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24/04/2020

Cours de
Génie Génétiques
Dr. O. HASSAÏNE

Maître de Conférence à l’Université d’Oran 1.


Département de Biotechnologie.

SUPPORT ET ORGANISATION DE
L’INFORMATION GENETIQUE

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Le support de l’information génétique

Le support de l’information génétique

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Mécanisme de réplication de l’ADN

trois étapes:

A\ L’initiation.

B\ L’élongation.

C\ La terminaison.

Mécanisme de réplication de l’ADN

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Mécanisme de réplication de l’ADN


3’
5’
Brin Directeur

5’
3’

Amorce (Primer) d’ARN

Fragment d’Okazaki

Brin retardé 3’
5’

Mécanisme de réplication de l’ADN


3’
5’
Brin Directeur

5’
3’

Amorce (Primer) d’ARN

Fragment d’Okazaki

Brin retardé 3’
5’

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Mécanisme de réplication de l’ADN


3’
5’
Brin Directeur

5’
3’

Amorce (Primer) d’ARN

Fragment d’Okazaki

Brin retardé 3’
5’

Mécanisme de réplication de l’ADN

3’
5’
Brin Directeur

Brin retardé 3’
5’

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Le support de l’information génétique


• Comme tous les protistes procaryotes, les
bactéries possèdent un appareil nucléaire
constitué d'acide desoxyribonucléique (ADN)
qui est le support de l'information génétique.

• L'ADN chromosomique est constitué d'une


double hélice d'ADN circulaire.

• Cette double hélice est pelotonnée,


surenroulée dans le cytoplasme grâce à
l'action des topoisomérases (au nombre de 4
chez les bactéries).

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• Déplié, le chromosome bactérien a près de 1 mm de


long (1000 fois la longueur de la bactérie) et 3 à 5
nanomètres de large.

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• L'analyse chimique de l'appareil nucléaire


indique qu'il est composé
 à 80 % d'ADN (le chromosome),
 à 10 % d'acide ribonucléique ou
ARN (rôle de structuration)
 à 10 % de protéines.

• Formes topologiques : L'ADN bactérien qui


est circulaire peut exister sous trois formes
topologiques (superenroulée, relachée,
linéaire) objectivées par plusieurs
techniques telle l'ultracentrifugation, la
microscopie électronique ou tout
simplement l'électrophorèse en gel
d'agarose (technique d'usage courant).

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• Ces dernières sont représentées en particulier


par les ADN polymérases qui copient les
doubles brins d'ADN, les topoisomérases,
surtout les ADN gyrases, qui les déroulent
pour permettre l'action des polymérases, et
des ARN polymérases qui assurent la synthèse
des divers ARN.

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Acide désoxyribonucléique

les bases azotées peuvent s'associer deux à


deux par des liaisons hydrogènes

Les règles de Chargaff.

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La double hélice (modèle rubans)

La double hélice

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Caractéristiques importantes de l’ADN :

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Visualisation des fragments d’ADN

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La réplication de l’ADN
Le cycle cellulaire
Les cellules passent la majorité de leur temps en phase G0 (copie d’ADN en ARN).

Lorsqu’elles se divisent, elles doivent doubler leur ADN (copie d’ADN en ADN), afin que les
deux nouvelles cellules obtenues soient identiques.

La réplication semi-conservative

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La réplication semi-conservative

La réplication de l’ADN est semi-conservatoire


Chaque brin de l’hélice bicaténaire sert de matrice à la synthèse d’un brin fils.
Chaque molécule fille d’ADN contient un brin parental et un brin fils nouvellement synthétisé.

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Complémentarité des bases

La réplication de l’ADN est bi-directionnelle


Pour un ADN de procaryote circulaire, deux réplisomes ou réplicateurs vont en sens inverse à partir d’une origine
commune. Pour un ADN d’eucaryote linéaire et de beaucoup plus grande taille, la réplication démarre en un très
grand nombre de sites (jusqu’à 6000 fourches de réplication).

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L'ADN extra-chromosomique

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a- Les plasmides

Hartl, D., Jones, E., (2003). Génétique : Les grands principes. Paris : Dunod.

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• Plasmide: Élément génétique extra -


chromosomique se répliquant
indépendamment du chromosome de la
cellule hôte. On peut ne trouver qu'une
copie plasmidique par bactérie ou au
contraire en rencontrer de nombreuses. Si
elles sont plusieurs, les copies se
répartissent dans les cellules filles lors de la
division, au hasard ou de manière contrôlée.
Certains plasmides, comme le facteur F,
peuvent s'intégrer au génome de l'hôte.

• A côté du chromosome, support de


l'hérédité, la bactérie peut contenir des
éléments génétiques (ADN) de petite
taille (0,5 à 5 % du chromosome
bactérien), extra-chromosomiques.

• Ces éléments, appelés plasmides, ne


sont pas indispensables à la vie de la
bactérie dans les conditions habituelles
de croissance.

• Ils se répliquent indépendamment et en


général plus rapidement que le
chromosome bactérien.

• On les détecte lorsque les gènes qu'ils


transportent confèrent à la bactérie de
nouvelles propriétés.

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• Les plus connus de ces plasmides sont les


suivants :
– Le facteur sexuel ou facteur F: Le facteur sexuel
ou facteur F assure le transfert de fragments de
chromosome bactérien par conjugaison
(appariement de deux bactéries).

– Les plasmides de résistance aux antibiotiques (ou


facteurs R): Ils portent des gènes qui confèrent aux
bactéries la résistance à divers antibiotiques.

– La résistance codée par les gènes plasmidiques est


souvent liée à la production d'enzymes qui
inactivent les antibiotiques.

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– Les autres plasmides: Certains plasmides sont


responsables de la virulence (ex. : production de
toxines), de la résistance aux antiseptiques, du
métabolisme de certains composés (lactose, lysine,
etc...), et de la dégradation de substances, par
exemple le toluène, l'octane et l'acide salicylique.

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• Les plasmides permettent ainsi aux bactéries


de s'adapter à un environnement hostile.

PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES

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PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES

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Les Outils Enzymatiques du


Génie Génétique

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(A) - Les Enzymes de Restriction

Ce sont des endonucléases coupant de maniére définie et reproductible l’ADN double-brin


quelle que soit son origine.
Phage λ
Souche A Souche B
de E. coli de E. coli

Plage de lyse sur Tapis bactérien


tapis bactérien sans Plage de lyse
+
Lyse Analyse de l’ADN du phage Pas de Lyse
par la méthode de Southern

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Nomenclature des Enzymes de Restriction


Escherichia coli R y13
Plus de 500 enzymes de Restriction

-1ère lettre : Majuscule, qui est l’initiale du Genre


bactérien d’où a été extraire l’endonuclease.
EcoR I : 1ère enzyme trouvée chez E. coli
EcoR V: 5ème enzyme trouvée chez E. coli
-2ème lettre: Minuscule, correspondent au Espèce de la
bactérie d’où l’enzyme est extraite.

-Chiffre romain: représente le numéro d’ordre de


découverte de l’enzyme dans une même bactérie.

-Enfin, si cela est nécessaire, une lettre majuscule


représentant la souche bactérienne peut être ajoutée.

Les 3 types d’Enzymes de Restriction

La propriété qui caractérise les enzymes de restriction est de connaitre une séquence
d’ADN. L’action de l’enzyme après cette reconnaissance dépend de son type:

-Enzyme de type I: une fois la séquence reconnue l’enzyme se déplace sur l’ADN, s’arrête
de manière aléatoire 1 000 à 5 000 pb plus loin et libère quelques 10aines de nucéotides.

-Enzyme de type II: une fois la séquence reconnue, l’enzyme coupe l’ADN au niveau de
cette séquence.

-Enzyme de type III: ces enzymes reconnaissent une séquence et coupent une 20aines de
nucléotides plus loin.

Seules les enzymes de Type II sont utilisées au laboratoire.

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Les Enzymes de Restriction de Type II :

Les séquences reconnues :


La longueur des séquences reconnues est comprise entre 4 a 8 bases.
Les séquences reconnues sont palindromiques. Ceci signifie que la séquence est identique sur les
deux brins quand elle est lue dans le sens 5’3’. La coupure s’effectue donc sur les deux brins au
même site.

Eco RI : 5’ G AATT C3’


3’ C TTAA G5’

Les types de coupures:

des coupures à bouts francs (blunt ends ou flush ends) Hae III

5’—GG CC—3’
3’—CC GG—5’

5’—GG + CC—3’
3’—CC GG—5’

des coupures à cohésifs ou « protrusifs »


Eco RI

5’—G AATT C—3’


3’—CTTAA G—5’

5’—G + AATTC—3’
3’—CTTAA G—5’

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Les types de coupures:

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(B) – Autres Enzymes d’usage courant en


Génie Génétique et Biologie Moléculaire

Les polymérases d’acides nucléiques.

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(B) – Autres Enzymes d’usage courant en


Génie Génétique et Biologie Moléculaire

Les polymérases d’acides nucléiques.

La transcriptase inverse:
transcrit l’ARN en ADN complémentaire (cDNA). Elle travaille dans le sens 5’ 3’. C’est une enzyme codée
par le gène pol des rétrovirus. Elle leur permet de répliquer leur ARN génomique.
Cette enzyme est employée chaque fois qu’il est nécessaire de copier de l’ARN en ADN.
-La construction des banques d’ADN complémentaire (cDNA).
-La PCR sur ARN messager

(B) – Autres Enzymes d’usage courant en


Génie Génétique et Biologie Moléculaire

Les polymérases d’acides nucléiques.


l’ADN polymérase I:
Possède 3 activités:
- ADN polymérase dans le sens 5’3’ à partir d’une amorce 3’OH (ARN ou ADN simple brin). L’ADN
synthétisé est strictement complémentaire de la matrice.
-Une activité exonucléases dans le sens 5’3’
-Une activité exonucléases dans le sens 3’5’
Cette enzyme est utilisée toutes les fois qu’il nécessaire de synthétiser un ADN à partir d’une matrice.
Elle est utilisée:

 La détermination de la séquence d’un ADN par la


méthode des di-désoxynucléotides.
 Synthèse des sondes très radioactives
 La transformation d’extrémités cohésifs en bout francs.
 La construction de vecteurs à partir d’ADN simple brin.

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La Taq polymérase :

La Taq polymérase (aussi appelée « Taq pol » ou simplement « Taq ») est une
variété d'ADN polymérase thermostable nommée d'après Thermus aquaticus, une
bactérie thermophile à partir de laquelle cette enzyme a été isolée pour la
première fois en 1969.

Sa demi-vie enzymatique à 95 °C est de 40 minutes.

Elle est dépourvue d'activité exonucléasique, ce qui rend donc impossible la Structure d'une Taq polymérase liée à
correction d'erreur lors de la copie de l'ADN au niveau de son site actif

l’ARN polymérases :

L’ARN polymérase II est l’enzyme de la transcription des gènes exprimés sous forme de protéines.
Elle est présente dans tous les noyaux cellulaires.
La transcription qu’elle catalyse nécessite des ribonucléosides triphosphates comme substrats
(ATP, CTP, GTP et UTP), plusieurs cofacteurs protéiniques

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Les ligases

Les DNA ligases catalysent la liaison de l’extrémité 5’-phosphate terminale d’un brin d’ADN avec
l’extrémité 3’-OH terminale d’un autre brin

La DNA ligase de E. coli

La DNA ligase de E. coli ne lie les bouts francs de l’ADN qu’en présence de réactifs d’exclusion (polyéthylène
glycol ou Ficoll), mais elle est toujours active pour souder les fragments d’ADN double brin à extrémités
collantes, ou pour fermer une brèche dans un brin d’ADN dont la resynthèse est achevée.
La DNA ligase de E. coli utilise le NAD+ comme coenzyme donneur d’énergie

Elle n’a pas d’activité sur les RNA.


Les DNA ligases sont utilisées dans le clonage des fragments d’ADN et dans la construction des vecteurs.

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RNA ligase :

La RNA ligase du bactériophage T4 catalyse la liaison des fonctions 5’-phosphate des ADN ou ARN simple
brin à la fonction 3’-OH d’autres fragments simple brin d’ARN ou d’ADN. L’enzyme est capable de lier un
fragment d’un seul nucléotide.
La RNA ligase du bactériophage T4 est utilisée pour le marquage des ARN sur leur extrémité 3’ et pour la
synthèse d’oligonucléotides.

Les nucléases:
La désoxyribonucléase I
La désoxyribonucléase I est l’enzyme de la digestion des ADN chez les animaux. Elle hydrolyse les ADN double
ou simple brin jusqu’à un mélange de nucléotides et d’oligonucléotides. Elle agit comme une endonucléase,
préférentiellement sur les liaisons adjacentes aux nucléosides pyrimidiques. En présence de Mg++ elle hydrolyse
les liaisons au hasard indépendamment de la séquence ; en présence de Mn++ elle devient plus dépendante de
la séquence.

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Ribonucléase A

La ribonucléase A est l’enzyme de la digestion des ARN chez les animaux. Elle agit comme une endonucléase,
préférentiellement après les nucléotides à pyrimidine, en hydrolysant la liaison entre le phosphate et le carbone 5’
du nucléotide suivant. Elle hydrolyse les ARN jusqu’à un mélange d’oligonucléotides se terminant tous par un
nucléotide à pyrimidine estérifié par un phosphate en 3’.

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Clonage et vecteur de clonage


(Technologie de l’ADN recombinant)

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L'ADN extra-chromosomique
Les plasmides

Hartl, D., Jones, E., (2003). Génétique : Les grands principes. Paris : Dunod.

• A côté du chromosome, support de


l'hérédité, la bactérie peut contenir des
éléments génétiques (ADN) de petite
taille (0,5 à 5 % du chromosome
bactérien), extra-chromosomiques.

• Ces éléments, appelés plasmides, ne


sont pas indispensables à la vie de la
bactérie dans les conditions habituelles
de croissance.

• Ils se répliquent indépendamment et en


général plus rapidement que le
chromosome bactérien.

• On les détecte lorsque les gènes qu'ils


transportent confèrent à la bactérie de
nouvelles propriétés.

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• Les plus connus de ces plasmides sont les suivants :


– Le facteur sexuel ou facteur F: Le facteur sexuel ou
facteur F assure le transfert de fragments de
chromosome bactérien par conjugaison (appariement de
deux bactéries).

– Les plasmides de résistance aux antibiotiques (ou


facteurs R): Ils portent des gènes qui confèrent aux
bactéries la résistance à divers antibiotiques.

– La résistance codée par les gènes plasmidiques est


souvent liée à la production d'enzymes qui inactivent
les antibiotiques.

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– Les autres plasmides: Certains plasmides sont


responsables de la virulence (ex. : production de toxines),
de la résistance aux antiseptiques, du métabolisme de
certains composés (lactose, lysine, etc...), et de la
dégradation de substances, par exemple le toluène,
l'octane et l'acide salicylique.

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Le clonage permet l’insertion d’un fragment d’ADN dans


un vecteur permettant ainsi d’en obtenir plusieurs copies

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Présentation d’un vecteur de clonage


• Grande diversité des vecteurs : (détaillée en B)
• Cosmides
• Bactériophages
• Chromosomes artificiels de levure (YAC) et de bactérie (BAC)
• Plasmides : très souvent utilisés, réplication dans les bactéries (exemple choisi)

• Les vecteurs utilisés en génie génétique ont souvent une


origine naturelle (plasmides, bactériophages) mais ont été
largement modifiés

Présentation d’un vecteur : Propriétés du vecteur

a) Vecteur

Plasmide : petite molécule


extrachromosomique, d'ADN
Origine de double brin circulaire, de 3 à 10
réplication kilobases. Capable de se
dans la répliquer indépendamment du
bactérie chromosome bactérien et pouvant
être transféré d'une cellule à une
autre.

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Présentation d’un vecteur : Propriétés du vecteur

a) Vecteur

Plasmide : petite molécule


extrachromosomique, d'ADN
Origine de double brin circulaire, de 3 à 10
réplication kilobases. Capable de se
dans la répliquer indépendamment du
bactérie chromosome bactérien et pouvant
être transféré d'une cellule à une
autre.

Présentation d’un vecteur : Propriétés du vecteur

a) Vecteur

Plasmide : petite molécule


extrachromosomique, d'ADN
Origine de double brin circulaire, de 3 à 10
réplication kilobases. Capable de se
dans la répliquer indépendamment du
bactérie chromosome bactérien et pouvant
être transféré d'une cellule à une
Marqueur de autre.
sélection :
résistance contre
l'antibiotique
kanamycine

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Présentation d’un vecteur : Propriétés du vecteur

Site de clonage multiple :


a) Vecteur
nombreux sites de restriction)
uniques permettant l'insertion de
l'ADN après le promoteur

Plasmide : petite molécule


extrachromosomique, d'ADN
Origine de double brin circulaire, de 3 à 10
réplication kilobases. Capable de se
dans la répliquer indépendamment du
bactérie chromosome bactérien et pouvant
être transféré d'une cellule à une
Marqueur de autre.
sélection :
résistance contre
l'antibiotique
kanamycine

Présentation d’un vecteur : Propriétés du vecteur


Promoteur (pour pouvoir
exprimer la protéine d'intérêt il Site de clonage multiple :
a) Vecteur
faut cloner la séquence d'ADN nombreux sites de restriction (voir
en phase avec le promoteur 4)) uniques permettant l'insertion
(cf. cadre de lecture de la de l'ADN après le promoteur
traduction)
Plasmide : petite molécule
extrachromosomique, d'ADN
Origine de double brin circulaire, de 3 à 10
réplication kilobases. Capable de se
dans la répliquer indépendamment du
bactérie chromosome bactérien et pouvant
être transféré d'une cellule à une
Marqueur de autre.
sélection :
résistance contre
l'antibiotique
kanamycine

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Les classes de plasmides :


1-Les plasmides de première génération : Ce sont les premiers à avoir été utilisés en génie
génétique. Ce sont des plasmides à l’état naturel, non modifiés au laboratoire. Il s’agit des plasmides
suivants :
• ColE1
• RSF 2124
• pSC 101

2-Les plasmides de deuxième génération : Ce ne sont pas des plasmides


naturels mais résultent de plusieurs transformations : plasmides "artificiels".
La série la plus importante de ces plasmides est la série pBR 312 à pBR 322. Le plasmide pBR 322
est constitué de 4,4 Kb et possède deux gènes de résistance : un pour la tétracycline (TcR), l’autre
pour l’amplicilline (ApR). il possède, en plus, 20 sites uniques pour les endonucléases de
restriction dont 11 localisés sur les deux gènes de résistance :

Tableau N°4 : Localisation des de restriction sur les gènes de résistance TcR et ApR

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3- Les plasmides de troisième génération : Ce sont des plasmides pBR à l’origine mais rendus
plus performants et permettant d’obtenir des recombinants sans passer par des sous-clonages.
Remarque : Un plasmide pUC (plasmide of University of California) est un plasmide pBR
dans lequel on a remplacé le gène de résistance à la tétracycline (qui sert à repérer les plasmides
recombinés) par un gène bactérien lacZ.

3-1- La famille pUC : Ont une taille qui avoisine 2,6 Kb et ayant intégré les gènes de résistance à
l’ampicilline (ApR) et lacZ. Un polylinker identique à celui du phage M13 est associé à lacZ. Les
différents pUC (de pUC8 à pUC19) ne différent que par le nombre de nucléotides et l’emplacement
du polylinker :

Le polylinker du plasmide pUC 19 contient, en plus Sph I, Xba I, Kpn I et Sst I par rapport à pUC8 et
Hinc II au lieu de Hinc I.
Remarque : Il existe d’autres familles de plasmides de troisième génération, telles que la les
familles pSP et pGEM®.

Vecteur pUC19

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La régulation de l’expression des


gènes : l’opéron lactose

Dans les années soixante,


Jacob et Monod découvrent le
premier système de régulation
de l’expression des gènes,
qu’ils nomment l’"opéron"
lactose. Il s’agit du système qui
gère la régulation de la
production d’une enzyme (qui
intervient au début de la
chaîne de métabolisme du
lactose) en fonction de la
concentration de lactose dans
le milieu.

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Déterminer l’orientation relative


Orientation 1
AX A X

AX Orientation 2 A X

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HYBRIDATION MOLECULAIRE

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Complémentarité

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I – DEFINITION de la FUSION et de L’HYBRIDATION MOLECULAIRE

ADN
double brin

Dénaturation
- chauffage > Tm
- agent dénaturant

ADN
simple brin

glace refroidissement
progressif

Simple brin REAPPARIEMENT


HYBRIDATION

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II- FACTEURS DE L’HYBRIDATION

-Température de fusion

-Facteurs influençant l’hybridation

- la C% d’ADN et le temps
COT ( ADN) et ROT (ARN)

- la température

- la complexité des séquences

- la force ionique

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III - Les différents types d’hybridation

L’hybridation peut avoir lieu

1 - en solution
2 - sur support solide :
- immobilisation de la cible sur une membrane (nitrocellulose, nylon), sur verre
- colonies bactériennes
- chromosomes
- coupe de tissus...

Objectif : détecter la présence d'un acide nucléique d'une séquence donnée par l’utilisation
d’un fragment d’ADN complémentaire = sonde

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IV – APPLICATIONS DE L’HYBRIDATION

1- Hybridation d’ADN sur support solide : SOUTHERN BLOT

▪ Procédure
– Extraction ADN
– Fragmentation
– Électrophorèse
– Transfert
– Hybridation, lavages, révélation

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▪ Applications
- Recherche d’altérations sur un gène
- Empreintes génétiques
-…

Southern blot : illustrations RFLP

Hybridation d’ARN sur membrane Northern Blot

▪ Procédure

– Extraction ARN
– Électrophorèse
– Transfert
– Hybridation, lavages, révélation

▪ Application

- Analyse de l’expression d’un gène


- Recherche de variant d’épissage

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Hybridation d’ADN in situ

• Procédure
– Hybridation de sondes fluorescentes sur chromosomes en métaphase

• Applications
– Recherche de remaniements du génome
– Localisation d’un gène
–…

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Localisation chromosomique

Rouge : sonde gène


Vert: sonde centromere chromosome 2

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LES SONDES

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Sonde nucléique (définition)

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Les différents types de sondes

- les sondes ADN génomique


- les sondes cDNA
- les oligosondes
- les ribosondes

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Marquage : random priming

• La synthèse d’un brin marqué de DNA peut aussi être faite par une DNA polymérase à partir d’amorces contenant
des séquences aléatoires. Ces amorces sont obtenues par synthèse chimique d’oligonucléotides contenant au
hasard chacune des quatre bases à chaque position. On peut aussi utiliser un produit de digestion poussée d’un
ADN génomique réduit en fragments aléatoires de 6 à 12 nucléotides.

• Dans les deux cas, un ou plusieurs des oligonucléotides s’hybrident avec la séquence en 5’ du fragment d’intérêt
(ADN simple brin) et servent d’amorces pour la synthèse d’un deuxième brin.

• Si cette opération est réalisée en présence de nucléotides substrats fortement marqués, le marqueur sera
incorporé dans le DNA synthétisé.

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Marquage : nick translation

• Le « déplacement de brèche » (nick translation) est une technique de marquage utilisant les propriétés de la
DNA polymerase I (E. coli), pour obtenir des sondes radioactives.
• L’ouverture d’une brèche dans la structure primaire d’un des deux brins d’un fragment d’ADN est obtenue par
l’action de la désoxyribonucléase pancréatique.
• La DNA polymérase synthétise un nouveau brin d’ADN à partir de l’extrémité 3’OH terminale d’un coté de la
brèche ainsi créée. Simultanément l’activité 5’→3’ exonucléase de la DNA pol I hydrolyse les nucléotides du
coté 5’-phosphate de la même brèche. Il en résulte un déplacement de la brèche le long de l’ADN avec un
remplacement des nucléotides du brin coupé.
• Si cette opération est réalisée en présence de nucléotides substrats fortement marqués, le marqueur sera
incorporé dans le DNA synthétisé. Pour éviter la formation de structures en épingles à cheveux, la synthèse
doit être maintenue très lente à une température basse : 16° C

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Marquage : polynucléotide kinase

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-4-
Détermination de la séquence d’un acide nucléique

Le Séquençage d’ADN

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Marquage : polynucléotide kinase

• La polynucléotide kinase catalyse le transfert du phosphate γ de l’ATP sur une fonction alcool du carbone 5’ d’un
ADN ou d’un ARN. Le substrat requiert une déphosphorylation préalable si la fonction est estérifiée. L’enzyme
catalyse aussi l’échange du phosphate 5’ terminal d’un ADN ou d’un ARN avec le phosphate γ de l’ATP, en
présence d’ADP comme accepteur de phosphate.
• La polynucléotide kinase du commerce est extraite d’une bactérie (E. coli) infectée par le bactériophage T4. Une
unité d’enzyme catalyse le transfert de 33 picomoles de phosphate par minute à 37° C.
• La polynucléotide kinase est utilisée au laboratoire pour incorporer du phosphate radioactif (32P) sur l’extrémité 5’
d’un acide nucléique, soit par transfert, soit par échange.

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Autoradiographie du gel de séquence

ddGTP ddATP
ddTTP ddCTP
A C G T

A
AT
ATG
ATGC
ATGCT
Migration

ATGCTA
Lecture

ATGCTAC
ATGCTACG
ATGCTACGT
ATGCTACGTC
ATGCTACGTCA
ATGCTACGTCAA
ATGCTACGTCAAC
ATGCTACGTCAACT
ATGCTACGTCAACTA

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Séquençage de l’ADN : la méthode de


Sanger

O NH2
O NH2
HN N N N
NH N
O N O N N N NH2 N N
3- 3-
HO 9P3 O O HO 9P3 O O 3-
HO 9P3 O 3-
HO 9P3 O
O O

OH OH OH OH
dTTP dCTP dGTP dATP

O NH2
O NH2
HN N N N
NH N
O N O N N N NH2 N N
3- 3-
HO 9P3 O O HO 9P3 O O 3-
HO 9P3 O 3-
HO 9P3 O
O O

ddTTP ddCTP ddGTP ddATP

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Séquençage de l’ADN : la méthode de


Sanger
Primer
5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ ADN polymérase
3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’ dATP, dTTP, dCTP et dGTP
 dATP radioactif P32
Tube 1 + ddTTP
-----ATGCTACGTCAACTA----- Tube 2 + ddCTP
-----TACCATGCAGTTGAT -----ATGCTACGTCAACTA-----
-----TACCATGCAGTT -----TACCATGC
-----TACCATGCAGT -----TACC
-----TACCAT -----TAC
-----T

Tube 4+ ddATP
Tube 3 + ddGTP -----ATGCTACGTCAACTA-----
-----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGCAGTTGA
-----TACCATGCAGTTG -----TACCATGCA
-----TACCATGCAG -----TACCA
-----TACCATG -----TA

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ddT-BigDye terminator

Me2N O NMe2

émission
Cl COO

Cl
O NH

Transfert O
d’énergie NH
O O O

OOC
H
N O
O
O NH
O
excitation 3-
HO 9P3 O O

Le séquençage automatique

3’

Sens de la lecture sur


un autoradiogramme

5’

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GenBank Data
Year Base Pairs Sequences
2008 99,116,431,942 98,868,465

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La PCR
Polymerase Chain Reaction
ou réaction de polymérisation en chaîne

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Le support de l’information génétique

Mécanisme de réplication de l’ADN

trois étapes:

A\ L’initiation.

B\ L’élongation.

C\ La terminaison.

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24/04/2020

Mécanisme de réplication de l’ADN

Mécanisme de réplication de l’ADN


3’
5’
Brin Directeur

5’
3’

Amorce (Primer) d’ARN

Fragment d’Okazaki

Brin retardé 3’
5’

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Mécanisme de réplication de l’ADN


3’
5’
Brin Directeur

5’
3’

Amorce (Primer) d’ARN

Fragment d’Okazaki

Brin retardé 3’
5’

Mécanisme de réplication de l’ADN


3’
5’
Brin Directeur

5’
3’

Amorce (Primer) d’ARN

Fragment d’Okazaki

Brin retardé 3’
5’

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Mécanisme de réplication de l’ADN

3’
5’
Brin Directeur

Brin retardé 3’
5’

PCR (Polymerase Chain Reaction)


DÉFINITION
En 1983, Karry Mullis (prix Nobel,1993) met au point une technique
d’amplification de l’ADN: la PCR (Polymerase Chain Reaction ou
Réaction de Polymérisation en Chaîne). Aujourd’hui c’est une
technique incontournable et couramment utilisée en routine dans
les laboratoires.

En deux mots, c’est une réaction enzymatique qui permet de


sélectionner puis d’amplifier en une très grande quantité un
fragment d’ADN particulier, présent en très faible quantité au
départ, parmi des millions d’autres fragments.

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1993 Nobel Prize in Chemistry


Karry Mullis

PCR (Polymerase Chain Reaction)


PRINCIPE
La PCR est une suite de cycles, qui se répètent en boucle,
comportant chacun trois paliers de température. De plus, chacun
de ces paliers est caractérisé pas une réaction chimique distincte.
En moyenne une PCR comporte entre 20 et 40 cycles.

Les acteurs de la PCR sont:


L’ADN
Avant la réaction de PCR, l’ADN est extrait à partir de l’échantillon
que l’on veut analyser (salive, cheveux, cellules, fossile…). Puis,
cet extrait purifié en ADN, contenant le fragment d’ADN que l’on
souhaite amplifier, peut être utilisé en PCR.

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Les deux amorces


Ce sont des fragments courts d'ADN, capables de s'hybrider de
façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, sur l’un
des deux brins d'ADN.
Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN
à amplifier. La taille de ces amorces est généralement d’une
vingtaine de désoxyribonucléotides. De plus, les amorces sont en
très forte concentration par rapport à celle de l’ADN à amplifier.

Les DésoxyriboNucléotides-Tri-Phosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)


Les dNTPs (Désoxyribonucléotides-Tri-Phosphates) sont des molécules de base,
qui constituent l’ADN, utilisés par la Taq polymérase pour la synthèse du
nouveau brin d’ADN complémentaire.

L’enzyme, Taq polymérase


L’enzyme utilisée est une polymérase, c'est-à-dire qu’elle peut synthétiser un
nouveau brin d’ADN à partir du brin d’ADN matrice après s’être fixée à une
amorce.

Le milieu réactionnel
Le milieu réactionnel de la PCR comporte l’ADN à amplifier, les dNTPs, les deux
amorces, la Taq polymérase, un tampon et des ions magnésium (MgCl2). Ces
deux derniers composants définissent un milieu avec un pH optimal et une
concentration saline optimale pour le bon fonctionnement de l’enzyme.

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Les acteurs de la PCR :

Bloc chauffant

Clavier pour la
programmation des cycles

Thermocycleur

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Consomables

Chaque cycle est donc constitué de trois périodes différentes:

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1- La dénaturation:
La température dans le tube est réglée à 95°C. A ce moment là,
l’ADN se dénature.
En effet, l’ADN perd sa structure caractéristique en double
hélice, les liaisons hydrogène reliant les bases de chaque brin
d’ADN étant instables à cette température. L’ADN double-brin
(2 brins) est dénaturé en ADN simple brin (1 brin).

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2- L’hybridation:
Ensuite la température est descendue à la température dite
d’hybridation. Cette dernière est généralement comprise entre
50°C et 60°C et elle est fonction de la composition en
désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dGTP, et dCTP) des
amorces. Les amorces reconnaissent et se fixent à leurs
séquences complémentaires en reformant des liaisons
hydrogène. On dit que les amorces s’hybrident au brin d’ADN

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3- L’élongation:

Puis la température est réglée à 72°C, température idéale pour


l’activité de la Taq polymérase.
C’est une enzyme très spéciale, puisqu’elle est dite
thermorésistante. En effet, sa température optimale d'action est
de 72°C et elle est capable de résister à des températures allant
jusqu’à 100°C.
Cette Taq polymérase est extraite d’une bactérie extrêmophile,
Thermus aquaticus, qui ne vit que dans les sources chaudes. En
effet, c’est en 1969 que Thomas Brock découvre cette bactérie
thermophile, dans le plus grand geyser du monde, le Steamboat
Geyser, au parc de Yellowstone aux Etats-Unis.

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• La PCR

Visualisation des Produits de PCR sur gel d’agarose

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METHODE
Préparer une série de microtubes PCR 0.2μl stériles identifies
correspondant au nombre d’échantillons d’ADN plus le témoin négatif.
Dans un seul tube stérile préparer un Mixe pour 7 réactions (5
échantillons + 1 témoin négatif + 1 réaction supplémentaire):

Réactif Concentration Volume Volume


finale (une réaction de 25µl) (n+1*=12 réactions)
H2O distillée _ µl
stérile
Tampon 10X 1X 2.5µl 17.5
Amorce 1 0.2 µM 1 µl 7
Amorce 2 0.2 µM 1 µl 7
d NTPs 200 µM 0.5µl 3.5
Taq polymérase. 1 Unité 0.1µl 0.7
L’ADN matriciel 100 ng/µl µl _

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Programme de PCR

30 cycles
initiation Dénaturation
:94°C pendant 5 min 94°C pendant 30 sec. Élongation Élongation finale

Hybridation 72°C pendant 30 sec 72°C pendant 7 min

64°C pendant 1 min

Les applications de la PCR


A. La recherche d'une pathologie:
-En parasitologie
-En bactériologie (ex : tuberculose)
-En virologie
-En oncologie (gènes impliqué dans la cancérogenèse) .
On met en évidence l'absence, ou la présence, dans le prélèvement d'un fragment d'ADN
spécifique de l'agent causal.

B. Le diagnostic des maladies héréditaires (diagnostic anténatal)


Identification sur un gène d'une mutation connue et identifiée (ex : mucoviscidose
« maladie des mucus visqueux ») ou d'une délétion , responsables et caractéristiques de la
maladie recherchée.

La mucoviscidose est une maladie génétique, affectant les épithéliums


glandulaires de nombreux organes. C'est une grave maladie qui touche
notamment les poumons et entraîne de graves difficultés respiratoires.

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Avant, une telle opération nécessitait impérativement :

 le clonage de la séquence.
 Son isolement.
 Son amplification dans une cellule hôte
 Sa purification.

Cette méthode extrêmement lourde et longue a été dès que possible abandonnée au
profit de la PCR.

D’autres applications de la PCR


 Recherche d’OGM
 Détection de polymorphismes
 Séquençage
 Recherche de paternité

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Qu'est ce que la mutagénèse par PCR ?

Les portions en rouge représentent les régions apportant une mutation.


Cette mutation se retrouve, in fine, dans le produit d'amplification.

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Qu'est ce que la mutagénèse par PCR ?

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