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Université Mohammed V - Rabat

Ecole Supérieure de Technologie

Département Génie Urbain et Environnement

Filière : Génie Bio Industriel

Stage technique
Réalisé par :

Meryem EL FAQUIRE

Intitulé :

La méthode de chromatographie liquide à haute


performance (HPLC) pour le contrôle des médicaments
vétérinaires

: Réalisée par : Encadré par


El faquire Meryem Pr . M.Mounaim Halim EL JALIL
Mr. Ali TALMI

Département de chimie Année universitaire 2018-2019

1
Dédicaces

Je dédie cet humble travail :

A ma très chère mère : tu représentes pour moi le symbole de la


bonté par excellence, la source de tendance et l’exemple du
dévouement Qui n’a pas cessé de m’encourager et de prier pour
moi.
A mon cher père, aucune dédicace ne saurait examiner
l’amour, l’estime, le dévouement et le respect que j’ai toujours eus
pour vous.

Puisse dieu tout puissant vous garder et vous procurer santé et


bonheur

Je dédie aussi ce travail à :


Mes frères (Oussama , Saâd et Mohammed Toufik ) .
Ma grand mère Aicha
Tous mes amis en Souvenir des plus beaux instants qu'on a passé
ensemble.

Aussi bien à tous ceux qui m'ont aidé Merci ….

Meryem

Remerciement

Au terme de ce travail, nous nous tenons à remercier :

2
Mon encadrant le professeur Mr. M. El jalil,
Vous avez bien voulu nous confier ce travail riche d’intérêt et nous guider à chaque étape de
sa réalisation. Vous avez toujours réservé le meilleur accueil, malgré vos obligations
professionnelles. Vos encouragements inlassables, votre amabilité, votre gentillesse méritent
toute admiration. Nous avons saisi cette occasion pour vous exprimer notre profonde
gratitude tout en vous témoignant nos respects, nous remercions également les membres de
jury pour leur présence, leur faveur et leur examination de notre rapport, veuillez, messieurs,
accepter notre plus profond respect.

M. Talmi Ali chef de la section chimie nous avons eu le privilège de travailler parmi votre
équipe et d’apprécier vos qualités et vos valeurs. Votre sérieux, votre compétence et votre
sens du devoir nous ont énormément marqués. Veuillez trouver ici l’expression de nos
respectueuses considérations et notre profonde admiration pour toutes vos qualités
scientifiques et humaines.

Tout le personnel de la Division de la Pharmacie et des Intrants Vétérinaires qui ont mis à
notre disposition toutes les informations et les connaissances nécessaire pour notre formation
et aussi qui nous ont permis d’effectuer cette période de stage dans d’excellentes conditions.

Que tous ceux qui nous ont aidés de près ou de loin, trouvent ici l’expression de notre sincère
reconnaissance.

3
Résume
Ce travail présente des généralités sur les médicaments vétérinaires , la
technique de dosage par chromatographie liquide à haute performance (HPLC)
. d'un antibiotique utilisé en médecin vétérinaire notamment l'Enrofloxacine

Les résultats de cette technique a été présenté sous forme des chromatogrammes
(des pics) de la molécules d'Enrofloxacine par le logiciel chromera au niveau de
l'HPLC et détermine sa quantité dans le médicament pour la conformité selon
la marge indiquée dans le dossier du fabriquant .

Abstract
This work presents generalities on veterinary drugs, the technique of
determination by high performance liquid chromatography (HPLC) of an
antibiotic used in veterinary medicine including Enrofloxacine.
The results of this technique were presented in the form of chromatograms
(peaks) of Enrofloxacine molecules by chromera software at the level of HPLC
and determines its amount in the drug for compliance according to the margin
indicated in the record of the manufacturer.

Liste des abréviations

. ACN : Produit chimique l'Acétonitrile

4
. DPIV : Division de Pharmacie et des Intrants Vétérinaires

. ENR : Enrofloxacine

. E1-E2 : l'échantillon 1 et 2

HPLC : High Performance Liquid Chromatography - Chromatographie Liquide à Haute


. Performance

. S1-S2 : Standard 1 et 2

. UV : Ultra Violet-Visible

Liste des tableaux

Tableau 1 : Propriétés physico-chimiques l’Enrofloxacine

Tableau 2 : Propriétés pharmacocinétiques de l’ENR

Tableau 3 : Conditions chromatographiques pour l’injection de l’ENR

Liste des figures

.Figure 1: Organigramme de la DPIV

5
Figure 2: Molécule de l’Enrofloxacine.
Figure 3 : Principe de fonctionnement d’une chaine HPLC.
Figure 4 : Les organes d’une chaine HPLC.

Figure 5: une pompe HPLC.


Figure 6: Injecteur HPLC.
Figure 7: Une colonne HPLC.
Figure 8 : Détecteur UV HPLC.

Figure 9 : Composition du médicament à contrôler.

Figure 10 : les fioles de la dilution du standard et les échantillons.

Figure 11 : Viales contenant les 4 injections ( S1, S2 , E1, E2 ).

Figure 12 : injection des viales dans l'HPLC .

Figure 13 : Purgation de la pompe et la colonne .

Figure 14 : la séquence et la méthode de l'Enrofloxacine.

Figure 15 : pic du standard .

Figure 16 : pic de l'échantillon.

Figure 17 : Rapport analytique des résultats de contrôle de ENR.


Figure 18 : Résultats finals de standard et d’échantillon de ENR.

Table des matières


Introduction…………………………………………………………………………………9

Présentation de l'office National de Sécurité Sanitaire des produits Alimentaire .1


(ONSSA)……………………………………………………………………..10

Présentation de la division de la pharmacie et des Intrants vétérinaires (DPIV) .2


……………………………………………………………………………………….10
6
Synthèse bibliographie
I. Généralités sur les médicaments vétérinaires……………………………………13

1. Définitions d’un médicament vétérinaire……………………………………………...13


2. Eléments constitutifs du médicament………………………………………………….13
2.1.Définition d'un principe actif………………………………………………………...13
2.2.Définition d'un excipient……………………………………………………………..13
3.Les Antibiotiques……………………………………………………………………….14
II. L'Enrofloxacine…………………………………………………………………………14
1. Les antibiotiques quinolones…………………………………………………………...14
2.Définition générale……………………………………………………………………….14
3.Propriétés physico-chimiques…………………………………………………………..15
4.Activité et susceptibilité………………………………………………………………….15
5.Propriétés pharmacocinétiques…………………………………………………………16
6.Surdosage/Toxicité aigué………………………………………………………………..17
III. Généralité sur la chromatographie……………………………………………..….17
1. Principe…………………………………………………………………………………...17
2.Classification selon le phénomène chromatographique…………………….............18
- la chromatographie d'adsorption…………………………………………….…….18
- la chromatographie de partage……………………………………………………18
- la chromatographie d'échange d'ions……………………………………………..19
- la chromatographie d'exclusion……………………………………………..…….19

Matériels et Méthode

I. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)………………………....21


1. Définition……………………………………………………………………………...…..21
2. Principe de la HPLC……………………………………………………………………..21
3. Appareillage de la HPLC………………………………………………………………..22
a) Le réservoir de la phase mobile…………………………………………………….23
b) Le système de pompage…………………………………………………………….23
c) L'injecteur……………………………………………………………………………...24
d) La colonne…………………………………………………………………………….24
e) Détecteur UV………………………………………………………………………….25
f) L'enregistreur…………………………………………………………………………..26
g) Intégrateur……………………………………………………………………………..26
h) Contrôle par HPLC……………………………………………………………….......26

II. Dosage d'Enrofloxacine dans un médicament vétérinaire par HPLC………..27


1. Introduction……………………………………………………………………………….27
2.Verrerie………………………………………………………………………….…………27
3.Appareillage……….………………………………………………………………………27
4. Produits chimiques et réactifs……………………………………….…………………28
5. Conditions chromatographiques…………………………………….…………………28
6. Préparation et injection………………………………………………………………….28
7. Expression des résultats………………………………………………………………..31

Résultats discussions
7
I. Interprétation des résultats du dosage d'Enrofloxacine…………………….…..33
1. Introduction…………………………………………………………………………........33
2. Résultats des injections…………………………………………………………………33
3. Décision…………………………………………………………………………………..35
4. Discussion………………………………………………………………………..………35

Conclusion…………………………………………………………………………………36

Références………………………………………………………………………………...37

Introduction

En élevage des animaux, toute pathologie infectieuse d’origine bactérienne est


.potentiellement dangereuse fait courir un grave risque sanitaire et économique à l’éleveur
Donc il sera nécessaire d’utiliser des antibiotiques à la fois pour des traitements curatifs ou
encore préventifs afin de maintenir les troupeaux en bonne santé. (1)
Pourtant son usage doit être strictement contrôlé car, s'il doit avant tout être efficace, il ne doit

8
constituer en aucun cas un risque ni pour l'animal, ni pour le consommateur des denrées
animales ou d'origine animale, ni pour l'environnement. (2)
Pour s’assurer de la qualité, l’efficacité et la sécurité du médicament, Il est nécessaire
d’effectuer un contrôle analytique des différentes substances contenues dans la forme
pharmaceutique en question. (3)

Le contrôle des produits vétérinaires commence par l’adoption légale des définitions des
différents produits utilisés (vaccins, antibiotiques, désinfectants, vitamines, antiparasitaires
etc.) et des conditions de leur importation ou de leur fabrication s’ils sont élaborés dans le
pays. C’est pourquoi les produits vétérinaires font l’objet d’un enregistrement officiel avant
. toute autorisation de commercialisation
Les travaux de laboratoire consistent à effectuer des tests galéniques et organoleptiques, à
identifier et à doser les principes actifs par technique chromatographique HPLC, de chaque
.échantillon reçu

Ce travail fait partie des activités de la DPIV, service du contrôle et des expertises, section
chimie à l’ONSSA. Il porte sur le contrôle d’une méthode d’analyse de l’Enrofloxacine, il
comprend trois chapitres
; ,Le premier chapitre, rapportant des généralités sur les médicaments vétérinaires •
Le deuxième chapitre est consacré aux conditions expérimentales : matériel et •
; méthode qui présente notre plus grand intérêt
Le troisième chapitre rapportant les résultats de la méthode du contrôle de l’Enrofloxacine •
.par HPLC

Présentation de l’office National de sécurité Sanitaire des .1


: produits alimentaires (ONSSA)
L’Office National de Sécurité Sanitaire des Produits Alimentaires (ONSSA) est un
établissement public doté de la personnalité morale et de l’autonomie financière crée en 2009
par la loi n° 25-08 et placé sous la tutelle de l’Etat. Il exerce, pour le compte de l’Etat, les
attributions relatives à la protection de la santé du consommateur et à la préservation de la
.santé des animaux et des végétaux
Il est appelé à appliquer la politique du gouvernement en matière de sécurité sanitaire des
végétaux, des animaux et des produits alimentaires depuis les matières premières jusqu’au

9
.consommateur final, y compris les aliments pour animaux
L’ONSSA a été créé pour appuyer les orientations stratégiques tracées par le Plan Maroc Vert
qui ambitionne de faire de l’agriculture un moteur de croissance essentiel dans l’économie
marocaine, ainsi de rendre les produits alimentaires plus compétitifs aussi bien sur le marché
.national qu’international

2.Présentation de la Division de la pharmacie et des intrants vétérinaire


(DPIV):

La division de la pharmacie et des intrants vétérinaires est rattaché à la direction des services
vétérinaires de l’ONSSA.
Elle comprend deux services :
*Le service de l’enregistrement et des inspections .

*Le service du contrôle et des expertises.


Le service du contrôle et des expertises est un service public rattaché à la division de la
pharmacie et des intrants vétérinaires de la direction des services vétérinaires de l'ONSSA.
Ses principales missions et attributions sont :
* L'expertise analytique et microbiologique des médicaments vétérinaires, y compris les
vaccins, les produits biocides d'élevage et des additifs de l'alimentation animale.
* Analyse des résidus de médicaments vétérinaires dans les denrées animales et d'origine
animale.
* Contribution aux travaux de recherches dans le domaine de la pharmacie vétérinaire et de la
recherche des résidus de médicaments vétérinaires.

* Le diagnostic de certaines maladies animales (rage). (2)

10
* Organigramme de la DPIV :

Figure 1: Organigramme de la DPIV.

11
Synthèse
bibliographique

12
I. Généralités sur les médicaments vétérinaires

1. Définitions d’un médicament vétérinaire :

Un médicament vétérinaire est «toute substance appliquée ou administrée à tout animal


producteur de nourriture, tels que les animaux producteurs de viande ou de lait, la volaille, les
poissons ou les abeilles, que ce médicament soit utilisé dans un but thérapeutique,
prophylactique ou de diagnostic ,ou pour la modification de fonctions physiologiques ou du
comportement».(4)

Chaque médicament vétérinaire possède une activité (ou plusieurs) appropriée, et une
efficacité contre certaines maladies, on trouve parmi les médicaments les plus utilisés : les
anticoccidiens contre la coccidiose, les anthelminthiques et les antibiotiques prenant
l’exemple de l’Enrofloxacine, qui fait l’objet de ce projet.

2. Eléments constitutifs du médicament :


Le médicament vétérinaire est composé d'un ou de plusieurs principes actifs et d'un ou de
plusieurs excipients. Le principe actif est la molécule qui possède les propriétés
pharmacologiques responsables de l'effet thérapeutique du médicament, alors que l’excipient
désigne l'ensemble des substances qui accueillent le principe actif, permettent la mise en
forme du médicament, la protection du principe actif et sa libération dans l'organisme. Ainsi, à
matière active identique, l’excipient fait la différence dans l’activité du médicament. (5)

2.1 Définition d'un principe actif :


Le principe actif est tout composant d’un médicament qui est destiné à exercer une action
pharmacologique ou un autre effet indirect en rapport avec le diagnostic, le traitement, la
prévention d’une maladie, ou à agir sur la structure ou les fonctions de l’organisme humain ou
animal par des moyens pharmacologiques.

2.2 Définition d'un excipient :

L’excipient est toute substance inactive par elle même sur la maladie, qui utilisée dans la
formulation, facilite l’administration et la conservation du principe actif du médicament..

13
3. Les antibiotiques :

Les antibiotiques sont des molécules possédant la propriété de tuer (bactéricide) ou de limiter
la propagation (bactériostatique) des bactéries.

Les antibiotiques sont utilisés en médecine (et en médecine vétérinaire) pour lutter contre des
infections bactériennes et doivent être choisis en fonction de leur efficacité sur la bactérie à
combattre, ce qui peut être testé grâce à un antibiogramme. (6)

II.L'Enrofloxacine :

1. les antibiotiques quinolones :

Un antibiotique quinolone est n'importe quel membre d'un grand groupe de bactéricides à
large spectre qui partagent une structure de noyau bicyclique liée au composé 4-quinolone, ils
sont utilisés en médecine humaine et vétérinaire pour traiter les infections bactériennes, ainsi
que dans l'élevage.
Presque tous les antibiotiques quinolones utilisés de nos jours sont des fluor quinolones, qui
contiennent un atome de fluor dans leur structure chimique et qui sont efficaces contre les
bactéries à Gram négatif et à Gram positif.(7)

Dans cette mémoire nous avons choisi de traiter comme exemple d’antibiotique quinolone
l’Enrofloxacine.

2.Définition générale :

L'Enrofloxacine (ENR) est un antibiotique fluoroquinolone. Enrofloxacine est actuellement


approuvé par la FDA pour le traitement des animaux domestiques.
C'est un agent bactéricide, l'activité bactéricide de l'Enrofloxacine est dépendante de la
concentration, la mort des cellules sensibles se produisant dans les 20 à 30 minutes suivant
l'exposition. L'Enrofloxacine a démontré un effet post-antibiotique significatif pour les
bactéries à Gram négatif et à Gram positif et est active à la fois dans les phases stationnaires
et de croissance de la réplication bactérienne. L'Enrofloxacine est partiellement déséthylée par
le CYP450 en son métabolite actif, la ciprofloxacine, qui est également un antibiotique des
fluoroquinolone .(8)

14
Figure 2: Molécule de l’Enrofloxacine

3. Propriétés Physico-chimiques :

Tableau 1 : Propriétés physico-chimiques de l’Enrofloxacine : (9)

Formule C 19 H 22 F N 3 O 3
Masse moléculaire 359,4 g/mol
point de fusion entre 222 et 226°C
pH dans 100 ml d’eau 6,4

4. Activité et susceptibilité :
L'Enrofloxacine est un agent antibactérien synthétique de la classe des dérivés de l'acide
fluoroquinolone carboxylique. Il a une activité antibactérienne contre un large spectre de
bactéries Gram négatif et Gram positif. (9)

Il est efficace contre une spectre large des bactéries notamment :

 Pseudomonas aeruginosa
 Klebsiella
 Escherichia coli
 Enterobacter
 Campylobacter
 Shigella
 Salmonella

Activité variable contre:

15
 Streptocoque

Inefficace contre:

 Anaérobies

5. Propriétés Pharmacocinétiques :

Tableau 2 : propriétés pharmacocinétiques de l’ENR  : (10)

Biodisponibilité 80% chez les chiens, 65-75% chez les moutons

Métabolisme Rénal et non-rénal

4-5 heures chez les chiens, 6 heures chez les


Demi-vie biologique
chats, 1,5 - 4,5 heures chez les moutons.
Excrétion Bile (70%); Rénal (30%)

6. Surdosage / Toxicité aiguë :

Il est peu probable qu'un surdosage aigu de l'un ou l'autre composé entraîne des symptômes
plus graves que l'anorexie ou les vomissements, mais les effets indésirables mentionnés ci-
dessus peuvent survenir. Les chiens recevant 10 fois le taux de dosage marqué de
l'Enrofloxacine pendant au moins 14 jours n'ont développé que des vomissements et de
l'anorexie. Cependant, la mort s'est produite chez certains chiens nourris 25 fois plus
longtemps que la dose indiquée sur l'étiquette pendant 11 jours .(11)

DL 50 orale : supérieure à 5000 mg / kg

Dermique DL 50 : supérieure à 2000 mg / kg

Inhalation DL 50 : supérieure à 3547 mg / m3 (exposition de 4 heures)

Effets sur les yeux: irritant; réversible en moins de 7 jours. Chez les chats, il peut produire
une cécité soudaine lorsqu'il est administré par injection, car il est rétinotoxique.

16
III. Généralité sur la Chromatographie :

1. Principe :

La chromatographie permet la séparation d’un ou de plusieurs composés d’un mélange en vue


de leur identification et de leur quantification.

La chromatographie en phase liquide a permis de réaliser des analyses qui n’étaient


auparavant pas possible avec les techniques sur couche mince ou en phase gazeuse.

On distinguer deux objectifs :

1-Objectif analytique :

Il s’agit d’identifier des solutés qualitativement et/ou quantitativement, l’opération se faisant


par le seul processus chromatographique, auquel peuvent être associées, en passage direct,
d’autres techniques analytiques chimiques ou physico-chimiques destinées à faciliter l’analyse
qualitative (on qualifie cela de couplage). Les quantités analysées doivent être extrêmement
minimes afin de ne pas s’écarter des règles d’idéalité de la thermodynamique.

2-Objectif préparatif :

Les concentrations des solutés sont ici importantes et on travaille hors des règles d’idéalité
thermodynamiques. Les quantités produites demeurent cependant faibles (de l’ordre du kg /
jour) et le procédé ne sera utilisé que pour préparer des substances rares, sensibles à la chaleur
(protéines, etc.)

2. Classification selon le phénomène chromatographique :

IL existe différents modes de séparation en chromatographie en phase liquide :

 L’adsorption
 Le partage
 L’échange d’ions
 L’exclusion

17
Qui dépend de la nature (de la structure) de la phase stationnaire utilisée. On distinguera
donc :

 La chromatographie d’adsorption :

Le phénomène d’adsorption est essentiellement un phénomène de surface par lequel les


composés sont attirés sur les sites actifs de la phase stationnaire par des liaisons hydrogènes et
électrostatiques.

La phase stationnaire est un matériau solide en forme de petits granules de différentes


grosseurs, les plus utilisées sont le gel de silice, l’alumine et la cellulose en poudre.

 La chromatographie de partage :

Dans une chromatographie de partage, la phase stationnaire est non pas un solide, mais un
liquide fixé physiquement ou greffé chimiquement sur un support solide. Les composés d’un
mélange vont donc se solubiliser dans la phase liquide stationnaire. C’est la solubilité
différente des composés dans la phase stationnaire et dans la phase mobile qui rend la
séparation chromatographique possible.

 La chromatographie d’échange d’ions :

Ce type de chromatographie permet d’isoler la substance chargée électriquement (la phase


stationnaire comporte des groupements ionisés (+ ou -) fixés) d’un mélange de molécules
chargées (liquide). Pour cela, on fait passer le mélange sur une phase stationnaire (solide)
chargée déjà associée à des ions connus et on remplace ces ions par les ions /molécules
chargées du mélange à séparer.

 La chromatographie d’exclusion :
La chromatographie d’exclusion permet la séparation des molécules à travers un gel poreux
en fonction du poids moléculaire, en fonction de : la taille, la forme et le poids moléculaire.
La phase stationnaire : elle est constituée de billes de polysaccharide.
La phase mobile : elle est constituée d’un éluant (eau, tampon pH), il sert à entrainer les
molécules du mélange. (12)

18
Matériels et
Méthodes

19
I. Chromatographie liquide à haute performance(HPLC) :

1. Définition :

La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une technique utilisée
dans un grand nombre de domaines Analytiques, et plus particulièrement dans les domaines
de l’agroalimentaire, de l’environnement, de la pharmacie et de la biologie.
Un chromatographe en phase liquide, souvent appelé chaîne HPLC; est constitué de quatre
Modules principaux : un système de pompage, un injecteur, une colonne et un détecteur. (13)

2. Principe de la HPLC :
Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution d’abord, puis elle sera introduite dans la
phase mobile liquide (éluant). Grâce à la répartition sélective des solutés entre la phase mobile
et la phase stationnaire, chaque soluté est donc soumis à une force de rétention exercée par la
phase stationnaire, et une force de mobilité due à la phase mobile. Suivant la nature des
molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé
colonne chromatographique. (14)
La phase mobile, poussée par une pompe sous forte pression, parcourt le système
chromatographique. Le mélange à analyser est injecté puis transporté à travers le système
chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre
la phase mobile et la phase stationnaire. En sortie de colonne, grâce à un détecteur approprié,
les différents solutés sont représentés par des pics. L’ensemble des pics enregistrés est appelé
chromatogramme. (15)

Le mécanisme de la séparation chromatographique s’explique par les différences de


répartition des molécules des composés d’un mélange entre deux phases non-miscibles : l’une
mobile et l’autre stationnaire. Ce principe est traduit par le schéma suivant :

20
Figure 3 : Principe de fonctionnement d’une chaine HPLC

3.Appareillage de la HPLC :
Les différentes composantes d’une chaine HPLC sont présentées sur le schéma suivant. Tous
les organes du système sont liés à un micro-ordinateur qui pilote tous le s processus.

Figure 4 : Les organes d’une chaine HPLC

L’appareillage se compose d’un réservoir contenant la phase mobile, d’un système de


pompage, d’un injecteur, d’une colonne chromatographique (éventuellement thermostatée),
1. Le réservoir de la phase mobile :
Ce réservoir est rempli de la phase mobile qui est un solvant ou un mélange de solvants qui
doit être de pureté analytique et filtré pour éliminer les particules solides qui risqueraient
d’endommager la pompe ou de bloquer la colonne. (16)

21
2. Le système de pompage :
Le système de pompage est la partie du chromatographe qui permet de pomper l’éluant, d’en
réguler le débit et de maintenir la pression de l’ensemble. Sur une chaîne HPLC classique le
système de pompage est capable de refouler le liquide jusqu’à une pression de 400 bars. En
pratique, la pression de travail est généralement comprise entre 100 et 250 bars. Un système
de pompage peut être utilisé soit en mode isocratique, soit en gradient d’élution.

Le mode gradient : de solvant pour lequel on fait varier la composition du solvant en cours
d’analyse en vue d’améliorer les séparations et surtout de raccourcir les temps d’analyse,
c’est-à-dire avec une variation de la concentration des constituant du mélange d’éluant

Le mode isocratique :pour lequel la composition de la phase mobile est fixe, c’est-à-dire


100% d’un même éluant tout au long de l’analyse.

Figure 5: une pompe HPLC

22
3. L’injecteur:

La pression en tête de colonne étant de plusieurs dizaines de bars, il n’est pas possible
d’utiliser une seringue et de percer à travers d’un septum pour injecter l’échantillon comme
chromatographie gazeuse. Il est donc indispensable d’utiliser une boucle d’échantillonnage
montée sur une vanne d’injection.

Figure 6: Injecteur HPLC

4. La colonne :
La colonne est l’élément majeur de la chaîne HPLC. C’est un tube construit par un matériau le
plus possible inerte aux produits chimiques, souvent en inox ou en verre. Le choix d’une
colonne HPLC est lié aux paramètres suivants :
- Type de la phase stationnaire ;
- Longueur ;
- Diamètre des particules (dp) ;
- Débit de la phase mobile supportable. (17)
* Les principales phases stationnaires utilisées sont :
- La phase normale :
Cette phase est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un
éluant peu polaire (apolaire). Ainsi, lors de l’injection d’une solution, les produits polaires
sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaires qui sortent en tête. (18)
- La phase inverse :

23
Cette phase est majoritairement composée de gel de silice greffée par des chaines linéaires de
8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est très peu polaire (apolaire) et
nécessite donc un éluant polaire. Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués
en premier.
Contrairement à une phase normale, il n’y a pas d’évolution de la phase stationnaire au cours
du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante. (18)
.

Figure 7: Une colonne HPLC

5.Détecteur UV:

Différents systèmes de détection sont disponibles en chromatographie liquide. Le détecteur


UV est l'un des plus utilisé en chromatographie liquide. Le principe est fondé sur la loi de
Beer-Lambert, qui relie l'absorbance optique d'un composé à sa concentration. Les détecteurs
de base permettent de faire la détection à une seule longueur d'onde à la fois, donc avec une
radiation monochromatique. Il faut alors,
préalablement à l'analyse, connaître le spectre d'absorption UV du ou des composés à
analyser.

Figure 8: Détecteur UV HPLC


24
6.L’enregistreur :

L’enregistreur reçoit un signal électrique proportionnel à la concentration de l’analyste qui


traverse le détecteur. Ce signal est traité, amplifié puis utilisé pour tracer le chromatogramme.
Pour qu’un pic soit exploitable, on considère généralement que le rapport signal / bruit doit
être au moins de trois. Le bruit se traduit par des oscillations plus ou moins marquées autour
de la ligne de base, ce bruit de fond aléatoire provient de diverses causes (14) :

- La variation de température ;
- De la pression ;
- L’instabilité électronique.
Par ailleurs on doit avoir une ligne de base aussi proche que possible de l’horizontale. (14)

7. Intégrateur

La chromatographie est une méthode de séparation utilisée en vue d’un dosage.


Il faut donc avant tout chercher à séparer correctement les pics avant de les intégrer, une
intégration consiste à mesurer sous un pic.
La Détection dépend de deux paramètres :

 La sensibilité (le seuil d’intégration)


 La largeur des pics

8. Contrôle par HPLC :

Les méthodes d’analyse par HPLC utilisées proviennent des dossiers des fabricants et de la
division de la pharmacie des intrants vétérinaires du Maroc. Ces méthodes ont été transférées,
validées et mises sous assurance-qualité.

L’identification par HPLC a été réalisée par la comparaison du temps de rétention du principe
actif contenu dans le produit fini (l’échantillon)avec celui de la substance de référence
(standard).

II. Dosage d’Enrofloxacine dans un médicament vétérinaire par


HPLC :

L’Enrofloxacine est un médicament vétérinaire utilisé souvent comme antibiotique contre les
bactéries Gram + et Gram -, dans cette manipulation nous allons contrôler le taux de cette
molécule dans un médicament vétérinaire qui doit normalement contenir 10 g de ENR (dont il
est indiqué étiquetage du médicament).

25
Figure 9 : Composition du médicament à contrôler

1. Verrerie :

La verrerie est commune à celle utilisée dans laboratoire de contrôle des médicaments
vétérinaires. Elle est composée entre des micropipettes, des fioles jaugées, des béchers et des
éprouvettes graduées de différentes capacités.

2. Appareillage :
- Le système chromatographique utilisé est un appareil HPLC équipé d’une boucle
d’injection de 100 μl , d’un four (25 à 90 °C), d’une pompe d’injection (4 à 400 bar) et d’un
détecteur UV/Vis (190 à 600 nm) ;
- Une balance analytique pour le pesage du standard ;
- Un agitateur vortex ;
- Un bain ultrason.

3. Produits chimiques et réactifs :


 Acétonitrile
 Eau ultra pure
 Triéthylamine
 Enrofloxacine pur (Standard)

26
4. Conditions chromatographiques :
Dans les paramètres de l’HPLC et du détecteur UV on doit assurer la configuration suivante :
Tableau 3 : Conditions chromatographiques pour l’injection de l’ENR :
Phase mobile Longueur Débit Pression Colonne Volume injecté
d'onde (nm) (ml/min)
-50%-Acétonitrile 280 0.7 110psi C18 5 µm 20 µl
50% - Eau (Pound per 25 cm
2% - Square
Triéthylamine Inch)

- La solution mère (M) : 50%-Acétonitrile, 50% - Eau .


5. Préparation et Injection :
1. Préparation de standard et des échantillons par dilution :
- les échantillons :
- Préparation de la solution mère qui contient 250ml d’ACN et 250ml d'eau ultra pur dans
une fiole de 500 ml .
- Ajout d'un 1ml de notre échantillon de médicament dans une fiole de 100 ml puis , jauger
avec la solution M pour préparer une première dilution.
- Pour la deuxième dilution, 1ml de la première dilution a mis dans une fiole de 50ml puis ,
jauger avec l’eau pure .
- les fioles sont homogénéisés au vortex .
-Standard :
- peser deux fois 10 mg du standard ( ENR pur ) : S1 et S2 , dans une fiole de 10ml
contenue la solution M pour la premier dilution ,
ensuite pour la deuxième dilution , 1ml de la premier dilution a ajouté dans une fiole de
50ml , puis jauger avec l'eau pur jusqu'à le trait de jauge .
Remarque :
la préparation du standard (ENR pur) pour la vérification du temps de rétention, l’aire et la
hauteur des pics .
- Remplissage des viales deux pour l’échantillon et deux autres pour le standard, (20µl dans
chaque viale), les 4 viales (S1, S2, E1, E2).

27
Figure 10 : les fioles de la dilution du Figure 11 : viales des 4 injections (S1, S2, E1,
standard et les échantillons Enfin , placer les viales dansE2)
notre plateau de

HPLC pour les analyser.

Figure 12 : Injection des viales dans l’HPLC pour


analyse chromatographique

6.Les étapes d'injection :

- Purger la pompe pour éliminer les puretés du système d'injection .


- purger la colonne et donner le débit qui convient .

- Vérifier la pression pour éviter le risque d'un fuite

- créer une séquence contenant le numéro d'échantillon et le standard par l'ordre de la position
du plateau d'injection ( exp : E 422 M1 , E 422 M2 , S1 , S2 ).

- Introduire la méthode adaptée du principe actif (Enrofloxacine)

- Lancer l'injection ( clique sur START ).

e la pompe Figure 14 : la séquence et la


méthode
28 d'Enrofloxacine
7. Expression des résultats :
Les résultats en HPLC sont des chromatogrammes définissant une aire et présentant des pics
spécifiques. Le paramètre d'identification est le temps de rétention qui correspond au temps
d'élution au maximum du pic, mesuré à partir de l'injection. Le dosage est quant à lui basé sur
la mesure de la surface du pic ou sa hauteur. La teneur en principe actif est déterminé en
rapport avec la concentration des standards en utilisant la formule suivante :

g⁄100g = (Ae⁄As) ∗ (Ps⁄Pe) ∗ T ∗ D

Avec :
Ae : Air de l’échantillon As : Air du standard
Ps : Prise d’essai du standard Pe : Prise d’essai de l’échantillon
D : Facteur de dilution T : Titre du standard

29
Résultats et
discussion

I. Interprétation des résultats du dosage d’Enrofloxacine :


La division de la pharmacie et des intrants vétérinaires (DPIV) reçoit des médicaments à
contrôler avec un rapport qui décrit la composition et la molécule à vérifier, en plus du
protocole de la technique demandée et les résultats envisagés.
Le médicament que nous avons analysé doit contenir le principe actif (Enrofloxacine)

Analyse quantitative :

30
Basée sur le fait que l’aire des pics chromatographiques est proportionnelle à la concentration
ou à la quantité du produit analysé.

Analyse qualitative :
Le temps de rétention de l’échantillon doit correspondre à celui du standard pour confirmer
qu’il s’agit bien de la molécule ENR.
Le logiciel au niveau de l’HPLC effectue les
calculs nécessaires et détermine la quantité ENR
dans le médicament et permettant de voir si
celle-ci correspond à la quantité indiquée par le
fabriquant.

1. Résultats des injections :
Figure 16 : Pic de l'échantillon 1

Le logiciel Chromera au niveau de l’HPLC, présentera des chromatogrammes de la molécule

Enrofloxacine de l’échantillon et du standard :


Pour déterminer la quantité de l’Enrofloxacine dans le médicament, le logiciel Chromera
effectue des calculs nécessaires en se basant sur la relation suivante :
Figure 15 : Pic du standard 1
Ae Ps
Quantit é en g/100 ml= × ×T × D
As Pe

31
avec :

Ae : Aire du pic de l’échantillon


As : Aire du pic du standard
Ps : Poids de l’échantillon
Pe : Poids du standard
T : Titre du principe actif
D : Facteur de dilution
Les résultats finaux des standards et des échantillons sont calculés automatiquement par le
programme et transformés en rapport analytique :

Figure 17 : Rapport analytique des résultats de contrôle


Figure 18 : de
Résultats
ENR finals de standard et
d’échantillon de ENR

²
2. Décision :
En se basant sur la marge acceptée de ENR dans l’échantillon (elle est entre 9.5 et 10.5g / 100
ml du poids total du médicament), ce qui correspond à la marge où notre médicament doit se
manifester.
Les résultats montrent que nos deux échantillons sont dans cette marge alors jugés conformes
aux exigences et aux normes demandées.

Discussion  :

Pour l’analyse des résultats obtenus, le temps de rétention de l’échantillon correspond à celui
du standard, donc ce qui témoigne donc qu’il s’agit bien de la molécule étudiée ,ceci concerne
l’analyse qualitative.

32
En ce qui concerne l’analyse quantitative, elle est basée sur le fait que l’aire et la hauteur des
pics chromatographiques sont proportionnelles à la concentration ou à la quantité du produit
analysée.
Le logiciel au niveau de l’HPLC effectue les calculs nécessaires et détermine la quantité du
principe actif dans le médicament, ce qui est conforme à la quantité indiquée par le fabriquant.

Conclusion

33
Références
1 - Sandres P, L’antibiorésistance en médecine vétérinaire : enjeux de santé publique et de
santé animale. Bull. Acad. vêt. Fr. Tome 158 : pp. 137-142.
2 - Brunaud Sophie ; Le médicament vétérinaire : distribution au détail en France et en
Europe, rôle et implication du pharmacien ; thèse ; Université de Poitiers ; 1987.
3 - El Bourakadi Khadija ; Optimisation et validation d'une méthode de dosage simultané de
paracétamol et la caféine dans différentes formes pharmaceutiques : Comprimé, Sachet, et
Gélule ; mémoire de Master ; université Sidi Mohamed Ben Abdallah ; 2015.
4 - Comité mixte FAO/OMS d'experts des additifs alimentaires – JECFA/ Manuel de
procédure du codex : la commission du codex alimentariushttp://www.fao.org/fao-
whocodexalimentarius/standards/vetdrugs/glossary/fr/ Consulté le 09-03-2016 .
5 -Mammeri Asmaa, Sekhane houria ; Techniques d’analyse et contrôle qualité
microbiologique et physico-chimique d’un produit pharmaceutique, Mémoire de master,
Université Mentouri Constantine 1 ; 2017.

6 - Article L.5111-1 du Code de la Santé Publique, en France.


7 - Sèmanou Robert Dognon ; Qualité des antibiotiques vétérinaires utilisés en Afrique de
l’Ouest et méthodes de détection de leurs résidus dans les denrées alimentaires ; Journal of
Animal & Plant Sciences, 2018. Vol.36, Issue 2: 5858-5878.
8 - Fabrice Ndayisenga ; Analyse de la distribution et de la qualité des médicaments
vétérinaires au Rwanda ; Thèse de doctorat ; Université Cheikh Anta Diop de Dakar; 2009.
9 - Lai Michel ; Réévaluation des connaissances et représentation des parents d’enfants
atteints de viroses saisonnières vis-à vis de la prescription d’antibiotiques ; Université Paris
Diderot- Paris 7 ; 2013.
10 - Ellatifi Oussama ; Place des fluoroquinolone dans le traitement des infections urinaires
dans les établissements de santé lorrains ; Thèse de doctorat ; Université Henri Poincaré–
Nancy 1 ; 2011.
11 - Ouaidy Oussama ; Les quinolones en néonatologie : indications et effets secondaires (à
propos de 96 cas) ; Thèse de doctorat ; université Sidi Mohammed Ben Abdallah ; 2013.
12 - Jumber lien physique : PDF HPLC.

34
13 - Weidman Sandra ; Intérêt de l’association entre l’Enrofloxacine et la colistine ainsi que
de l’Enrofloxacine et la bromhexine dans le traitement des infections respiratoires aviaires ;
Thèse de doctorat ; Université Claude -Bernard – Lyon I ; 2008.

14 - Ben Saad Latifa ; Etude de la séparation des fluoroquinolone par HPLC : application à
l’étude de leur dégradation par rayonnement gamma ; mémoire de master ; Université Tunis
El Manar ; 2013.
15 - Professeur Jean-Louis Cuq. Cours chromatographie liquide, Université

16 - J. Dgraeve, F. Berthou, Méthodes chromatographiques, 2éme édition, (1986), p392.


17 - Dr Thierry Briere - Professeur agrégé – Département de Chimie, Université de La
Réunion, (2001), p36-37, p44-45, p46.
18 - A. Coursimault, STP pharma pratiques, (1998), 2éme édition, P478-488.

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