République Algérienne Démocratique et populaire

Ministère de l’enseignement supérieur de la recherche

scientifique

Université des sciences et de la technologie d’Oran

Mohammed Boudiaf

Faculté des sciences de la nature et de la vie

Département vivant et de l’environnement

Compte rendu de TP 01 : isolement de micro

organisme a partir de différence biotopes

-Elaboré par :

 MILOUDI MERIEM
 Tahar Yamina

-Groupe :05/06

-Section :02

-Module :écologie

-Professeur: LAMIA MERMOURI

L’année 2021 / 2022

 Introduction
En microbiologie, l’isolement est une technique permettant de séparer les micro-organismes
présents dans un mélange microbien. La technique de l’isolement présente deux applications :
- Dans le cadre d’un mélange bactérien, l’isolement est utilisé au préalable de l’étude du
mélange. L’isolement permet ainsi de séparer les différents membres du mélange et de les
étudier de façon séparée. - Dans le cadre d’une culture pure (une seule espèce), cette
technique permet de vérifier sa pureté.

But
Isoler et dénombrer des micro-organismes qui se trouvent dans les échantillons du sol et eau
de mer par la méthode des dilutions tout en maintenant le plan de travail aseptique.

Principe
l'isolement consiste à réaliser à partir d'un échantillon des suspensions dilution. seront
développés . chaque germe sera à l'origine d'une colonie, le comptage des colonies permet par
une méthode de calcul simple d'estimer la quantité de germes contenue.

Matériel utilise 
-le bec bunsen -vortex -anse de platine –pipettes pasteur –pipettes gradué-les tubes en ver –
papier absorbant-désinfectant(eau javel) –boites pétri contenant les trois milieu de culture
(BG11-sabouraud-GN)-balance-eau de mer-sol –bleu de méthylène-microscope optique-lame
et lamelle-erlenmeyer fermé avec coton (BG11)- huile d’immersion- crayons-eau distillé
stérile

Mode opératoire
 -Précautions générales de travail :
 Tous les objets utilisés doivent être stériles.
 Les mains lavées à l’alcool. Le paillasse doit être lavé à eau de javel.
 Le travail doit s’effectuer dans la zone de protection du bec bunsen, à l’abri des
courants d’air.il faut flamber les goulots des tubes et flacons après leur ouverture et
avant leur fermeture.
 Les boites de pétri doivent être ouvertes en maintenant le couvercle à l’oblique avec
ouverture du coté de la flamme.
Isolement sur milieu solide sol

s
-1-Milieu sabouraud :

La gélose Sabouraud est un milieu d'utilisation générale, permettant la croissance et

l’isolement d'une grande variété de levures et moisissures. L'addition de chloramphénicol
inhibe la croissance des bactéries Gram positif et Gram négatif.

-2-Milieu GN (gélose nutritif): La Gélose Nutritive est un milieu largement utilisé pour la
culture des micro-organismes peu exigeants. Elle est recommandée dans de nombreuses
méthodes standardisées d’analyses des aliments, des laitages, de l’eau et d’autres produits.
 -a-Préparation de la
solution :mère 
1gramme du sol est introduit dans un tube contenant 9 mL d’eau distillée stérile . Les
échantillons sont homogénéisés par agitation au vortex pendant quelques minutes.

1 b- la dilution décimale :

- Prélever 1 ml(SM) à l’aide d’une micropipette stérile et déposer dans un tube à essai
contenant 9 ml d’E.D stérile - Agiter pendant au moins une minute. - Répéter les étapes pour
les deux autres dilutions (10-2, 10-3, ). - En prenant juste la dilution 10-2, pipeter 0,1 ml et
déposer dans chacune des 2 boites de Pétri contenant (boite1 :milieu sabouraud/boite2 :milieu
GN) . Étendre sur toute la surface avec un étaloir stérile .

Fig01 :dilution décimale
1g sol

Schéma1 : la dilution
décimale

b- Ensemencement :

- L’ensemencement a 0.1ml de dilution10-2 est prélevé a l’aide d’une pipette et

déposée dans les deux boites de pétri. Etaler à l’aide d’un étaloir stérile chaque
boite par mouvement de stries. Incuber la boite1 contient le milieu sabouraud
à28°c et la boite 2(GN) à 37°c.

-on observe les boites après 72h jusqu'à une semaine

 Lecture des résultats :

Fig02 : culture microbienne boite01(milieu sabouraud)

-Dénombrement : : selon la loi 15<colonie<150 nous avons compté la boite 1 et en avons

trouvé jusqu’au 25colonies de différentes forme, couleur et aspect.(15colonie présente des
levures et jusqu'à 10 colonie représente des macro mycètes -champignon )

-Etude macroscopique des colonies :

Boite01 forme relief contou taille surface opacité couleur consis

r tance
Colonie1 : circulaire bombé régulier petites lisses opaque blanche créme
levure s uses
Colonie2 : irrégulière bombé ondulé Moyennes rugueus opaque blanche sèche
Moissisures Et grosses es s
et
champignon
s

Fig03 : culture microbienne boite02(milieu GN)

-Dénombrement : nous avons dénombré la culture microbienne de la boite 2 et en avons

trouvé jusqu’au 51colonies de différentes forme, couleur et aspect.la boite contient des
 colonies présente des bactéries (jusqu’au 30colonies)-10colonies des champignons
filamenteux-et les autres colonies retour à des levures.

-Etude macroscopique des colonies :

Boite02 forme relief contour taille surface opacité couleur consistance

macro filamenteuse convex Ondulé Moyenne rugueuse opaque Blanche sèche

mycètes e et lobé et ya -beige
grande
bactéries circulaire bombé régulier Petites et lisse opaque blanchatr crémeuses
y’a e
moyennes
levures circulaire Bombé régulier petites lisse opaque blanche Crémeuses
convex
e
Isolement : eau de mer

s
-nous avons pris deux milieux de culture, le milieu GN et un milieu de BG11.

-Milieu BG11 : est optimisé pour la croissance et l'entretien de certaines cyanobactéries.

-Mode opératoire :

-a-Préparation de la dilution décimale : - Prélever 1 ml de la solution mère (eau de mer) à

l’aide d’une micropipette stérile et déposer dans un tube à essai contenant 9 ml d’E.D stérile -
Agiter pendant au moins une minute. - Répéter les étapes pour les deux autres dilutions (10-
2, 10-3, ). - En prenant la dilution 10-1, pipeter 0,1 ml et déposer dans chacune des 2 boites
de Pétri contenant (boite1 :milieu GN/boite2 :milieu BG11). Étendre sur toute la surface avec
un étaloir stérile . b- Ensemencement :

- L’ensemencement a 0.1ml de dilution10-1 est prélevé a l’aide d’une pipette et déposée dans
les deux boites de pétri. Etaler à l’aide d’un étaloir stérile chaque boite par mouvement de
stries. Incuber la boite1 contient le milieu GN et la boite 2(BG11) à 37°c.

-on observe les boites après 72h jusqu'à une semaine

Résultat :

Fig04 : culture microbiennes Sur milieu

GN –boite1-
 -Dénombrement de la boite : nous avons dénombré la boite 1 et en avons trouvé jusqu’au
40colonies de différentes forme, couleur et aspect.(colonies présente des levures - macro
mycètes (champignon )-bactéries)

-Etude macroscopique des colonies :

Boite01 forme relief contour taille surfac opacit couleur consistanc

e é e
levures circulair Bombé régulie petites lisse opaqu blanche crémeuses
e convex r e
e
macro circulair
mycètes e
(champignon
)
bactéries circulair bombé régulie Petite lisse opaqu blanchatr crémeuses
e r s e e

Fig05 : tapis microbien sur le milieu

bg11 -boite02-

-Dénombrement de boite : on a dénombré la boite et on a trouvé des quelques colonies retour

à des algues bleue vertes qui s’appelle les cyanobactéries.

--Etude macroscopique des colonies :

Boite02 forme relief contour taille surface opacite couleur consistance

Les cyanobactéries.

Isolement sur milieu liquide eau de mer -BG11

 Mode opératoire :

 nous avons apporté un erlenmeyer qui contient 20ml du solution BG11 (recouvert
de coton pour le passage de l’oxygène) et avec un ph égale 7.2.
 On a pris 0.5ml de la dilution10-2 et nous le mettons dans l’erlenmeyer
 On a agité la solution obtenue pour la rendre homogène
 On le mets sur une paillasse à 25 °c et à éclairement ambiants
 Lecture de résultat après chaque semaine.

Fig 06 : solution BG11 dans un

erlenmeyer

- Résultat :

-les résultats obtenus après deux semaine d’observation nous ont permis
d’établir un changement de la couleur (vert) et dégagement du gaz ,cela
indique la présence des algues vertes (cyanobactéries).

Fig 07 : solution BG11 dans un

erlenmeyer après incubation.
 -interprétation et discussion :

-on a comparé les colonies de la culture microbienne contient le milieu gélose nutritive pour
les deux boites eau de mer et sol

-les deux cultures présentent une croissance microbienne.(bactéries-levures et champignon)

-D’après le dénombrement qu’on a fait pour le comptage des colonies sur les deux boites, on
interprète que le nombre des micro-organismes présentent dans le sol plus croitre par apport l’
eau de mer.

Conclusion

-L’isolement étudié dans notre manipulation sur les deux biotopes (sol ,eau de mer) montre
qu’il ya une croissance importante sur les milieux de culture préparé et par la comparaison
qu’on a fait indique : le sol est plus riche des micro-organismes que l’eau. cette différence
résulte le sol contient la plupart des éléments nutritifs pour la croissance microbienne.

Etude microscopique par la coloration de bleu de méthylène

-Préparation du frottis : Nous avons mis une goutte de L’eau de mer sur lame et
lamelle après la Coloration avec bleu de méthylène (même méthode pour l’eau
stagnantes) et on le met dans le microscope pour l’observation avec
grossissement x100 et on va ajouter huile d’immersion est utilisée pour
augmenter la résolution des microscopes.

Observation microscopique L’eau de mer

 Observation microscopique L’eau stagnantes

Observation microscopique

L eau de mer : Avoir quelques protozoaire.

L eau stagnantes : Présence des diatomée( grosse et petite) et plusieurs protozoaire.

Interprétation:

- présence d'un grand nombre des bactéries dans l’eau stagnantes par rapport l’eau de mer.