, même à et de concentration de l’échantillon est vaste et couvre tous les
l’état de traces. Les composés sont extraits par adsorption sur domaines dont les échantillons sont complexes et nécessitent
une fibre de silice fondue revêtue d’un polymère. Initialement l’extraction de composés à l’état de traces : environnement,
conçus sous forme de fibre, les supports ont évolué ainsi que le agroalimentaire, biologie, toxicologie, pharmacie et chimie
milieu adsorbant pour améliorer l’efficacité de l’extraction. légale [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10].

Développée à la fin des années 1980 par Arthus et Pawliszyn


(université Waterloo, Canada) [1] [2], la commercialisation de la
SPME date de 1993 par Supelco (Bellefonte, PA, États-Unis) (pour 2. Bases théoriques
les fibres et les supports) et son automatisation de 1996 par Varian
(passeur automatique d’échantillons).
La théorie de la microextraction en phase solide (SPME) a été
Alors que les méthodes d’analyse se perfectionnent et voient largement développée par Pawliszyn et ses collaborateurs [1] [11]
leurs limites reculer au-delà des picomoles, les méthodes d’extrac- [12]. Cette technique s’apparente à la chromatographie d’adsorp-
tion et de préconcentration des échantillons restent encore lon- tion. Dans sa configuration la plus ancienne sou