Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
1
INTRODUCCIÓN
SOLUCIONES
UNIDADES DE CONCENTRACIÓN
2
NaCl ⇒ Na+ + Cl -
Por cada mol de NaCl sólido se formó 1 mol de Na+ y 1 mol de Cl- .
Luego:
Concentración de Na+ = 1 mol
-
Concentración de Cl = 1 mol
Para ácidos y bases n = número de protones que puede ceder (el ácido) o captar
(la base) por molécula.
3
4. Porcentaje peso / volumen (% p/v) : peso de soluto en gramos por 100 ml de
solución (% g). Se habla de porcentaje, ya que 100 ml de una solución acuosa
relativamente diluída pesan aproximadamente 100 gr. Para soluciones muy
diluídas se usa el submúltiplo mg % = peso del soluto en mg por 100 ml de
solución.
5. Porcentaje peso / peso ( % p/p): peso en gramos de soluto por 100 gramos
de solución. La concentración de la mayoría de los ácidos comerciales viene
dada en % p/p. Aquí la proporción de soluto puede ser mayor que la proporción
de solvente.
Ejemplo: H2 SO4 al 96%. Para transformar % p/p a concentración molar o
normal es necesario conocer la densidad de la solución.
2. Ahora calculamos el peso de HCl ( HCl puro ) contenido en este litro: 100
g de solución contienen 28 g., 1.150 g. de solución contienen:
1.150 g. x 0.28 = 322 g.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
4
Para preparar una solución de un soluto dado se puede usar el soluto puro
(generalmente sólido) o una solución concentrada de él en el mismo solvente
(solución stock). Este último caso constituye una dilución.
Para diluciones rige la relación:
Nuestro sentido común nos dice que la respuesta será 0.2 M, ya que la solución
se diluyó 10 veces. El cálculo según la relación dad sería:
C2 = V1 x C1 / V2 = 10 ml x 2M / 100 ml
10 ml x 2M = 100 ml x XM donde X = 0.2 M
II pH Y TAMPONES
ÁCIDOS Y BASES
HA + H2O ⇔ H3O + A-
HA ⇔ H+ + A- (1)
5
Considerando esta reacción en el sentido inverso, la especie A- puede captar
protones. A- es la base conjugada de HA. Similarmente para una base B:
B + H+ ⇔ BH+ (2)
Ejemplos de bases según Bronsted: los compuestos orgánicos básicos que deben
su basicidad al grupo funcional amino.
Ácidos fuertes: HCl, HNO3, HClO4, H2SO4 (ambos protones), H3PO4 (solamente el
primer protón que se disocia).
a. ÁCIDOS DÉBILES
Consideramos a modo de ejemplo el ácido acético, HOAC.
Este ácido débil posee un solo protón ácido. En solución acuosa coexisten en
equilibrio moléculas de la especie protonada con moléculas del anión acetato
(Oac-) y protones.
La relación entre la concentración de las especies nombradas a una temperatura
determinada está dada por la constante de equilibrio de la reacción de disociación,
llamada constante de acidez, Ka:
6
Se suele expresar la acidez a través del pKa en vez de usar Ka:
pKa = - log Ka
Ka de HOAc (25° C) = 4.75
[ H+ ] = [ OAc ] = x
[HOAc ] = 0.1 - x
El valor numérico de Ka indica que HOAc estará poco disociado, por lo tanto es
lícito efectuar la siguiente aproximación:
[HOAc ] = 0.1
b. BASES DEBILES
Para Una base débil B se puede definir también una constante. En este caso, la
llamada constante de basicidad Kb
Ka x Kb = Kw
7
Siendo Kw = constante de disociación del agua
SOLUCIONES TAMPÓN
Cuando se titula una solución de HOAc con una solución de una base fuerte
(NaOH), midiendo el pH después de cada adición se obtiene el siguiente gráfico,
llamado curva de titulación :
14
8
3. HOAc ⇒ OAc- + H+
Para:
Al titular una solución básica que contiene el anión acetato con un ácido fuerte se
observa el mismo fenómeno. Estaríamos recorriendo nuestra curva de derecha a
izquierda.
TABLA 1
9
COMPUESTO pKa (20° C)
Glicina 2.45
10
SELECCIÓN DE UN TAMPÓN
11
Observación: la concentración de un buffer es la suma de las concentraciones de
la especie protonada y de la especie desprotonada.
FOTOMETRIA : ABSORCIOMETRIA
12
La absorciometría aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber
radiación electromagnética.
c = λ x ν
c = velocidad de la luz en el vacío
λ = longitud de onda
ν = frecuencia
La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energía
necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de
menor energía a otro de mayor energía de ciertos compuestos, llamados
cromóforos. Las sustancias coloreadas absorben luz visible, su color corresponde
a la radiación no absorbida: la luz solar es blanca, ya que contiene radiación de
todo el espectro visible, además de otras radiaciones.
I0 I
--------------------------------> ----------------------------->
Luz incidente Luz transmitida
b
I0.: intensidad de haz incidente
I : intensidad de haz transmitido
b: camino óptico
13
Si el compuesto absorbe a una longitud de onda dada, I es menor que I 0 . Cuanto
mayor es el número de moléculas de este cromóforo encontradas por el haz de luz
en su camino, menor será la intensidad de la luz transmitida. Dicho número de
moléculas depende de la distancia recorrida a través de la solución (camino
óptico) y de la concentración. La relación entre estos parámetros esta dada por la
ley de Lambert – Beer :
ε bc
I = I0 x 10- (1)
Log I0 / I = ε bc
A = Log I0 / I (2)
Luego:
A = ε bc (3)
Ley de Lambert - Beer
14
La ley de Lambert – Beer indica que la absorbancia a una λ dada aumenta en
forma lineal con la concentración (con b = cte.), mientras que la transmitancia
disminuye en forma exponencial:
A T T = 10-(cb
pendiente = 1
C
C
Figura N ° 1
10
15
La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su única banda en la región del
visible a 445 nm, corresponde a absorción de luz azul.
INSTRUMENTOS DE MEDICIÓN
− Fuente de luz
− Filtros o monocromador, que permite seleccionar la longitud de onda.
− Portador de muestra
− Detector
− Dispositivo que permite la lectura de la medida directamente o inscriptor
LA FUENTE DE LUZ
No existe una fuente de luz que proporcione radiación de todo el rango espectral
UV / visible de suficiente intensidad, por consiguiente, se usan fuentes diferentes:
FILTROS
16
No proporcionan luz realmente monocromatica, sino que permiten el paso de un
cierto rango de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda máxima
transmitancia del filtro.
MONOCROMADORES
Poseen un elemento dispensor, que puede ser un prisma o una red de distracción.
El elemento dispensor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un
sistema de espejo permite dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada
hacia la ranura de salida.
Al cerrar más la ranura aumentará la monocromaticidad de la luz, pero siempre
pasara un cierto rango de longitud de onda.
En la práctica se considera que un espectrofotómetro opera con luz prácticamente
monocromática. La calidad de un espectrofotómetro depende en parte importante
de esta característica.
PORTADOR DE MUESTRA
Allí se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra de referencia. Las
cubetas son de vidrio o plástico (para el visible) o cuarzo (para el UV).
DETECTOR
Los detectores son del tipo fotoeléctrico: al incidir luz producen corriente eléctrica,
de intensidad proporcional a la intensidad de la luz. Se distinguen celdas de capa
barrera (solamente para fotómetros de filtro). Fototubos y tubos
fotomultiplicadores.
LECTURA O REGISTRO
La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia.
Si el instrumento informa la transmitancia se calcula A usando la ecuación (5). La
absorbancia se mide en 3 cifras después de la coma. El rango de A medible es de
0.000 hasta 1.500 o hasta 2.000 o 3.000 (dependiendo del instrumento).
17
concentración. La ventaja del método con curva de calibración es que permite usar
también un fotómetro de filtro.
C (problema) = A (problema)
C (estándar) A (estándar)
A=kxC
18
grupos, etc. ) para desarrollar una reacción coloreada que sirve entonces
para determinar su concentración.
c. La sustancia en solución, a pesar de ser incolora, presenta un máximo de
absorción característico, generalmente a longitudes de onda cortas (UV)
que puede ser usada para su determinación.
BIBLIOGRAFÍA
• H. WILLARD, L. MERRIT, J.DEAN “INSTRUMENTAL METHODS OF
ANÁLYSIS”
• G. EWING “INSTRUMENTAL METHODS OF CHEMICAL ANLYSIS”
• A. STROBEL “INSTRUMENTACIÓN QUÍMICA”
• S.B. BROWN, ED, “AN INTRODUCTION TO SPECTROSCOPY FOR
BIOCHEMISTS”
TRABAJO PRÁCTICO
INTRODUCCIÓN
Se han descrito un gran número de métodos para la cuantificación de proteínas.
Todos representan ventajas y desventajas, la selección de uno en particular va a
depender de la proteína que deseamos cuantificar, la sensibilidad deseada,
posibles interferencias y la sencillez del método.
En general, los métodos están basados en reacciones químicas, absorción
ultravioleta, reacciones de fluorescencia y determinación del nitrógeno.
19
METODO TURBIDIMÉTRICO
Las proteínas precipitan cuando se mezclan con soluciones diluidas de ácido
tricloroacético, sulfosalicílico o ferricianuro de potasio en ácido acético. Este
método tiene desventajas ya que no todas las proteínas precipitan en la misma
cantidad e interfieren otras sustancias precipitables por ácidos nucleicos. La
ventaja que presenta en uso es la rapidez de la determinación. El rango útil de
trabajo es entre 0.1 y 0.3 mg de proteínas agregadas.
MÉTODOS COLORIMÉTRICOS
El método colorimétrico más difundido es el método de Löwry, en que el color final
de la reacción, es el resultado de la reacción de Biuret de la proteína con el ión
cobre en medio alcalino y la reducción del reactivo fosfomolíbdico – fosfotúngstico
por la serina y triptófano presentes en las proteínas.
Los métodos de Biuret y Bradford se discutirán más adelante en esta guía y son
los que se realizarán en el presente trabajo práctico.
20
violeta. El color desarrollado se debe a un complejo de coordinación entre el Cu y
cuatro átomos de nitrógeno que provienen de dos cadenas peptídicas adyacentes.
Los dipéptidos y los aminoácidos (excepto la serina y treonina) no dan esta
reacción. La reacción no es absolutamente específica para los en laces peptídicos,
interfiriendo una serie de compuestos en la determinación de proteínas como por
ejemplo, sales de amonio.
Mediante este método se pueden valorar proteínas en un rango de 1 a10 mg.
MATERIALES
Reactivo Biuret: colocar 1.5 g, de CuSO4 x H2O y 6 g. de tartrato de sodio y
potasio (NAKC4H4O6 x 4 H2O). Agregue alrededor de 500 ml de agua destilada y
agitar hasta dilución. Agregue lentamente y agitando constantemente, 300 ml
NaOH 2.5 N. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. Agregar 1.0
gr., de yoduro de potasio y agitar hasta que este totalmente disuelto. Llevar a un
volumen final de 1000 ml y guardar en un frasco de polietileno. Este reactivo es
estable indefinidamente.
Spectronic 20 (540 nm)
Muestra de albúmina: solución patrón de albúmina 10 mg / ml.
21
MATERIALES
Reactivo de Bradford: disolver 100 mg. de azul de Coomasie G –250 (sigma) en
50 ml de etanol 95 % (siempre queda un ligero residuo insoluble). Agregue
lentamente 100 ml de ácido fosfórico 85 % p /v y luego complete a 100 ml con
agua destilada. Dejar el reactivo en reposo todo un día y luego filtrar. El reactivo
debe filtrarse toda vez que presente residuo o que el blanco de reactivo leído
contra agua presente una absorbancia mayor a 0.5.
CURVA DE CALIBRACIÓN
1. Disponga de 7 tubos y coloque en cada uno volúmenes adecuados que
contengan 5; 10; 15; 20; 25; 30 µ g de albúmina, el séptimo tubo úselo como
blanco y agregue 0.8 ml de agua destilada.
2. Complete todos los tubos a 0.8 ml con agua destilada.
3. Agregue 0.2 ml del reactivo de Bradford
4. Espere 10 min. y mida A 595 nm.
BIBLIOGRAFÍA
− Skoog & West. Análisis Instrumental
− Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company 2° Edición Pág. 75 – 77.
− Bradford, M (1976) Analytical Biochemistry 72, Pág. 248 – 254.
II.- DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA
ÁCIDA DE GERMEN DE TRIGO
INTRODUCCIÓN
Reacción Enzimática
Una enzima es una proteína que cataliza una reacción química específica, es
decir, aumenta su velocidad de reacción. La figura 1 muestra la variación de la
concentración de producto de una reacción enzimática en el tiempo (cinética), así
como también la desaparición de sustrato.
22
La pendiente de esta curva corresponde a la velocidad de la reacción . Se aprecia
que durante cierto tiempo (inicio) la velocidad se mantiene constante (la curva es
una recta) y posteriormente decae.
23
monoésteres con la consecuente liberación de fosfato orgánico. Este tipo de
reacciones esta muy distribuido en la naturaleza. La reacción es la siguiente:
O
Ez
R O P O- + H2O → ROH + Pi
O
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Materiales
− Amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 M pH 5.0
− Sustrato p–nitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2.5 mM
− Solución de p–nitrofenol 60 µ M en NaOH 0.02 M
− Solución de 0.02 M NaOH
− Solución stock de enzima 5 mg / ml en BSA 0.1 % diluída 1:20
− Baño termoregulado a 37° C
EXPERIENCIA A
Curva de calibración para la formación de p–nitrofenol
Prepare 6 tubos que contengan 0; 1.00; 2.00; 3.00; 4.00; 5.00 ml de una solución
de p–nitrofenol 60 µ M y enrase cada uno de los tubos con NaOH 0.02 M a 6.00
ml, de volumen final. Mezcle bien, transfiera a la cubeta y lea absorbancia a 405
nm. Como tubo blanco utilice el tubo que no contiene p–nitrofenol y calibre el
equipo. Grafique A405 versus los µ moles de p–nitrofenol en cada uno de los tubos.
Use esta curva estándar para analizar sus datos cinéticos.
EXPERIENCIA B
Determinación de la actividad de la fosfatasa ácida de Germen de trigo
Ya que el ensayo de la fosfatasa se realiza a tiempo fijo, es necesario determinar
la dilución correcta de enzima a usar ó el tiempo de ensayo con una misma
dilución de enzima.
24
Prepare un tubo que contenga 2.0 ml de amortiguador citrato de sodio 0.1 M;
EDTA 0.15 M, pH 5.0 y 2.0 ml de sustrato NPP 2.5 mM. A continuación, preincube
el tubo en un baño termoregulado a 37°C por un par de minutos y luego agregue
1.0 ml de la dilución de la enzima (1:20). Mezcle e inmediatamente saque una
alícuota de 0.5 ml adiciónelo a un tubo que contenga 5.5 ml de una solución de
NaOH 0.1 M. Este es un control denominado tiempo cero de la reacción, que le
permite calibrar el equipo de manera que solo mide la absorbancia del producto
liberado enzimaticamente. En paralelo prepare otros tubos que contengan la
misma mezcla de reacción que el tiempo cero, agregue 1.0 ml de enzima e incube
respectivamente 15 y 30 min., luego saque una alícuota de 0.5 ml de cada uno de
los tubos y adiciónela a los tubos que contengan 5.5 ml de NaOH 0.1 M.
Finalmente determine la absorbancia (405nm) de cada uno de los tubos utilizando
como blanco el tiempo cero. Recuerde que el ensayo se realiza en un volumen
final de 5 ml y que cada una alícuota de 0.5 ml de cada uno de los ensayos es
diluída a 6 ml para medir absorbancia.
Velocidad (µ moles /
N° tubo A405 µ moles Pi
min.)
1 0.0 0.0 0.0
2
3
4
BIBLIOGRAFÍA
− Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2° Edición Pág. 77 – 85; 105 – 108.
− Lehninger, A y col. Principios de Bioquímica.
− Stryer, A. Bioquímica.
25
II.- CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
Es una técnica útil para separar compuestos de diferente peso molecular. La base
de la separación del método es la propiedad del gel (Sephadex) de fraccionar
solutos de acuerdo a su tamaño molecular.
Cuando se coloca una solución acuosa con macromoléculas que difieren en
tamaño y se pasa a través de una columna empacada con gel de dextrano
(Sephadex) las moléculas más grandes son incapaces de penetrar los poros del
gel (se excluyen) y se mueven más rápido a través de la columna (tienen menos
trayecto que recorrer) que las pequeñas. Estas últimas, difunden a través de los
poros según su tamaño. Las diferentes moléculas eluyen de la columna en una
secuencia decreciente en tamaño molecular.
MATERIALES
− Columna de vidrio 1.3 x 15 cm.
− Sephadex G – 75
− Muestra: azul dextrano 0.5% PM (x), y dicromato de potasio (K2Cr2O7) al 0.5%.
26
MONTAJE DE LA COLUMNA
Ponga una mota de lana de vidrio en el fondo de la columna con la ayuda de una
bagueta. Mediante una pinza, cierre la salida de la columna y llénela con agua
destilada. Soltando la pinza deje escurrir el agua hasta la mitad de la columna.
Este procedimiento evita que queden burbujas a la salida de la columna. Si
hubiera quedado alguna burbuja de aire, repita el procedimiento de nuevo.
COLOCACIÓN DE LA MUESTRA
Una vez equilibrada la columna, con ayuda de la pipeta pasteur retire el agua de
ella. Cuando está a punto de empezar a secarse la superficie del gel, agregue 0.2
ml de una muestra con una pipeta Pasteur. Una vez que la muestra ha entrado al
gel, agregue un poco de tampón lavando las paredes y espere que penetre. Luego
agregue más tampón.
ELUCIÓN DE LA MUESTRA
Eluya la muestra haciendo pasar tampón por la columna igual que cuando la
equilibró. Colecte fracciones de aproximadamente 1 ml.
CUESTIONARIO
1. Qué puede concluir de las distintas fracciones que ha colectado?
2. de acuerdo al resultado que Ud. Obtuvo ¿Qué podría decir, en forma
comparativa, del peso molecular de los compuestos?
3. Diseñe un método experimental que le permita cuantificar la muestra eluída.
BIBLIOGRAFÍA
− Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2° Edición Pág. 20 – 27.
− Lehninger, A (1982). Principles Biochemistry. Capitulo 6. Pág. 127 – 129.
27
III.- CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO
Materiales
− Columna de vidrio de 10 ml
− DEAE – celulosa (Dietilaminoetil celulosa)
− Muestra albúmina 20 mg / ml.
− Tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7.0
− Soluciones NaCl 0.05 M; 0.1 M; 0.2 M; 0.5 M en tampón fosfato de sodio 20mM
pH 7.0
28
MONTAJE DE LA COLUMNA
Ponga una mota de lana de vidrio en el fondo de la columna con la ayuda de una
bagueta. Mediante una pinza cierre la salida de la columna y llene ésta con
tampón fosfato 20 mM pH 7.0. Soltando la pinza, deje escurrir el tampón hasta la
mitad de la columna.
COLOCACIÓN DE LA MUESTRA
Una vez equilibrada la columna, deje escurrir el tampón, cuando esté a punto de
empezar a secarse la superficie del lecho de la columna, agregue 1 ml de
muestra. Una vez que la muestra ha entrado al lecho de la columna, agregue un
poco de tampón lavando las paredes y espere a que penetre. Luego lave la
columna con 12 –15 ml de tampón recolectando fracciones de aproximadamente 3
ml.
ELUCIÓN DE LA MUESTRA
Con el fin de eludir la muestra, agregue sucesivamente de 15 ml de las soluciones
NaCl en concentraciones crecientes. Colecte el eluído de la columna en
fracciones de 3 ml cada una.
CUESTIONARIO
1. Qué puede Ud. concluir del experimento realizado?
2. Qué resultado esperaría, si la columna se equilibrara con tampón fosfato 20
mM pH 7.0 u NaCl 500 mM ? (la muestra aplicada está disuelta en el mismo
tampón).
29
3. Qué resultado esperaría Ud. si la columna se equilibrara con tampón pH 5.0?
[pI (pto isoeléctrico) de albúmina es 5].
4. Si se realiza el mismo experimento utilizando leche como muestra, Qué
resultados esperaría? (Podría identificar las fracciones que contienen lacto
albúmina). Discuta.
5. Se tiene una solución que contiene una enzima más lacto albúmina. Si a Ud. le
interesa sólo la enzima y debe remover la lacto albúmina, como realizaría el
experimento si no posee columna?
BIBLIOGRAFÍA
− Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2° Edición Pág. 16 – 20.
− Lehninger, A (1982). Biochemistry. 2° edición. Editores Word. Capitulo 6. Pág.
127 – 129.
− Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry . 2a. Edición. Editores Freeman &
Company.
IV.-ELECTROFORESIS
Las proteínas son polielectrolitos y por lo tanto, son susceptibles de ser analizadas
electroforeticamente. Normalmente, las cadenas laterales de ciertos aminoácidos
son los sitios ionizables en la proteínas (arginina, pKa = 12; lisina; pKa = 9, 7 – 10,
7; cisteína, pKa = 8, 5 – 9, 5; tirosina, pKa = 8, 5 – 10, 0; histidina, pKa = 6, 0 – 7 ,
0; ácido aspartico y glutámico, pKa = 3, 9 – 5, 0) contribuyen a la carga neta de las
proteínas, como también algunos grupos prostéticos (ejemplo: NAD+). Otras
30
moléculas, además de proteínas, pueden ser separadas por electroforesis
después de formar complejos con los iones inorgánicos u otros grupos cargados.
Además de la carga neta y el campo eléctrico, hay muchos otros factores que
influencian la rapidez de la migración electroforética de proteínas, incluyendo
tamaño, pH y la naturaleza del medio a través del cual ocurre la migración.
A bajo pH, las proteínas tienden a llevar más cadenas laterales positivas que
negativas, por lo tanto la carga neta será positiva y la migración en una
electroforesis será hacia el cátodo (electrodo negativo). A pH alto, las cadena
laterales negativas predominan y la proteína migra hacia el ánodo. De lo anterior,
se deduce que para cada proteína existirá un pH en el cual el número de cargas
positiva y negativas sea igual. Si la electroforesis es realiza a este pH, no habrá
migración, debido a que la proteína no tiene carga neta. Valores de pH del
solvente por encima del pI (punto isoeléctrico) hacen que la carga neta de la
proteína esa más negativa y su movilidad electroforética hacia el ánodo aumenta.
En cambio, valores de pH más bajos que el pI hacen que la proteína sea más
positiva, por ende, la movilidad electroforética aumenta hacia el cátodo. Debido a
que el pH influencia marcadamente la movilidad electroforética, es importante
31
mantener el pH constante durante la electroforesis. Esto se lleva a cabo
incluyendo tampones en las soluciones electrolíticas.
La electroforesis en geles de poliacrilamida es quizás el sistema electroforético
mas útil y versátil en el análisis y separación de proteínas, moléculas pequeñas de
RNA y fragmentos de DNA.
Los principales usos de la electroforesis discontinua son por una parte, determinar
pureza de una proteína y en segundo termino para analizar los componentes de
32
una mezcla compleja. La pureza, es por supuesto, un termino relativo, ya que se
puede obtener una sola banda en el gel, debido a que las impurezas están a
concentraciones muy bajas para ser detectadas.
33
Finalmente, debido a que el método separa polipéptidos de acuerdo la tamaño,
provee también información acerca de PM y la composición de sus unidades de
cualquier complejo proteico.
BIBLIOGRAFÍA
− Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry . 2a. Edición. Editores Freeman &
Company.
− Chrambach, A. & Robbard, D. (1971) Science, 172, 440.
− Laemmli, UK (1970) Nature (London) 277, 680 – 685.
− Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. I, T.S. Work
+ E: Work Editors A:H: Gordon, Pág. 1 –145 (parte I).
PARTE EXPERIMENTAL
A.- SOLUCIONES
A. Acrilamida – bisacrilamida: 45% - 1.2% ( 46.2 %T – 2.6 %C).
Precaución: la acrilamida es neurotóxica. EVITE EL CONTACTO
DIRECTO. Agregar a la solución una punta de espátula de carbón
activado agitar durante 2 horas, filtrar por papel whatman. Guardar a 4°C.
B. Tampón gel separador
1.5 M Tris – HCl pH 8.8, 0.4 % SDS (guardar a 4°C).
C. Tampón gel espaciador
0.5 M Tris – HCl pH 6.8, 0.4 % SDS (guardar a 4°C).0.5 M
D. Persulfato de amonio 1%
Preparar solución fresca; duración una semana (guardar a 4°C)
34
E. Temed ( N; N; N’; N’ – tetrametiletilendiamina)
F. Tampón de corrida 4X
0.1 M Tris, 0.768 M glicina, 0.4 % SDS. Diluir con agua antes de usar, no
es necesario ajustar pH. (guardar a 4°C).
G. SDS 20% P /V (guardar a temperatura ambiente)
H. Azul de Bromofenol:
0.2 % azul de Bromofenol en 0.1 M Tris – HCl pH 6.8
I. Tampón de muestra (5X)
0.125 M Tris – HCl pH 6.8, 5 % SDS, 25% glicerol, 0.05% azul de
Bromofenol (guardar a -20°C).
J. Fijador: 30% etanol, 10% ácido acético
K. Solución de teñido
0.3% azul de Coomasie R – 250 en 50% metanol y 10% ácido acético. Se
disuelve el azul de Coomasie en metanol (agitar 8 horas), se filtra, se
agrega ácido acético y el agua.
L. Solución de desteñido: 7% ácido acético – 30% metanol
N. Gel espaciador
Acril – Bis 45 – 1.2&
Tris – HCl 0.5 M pH 6.8, 0.8 % SDS
Persulfato 1%
Agua
TEMED
PROCEDIMIENTO
35
I. Una vez gelificado el gel espaciador, retirar la peineta y el espaciador basal y
colocar las placas en la cámara electroforética.
J. Agregar el tampón de corrida al deposito inferior evitando atrapar aire en el
borde del gel.
36