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Université Saad Dahlab

Faculté de Médecine, Département de Pharmacie


Laboratoire de Chimie Analytique

La Chromatographie sur Couche Mince


Thin - Layer Chromatography
(CCM – TLC)

Cour pour les étudiants en 3eme année de pharmacie

Fait par Dr F.BELAIDI


Introduction
La chromatographie planaire, également connue sous le nom de chromatographie sur couche
mince (CCM), est une technique de séparation ayant sa propre spécificité permettant de
contrôler la pureté d'une substance, de séparer les constituants d'un mélange et éventuellement
de les identifier.

 Bien que la mise en œuvre de cette technique soit différente de celle des autres
techniques chromatographiques , le principe de la séparation et la nature des phases
restent les mêmes. Elle utilise une phase stationnaire disposée en couche mince sur
une plaque et une phase mobile entrainée par capillarité le long de la plaque.

 Il s’agit d’une méthode sensible, de faible coût, pouvant être automatisée, elle est
devenue désormais indispensable sachant aussi qu’il est possible de mener plusieurs
séparations en parallèle.

I-Place de la CCM parmi les méthodes chromatographiques

Figure 01: La CCM parmi les méthodes chromatographiques

II-Principe

Il s’agit d’une méthode chromatographique basée sur la différence d’affinité des solutés vis-à-
vis de:

 Un adsorbant (la phase stationnaire)

L’adsorbant est déposé en une couche mince et uniforme sur un support approprié (plaque de
verre, feuille de polyester ou d’aluminium grâce à un liant.

 Un solvant ou un mélange de solvants (la phase mobile= éluant)

L’éluant se déplace par capillarité à travers la phase stationnaire entraînant à des vitesses
différentes les constituants à séparer .Au cours de leur migration (= développement), les
analytes sont entrainés par la phase mobile à travers la couche mince.

La vitesse d’entraînement des analytes est la résultante :


 la force d’entraînement par la PM (solubilité)
 la force de rétention par la PS (adsorption)
Les deux forces dépendent :
 la nature de l’analyte
 la nature de la PS et de la PM
 la température

Figure 02: les forces exercées sur l’analyte

III-Mécanismes de rétention

1- Le phénomène d’adsorption :
Il s’agit d’un phénomène de surface ou les composés sont attirés sur les sites actifs de la PS
par :
 Les forces de Van Der Waals .
 Les liaisons hydrogènes.
Pour des fins séparatives, L’adsorption doit être réversible car la capacité d’adsorption des
composés sur la phase stationnaire est en relation directe avec leur polarité.
Plus un composé est polaire, plus fortement il sera adsorbé sur les sites actifs de la phase
stationnaire (cas de la silice) et moins vite il se déplacera
Figure 03:Adsorption de l’analyte sur la PS constituée de silice

La polarité de l’éluant a une influence considérable sur la vitesse de déplacement des


composés d’un mélange. Ainsi plus l’éluant est polaire, plus les composés se déplacent
rapidement. En effet, l’éluant est également adsorbé sur les sites actifs de la phase stationnaire
et entre en compétition avec les composés du mélange.

2- Le phénomène de partition (partage)

La phase stationnaire est un liquide fixé physiquement ou greffé chimiquement sur un support
solide. Les analytes vont se solubiliser dans la phase liquide stationnaire, au lieu de s’y
adsorber et C’est la différence de solubilité des composés dans la PS et dans la PM qui rend la
séparation chromatographique possible

 Plus un composé est soluble dans la phase liquide stationnaire, moins vite il se
déplacera.

 Plus un composé est soluble dans la phase mobile, plus vite il se déplacera.

 Les analytes doivent avoir des coefficients de partage différents, pour pouvoir les
séparer.

3- Le phénomène d’échange d’ions et appariements d’ions

La Phase stationnaire est en polystyrène traitée chimiquement pour faire apparaître des sites
actifs ioniques.Les agents d’appariement d’ions les plus courants sont:
* Sulfates ou sulfonates : (cations)
* Ammoniums quaternaires : (anions)
La Phase mobile est constituée d’une solution tampon aqueuse et repose sur l’échange des
contre-ions mobiles (PS) avec des ions, de même signe, présents dans la (PM)
IV-Matériel
1. La Plaque Chromatographique
La plaque CCM est constituée d’un support sur lequel est disposée une couche mince et
uniforme de phase stationnaire.L’adhérence de la phase stationnaire sur le support est assurée
par un liant et la plaque de CCM peut avoir différentes dimensions:

5 x 5 / 10 x 20 / 20 x 20

Figure 04 : Coupe transversale d’une plaque CCM

L’épaisseur de la couche CCM varie en fonction du but recherché


 Chromatographie préparative : l’épaisseur varie de 1 à 2 mm
 Chromatographie analytique : elle est de 0.2 à 0.3 mm.
 Les plaques HPTLC (High Performance TLC) : 100 μm dont les avantages sont :
Meilleure séparation
Temps d’élution plus faibles
Faible quantité d’échantillon nécessaire
 Sensibilité de détection accrue
 Plaques UTLC(Ultra Thin Layer Chromatography) : monolithiques dont l’épaisseur
de la couche est de 10 μm.
a. La phase stationnaire

Tableau 1: Phases stationnaires non greffées


b. Le liant
Assure l’adhérence de la PS et empêche son détachement au cours du processus
chromatographique .Les liants peuvent être organiques ou minéraux, et sont ajoutés à la PS en
cours de fabrication avec comme avantage des liants minéraux le fait qu’ils rendent la PS
fragile et facilitent le grattage lors de la quantification il existe :

Liants organiques: Ex: Amidon


Liants minéraux: Ex: Sulfate de Calcium hydraté (plâtre de Paris)

2. La phase mobile

Il s’agit d’un solvant ou mélange de solvants qui a pour rôle d’entraîner les analytes tout au
long de la phase stationnaire.Le choix de la phase mobile est basé sur deux paramètres
fondamentaux:La force éluante et la sélectivité.
a- Les solvants en CCM

b. Classification des solvants de la phase mobile selon la force éluante


Force éluante du solvant ε0 : Définie comme l’énergie libre d’adsorption des molécules
de solvant par unité de surface de phase stationnaire .

Tableau 2: Classification des solvants

C . Classification des solvants selon le triangle de sélectivité de SNYDER


Solvants classés en VIII groupes de sélectivité en fonction de leur aptitude à donner différents
types d’interactions soluté-solvant:
Xa: mesure les accepteurs de protons.

Xd: mesure les donneurs de protons.

Xn: mesure les attractions dipolaires.

Changer un solvant par un autre solvant du même groupe ne change pas la sélectivité mais
joue sur la solubilité de l’échantillon.

Figure 05: Triangle de sélectivité de SNYDER

3- Les cuves de migration


Récipients en verre quadrangulaires ou cylindriques ,d’une étanchéité parfaite
 Doivent être hermétiquement fermées.
 L’atmosphère de la cuve doit être parfaitement saturée,
Pour cela on :
o Tapisse entièrement les parois interne de la cuve d’un papier filtre.
o Une fois que des solvants sont introduits, agiter énergiquement pour que le papier
soit imbibé.
o On laisse la phase mobile dans la cuve pendant 24 heures (phase de saturation).

Figure 06: cuves de migration


IV-Mise au point de la ccm
1-Activation de la plaque :

Dont le principe consiste à introduire les plaques dans une étuve, afin d’éliminer l’humidité
résiduelle adsorbée sur la plaque . Activation de la plaque par chauffage:Pendant une nuit à
110°C ou Pendant une demi-heure à 150°C
 Cependant , ATTENTION au delà de 150°C, altération de la PS

2. La préparation des échantillons


La CCM est une technique moins exigeante /aux autres méthodes chromatographiques . Elle
peut se faire en plusieurs étapes selon le type de la séparation désirée :
 Prélèvement , extraction, filtration, éventuellement concentration, ou même pré-
séparation en éliminant les composés gênants .
 Echantillons à analyser et standards sont mis en solution dans un solvant volatil
(trichlorométhane, dichlorométhane …)
 Pour des conditions de dépôt optimales, on utilise le même solvant de dissolution pour
les standards et les échantillons.

A-Les solvants de dissolution


Bien qu’il soit éliminé après le dépôt par évaporation, il peut influencer le résultat de
l’analyse .Pour s’affranchir des interférences, le solvant doit:
- Etre suffisamment polaire pour bien dissoudre l’échantillon mais pas trop pour
s’éliminer facilement.
- Avoir une force éluante faible.
- Etre non toxique, stable et ne pas réagir avec l’échantillon.
- Etre le plus pur possible.

3. Dépôt de l’échantillon
Mais avant; on commence par :
3.1Préparation de la plaque CCM
Sur la couche mince on doit Tracer une légère ligne horizontale à 1cm de son bord inférieur.
Et Tracer une autre ligne horizontale en grattant la PS pour stopper l’évolution du solvant,
située à environ 15 cm du bord inférieur puis Déposer un petit volume (qlq microlitres)de la
solution échantillon à proximité du bord inférieur de la plaque.
Figure 07:Préparation de la plaque CCM

3.2Technique utilisée pour le dépôt de l’échantillon


Selon la technique utilisée pour le dépôt, on distingue:
 Un Spot: dépôt par capillarité ou par contact.
 Une Bande: dépôt par pulvérisation.
Il faut Eviter de déposer l’échantillon trop près du solvant, car il y a risque de diluer
l’échantillon et donc l’ observation des trainées.

a)-Dépôt par capillarité ou dépôt par contact


Il s’agit d’une méthode de dépôt manuelle qui Se fait par un capillaire calibré ou micro
seringue où L’échantillon est déposé en un point par contact du capillaire sur la plaque.

b)-Dépôt par pulvérisation


Il s’agit d’une méthode de dépôt automatique où l’échantillon est vaporisé sur la surface de la
plaque sous forme d’une bande qui a pour intérêt de Pouvoir maîtriser la reproductibilité des
quantités déposées qui est indispensable pour l’analyse quantitative.

Figure 09: technique de dépôt par pulvérisation


3.3Après le dépôt de l’échantillon
Apres avoir Sécher la plaque à l’air libre pendant 10min, ou à l’aide d’un sèche-cheveux.
Introduire la plaque dans la cuve , au fond de laquelle se trouve un petit volume de la phase
mobile ( d’éluant), L’échantillon doit se situer au-dessus du niveau d’immersion.

4. Développement des plaques


Il s’agit d’un Processus au cours duquel l’échantillon est entraîné par la phase mobile à
travers la phase stationnaire. La durée de développement varie selon la nature des solvants (30
min à 3 h au maximum) .La migration est arrêtée lorsque le front du solvant a parcouru 10 à
15 cm.
A – Développement linéaire
A.1. Développement vertical:
La plaque est disposée verticalement dans la cuve et La phase mobile monte à travers la
phase stationnaire par capillarité
A.2. Développement horizontal:
La plaque est disposée horizontalement et La phase mobile arrive de deux côtés opposés de la
plaque. Le processus de développement s’arrête lorsque les deux fronts se rencontrent.
Elle a pour avantage de permettre une occupation totale de la surface de la PS et de doubler
le nombre d’échantillons à analyser.
B – Développement bidimensionnel
Si un développement linéaire ne permet pas de séparer les constituants du mélange
Il existe un développement bidimensionnel : deux élutions successives dans deux directions
perpendiculaires.

5. Méthodes de révélation

Selon la nature de l’analyte , différents cas se présentent:


 Détection visuelle:
- En lumière du jour.
- En lumière ultraviolette.
 Dérivation pré ou post-chromatographique:
Révélation par réaction chimique, physique ou biologique.

a. Détection visuelle
 Lumière du jour
La détection se fait à la lumière du jour, pas besoin de révélateur grâce aux couleurs
intrinsèques des analytes
 Lumière UV
 Substances fluorescentes:
A l’examen aux rayons ultra-violets (lampe UV), elles apparaissent brillantes sur fond noir.
 Substances non-fluorescentes:
La PS est préparée avec un indicateur fluorescent. A l’examen aux rayons UV, les SPOT
paraissent sombres sur un fond fluorescent

b-Révélation par dérivation (formations de dérivés) :


Lorsque le composé ne présente aucun groupement chromophore susceptible d’être détecté
par spectrophotométrie.
Dérivation pré-chromatographique
Par l’ Ajout du réactif en solution lors de la préparation des échantillonsou l’Ajout du réactif
par vaporisation directement sur le dépôt.Les réactions de dérivation peuvent être de
différentes natures :D’oxydation, réduction, estérification, hydrolyse,halogénation (vapeur de
brome , d’iode),formation d’hydrazone……..
Dérivation post-chromatographique
La révélation se fait par pulvérisation de réactifs chimiques sur la plaque après
développement.
 Réactifs universels:

- Acide sulfurique.
- Réactif phosphomolybdique.
- Dichromate de potassium.
- L’iode.
 Réactifs spécifiques:
 - Ninhydrine.
 - Anisaldehyde.
 - Dinitrophenylhydrazine
 - Iooplatinate
Les produits résultants sont souvent fluorescents ou bien absorbent en lumière UV

V. Grandeurs de la CCM
1. Facteur de retardement Rf

L’analyte est caractérisé en CCM par un rapport appelé: « facteur de retardement » (retarding
factor).

Les Paramètres influençant le Rf sont:


- Épaisseur de la phase stationnaire.
- Contenu en eau dans les phases mobiles et stationnaires.
- La température.
- Le degré de saturation par la vapeur de la phase mobile de l’enceinte de
développement.
- La taille de l’échantillon.
Pour s’affranchir de ces paramètres qui sont difficiles à contrôler, utiliser le facteur
relatif Rx.

VI-Analyse qualitative et quantitative en CCM


a)-Analyse qualitative

L’exploitation qualitative en CCM est, en général, faite directement sur la plaque, grâce aux
valeurs caractéristiques de « Rf », et grâce à des réactions chimiques spécifiques :
 L’identification d’une substance inconnue
Peut être présumée en comparant sa distance de migration avec celles de composés
connus (substances de référence) , déposés, sur la même plaque.
 Déterminer la pureté d’une substance
Un corps pur n’ayant subi aucune dégradation ne doit donner qu’une seule tache à la
révélation.
 Études de stabilité des médicaments
Aussi bien en développement qu’en analyse de routine.

b- Analyse quantitative
 Mesure de la dimensions des taches: (méthode comparative)
Il s’agit d’une méthode semi-quantitative(la plus simple) qui consiste à mesurer la surface
des taches , cette surface est en rapport avec la quantité de substance initialement déposée.
 Densitomètrie :
La plaque CCM est déplacée sous l’optique d’un densitomètre qui mesure soit l’adsorption,
soit la fluorescence à une ou plusieurs longueurs d’onde.
Cette mesure conduit à un diagramme comportant des pics dont on peut mesurer les aires.
 Analyse d’image vidéodensitométrie :
Technique récente, dans laquelle les images obtenues sont transformés par un systéme en
résultats chromatographiques
 Dosage après élution :
Technique la plus utilisée , et qui donne les résultats les plus précis.
Une fois les taches sont localisées (coloration, détection UV) :
- Prélèvement ,par grattage, de la phase stationnaire au niveau de chaque tâche.
- Elution des substances qui s’y trouvent pour dosage par une méthode appropriée.

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