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· Aspect historique du

microscope à fluorescence :
La fluorescence a été découverte la première fois en 1845
par Fredrick W. Herschel. Il a découvert que la lumière UV
peut exciter une solution de quinine (par exemple l ’eau
tonique) pour émettre la lumière bleue. Mais ce n’est qu’en
2006 que le premier microscope à fluorescence a été mis au
point. Puis en 2008, il équipait déjà des laboratoires.

· C'est quoi la microscope à


fluorescence?
La microscopie à fluorescence est une technique utilisant
un microscope optique en tirant profit du phénomène de
fluorescence, au lieu de, ou en plus de l'observation
classique par réflexion, ou absorption de la lumière visible
naturelle ou artificielle. On peut ainsi observer divers objets,
substances (organiques ou inorganiques) ou échantillons
d’organismes morts ou vivants.

· Les différents éléments d'un


microscope à fluorescence :
Un microscope àfluorescenceest un microscopephotonique,
composé :

o De 2 sources de lumières : • Une lampe halogène pour


étudier les échantillons en transmission comme avec les
microscopesde routineclassiques. • Une lampe à arc (par
exemple une lampe à vapeur de mercure) qui possède des
raies caractéristiques dans son spectre et qui permet
d'exciter les fluorochromesutilisés
pourmarquerl'échantillon.

o D'un trajet optique qui comprend différentes lentilles, des


prismes, des cubes de fluorescences (filtre d'excitation +
miroir dichroïque + filtre d'émission), des objectifs et des
oculaires.

o D'un capteur(le plus souvent uncapteurCCD).

· Avantages et inconvénients:
o Avantages : • Prise en main du microscope facile et rapide
• Acquisition des images rapide • Particulièrement adapté
pour l'étude d'échantillons sensibles aux fortes illuminations
comme les cellules vivantes.

o Inconvénients: • Les images peuvent manquer de netteté,


entre autre, à cause de la visualisation de la fluorescence
émise hors focus. Pour remédier à ce problème, il est
possible de déconvoluer les images. Ce traitement permet
grâce à un calcul, d'éliminer le flou dû à la fluorescence
émise hors focus.

· Explication de la notion de
fluorescence :
La fluorescenceest une émission lumineuse provoquée par
diverses formes d'excitation autres que la chaleur. Elle peut
servir à caractériser un matériau (Bois, papier, pierre… )

Une molécule fluorescente (fluorophoreou fluorochrome)


possède la propriété d'absorber de l’énergie lumineuse
(lumière d'excitation) et de la restituer rapidement sous
forme de lumière fluorescente (lumière d'émission) par une
molécule fluorescente appelée un fluorochrome.

· Explication de la notion de
fluorochrome :
Un fluorochrome (ou fluorophore) est une sorte de colorant
fluorescent utilisé pour tracer les protéines, les tissus et les
cellules avec un marqueur fluorescent pour leur examen
ultérieur par microscopie à fluorescence. Un fluorochrome
fonctionne en absorbant l'énergie d'une région de longueur
d'onde spécifique, communément appelée la plage
d'excitation, et en ré-émettantcette énergie dans une autre
région de longueur d'onde spécifique, communément
appelée la plage d'émission.

Les fluorochromes sont caractérisés par plusieurs


paramètres tels que : • Les longueurs d'onde de leurs pics
d'excitation et d’émission • La durée de vie de leur état
éxcité • L’efficacité de leur fluorescence (c'est-à-dire le
nombre de photons émis rapporté au nombre de photons
absorbés).

· Principe de fonctionnement du
microscope à fluorescence :
Ce type de microscope, permet de visualiser la fluorescence
émise par les marqueurs fluorescents introduits dans
l'échantillon à étudier. Pour cela, le microscope est équipé
d'un jeu de filtres et de miroirs dichroïques. On trouve dans
le microscope deux types de filtres. Des filtres d'excitation,
qui permettent de sélectionner les longueurs d'ondes qui
vont exciter l'échantillon et des filtres d'émission qui vont
permettre d'éliminer lors de l'observation, certaines
longueurs d'ondes émises par le fluorochrome en réponse à
l'excitation.
· Domaines d'utilisation :
o Diagnostic • En bactériologie, on utilise
l’immunofluorescence pour une détection directe de
bactéries dans les liquides biologiques. • En virologie,
l’immunofluorescence directe est utilisée pour réaliser des
cinétiques d’apparition d’antigène cellulaire ou viral. Et
l’immunofluorescence indirecte est employée pour une
recherche d’un virus d’infection. • En cancérologie, on peut
quantifier l’expression d’oncogènes par cytofluorimétrie. •
Enfin, l’immunofluorescence peut servir à déterminer la
qualité du sperme, afin de diagnostiquer une stérilité.

o Recherche fondamentale • Observation de la division


cellulaire • Analyse du cycle cellulaire • Hybridation
moléculaire.

· Procédés d'observation en
immunofluorescence :
L’immunofluorescence est une technique
d’immunomarquage, qui utilise des anticorps ainsi que des
fluorochromes. L'immunofluorescence permet de révéler une
protéine spécifique directement dans la cellule, par
émission de fluorescence.

En immunofluorescence, on peut réaliser deux types de


marquages: o L’immunofluorescence directe. Lors de ce
marquage, on utilise un anticorps dirigé contre la molécule
recherchée, appelée antigène. Cet anticorps est couplé à un
fluorochrome. Ensuite pour révéler la préparation, on peut
utiliser un microscope à fluorescence. Cette technique reste
une des plus utilisées dans la recherche scientifique.

o L'immunofluorescence indirecte est basée sur l'utilisation


successive de 2 anticorps : le premier anticorps de type
monoclonal reconnait spécifiquement la protéine d’intérêt.
Le second anticorps de type polyclonal est dirigé contre
l'anticorps primaire (le premier). C'est le second marquage.
Dans ce cas, on a deux anticorps. L’anticorps primaire est
dirigé contre l’antigène recherché. Ensuite on utilise un
deuxième anticorps, marqué par un fluorochrome, et
possédant une haute affinité pour l’anticorps primaire.

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