Ministère de l agriculture de l’environnement

Et des ressources hydrauliques

Rapport de stage
Pv2
Service de microbiologie à l’école
nationale de médecine vétérinaire
Sidi Thabet
Elaboré par

Srairi Sinda

Année universitaire 2016/2017

Remerciements
Mes grands remerciements s’adressent au
chef de service de microbiologie à l’école
nationale de médecine vétérinaire, Sidi thabet,
Madame Lilia Messadi qui malgré ses
nombreuses responsabilités, s’est toujours
montrée disponible en m’encadrant et en me
faisant part de ses précieux conseils et
instructions.

Je tiens à remercier aussi mes professeurs

Aymen Mamlouk et Faten Ben Chahida pour
leurs disponibilités permanentes et leurs
rigueurs scientifiques qui m’ont permis
d’apprendre davantage.

Je présente ma reconnaissance aux

techniciens et aux thésards qui n’ont pas
hésité à m’informer sur les différentes
instructions pour le bon déroulement du travail
dans le service.

Plan
I. Présentation du service de microbiologie à l’école de
médecine vétérinaire Sidi Thabet :
Les principaux domaines d’activité de ce service sont :

 La bactériologie médicale 
 La biologie moléculaire
 Les analyses sérologiques

Le service de microbiologie est constitué de :

 Un laboratoire de diagnostic
 Deux laboratoires de recherche :
 Unité bactériologie
 Unité biologie moléculaire
 Une salle de nettoyage et de stérilisation
 Une salle de préparation des milieux.

1. Le laboratoire de diagnostic :
La réception des prélèvements ainsi que la réalisation des différentes analyses
bactériologiques aient lieux au niveau de cette unité.

Elle est équipée de :

 Deux étuves
 Un réfrigérateur
 Une hotte
 Deux lavabos
 Une longue paillasse sur laquelle sont déposés les outils nécessaires de
travail : bec Bensen, verrerie, anses de platines ….
 Un ordinateur
 Deux microscopes optiques
2. Le laboratoire de biologie moléculaire :

Au sein de ce laboratoire, on réalise l’ extraction d’ADN , la PCR (plymerase

chain reaction), l’ électrophorèse ainsi que les tests serologiques tels que l’
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
Il est équipé de :
 Une Hotte
 Trois Thermocycleurs
 Deux Centrifugeuses
 Un refrigerateur
 Tissu lyser
 Un vortex
 Bain sec
 Bain marie
 Un agitateur électrique (Elissa)
 Un gel dog
 Un générateur électrique

3. Salle de nettoyage et de stérilisation :

Le nettoyage et la stérilisation sont deux opérations basiques du travail dans
le laboratoire. On vise essentiellement à détruire tous les micro-organismes
d’un objet de façon durable lors de la préparation du matériel et des milieux,
ainsi qu’avant le lavage ou l’élimination des matériaux utilisés. L’objectif de la
stérilisation est double : contrôler les micro-organismes et prévenir une
éventuelle contamination.
Le nettoyage fait recours à l eau de javel et l eau distillée alors que la
stérilisation existe sous deux formes principales :
-stérilisation à chaleur sèche (bec Bunsen , four)
-stérilisation humide (autoclave)

Cette salle est équipée de :

 Trois autoclaves
 Un four pasteur
 Une étuve
Le protocole de stérilisation s’applique comme suivant :
 - Mise dans l’Autoclave (121c° pendant 15 min pour le matériel en plastique et
en caoutchouc ainsi que les milieux de culture)
- bruler et rejetter des boites usées
-Lavage à eau de javel pour la verrerie puis lavage à l’eau distillée
-mise dans le four pasteur (180c° pendant 20 min : metaux et verrerie vide
bouchée avec du coton : tubes à essai, boites de pétri, pipettes pasteur.)
-Mise du matériel stérilisé dans l étuve pour jusqu’ à son refroidissement
complet puis stocké à l abri des poussières.

4. salle de préparation des milieux :

une petite salle contenant les outils de base de préparation des milieux de
culture  : une balance , un bec de bunsen , les différents types de verrerie ,
bouteilles d’ eau distillée et les boites à poudre correspondantes a chaque
milieux.
Les milieux préparés sont divers et varient en fonction des besoins et des
échantillons.

II. L a bactériologie médicale :

Dans le cadre de ses activités de diagnostic et d’appui analytique , le
laboratoire met en place des techniques et des outils nécessaires pour
l’analyse bactériologique des prélèvements.

Au cours de ce stage, j’ai suivi les differents processus au sein de cette unité
et j ai participé aux différentes étapes (préparation des milieux de culture,
prélèvements, isolement de la bactérie, galerie biochimique, antibiogramme).
1. Préparation des milieux :
Un milieu de culture est un support qui permet la culture de  de bactéries afin
de permettre leur étude. En principe, les cellules trouvent dans ce milieu les
composants indispensables pour leur multiplication en grand nombre,
rapidement, mais aussi parfois des éléments qui permettront de privilégier un
genre bactérien ou une famille.

Il y a trois grands types de milieux :

Le milieu minimum : ce milieu permet la croissance bactérienne, composé de

substrats nutritifs (acides aminés, peptides, bases nucléiques, sucres …), un
système tampon (constante de pH), des sels minéraux et des vitamines. Les
bactéries poussant sur un milieu minimum dites bactéries non exigeantes
exemple les entérobactéries.

Le milieu enrichi  : pour les bactéries exigeantes qui nécessitent d’autres

facteurs de croissance :(Sang, protéines, hémoglobine, vitamines
supplémentaires…).

Le milieu sélectif : permettent uniquement la culture de certains genres

de micro-organismes. Pour cela on ajoute des éléments qui inhibent la
croissance des micro-organismes indésirables comme le chlorure de sodium à
forte concentration, le thiosulfate de sodium, le cristal violet ou
certains antibiotiques, etc.
Les éléments ajoutés sont sélectionnés selon les caractéristiques du micro-
organisme recherché. Ces milieux sont utilisés pour l'analyse d'un prélèvement
poly bactérien.
Exemple: préparation de la gélose de Mueller Hinton (Mueller Hinton Agar)

Composition :

 Hydrolysat acide de caséine

 Infusion de viande
 Amidon soluble
 Agar agar bactériologique
 Préparation :
Mettre en suspension 38g de milieu déshydraté dans 1 L d’eau distillée ou
déminéralisée. Porter à l’ébullition lentement en agitant jusqu’à dissolution
complète. Répartir en tube ou en flacons. Stériliser à l’autoclave à 115°C
pendant 15 min.

2. La réception des prélèvements :

Toute demande d’analyse transmise au laboratoire doit être accompagnée
d’une prescription médicale.
Les analyses microbiologiques sont disponibles pour des échantillons de
différentes natures : les prélèvements de lait, des fragments tissulaires, fiente,
des écouvillons nasals, oculaires, buccaux, anaux et vaginaux.
3. Coloration de Gram :
Cet examen est primordial car il est rapide à réaliser, permet de choisir les
milieux de culture à utiliser pour isoler la ou les bactéries en fonction des
germes que l'on voit, mais permet surtout de donner une réponse rapide au
clinicien. C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les propriétés
de la paroi bactérienne (si une bactérie est gram positive ou négative.)
Pour réaliser ce type de coloration on procède aux étapes suivantes :

 Fixation du prélèvement
 Couvrir la lame avec le bleu de gentiane et laisser agir 1 min
 Rincer la lame à l’eau distillée
 Couvrir la lame par le lugol et laisser agir 1 min
 Décolorer par l alcool
 Rincer à l’eau distillée
 Couvrir la lame avec la  fuchsine
 observer avec une goutte d'huile à immersion au microscope.

4. Isolement :
On entame l’étape d’isolement de la bactérie recherchée en ensemençant le prélèvement
dans des bouillons d’enrichissement (l’eau peptonnée tamponnée) et le bouillon rappaport
sélectif pour les Salmonelles. L’incubation dure entre 18 et 24h à 37°C.

5. Ensemencement et identification des Bactéries :

Après l’incubation, on ensemence le prélèvement sur des milieux de culture adéquats.
On doit observer ainsi les caractéristiques macroscopiques des colonies apparues sur le
milieu 
 NB : Afin de chercher les Escherichia coli et les autres entérobactéries on a ensemencé sur la
gélose Macconkey simple et la gélose Macconkey additionnée d’un antibiotique
lecéfotaximequi appartient à la famille des béta lactamines (céphalosporine de 3éme
génération).

NB : A partir du milieu Rappaport on ensemence sur la gélose XLD (Xylose-Lysine-

Désoxycholate) utilisée pour l’isolement des salmonelles H2S+.

Le milieu Mode Sélectivité / Caractères Résultats

d’ensemencement composition recherchés
Milieu Chapman Ce milieu contient On peut Les
L'ensemencement un inhibiteur :  étudier la colonies
doit être massif, en fortes fermentation mannitol
stries serrées concentrations en du mannitol + sont
chlorure de par virage entourées
sodium (75 g.L-1),  au jaune de d’une
ce qui permet un l’indicateur auréole
isolement sélectif coloré, le jaune.
de Staphylococcus  rouge de
tolérant les fortes phénol
concentrations en
NaCl

Le milieu Mode Sélectivité / Caractères Résultats

d’ensemencement composition recherchés
 Milieu Mac Conkey Ce milieu contient deux le lactose colonies
inhibiteurs de la flore dont rouges entour
Isolement par la Gram+ : ées d’un hâlo
l’utilisation opaque
méthode des
- les sels biliaires
est révélée lactose+
cadrans.
par
Incuber 18 à 24 h à - le cristal viole l’indicateur colonies
37 °C. coloré du jaunes ou
. milieu, le incolores :
lactose-
rouge neutre

Le milieu Mode Sélectivité / Caractères recherchés Résultats

d’ensemencement composition
Milieu XLD Xylose- 'isolement  colonie rouge à centre
En zigzag Lysine- de Salmonella et Shigella à noir Salmonella (H2S+) : 
Désoxycholat partir des aliments ou des  colonie rouge sans centre
e selles. noir : Shigella ;
 colonie
jaune : Escherichia, Klebsiella 

Le milieu Mode Sélectivité / Caractères Résultats

d’ensemencement composition recherchés
 Gélose au sang . colonies entourées d'une
Hémolyse zone claire facilement
 contenant des globules visible sur la gélose
Isolement
rouges (souvent du rouge
sang de mouton)
18 à 24 h à 37°C
*sécrétion d’une
hémolysine bactérienne
(c’est une exotoxine qui
engendre la lyse des
globules rouges).

La lecture des milieux se fait après incubation à 37°c entre 18h et 24h.

L’indentification du germe est ensuite confirmée par la réalisation d’ une mini

galerie biochimique sur des milieux de culture en tube. Cette galerie contient :
 Milieu Hajna-Kligler
Tube contenant une gélose rouge , formé d un culot (glucose) et d’une pente
(lactose).ce milieu contient 2 sucres ,extrait de viande de bœuf , extrait de
levure , peptone , chlorure de sodium, citrate ferrique , thiosulfate de
sodium ,rouge de phénol (indicateur coloré) et d’agar

Mode d’ensemencement Caractères recherchés Résultats

Utilisation du glucose Bactérie de type fermentatif du glucose et lactose +:
culot jaune et pente jaune.
Ensemencer abondamment la Utilisation du lactose
surface par stries serrées ou Bactérie de type fermentatif du glucose et lactose - :
par inondation, puis le culot Production H2S culot jaune et pente rouge.
par simple piqûre, à l'aide de
la même pipette boutonnée.  Production de gaz Une production de gaz : bulle d’air pouvant fragmenter
la gélose ou la décoller.
Mettre à l'étuve 24h à  37°C.
Une production de H2S précipité noir de sulfure de
Fer.

Milieu citrate de Simmons

           

Mode
Caractères recherchés Résultats
d’ensemencement
Utilisation du citrate - Virage de l'indicateur de pH au bleu : il y a eu
comme seule source de alcalinisation du milieu et la souche est citrate de
La pente est ensemencée par une carbone Simmons +.
strie longitudinale, réalisée à
l'anse, à partir d'une suspension - Pas de virage de l'indicateur de pH : il n'y a pas eu
de la culture solide en eau alcalinisation et le milieu ne présente pas de culture.
distillée stérile. La souche est citrate de Simmons -.

- Mannitol-mobilité
            Ce milieu permet l’étude de la dégradation du mannitol qui est un produit de dégradation du mannose.

Mode d’ensemencement Caractères recherchés Résultats

Mannitol - Caractère mannitol

Ensemencer par piqûre Mobilité - milieu  jaune : Mannitol +

centrale à l’aide d’un fil
droit. Nitrate réductase - milieu rouge : Mannitol –

Incuber 24 h à T° optimale. - La mobilité : gélose trouble

 - Nitrate réductase : Nitrate réductase +
(coloration rose à la surface).

Milieu urée indole :

Tube à hémolyse contenant un milieu liquide de couleur jaune orange. On ensemence à
l’aide de l’anse de platine. Le milieu Urée-Indole permet de rechercher l’uréase et la
production d’indole à partir de tryptophane. La production de l’uréase par la bactérie
provoque une réaction acidifiant le milieu qui fait virer l’indicateur coloré.la présence
d’indole donne après addition de réactif de Kovacs une coloration rouge à la partie
supérieure du milieu.

Autres tests :
Pour distinguer les staphylocoques des streptocoques, on fait le test de
catalase. Sur une lame on met du H2O2 et on ajoute une colonie. Si on obtient
une effervescence, il s’agit bien de staphylocoque sinon c’est un streptocoque.

Au cours de mon stage j ai réalisé le test coagulase pour la mise en évidence

d'une activité coagulase chez une souche de Staphylococcus.

  Le principe de ce test est simple. On met en contact du plasma du lapin

(pendant 3 heurs) incapable de coaguler seul, avec un peu de bouillon Cœur-
Cervelle où a été cultivé le germe étudié. La présence de l enzyme coagulase se
traduit par la formation d’un caillot au fond du tube indique.

5. Réalisation de l’antibiogramme :
Un antibiogramme est une technique de laboratoire qui consiste à placer la
culture de bactéries en présence des antibiotiques afin de tester sa
sensibilité vis-à-vis de ces  antibiotiques .

Afin de pouvoir classer les souches en souches sensibles à l’antibiotique,

résistantes ou intermédiaires, on mesure le diamètre d’inhibition sur la gélose,
et on le compare à la concentration critique inférieure (CCI) et la concentration
critique supérieure (CCS).

Le protocole de l antibiogramme est le suivant :

 Réalisation d'une suspension[
Il y a deux solutions possibles:
Soit vous disposez d'un bouillon de culture vieux de 24 h (phase stationnaire)
vous pouvez l'utiliser de la manière suivante:

 pour les gram-positif, effectuer une dilution au 1/500;

 pour les gram-négatif, effectuer une dilution au 1/5000.
Soit vous disposez de colonies pures sur un milieu de culture, dans ce cas :

 mettre stérilement de l'eau physiologique dans un tube à hémolyse;

 prélever les colonies pures et les mettre en suspension jusqu'à obtenir la
même opacité que l'étalon Mac Farland 0.5;
 si la suspension est trop trouble, ajuster l'opacité en ajoutant de l'eau
physiologique.
 Préparation de la gélose
 prendre la gélose de Mueller-Hinton, vérifier l'absence d'eau à la
surface ; s'il y en a, laisser sécher;
 annoter où seront positionnés les disques d'antibiotiques sur le fond de
la boîte (Il faut les éloigner de 1 cm du bord minimum)
 ensemencer la gélose par 1 mL de suspension
 laisser sécher de 3 à 5 minutes;
 déposer les disques d'antibiotiques;
 incuber 24 h.
 Lecture des résultats

Mesurer les diamètres des zones d'inhibition de croissance de la souche

microbienne
Pour chaque souche microbienne, la sensibilité ou la résistance à un
antibiotique est différente.
Type de souche Diamètre (mm)
Souche sensible Diamètre sup ou égal au diamètre de
la CCI
Souche résistante Diamètre inf au diamètre de la CCS
Souche intermédiaire Diamètre inf au diamètre de la CCI et
sup ou égal au diamètre de la CCS.
III. La biologie moléculaire :
Durant mon stage, j ai participé à la réalisation de l électrophorèse comme
étape indispensable lors de la RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain
reaction) afin d’ identifier les animaux infectés par le virus de border disease.

La maladie de la frontière, ou « Border disease » (BD), est une maladie virale

des ovins : un Pestivirus de la famille des Flaviviridae .
Stérilité des brebis, mortinatalité des agneaux et naissance d’agneaux chétifs
constituent les principaux signes révélateurs de la maladie.

La technique de l'électrophorèse en gel d'agarose est basée sur la séparation

des acides nucléiques chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique.
Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose : les molécules
de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que
les molécules de tailles supérieures.
L’electrophorèse de l’ADN sur gel d’agarose comporte deux etapes
essentielles :

 Préparation du gel d’agarose :

 Mélanger tampon TBE et agarose à raison de 0,8 g d'agarose pour 100 ml

de tampon (la proportion d’agarose dépend de la taille des molécules
d’ADN à séparer).  
 Faire fondre l'agarose au four à micro-ondes en surveillant pour éviter
les projections ou au bain marie. Agiter de temps à autre pour
homogénéiser le mélange
 Laisser refroidir jusqu'à ce qu’il devienne possible de saisir le flacon à
main nue (environ 60 °C). 

 Ajouter le bromure d’éthidium, abrégé BET (marqueur moléculaire).

 Placer les joints fournis avec la cuve pour fermer le support de gel et
positionner le peigne à 1 mm du fond et à environ 1 cm de l’extrémité du
support. Régler le niveau pour que le support de gel soit horizontal. 
 couler lentement le gel sur 3 à 5 mm d'épaisseur en veillant à ce qu’il
entoure bien les dents du peigne. 
Laisser refroidir, enlever le peigne et les joints. Le gel est prêt pour le
dépôt des échantillons.

 Préparation et dépôt des échantillons :

 Mélanger le colorant de charge et l’ADN sur un morceau de para film et

prélever le mélange avec une micropipette réglée sur le volume
approprié en changeant de cône à chaque prélèvement.
 Remplir les puits en faisant attention de ne pas déchirer le fond du gel
avec la pointe de la pipette.
 Placer le support avec le gel chargé dans la cuve d'électrophorèse en
positionnant les puits du côté de la cathode (pôle noir).
 Remplir la cuve de tampon TBE (réutilisable plusieurs fois) en versant
délicatement et très lentement lorsque le gel commence à être
recouvert pour éviter les fuites d’ADN vers le tampon.
 Fermer la cuve, brancher les fils et mettre sous tension. 
 Laisser migrer jusqu’à ce que le colorant de charge arrive à proximité du
bord du gel (environ 55 min à 100 V pour un gel de 80 mm dans une mini
cuve).
 Couper l’alimentation après 30 min., débrancher les connections et
récupérer le gel dans son support.
L’utilisation du block gel est évidente pour la visualisation des bandes.
Le résultat était négatif.

IV. La sérologie :

La sérologie est une méthode biologique utilisant le sérum pour établir des
diagnostics microbiologiques.
Durant mon stage j ai participé à la réalisation de l’ELISA (Enzyme-Linked
Immuno Assay) , afin de détecter des anticorps anti Fièvre Q et anti
brucellose dans 94 échantillons sériques de dromadaires.

On a fait recours a l’ ELISA indirect en utilisant un kit commercialisé ou les

agents pathogènes :Coxiella burneti et Brucella abortus sont déjà fixés sur le
fond des puits.
Notre travail consiste à consiste à fixer l'anticorps à doser:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps à doser pendant environ
45 minutes. Les anticorps se fixent spécifiquement sur l'antigène. Les puits sont
ensuite lavés pour éliminer les anticorps à doser en excès avec du tampon de
lavage.

Puis on procède à  fixer l'anticorps de détection:

On incube à 37°C dans  les puits, la solution d'anticorps de détection pendant
environ 45 minutes. Les anticorps de détection se fixent  spécifiquement sur les
anticorps à doser. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de
détection en excès avec du tampon de lavage. Notons que les anticorps de
détection sont couplés à une enzyme qui en présence de son substrat le
transforme en produit de réaction détectable et mesurable grace à l'apparition
d’ une coloration.

La quatrième étape consiste à révéler les anticorps fixés:

On incube à température ambiante et à l'obscurité pendant 10 minutes, une
solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme. L'apparition d'une
coloration dans le substrat indique la présence de l'anticorps à doser.
L'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité d'enzyme présent et
donc à la concentration d'anticorps recherché.
 V. Etude de cas :

La rhodococcose pulmonaire chez un poulain

La rhodococcose est due à la contamination du poulain par la

bactérie Rhodococcus equi. 
Le diagnostic est réalisé à partir d’un poumon de poulain mort âgé de 1 mois
et demi.
 La chronologie du Protocol suivi pour L’identification de Rhodococcus equi
est présentée ci-dessous :
Jour 0 :
 Réception du poumon lésé : présence de plusieurs abcès
 Coloration de Gram : coque Gram + (à partir de l’abcés)
 Mise en culture et incubation sous co2
Jour 1 :
 Observation des colonies : boite riche en colonies rondes muqueuses,
non hémolytiques, pigmentées en rose
 Coloration de Gram  à partir de la colonie
 Réalisation de plusieurs tests :
-CAMP test : (+)Staph aureus(R. equi ne produit pas d’ hemolysine sur
gélose au sang mais elle produit une hemolysine particulière avec
Staphylococcus aureus)
 - test de catalase / oxydase: catalase + , oxydase –

- test uréase : uréase + coloration rouge traduit une alcalinisation du

milieu, suite à  l'hydrolyse de l'urée et formation de carbonate
d'ammonium
 Repiquage : pour l’obtention de boite pure.

Jour 2 :
 Réalisation de l’antibiogramme sur gélose au sang et incubation à 37°c
pendant 24h

Jour 3 :
 Mesurer les diamètres des zones d'inhibition de croissance de la
bactérie.
 Figure : Résultat de l’antibiogramme

VI. Conclusion :
Je tiens à remercier l’équipe qui m’a vraiment très bien accueilli durant ces
15 jours. Elle a été toujours prête à répondre à mes questions.
J’ai pu mettre en pratique mes connaissances théoriques acquises et
enrichir mes connaissances sur le but d’une analyse de bactériologie
médicale (identification de la bactérie, analyse bactériologique,
antibiogramme ….).
Ce stage était une bonne occasion pour actualiser mes connaissances sur la
partie moléculaire ainsi que les techniques de sérologie