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Faculté de Médecine de Blida Département de Pharmacie Laboratoire de Chimie Analytique

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE


« CLHP - HPLC »
I. Introduction
Parmi les techniques chromatographiques dont la phase mobile est un liquide, la chromatographie
liquide haute performance (CLHP) est la plus connue.

II. PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE (CL)


Est une technique de séparation chromatographique fondée sur la distribution différentielle des
espèces entre deux phases non miscibles :
- Phase stationnaire : Silice vierge ou greffée, Polymère moléculaire, Échangeurs d’ions.
- Phase mobile : Solvant pur, Mélange de solvants
Chaque soluté se répartit entre les deux phases citées selon un coefficient de distribution de Nernst
«K»

K = CS/CM
CS : Concentration du soluté dans la phase stationnaire
CM : Concentration du soluté dans la phase mobile

III.CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE


III.1. Chromatographie d’adsorption
Phase stationnaire : Solide adsorbant polaire (ex: gel de silice , alumine) ou peu polaire (ex: charbon
actif)
Phase mobile : Solvant polaire (ex: méthanol) ou apolaire (ex: éther)
La rétention est due à une suite de processus d’adsorption /désorption du soluté

Phase mobile
Phase stationnaire

Soluté

Fig.1: Principe de la chromatographie d’adsorption

III.2. Chromatographie de partage

a. Principe :
Phase stationnaire : Liquide immobilisé sur un support inerte
Phase mobile : liquide
La rétention et la séparation sont basées sur :
✓ La différence de solubilité des solutés dans la phase mobile
✓ Les différences d’interactions des solutés avec la phase stationnaire

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b. Types :
1.Chromatographie de partage classique ou en phase normale (NPLC)

✓ Phase stationnaire est plus polaire que la phase mobile


✓ Phase mobile peu polaire ou apolaire (ex: isopropanol, hexane, acétate d’éthyle)

2.Chromatographie de partage à polarité de phase inversée (RPLC)

✓ Phase stationnaire moins polaire que la phase mobile


✓ Phase mobile polaire (ex: Acétonitril (ACN),méthanol)

IV. CONCEPTION GENERALE D’UN APPAREIL DE CLHP


Colonne
Logiciel

Système
d’injection

Réservoir
Phase mobile Echantillon

Pompes Détecteur

Effluent
(Déchet)

Fig.2: Schéma des différents composants d’un chromatographe pour HPLC

IV.1.Réservoirs de la phase mobile


Un ou plusieurs bouteilles (500 mL), en verre ou en acier inoxydable dans lequel plonge un tube avec
une extrémité filtrante en téflon.

Fig.3: Réservoirs de solvants Fig.4: filtre (acier inox ou téflon)

IV.2. Pompes
Toute installation de CLHP comporte au moins une pompe pour forcer le passage de la
phase mobile à travers la colonne chromatographique
Délivre la phase mobile en continu et à débit précis et constant :Débit : 0,01 à 10 ml/min ;Stabilité de
flux < 1% ;Pression maximale  350 bars
Généralement pilotées par informatique.

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Permet de délivrer à débit constant :


✓ Eluant de composition fixe : mode isocratique
✓ Eluant de composition variable : mode gradient d’élution
Les pompes à piston alternative est l’un des systèmes de pompage les plus utilisés en C.L.H.P.

1er piston 2nd piston 2nd piston 1er piston

Fig.5: Principe de fonctionnement d’une pompe (binaire) à 2 pistons en série en HPLC

IV.3. Système d’injection


- La méthode la plus simple et la plus pratique d’introduire l’échantillon est le procédé d’injection
par boucles d’échantillonnage (vanne à 6 voix)
- Une vanne à boucle d’échantillonnage d’une capacité fixe :10, 20, 50,… µL

Position chargement de la Position injection dans


boucle « LOAD » la colonne « INJECT »

Fig.6: Vanne d’injection à six voies avec boucle d’échantillonnage pour HPLC

IV.4. Colonne chromatographique en CLHP

Fig.7: Colonnes en acier de longueurs et diamètres variables

• La colonne chromatographique est constituée d’:


✓ Un Support solide

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- Tube droit en acier inoxydable, ou en verre recouvert extérieurement par l’acier.


- Longueur : 5 à 30 cm
- Diamètre interne : 4 à 5 mm
✓ Un Contenant de remplissage
- Solide inerte (billes en verre, polymères poreux…)
- Rôle : fixation de la phase stationnaire
✓ Une Phase stationnaire
- Silice, polymère
• La colonne chromatographique est précédée d’une pré-colonne, courte (0.4 à 1 cm) de même
nature de phase stationnaire. Cette colonne de garde sert à retenir certaines impuretés et à
prolonger la durée de vie de la colonne principale en préservant ses performances.

Sens de l’élution

Colonne
précolonne analytique
R
R

DF DF DF
R : Raccord
DF : Disque fritté

Fig.8: colonne standard et pré-colonne de CLHP

IV.5. Phase stationnaire de HPLC de partage

IV.5.1. Gel de silice


Le gel de silice est un solide amorphe ayant pour formule de composition SiO 2 (H2O) n, de caractère
polaire, acide.
A la surface de la silice, on retrouve des groupes : silanols (-OH) , siloxanes (-O-)

Fig.9: Structure de gel de silice

Le gel de silice comporte des pores de tailles différentes


Il est préparé soit de :
1. Micro-sphères : microparticules sphériques d’un diamètre constant dans une même colonne
mais il en existe plusieurs types allant de 1 à 12 um.

Fig.10: Représentation d’une s tructure de gel silice Fig.11: Représentation d’une s tructure de gel silice
comporta nt des pores de diffusion répartis dans la comporta nt Particules poreuse en surface avec un noyau
tota l ité de la particule. non poreux.

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2. Monolithes : il s’agit d’un gel de silice formé d’une seule pièce dans la colonne même

Fig.12: Représentation détail de structure


d’un remplissage du type monolithique.

Les silices chromatographiques sont constituées de particules sphériques.Cette forme sphérique


offre une meilleure résistance mécanique et une moindre résistance à l’écoulement.

Fig.13: Si lice de forme irrégulière Fig.14: Si l ice de forme sphérique homogène

IV.5.2. Qualités et défauts du gel de silice


a. Qualités

✓ Surface spécifique importante


✓ Grande résistance mécanique
✓ Faible taille des particules (1.5 à 10 μm)
✓ Répartition granulométrique très étroite
✓ Particules sphériques
✓ Réactivité des groupements silanol (Si-OH)(Greffage)
b. Défauts

✓ Rétention des solutés basiques par échange d’ions due au caractère acide des silanols libres
ce qui induit des pics en traînée
✓ Solubilisation de la silice en milieu alcalin (pH > 7 )
IV.5.3. Gel de silice greffé
✓ La méthode de greffage la plus utilisée est la silanisation
✓ Réaction d’une organo-silane à fonction réactive X sur les groupements silanols du support
de silice par formation de liaison chimique covalente (pont siloxane)

OH CH3 OH CH3
Si - OH + X – Si – R Si – O – Si – R + H-X
O CH3 O CH3

X = ( Cl, OCH3 , OC2H5 )

Selon le radical « R » lors du greffage, résultent :

Phase stationnaire polaire


- Exp : (-diol, -cyanopropyl, aminopropyl,…)

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- Chromatographie liquide de partage en phase normale (NPLC)


Phase stationnaire apolaire
- Exp : (-alkyl, -phenyl,…)
- Chromatographie liquide de partage en phase inverse (RPLC)
Tableau 1: Exempl es de phase s tationnaires greffées

IV.5.4. End-capping
Les groupements silanols résiduels restants libres sont réduits par un traitement au
triméthylchlorosilane (TMCS) qui est le plus petit silane, c’est le endcapping.
Le « end-capping » est généralement de caractère apolaire.

CH3

Cl – Si – CH3

CH3

TMCS

IV.6. Phase mobile


IV.6.1. Propriétés des solvants utilisés
✓ Inertie chimique vis-à-vis des solutés à analyser et insolubilité vis-à-vis de la phase stationnaire
✓ Pureté des solvants (Solvants grade HPLC)
✓ Des interactions soluté-solvant (Force intermoléculaire dipôle-dipôle ,Liaisons hydrogènes…)
✓ Viscosité de la phase mobile (Pas trop élevée)
✓ Compatibilité avec le système de détection
✓ Polarité des solvants :
a. L’énergie libre d’adsoption du solvant ( °)

La force éluante de la phase mobile varie avec l'énergie libre d’adsorption qui permet de contrôler la
rétention des solutés
Plus ( °) est élevée , plus la phase mobile est élutive et le facteur de rétention est faible
b.La polarité P’ d’un solvant

L’indice le plus utilisé pour décrire quantitativement la polarité d’un solvant en CL est l’indice de
polarité de Snyder.
Cette polarité est scindée en
✓ Xe : mesure le pouvoir accepteur de protons par rapport à l’éthanol

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✓ Xd : mesure le Pouvoir donneur de protons par rapport au Dioxane


✓ Xn : mesure le pouvoir à donner des interactions dipôle- dipôle par rapport au Nitrométhane
Pour chaque solvant, on a : (Xe + Xd + Xn = 1)
L’indice de polarité varie de (-2) pour les Fluoroalcanes trés peu polaires jusqu’à 10,2 pour l’eau qui
est trés polaire

IV.6.2. Choix des solvants


La phase mobile est constituée d’un ou de plusieurs solvants de polarités et rôles différents :
➢ Solvant de base de polarité inverse à celle de la phase stationnaire (peu élutif)
➢ Modificateur de polarité (proche de celle de la phase stationnaire) (trop élutif)

Fig. 15: Pouvoir d’élution de quelques solvant en NPLC et RPLC

IV.6.3. Contrôle du pH
Quand les solutés sont de nature acide ou basique, il devient nécessaire de contrôler le pH de la
phase mobile (milieu tamponné).
- Les acides sont analysés à un pH inférieur d’au moins 2 unités au pKa de l’espèce la plus acide.
- Les bases sont analysées à un pH supérieur d’au moins 2 unités au pKa de l’espèce la plus
basique.

Fig. 16: Influence du pH dans la séparation des composés

IV.6.4. Adjuvants de la phase mobile


Une phase mobile peut contenir des substances dissoutes, parmi lesquelles :
- Tampons acido-basiques (solutés acides ou bases faibles).
- Source de chlorures pour certains détecteurs électrochimiques.
- EDTA: dans le but de complexer les ions métalliques ( pouvant interférer lors de détection
électrochimique).

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IV.6.5. Solutions de rinçage


A la fin de toute analyse chromatographique, il est nécessaire de rincer la totalité du système en le
faisant traverser par une solution de rinçage composée généralement de:
- Un solvant organique pour éliminer les souillures apolaires.
- Un solvant polaire (eau) pour éliminer les souillures polaires.
La proportion de ces solvants est fixée en fonction de la nature de l’échantillon et de la structure des
solutés.
Afin d’éviter la prolifération microbienne pouvant obstruer les fines tubulures d’un système HPLC, il
est recommandé, à la fin de l’analyse, de plonger les tubulures dans un solvant organique.

IV.6.6. ORDRE D’ELUTION


✓ En NPLC : une substance apolaire est trop fortement éluée par la phase mobile
✓ En RPLC : une substance polaire est trop fortement éluée par la phase mobile

IV.6.7. Modes de travail


Selon la composition de la phase mobile au cours de l’analyse

a. Mode isocratique
La composition de la phase mobile reste inchangée au cours de l’analyse. Même pouvoir d’élution

Fig. 17: Séparation des composés d’un mélange en mode isocratique (Eau/ACN)70/30

b. Mode à gradient d’élution


La composition de la phase mobile change au cours de l’analyse.
Il est possible d’augmenter la force éluante pour éliminer les composés très retenus pouvant
conduire à des contaminations.

Fig. 18: Sépa ration des composés d’un mélange en mode gradient
(20 à 60% ACN) pendant 30 mi n

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IV.7. Détecteurs en HPLC


La détection se fait par un instrument placé immédiatement à la sortie de la colonne.
Il permet de suivre en continu la séparation et de mesurer la concentration des solutés.

IV.7.2. Principaux détecteurs utilisés

Tab.2: Principaux détecteurs utilisés en HPLC Partage

a. Réfractomètre différentiel
Mesure en continu la différence d'indice de réfraction entre la phase mobile contenant le soluté et la
phase mobile pure correspondant à la référence.

R = Z (n-n0)
R: la réponse du réfractomètre. n: indice de réfraction de l’effluent.
Z: constante caractéristique de l’appareil. n0: indice de réfraction de la phase mobile

Fig.19 : Principe de la réfractométrie différentielle

b. Spectrométrie de masse

Fig.20: Appareillage CL-UV- MS

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c. Détecteur évaporatif à diffusion de lumière (DDL)


Est fondé sur l'évaporation partielle de l'effluent de la colonne de façon à obtenir un brouillard de
particules solides ou liquides du soluté qui traverse un faisceau lumineux.
La lumière diffusée sous un ongle déterminé est détectée par un photomultiplicateur.

Fig.21: principe de Détecteur à diffusion de la lumière(DDL)

d. Spectrophotométrie UV/visible
Mesure la perte d’intensité de la lumière UV - Visible lors du passage à travers une solution.
La sensibilité optimale est obtenue en utilisant le détecteur à la longueur d’onde où l’absorbance du
composé d’intérêt est la plus grande : λ max
La réponse est fondée sur la loi de Beer-Lambert:

A = log (I0/I) = - log T = ε L C


A: Absorbance
T: Transmittance
ε: Absorptivité molaire du soluté à la longueur d’onde λ.
I0: Intensité du rayonnement incident.
I: Intensité du rayonnement transmis.
L: Longueur du chemin optique.
C: Concentration du soluté dans l’effluent.

Fig. 22 : Système monochromatique

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Fig. 23 : Système polychromatique

e. Spectrofluorimètrie
Certains composés organiques absorbent des radiations dans l’UV et réémettent une fraction de la
lumière absorbée à une longueur d’onde supérieures.

If = KC
If: Intensité de la fluorescence
K: facteur de proportionnalité
C: Concentration de l’analyte

f. Détecteurs électrochimiques
✓ Utilisent les propriétés oxydo-réductrices des solutés, ce qui suppose que l'effluent de la colonne
chromatographique soit suffisamment conducteur pour permettre le passage du courant.
✓ Les échantillons à détecter doivent pouvoir s'oxyder ou se réduire à un potentiel suffisamment
faible pour ne pas provoquer l'électrolyse de la phase mobile ou des composants de la matrice de
l'échantillon.
✓ Le signal mesuré correspond à la perte ou au gain d'un ou plusieurs électrons.
✓ Chaque composé à des conditions particulières d'analyse: pH, potentiel de travail,…

V. APPLICATIONS DE CLHP
V.1. Dosage en biologie médicale
✓ Analyse spécialisée.
✓ Méthodes développées en interne obligatoirement validées.
✓ Matrices biologiques complexe (sang, urine, …)
✓ Nécessite un traitement pré analytique de l’échantillon (Extraction liquide/liquide, Extraction sur
phase solide, dérivatisation pour HPLC à détection fluormétrique)

V.2. Contrôle du médicament


La CLHP est retrouvée à différentes rubriques de monographies des pharmacopées (Ph.Eur,
USP) à savoir l’identification, essais, et dosage.

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