Ministère de l‟enseignement supérieure et de la recherche scientifique

Université d’Alger 1 Benyoucef BENKHEDDA

Faculté des Sciences
Département des Sciences de la Nature et de la Vie

Cours de Chimie Analytique et Analyse du

Métabolome – M2 Microbiologie Appliquée -

LA CHROMATHOGRAPHIE

Réalisé par: Dr. HAMRANI

1
Année Universitaire 2021-2022
 PROGRAMME

I. Généralités sur le métabolome microbien

II. La spectroscopie infrarouge et ses applications en microbiologie
III. Le MALDI-TOF-MS et ses applications en microbiologie
IV.La chromatographie en phase liquide couplée à la spectroscopie de
masse et ses applications en microbiologie.
V. La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie
de masse et ses applications en microbiologie.
VI.La résonance magnétique nucléaire et ses applications en
microbiologie.

2
 Plan de cours

Introduction
I- Chromatographie
1. Historique
2. Définition
3. Différents types de chromatographie
4. Choix d‟un système chromatographique
5. Domaine d‟application de la chromatographie
3
 Introduction

Les méthodes physiques de séparation sont très

nombreuses ,on peux les classer en deux grands
groupes : Chromatographie et électrophorèse , Dans les
deux cas les molécules séparées sont ensuite repérées
par une de leurs propriétés : affinité pour un colorant
spécifique, activité enzymatique, ou immunologique,
mesure de radioactivité,
4
 Historique
En 1906 un chimiste russe, Tswett, a séparé des pigments végétaux
colorés sur une colonne remplie de carbonate de calcium pulvérulent,
les pigments étaient entraînés avec de l'éther de pétrole (mélange
pentanes et d‟hexanes).
Il a observé sur la colonne la formation de
bandes de couleur différente (vert, orange,
jaune..).

Il a donné à cette technique le nom de

chromatographie (écriture des couleurs). Il a
défini également les termes : chromatogramme,
élution, rétention 5
Principe de la chromatographie

Fraction

Chromatographie d’élution
6
 Définition
La chromatographie sous toutes ses formes, est une méthode de
séparation des constituants d‟un mélange gazeux, liquide ou
solide.

C‟est une méthode de séparation des constituants d‟un

mélange, donc d‟analyse, basée sur les différences d‟affinités
(interactions) que peuvent présenter entre deux ou plusieurs
composés lors d‟un processus dynamique: le composant
(produit contenu dans le mélange), la phase mobile (le solvant)
et la phase fixe ou stationnaire (cellulose, silice, alumine,
etc…). 7
 Définition

L'origine du mot chromatographie vient peut-être de la

séparation de composés colorés puisque chroma en grec,
signifie couleur et graphein signifie écrire.

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 Différents types de chromatographie

Chromatographie d'échange d'ions

Chromatographie d'exclusion- Diffusion
Chromatographie d‟adsorption
Chromatographie de partage
Chromatographie d'affinité
Chromatographie sur couche mince
Chromatographie en phase gazeuse
Chromatographie liquide haute performance
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 Choix de la technique
Les différentes techniques sont complémentaires plutôt que concurrentes. Le
choix de l‟une ou l‟autre dépend :
 De la nature du soluté

Gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide, macromolécule, espèce organique,
polaire, ionique,…

 Du but de l’analyse:
Identification de composants d‟un mélange, nécessité ou non de “coupler” la
chromatographie avec une méthode spectroscopique ou avec la spectrométrie de
masse (CPG/SM ou GC/MS), contrôle de pureté, purification de produits
(colonnes préparatives), suivi de réaction en continu pour optimiser des
paramètres, dosages (quantification)… 10
 Domaine d’application de la chromatographie:
Domaine d‟application très vaste:

 Industries chimiques;
 Agro- alimentaires
 Environnement
 Pharmacie
 Microbiologie
 Biochimie

Avantage: Séparation, identification et quantification de très

faibles quantités de produits (~ng) 11
Chromatographie

- CCM
- GC
- LC
12
 Principe de la chromatographie
Le principe repose sur les équilibres de concentration des composés présents entre
deux phases non miscibles en contact.

- Phase stationnaire : peut-être solide ou liquide, qui est emprisonnée dans une
colonne ou fixée sur un support.
- Phase mobile : peut-être un liquide ou un gaz ou encore un fluide
supercritique, qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, entraînant avec
elle le soluté. Le processus d‟entraînement de ce soluté est appelé élution.

Chaque constituant adopte une vitesse de migration qui lui est propre en fonction
de sa solubilité dans la phase mobile et de son affinité pour la phase fixe qui tend
à le retenir.
Finalement on obtient la séparation des constituants du mélange initial. 13
 Principe de la chromatographie

 Différentes interactions peuvent entrer en jeu :

 Adsorption
 Partage
 Échange d‟ions

L‟adsorption: C‟est l‟accumulation de substances à la surface d‟une

des phases

14
 Aspect théorique

Le chromatogramme

Colonne
Injection Détecteur

Phase mobile

Chromatogramme
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 Le chromatogramme

Le chromatogramme: est une courbe qui traduit la variation au cours du temps

d‟un paramètre relié à la concentration instantanée du soluté en sortie de
colonne. La ligne de base correspond au tracé obtenu en l‟absence de composé
élué

Ce graphique est utilisé à la fois en analyse qualitative et quantitative.

- Analyse qualitative : permet l‟identification des composés par la position du
pic.
- Analyse quantitative : évaluer la concentration ou la masse d‟un composé en
utilisant l‟aire des pics

16
 La chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse (GC, Gas Chromatography) est une

technique physique d‟analyse basée sur la séparation de constituants d‟un
mélange, elle est développée à la fin des années 1950.

Le mélange à analyser est mis sous phase gazeuse avant d‟être entrainé dans
une colonne chromatographique par un gaz (CO2 en général)

Les différents constituants de ce mélange appelés solutés sont séparés en

entrainés par un fluide (un liquide ou gaz) que l‟on appelle phase mobile.

Ils interagissent ou non avec une phase fixe que l‟on appelle phase stationnaire
qui exerce sur eux un effet retardateur. 17
 La chromatographie en phase gazeuse
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) „ Gaz Chromatography GC en
anglais‟ est une technique de séparation applicable aux composés gazeux ou
susceptible d‟ètre volatilisés par élévation de température sans décomposition
mais elle est limitée aux composées thermostables et insuffisamment volatils.
Les CPG sont des chromatographies qui se caractérisent par:

 la phase mobile est un gaz

 la phase stationnaire (fixe) peut être:
• un solide adsorbant, on parle alors de CPG d‟adsorption ou CPG gaz-
solide. L‟adsorbant le plus utilisé est le silice.

• Un liquide imprégnant totalement la surface d‟un support devenu inerte, on

parle alors de CPG gaz- liquide ou CPG de partage 18
 Principe d’un chromatographie en phase gazeuse

Le mélange à analyser est

placés dans un injecteur. Il va
ensuite étre vaporisé puis
transporté à travers une colonne
(phase stationnaire), le
transport se fait à l‟aide d‟un
gaz inerte appelé gaz vecteur
(phase mobile) pour qu‟il y soit
séparé

19
 Principe d’un chromatographie en phase gazeuse

Les differentes molécules du mélange (les analytes) vont se séparer et sortir

de la colonne les unes après les autres. Plus un élément a d‟affinité avec la
phase stationnaire (colonne), puis il prendra de temps pour sortir de la
colonne de chromatographie. Les éléments peuvent étre identifiés à l‟aide
d‟un détecteur

20
Schéma simplifié d’un chromatographie en phase gazeuse

21
Quelques appareils de chromatographie en phase gazeuse

22
APPAREILLAGE DE CPG

23
 Description de l’aparéillage
Les appareils de chromatographie gazeuse appelés chromatographe
Un chromatographe est constitué de trois organes essentiels:

 un injecteur
 une colonne „placée dans une enceinte thermostat (four)
Un détecteur

Le gaz vecteur

L‟élution est assurée par un flux de gaz inerte appelé gaz vecteur ou porteur „
phase mobile‟. C‟est le gaz qui permet de faire évoluer l‟analyte à travers la
colonne de chromatographie; dans cette optique il doit posséder un certain
nombre de propriétés
24
 Le gaz vecteur
Le gaz vecteur idéal est :
Inerte : il ne doit pas réagir avec l‟analyte ni avec la phase stationnaire

De qualité pure: on le filtre avant la chromatographe

Le moins miscible possible avec la phase stationnaire

Bon marché

Compatible avec le détecteur

Le choix de gaz vecteur est conditionné par l‟efficacité de la séparation et de la
sensibilité du detecteur.
Les gaz les plus utilisés sont: hydrogène H2, azote N2, hélium He ou argon Ar 25
 L’injecteur
Les injecteurs permettent de vaporiser
l‟échantillon puis de l‟envoyer en tête de colonne
afin de se mélanger avec le gaz vecteur

L‟injection peut se faire d‟une

manière manuelle ou automatique en
utilisant un échantillonneur
automatique.

26
 Le four et la colonne

La colonne est placée dans une enceinte

chauffée appelée four pour maintenir une
température suffisante afin de garder les
solutés en phase gazeuse pendant l‟analyse

27
La colonne

La colonne est l‟organe principale. Elle se

présente sous forme de tubes fins enroulés
qui peut faire plus de 50 mètres, sur
laquelle les différentes molécules de
l‟échantillon injecté vont se séparer
suivant leurs affinités avec la phase
stationnaire.

28
 La colonne
Deux principaux types de colonne en CPG

29
La colonne

30
Aspect théorique

Comparer le
temps de rétention
31
Aspect théorique

32
 Aspect théorique: Paramètre d’un Chromatogramme

 Le temps (ou le volume d‟élution)

est porté en abscisse et l‟intensité
du signal de détection en
ordonnée.
 La ligne de base correspond au
tracé obtenu en l‟absence de
composé élué.
 La séparation est complète quand
le chromatogramme présente
autant de pics chromatographiques
revenant à la ligne de base qu‟il y
a de composés dans le mélange à
diagramme montrant les caractéristique d‟un
analyser. chromatogramme
33
 Paramètre d’un Chromatogramme
Temps de rétention et temps de rétention réduit
Le tr d‟un produit x est le temps écoulé entre l‟injection et sa sortie
Le temps de rétention corrigé t‟r tient compte du temps mort tm ou t0 : temps
réellement mis par un produit S pour parcourir une colonne

tm : Temps mort
tr : Temps de rétention
t’r : Temps de rétention réduit

34
Paramètre d’un Chromatogramme
Exemple

35
 Le partage

Principe

 2 corps différents ne se partagent pas de façon identique entre 2 phases

 Coefficient de partage

Tel que:

CS : concentration dans la phase stationnaire

CM: concentration dans la phase mobile
36
 Paramètre d’un Chromatogramme

Le chromatogramme idéal
Caractéristiques de la courbe de Gauss

37
Aspect Théorique
Le chromatogramme réel

Cas idéal Surcharge de la phase stationnaire Composé trop peu retenu

 Irrégularité de concentration dans la zone de dépôt

 Vitesse de la phase mobile non constante dans la colonne 38
 Efficacité d’une colonne
Notion de plateaux théorique – Hauteur équivalente d’un plateau théorique
Une colonne de N plateaux théoriques est une colonne divisée en N disques
cylindriques successifs.
Les phases mobile progresse par sauts successifs d‟un plateau théorique à l‟autre

39
 Efficacité d’une colonne

ωb est la largeur du pic à la base en unité de temps

ωh ou δ est la largeur à mi –hauteur en unité de temps
Plus le nombre de plateaux théoriques est élevé plus la colonne est efficace

40
 Hauteur équivalente d’un plateau théorique

Pour comparer des colonnes de différentes longueurs, on définit la hauteur

équivalente à un plateau théorique (HEPT).
Plus les plateaux théoriques sont étroits plus la colonne est efficace.

41
 Paramètre d’un Chromatogramme

Résolution entre deux pics: Résolution R ou Rs

Une séparation en CPG ou HPLC doit être résolutive
Doit pouvoir séparer deux pics

Pour avoir une bonne séparation :

Rs > 1,5 42
 Résolution d’une colonne
La résolution R entre deux pics est définie par deux relations:

Relation très utile pour mesurer le degré de

séparation mais ne relie pas les paramètres
fondamentaux de la chromatographie : ne
s‟applique pas dans le cas de deux pics A et B
très proches tr(A) ~ tr(B) et ωA ~ωB

Pour que les composés soient bien individualisés, une colonne doit présenter:

• Un nombre de plateaux théoriques N élevé et un HEPT bas

• Un facteur de sélectivité (ou facteur de séparation )α élevé
• Un facteur de rétention K élevé (temps de rétention élevés) 43
 Résolution d’une colonne

Relation donnant la résolution entre deux pics

Si:
 R<1 : mauvais résolution
 1<R<1,4 : résolution acceptable
 1,4<R<1,6 : résolution optimale
 R>1,6 : temps d‟analyse trop allongé
44
 Facteur de capacité ou Facteur de rétention

• K et k‟: facteur sans dimension s‟apparente au coefficient de partage, peut

être relié au tr et ne dépend ni du débit ni de la longueur de la colonne.

• Le facteur de capacité de la colonne k‟ est donnée par

2<k<6

45
 Sélectivité d’une colonne

Une colonne doit pouvoir séparer deux composés dont les pics sont adjacents.
Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics consécutifs 1 et
2, on utilise le facteur de sélectivité (ou rétention relative) défini par la relation:

 K1 et K2 sont les facteurs de capacité des solutés 1 et 2

 La séparation est bonne pour α >1,5 ( α toujours >1).

46
Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)

47
 Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)

Principe

 Méthode de séparation de composés non-

volatiles
Phase stationnaire

Phase mobile
A
 ÉCHANGE de molécule LIQUIDE entre
phase stationnaire et phase mobile
B
 Phase stationnaire solide

 Phase mobile LIQUIDE

48
 Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)

Appareillage
 Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)
La colonne
Un type de colonne en HPLC

50
 Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)

Choix de la colonne

 Nature de l’échantillon
 Nature de la phase stationnaire
 Diamètre de la colonne
 Longueur de la colonne

Paramètre important : Choix de la colonne

51
 Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)

ROLE: Détecteurs

 Appareil de mesure physico-chimique qui ne réagit qu‟au passage des

solutés voire d‟espèces spécifiques du soluté
 Signal traité après amplification par un système informatique
d‟acquisition
IDEAL:
 Sensible
 Rapport signal électrique/débit massique
 Rapport signal électrique/concentration
 Universel
 Robuste
 Domaine de linéarité large 52
Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)

Phase stationnaire

Paramètres de choix de la phase stationnaire

 Nature
 Polarité
 Stabilité
 Température mini et maxi d‟utilisation

53
 Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)
Détecteur à ionisation de flamme (FID)
Principe :
Mesure le courant ionique généré dans une flamme hydrogène au passage de
l‟échantillon

54
Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)

Spectrométrie de masse

Détermination de données structurales sur les composés 55

 la spectrométrie de masse MS

Appareillage :

• 1- La source d‟ion : pour volatiliser et ioniser ces opérations peuvent se faire simultanément ou
successivement selon le type de source d‟ions. Leur mécanisme intime est souvent mal connu.

2- L‟analyseur: pour mesurer m/z

Il mesure les valeurs du rapport: masse / nb de charge (appelé m/z) ; C‟est une partie de
l‟appareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur
à la distance à parcourir dans l‟appareil pour atteindre le détecteur.
56
la spectrométrie de masse MS
Les sources d’ions les plus courantes sont :
La source à plasma induit couplé (Induced coupled plasmas: ICP-MS)
La source à impact électronique (EI)
La source à ionisation chimique (CI)
La source à ionisation chimique par désorption (DCI)
L‟ionisation par thermospray (TSP)
La désorption de champs (FD)
L‟ionisation par bombardement d‟ions ou d‟atomes rapides (FAB)
La désorption par plasma (PD)
La désorption laser (LD)
L‟ionisation chimique à pression atmosphérique (API ou APCI)
La photoionisation (APPI)
L‟ionisation laser assistée par matrice (MALDI)
L‟électronébulisation (electrospray: ES ou ESI 57
 Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)
Les caractéristiques principales d'un analyseur sont :

•La résolution R
•La gamme m/z qu'il peut analyser
•La rapidité de balayage en m/z
•La sensibilité
•La vitesse avec laquelle les ions le traverse

•Souvent, avec un même analyseur, on peut augmenter l'une de ces

caractéristiques aux dépends des autres, mais seulement dans certaines
limites.
•Chaque type d'analyseur a son "point fort".
58
 Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)
Spectromètres de masse comerciaux :
De nombreux couples source /analyseur sont possibles

59
 Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)
La spectrométrie de masse à plusieurs dimensions:

Il y a plusieurs analyseurs qui se suivent. Les analyseurs peuvent être couplés et agir de façon
séquentielle. On parle alors de spectrométrie de masse à plusieurs dimensions
- Un premier analyseur sélectionne les ions avec un certain m/z
- On purifie donc un ion présent dans un mélange d‟ion qui peut être très complexe
- L‟ion « purifié » est alors fragmenté dans une chambre de collision.
- Un deuxième analyseur mesure alors les m/z des fragments. C‟est de la MS-MS (spectrométrie de
masse en tandem)
- Si on répète l‟opération, on fait de la MS-MS-MS ou MS3.
Certain appareils permettent de faire de la MS10
La MS-MS est un puissant outil de détermination de structure 60
Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)
Principe de la MS/MS : étude d’ions fils

Le premier analyseur ne balaye pas

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MERCI DE VOTRE
ATTENTION 62