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UNIVERSITÉ CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR

FACULTÉ DES SCIENCES ET TECHNIQUES


DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE VÉGÉTALE

MASTER EN BIOTECHNOLOGIES VÉGÉTALES ET MICROBIENNES

Variabilité des réponses agro-morphologiques


et physiologiques et analyse de l’expression
différentielle de gènes chez des mutants EMS
de sorgho (Sorghum bicolor [L.] Moench) sous
contrainte hydrique

Présenté et soutenu publiquement le 02 février 2018

Par :

M. ELHADJI MALICK KANE

Devant le jury composé de :

Président : M. Diaga DIOUF Professeur titulaire FST/UCAD

Membres : M. Djibril SANÉ Professeur titulaire FST/UCAD

M. Khalil KANE Chargé de Recherches ISRA/CERAAS

M. Aliou NDIAYE Maitre-Assistant FST/UCAD

Directeur de mémoire : Pr Djibril SANÉ ; Encadreur : Dr Khalil KANE


DÉDICACES

Louange à ALLAH, le Créateur prééternel ; que le salut et la paix soient sur le noble privilégié,
la plus honorable créature, le Prophète MOUHAMED (PSL), ainsi que sur sa famille
et tous ses compagnons.

À Serigne Mbaye SY Mansour, khalife général des Tidianes, et à toute la famille de Seydil Hadji
Malick SY (RTA).
À l’illustre défunt Mame Abdou Aziz SY Dabakh, notre vénéré guide spirituel sûr et éclairé.
Pour toutes les prières, recommandations et conseils formulés à notre intention.

À la mémoire
De ma grande sœur, Sokhna Khady Ndiaye KANE.
De mes grands-mères, Fatou Khoudia SY et Anta Ngouna LOUM.
De mes grands-pères.
Que vos âmes reposent en paix.

À ma mère Sokhna Ndeye Fatou CISSÉ et mon père El Hadji Mansour KANE.
Ce modeste travail est l’accomplissement ultime de tous les sacrifices que vous avez
consentis durant de longues années pour l’éducation et la réussite de vos enfants .

À mes chers frères et sœur, Mouhamadou Moustapha KANE, Sokhna Fatou Sy KANE, Abdou Aziz
KANE et Serigne Babacar KANE.
Pour votre affection sincère, votre gentillesse si immense et constante, votre
bienveillance et votre profonde sympathie.

À mon oncle Papa CISSÉ et sa femme Khady SY.


Pour toute l’assistance que vous m’avez apportée durant mon parcours
universitaire. J’éprouve pour vous une éternelle reconnaissance, et une grande
admiration.

À ma tante Khady FALL et son mari.


Pour m’avoir accueilli et soutenu pendant une année à Thiès.

À mes autres tantes et oncles.


Pour leurs soutiens et encouragements.

À mes cousins et cousines, mes neveux et nièces.


Pour votre esprit de dépassement, de solidarité et de sympathie.

À tous mes amis.


Pour leur amitié aussi sincère que désintéressée.

i
REMERCIEMENTS
Les travaux présentés dans ce mémoire constituent l’aboutissement de la collaboration entre
le Département de Biologie Végétale de l’Université Cheikh Anta Diop de Dakar (UCAD), le
Centre d’Étude Régional pour l’Amélioration de l’Adaptation à la Sécheresse
(CERAAS/ISRA) de Thiès et de l’Université de Purdue à Kansas City des États-Unis
d’Amérique. L’USAID, dans le cadre du projet SMIL, a financé la réalisation de ces travaux.

Tout d’abord, je tiens à remercier le Docteur Khalil KANE chargé de recherches au


CERAAS/ISRA de Thiès, pour sa sympathie, ses qualités scientifiques avérées, et l’encadrement
de ce mémoire. Recevoir les connaissances sur la RT-qPCR de sa part aura été un grand
privilège pour moi. Ce fut un immense plaisir de travailler avec vous.

Je remercie chaleureusement le Docteur Ndiaga CISSÉ, directeur du CERAAS, d’avoir


facilité notre accueil dans ce centre régional d’excellence (CRE).

Je dois témoigner ma respectueuse gratitude à l’égard du Professeur Djibril SANÉ, pour


avoir accepté de diriger ce travail. Votre accessibilité et votre démarche scientifique m’ont été
d’un grand soutien au cours de mon cursus universitaire. Trouvez ici l’expression de toute ma
reconnaissance, de ma profonde admiration et de ma respectueuse considération.

Je tiens également à remercier tout particulièrement le Professeur Ibrahima NDOYE,


coordinateur du Master BIOVEM, ainsi que tous les enseignants qui sont intervenus pour notre
formation.

Mes sincères remerciements à Monsieur le Professeur Diaga DIOUF, pour avoir bien voulu
présider ce jury. Soyez assuré de ma profonde et respectueuse reconnaissance.

Je tiens à remercier également le Docteur Aliou NDIAYE d’avoir accepté de juger ce


travail. Soyez assuré de ma profonde gratitude et de mes sentiments respectueux.

Je remercie Monsieur le Professeur Papa Ibra SAMB, pour l’intérêt que vous avez porté à
mes travaux et pour vos encouragements.

Mes sincères remerciements à Monsieur le Professeur Habib SY et à Monsieur Maodo


DIOUF, pour vos conseils et vos orientations depuis mes premières années à l’Université.

Je remercie également le Docteur Roger BAYALA, pour toute l’assistance technique et


méthodologique dans la réalisation de ce travail.

Un remerciement tout particulier et très personnel à Mademoiselle Khady NDOUR, pour


son soutien indéfectible et ses observations précieuses. En témoignage de ma profonde
reconnaissance.

Merci à Mademoiselle Elizabeth DIATTA, pour toutes les manipulations que nous avons
accomplies ensemble au laboratoire.

ii
Je remercie, également, le personnel scientifique du CERAAS, en particulier le
coordonnateur scientifique, Docteur Daniel FONCEKA, ainsi que tous les autres chercheurs
tels que les Docteurs Amy BODIAN, Mame Codou GUEYE, Marème NIANG BELKO,
Bassirou SINE, Amadou Oury DIALLO, Alain AUDBERD, pour leurs expertises
scientifiques et leurs remarques pertinentes lors des activités scientifiques. Sans oublier les
doctorants Baye Maguette DIOP, Mame Balla NDIAYE, Jack AKATA, Romaric
NGUEPJOP, Cyril DIATTA, Joseph Sékou DEMBELE, Boubacar GANO, pour leurs
orientations et conseils.

Je tiens à exprimer mes vifs remerciements à toutes les équipes des plateformes de biochimie,
de génotypage et d’écophysiologie du CERAAS, en particulier au doyen Mbaye Ndoye SALL,
à Madame Elizabeth DIOP, à Mademoiselle Rose DIOUF, à Mademoiselle Yvette Rachelle
DJIBOUNE, et à Mademoiselle Coura FALL, pour leur assistance permanente.

Un grand merci à Monsieur Pape NDIAYE, chef de l’exploitation du CERAAS au CNRA de


Bambey, ainsi qu’aux techniciens et ingénieurs des travaux agricoles, à l’image de Moussa
FATY et Romiel BADJI. Ma gratitude à tous les temporaires qui sont intervenus dans la mise
en place de l’essai au champ, l’entretien, le gardiennage, la récolte et le battage.

Je tiens à remercier tout le personnel administratif et de service du CERAAS, en particulier :

- l’administrateur du CERAAS, Monsieur Mao SENE, avec la collaboration du


personnel administratif du CERAAS à travers eux Mariama SENGHOR, Thérèse
FAYE, Latif DIACK ;
- Monsieur Cheikhou DRAME et Mademoiselle Khadidiatou DIOP, responsables du
service informatique du CERAAS ;
- les chauffeurs du CERAAS, Makha DEMBELE, Ibrahima DIOUF, Seydou SIDIBE,
Aly KA, Jean-Michel et Saliou GNING.

Enfin, j’exprime ma reconnaissance envers tous les stagiaires du CERAAS de Thiès et du


CNRA de Bambey, en particulier Gora FAYE, Ibrahima DIALLO, Aïssatou DIAO, Anna
THIAM, Nafissatou TAMBEDOU, Seynabou Touré SECK, Ablaye Kader AIDARA, Anta
SY, Omar KANDJI, Hamidou DIALLO, Mariétou LY, Mboré NIANG. Merci à tous pour les
souvenirs inoubliables.

J’exprime enfin ma profonde gratitude et mes sincères remerciements à mes camarades et


amis de la promotion BIOVEM 2015.

iii
LISTE DES ABRÉVIATIONS ET ACRONYMES
°C Degré Celsius
ADN Acide désoxyribonucléique
ADNc ADN complémentaire
ARN Acide ribonucléique
ARNm ARN messager
BET Bromure d’Éthidium
BIOVEM Biotechnologies Végétales et Microbiennes
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
CERAAS Centre d’Étude Régional pour l’Amélioration de l’Adaptation à la Sécheresse
CNRA Centre National de Recherches Agronomiques
Cq Cycle de quantification
DSEPI Durée semi-épiaison
DSFLO Durée semi-floraison
DSL Durée semi-levée
EF-P Elongation Factor P
EMS EthylMethaneSulfonate
ETM Evapotranspiration Maximal
FAOSTAT Food and Agricultural Organization Statistics
g Accélération
GRAS Gibberellic-Acid Insensitive (GAI), Repressor of GAI (RGA) and Scarecrow (SCR)
HRM High-Resolution DNA Melt curve analysis
IDT Integrated DNA Technologies
ISRA Institut Sénégalaise de Recherches Agricoles
JAS Jour Après Semis
M-MLV Moloney Murine Leukemia Virus
MACP Malonyl CoA-Acyl Carrier protein
MDB Membrane Desalting Buffer
MDH Malate dehydrogenase
min minute
MIQE Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments
Mbp Mega base pair
NB-ARC Nucleotide Binding adaptor – APAF-1, R proteins and CED4
NB-LRR Nucleotide-Binding site – Leucine-Rich Repeat
NCBI National Center for Biotechnology Information
PMG Poids de 1000 grains
PP2A Serine/threonine Protein Phosphatase
PP2C Protein Phosphatase 2C
PSII Photosystème II
RDML Real-time PCR Data Markup Language
Rdt Rendement
ROS Reactive Oxygen Species
RPM1 Resistance to Pseudomonas syringae pv. Maculicola 1
RT-qPCR Reverse Transcription – quantitative Polymerase Chain Reaction
s seconde
SMIL Sorghum and Millet Innovation Laboratory
SNP Single Nucleotide Polymorphism
STR Stressée
TBE Tris Borate EDTA
Tm Melting Temperature of the primers
UCAD Université Cheikh Anta Diop de Dakar
USAID United States Agency for International Development

iv
RÉSUMÉ
Le sorgho (Sorghum bicolor [L.] Moench) est la 5e culture céréalière la plus importante dans
le monde. Bien qu’il se développe très bien dans les régions arides et semi-arides du monde,
les différents stress abiotiques, y compris la sécheresse et les fortes températures,
compromettent substantiellement sa productivité. Les objectifs de cette étude sont les suivants :
(i) évaluer la variabilité phénotypique de mutants EMS de sorgho soumis à un déficit hydrique
au stade préfloral, (ii) quantifier l’expression différentielle de gènes de tolérance à la sécheresse
par RT-qPCR, et (iii) déterminer l’impact des mutations non-sens sur des séquences de gènes
candidats dans l’adaptation à la sécheresse du sorgho.
Huit mutants de sorgho sont sélectionnés sur la base de leurs performances agro-
morphologiques contrastées et sont cultivés au champ avec deux traitements hydriques (irrigué
et stressé). Les plantes sont irriguées jusqu’au 30e jour après semis, puis exposées à un déficit
hydrique préfloral pendant 30 jours. Quatre mutants et le témoin B35 sont ensuite choisis pour
l’analyse de l’expression des gènes LEA D34 et RPM1, impliqués respectivement dans la
tolérance à la déshydratation et aux fortes températures.

Les résultats de l’étude montrent qu’il existe une grande variabilité de réponses
physiologiques et agro-morphologiques entre les différents génotypes de sorgho étudiés en
condition de stress hydrique. Certains mutants, comme SbEMS 2571 et SbEMS 2660, ont
montré une stabilité de leur rendement dans les deux traitements hydriques, une grande capacité
à accumuler la chlorophylle, et à conserver une température foliaire basse durant le stress
hydrique. En revanche, la sécheresse a considérablement réduit le poids des grains, la hauteur
des plants et la teneur en chlorophylle des feuilles de tous les génotypes.
L’analyse de l’expression des gènes LEA D34 et RPM1 dans les tissus foliaires des
génotypes de sorgho montre une régulation de l’abondance de leurs transcrits par le stress
hydrique. LEA D34 et RPM1 sont en effet fortement exprimés chez SbEMS 2660 et B35 dès
les premiers jours du déficit hydrique. L’accumulation des transcrits de LEA D34 et RPM1
intervient tardivement chez le mutant SbEMS 3514, surement à cause de la sénescence précoce
de ses feuilles. En revanche, l’expression de LEA D34 et RPM1 n’est pas régulée dans les
feuilles des mutants SbEMS 4848 et SbEMS 0753, sensibles au déficit hydrique. Ces résultats
montrent que LEA D34 et RPM1 jouent un rôle important dans la tolérance à la sécheresse du
sorgho, puisqu’ils s’accumulent fortement chez les plants de sorgho avec les meilleurs
rendements après la récolte. De plus, l’accumulation des transcrits de ces gènes de tolérance
n’est pas corrélée avec la teneur en chlorophylle des feuilles ou la régulation de la
photosynthèse en conditions de stress hydrique. Par conséquent, LEA D34 et RPM1 sont des
marqueurs de la tolérance à la sécheresse.
Par ailleurs, les mutations non-sens sur des gènes candidats entrainent une modification
profonde du turn-over des protéines dans la réponse aux stress. Ces pertes de fonction ont un
impact significatif sur la tolérance à la sécheresse, l’osmorégulation et la détoxification
cellulaire. Éventuellement, la caractérisation moléculaire de ces mutations contribuera à la
compréhension de l’adaptation à la sécheresse et pour la sélection de génotypes d’intérêt.

Mots-clés : sorgho, mutant EMS, stress hydrique, RT-qPCR, LEA D34, RPM1

v
ABSTRACT
Sorghum (Sorghum bicolor [L.] Moench) is the fifth most important cereal crop in the world.
Although sorghum is grown very well in the arid and semi-arid regions of the world, the various
abiotic stresses, including drought and high temperatures, substantially compromise its
productivity. The objectives of this study were to: (i) evaluate the phenotypic variability to the
mutant EMS of sorghum subjected to preflower water deficit (ii) quantify the differential
expression of drought tolerance genes by RT-qPCR, and (iii) determine the impact of nonsense
mutations of candidate genes in drought adaptation to sorghum.
Eight sorghum mutants are selected on the basis of their contrasting agro-morphological
performances and are cultivated in the field with two water treatments (irrigated and stressed).
The plants are irrigated until 30 days after the seedling and then exposed to preflower water
deficit for 30 days. Data collected for agro-morphological and physiological parameters were
used to evaluate the behaviour of mutants under water stress condition. Four mutants and the
witness B35 are then selected to determine the differential expression of the LEA D34 and
RPM1 genes, respectively involved in tolerance to dehydration and high temperatures.
The results of the study show that there is a high variability of physiological and agro-
morphological responses between the different sorghum genotype studied under water stress
condition. Some mutants, such as SbEMS 2571 and SbEMS 2660, showed the stability of yield
in both water treatments, high capacity to accumulate chlorophyll, and maintain low leaf
temperature during water stress. In contrast, drought significantly reduced seeds weight, plants
height and leaves chlorophyll content of all genotype.
The analysis of the expression of LEA D34 and RPM1 genes in the foliar tissues of sorghum
genotype shows a regulation of the abundance of their transcripts by water stress. LEA D34 and
RPM1 are indeed strongly expressed in SbEMS 2660 and B35 from the first days of the water
deficit. The accumulation of transcripts of LEA D34 and RPM1 occurs late in the mutant
SbEMS 3514, probably due to the early senescence of its leaves. On the other hand, LEA D34
and RPM1 are not expressed in the leaves of the putative drought-susceptible mutants
SbEMS 4848 and SbEMS 0753. LEA D34 and RPM1 play an important role in the drought
tolerance genotype, since they accumulate strongly in sorghum plants with the highest yields
after harvest. In addition, transcripts accumulations of these tolerance genes were not correlated
with the chlorophyll content in leaves or the regulation of photosynthesis under water stress
conditions. The LEA D34 and RPM1 genes are therefore markers of drought tolerance.
Moreover, the nonsense mutations in candidate genes leads a profound change of the turn-
over of proteins in the signalling pathways in the response to stress. These alterations of
function have a significant impact on drought tolerance, osmoregulation, and cellular
detoxification. Eventually, the molecular characterization of these mutations will contribute to
the understanding of drought tolerance and the selection of genotype of interest.

Key words: Sorghum bicolor, water stress, EMS mutant, LEA D34, RPM1, RT-qPCR

vi
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Plant de Sorghum bicolor (L.) Mœnch. Source: KANE ..........................................4

Figure 2 : Schéma du processus de la perception du signal à la mise en place des mécanismes


moléculaires dans la régulation de l’expression des gènes impliqués dans la réponse aux stress
abiotiques (adapté de Wang et al., 2003). .............................................................................. 11

Figure 3 : Schéma classique de développement d’une population de mutants (Xin et al., 2008)
.............................................................................................................................................17

Figure 4 : Répartition des génotypes de sorgho sur le plan 1x2 défini par l’ACP .................. 34

Figure 5 : Profil d’amplification des produits PCR de 07 gènes chez le sorgho .................... 35

Figure 6 : Courbes d'étalonnage : Cq = f (Log concentration). .............................................. 38

Figure 7 : Courbes de dissociation des produits amplifiés de 07 gènes. ................................ 39

Figure 8 : Profils d’expression des gènes LEA D34 et RPM1 à trois (3) dates du stress hydrique
(T0, T1, T2) dans les feuilles des plants de sorgho. ............................................................... 40

Figure 9 : Phénotypes de plants de sorgho en condition de stress hydrique progressive. ....... 42

LISTE DES TABLEAUX


Tableau 1 : Analyse de variance des paramètres agro-morphologiques et physiologiques des
plants de sorgho en condition irriguée (ETM) et en condition de stress hydrique (STR) ........ 31

Tableau 2 : Corrélations entre les variables étudiées en condition irriguée (ETM) et en


condition de stress hydrique (STR) ....................................................................................... 32

Tableau 3: Caractéristiques des couples d’amorces RT-qPCR.............................................. 36

vii
LISTE DES ÉQUATIONS
Équation 1 : la pente de la courbe de quantification ............................................................. 20

Équation 2 : calcul de l’efficacité (E) de la PCR .................................................................. 20

Équation 3 : Méthode de ΔΔCq sans correction de l’efficacité (E=2) (Livak et Schmittgen,


2001). ................................................................................................................................... 21

Équation 4 : Méthode de ΔΔCq avec correction de l’efficacité (E spécifique pour le gène cible
et pour le gène de référence) par Livak et Schmittgen (2001). ............................................... 21

LISTE DES ANNEXES


Annexe 1 : Plan expérimental de l’essai ............................................................................... 57

Annexe 2 : Caractérisation agro-morphologique des plants de sorgho en ETM (irrigués) et en


STR (stressés)....................................................................................................................... 58

Annexe 3 : Caractérisation physiologique des plants de sorgho en ETM (irrigués) et en STR


(stressés)............................................................................................................................... 58

Annexe 4 : Phénotypes des plants de sorgho ......................................................................... 59

Annexe 5 : Évaluation de la qualité de la transcription inverse .............................................59

Annexe 6 : Description des gènes candidats mutés ............................................................... 60

Annexe 7 : Séquences protéiques ......................................................................................... 61

viii
TABLE DES MATIÈRES

DÉDICACES .................................................................................................................................... i
REMERCIEMENTS ....................................................................................................................... ii
LISTE DES ABRÉVIATIONS ET ACRONYMES ....................................................................... iv
RÉSUMÉ...........................................................................................................................................v
ABSTRACT .................................................................................................................................... vi
LISTE DES FIGURES .................................................................................................................. vii
LISTE DES TABLEAUX .............................................................................................................. vii
LISTE DES ÉQUATIONS ........................................................................................................... viii
LISTE DES ANNEXES ................................................................................................................ viii
INTRODUCTION ............................................................................................................................1
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................................3
1. Généralités sur le sorgho ..........................................................................................................3
1.1. Origine et diffusion du sorgho.......................................................................................................... 3
1.2. Systématique et classification .......................................................................................................... 3
1.3. Description du sorgho...................................................................................................................... 3
1.3.1. Morphologie du sorgho ............................................................................................................ 3
1.3.2. Physiologie du sorgho .............................................................................................................. 5
1.4. Production ....................................................................................................................................... 5
1.5. Utilisation du sorgho ....................................................................................................................... 6
1.6. Contraintes liées à la production ...................................................................................................... 6
2. Effets de la sécheresse et stratégies d’adaptation chez le sorgho ............................................7
2.1. Mécanismes d’adaptation à la sécheresse ......................................................................................... 8
2.1.1. Esquive .................................................................................................................................... 8
2.1.2. Évitement ................................................................................................................................. 8
2.1.3. Tolérance ................................................................................................................................. 9
2.2. Les mécanismes moléculaires de la tolérance à la sécheresse ............................................................ 9
2.3. Fonctions des gènes induits par la sécheresse ................................................................................. 10
2.3.1. Les protéines LEA.................................................................................................................. 12
2.3.2. Les protéines de choc thermique (Heat-Shock Proteins ou HSP) .............................................. 12
2.3.3. Les Protéines de résistance à Pseudomonas syringae ............................................................... 12
2.3.4. Les aquaporines...................................................................................................................... 13
2.3.5. La détoxification des effets du stress oxydatif ......................................................................... 14
2.3.6. La proline............................................................................................................................... 14
2.3.7. Les sucres .............................................................................................................................. 14
3. Mutagenèse induite et Amélioration du sorgho ..................................................................... 15
3.1. La mutagenèse chimique................................................................................................................ 15
3.2. Mise en place de la plateforme de découverte de gènes fonctionnels pour l'amélioration du sorgho . 17
4. La PCR quantitative .............................................................................................................. 18
4.1. Principe de la PCR quantitative...................................................................................................... 18
4.2. Notion de cycle de quantification ................................................................................................... 18
4.3. Méthodes de quantification ............................................................................................................ 19
4.3.1. Quantification absolue ............................................................................................................ 19
4.3.2. Courbe de quantification ......................................................................................................... 19
4.3.3. Quantification relative ............................................................................................................ 20

ix
MATÉRIEL ET MÉTHODES ....................................................................................................... 22
1. Matériel végétal ...................................................................................................................... 22
2. Station de l’étude.................................................................................................................... 22
3. Méthodes ................................................................................................................................ 22
3.1. Conduite de l’essai ........................................................................................................................ 22
3.2. Les paramètres étudiés................................................................................................................... 23
3.2.1. Mesures des paramètres physiologiques .................................................................................. 23
3.2.1.1. Le rendement quantique maximum de la photochimie du PSII (Fv/Fm)......................... 23
3.2.1.2. La teneur en chlorophylle (en « unité de SPAD ») ......................................................... 24
3.2.1.3. La température foliaire ................................................................................................. 24
3.2.2. Les Paramètres phénologiques ................................................................................................ 25
3.2.3. Les Paramètres de croissance et de développement ................................................................. 25
3.2.4. Le rendement et ses composantes............................................................................................ 25
3.2.5. Analyses statistiques............................................................................................................... 25
3.3. Analyse de l’expression des gènes ................................................................................................. 26
3.3.1. Prélèvement et broyage des feuilles ........................................................................................ 26
3.3.2. Extraction des ARN totaux des feuilles de Sorghum bicolor .................................................... 26
3.3.3. Contrôle de la qualité de l’ARN .............................................................................................. 27
3.3.4. Transcription inverse des ARN messager ................................................................................ 27
3.3.5. Design et Optimisation des amorces de qPCR ......................................................................... 27
3.3.6. Analyse de l’expression des gènes par RT-PCR quantitative en temps réel .............................. 28
3.3.7. Analyses statistiques............................................................................................................... 29
3.4. Identification des gènes mutés et méthode d’analyse des séquences ................................................ 29
RÉSULTATS .................................................................................................................................. 30
1. Analyses de la variabilité des paramètres agro-morphologiques et physiologiques ............. 30
2. Corrélation entre les paramètres agro-morphologiques et physiologiques .......................... 32
3. Analyse en composantes principales (ACP) .......................................................................... 33
4. Structuration de la diversité phénotypique ........................................................................... 33
5. Analyse de l’expression des gènes par RT-qPCR .................................................................. 35
5.1. Confirmation de la taille des amplifiats par électrophorèse sur gel d’agarose................................... 35
5.2. Courbe standard et Efficacité de la PCR ......................................................................................... 35
5.3. Analyse des courbes de fusion ....................................................................................................... 36
5.4. Etude de la régulation de l’expression des gènes LEA D34 et RPM1 chez le sorgho en condition de
stress hydrique ..................................................................................................................................... 36
6. Identification des gènes candidats mutés impliqués dans la tolérance à la sécheresse ......... 41
DISCUSSION.................................................................................................................................. 43
1. Diversité agro-morphologique et physiologique des mutants EMS de sorgho ..................... 43
2. Expression des gènes (transcrits) en réponse à la contrainte hydrique ................................ 44
3. Effets des mutations à haut impact sur l’adaptation à la sécheresse .................................... 46
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ........................................................................................... 48
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ....................................................................................... 49
ANNEXES ....................................................................................................................................... 57

x
INTRODUCTION
La sécheresse est l’une des principales contraintes pour la survie et le développement des
plantes cultivées. Son impact négatif sur la croissance des plantes comme le sorgho et sur la
production végétale n’est plus un fait à démontrer (Bray, 2000). Le sorgho est cultivé
principalement dans des régions intertropicales semi-arides et subhumides, surtout en Afrique
subsaharienne, où les ressources en eau sont très variables. La pluie, déficitaire dans ces zones,
est entrecoupée de longues pauses pluviométriques. Avec la forte concurrence des autres
grandes céréalicultures pour l’utilisation de l’eau, le sorgho ne bénéficiera probablement pas
davantage d’irrigation dans l’avenir. L’amélioration soutenue de la productivité du sorgho de
plus de 40 % est donc nécessaire dans les zones où la sécheresse est susceptible de se produire
d’ici 2025 (Pennisi, 2008). La recherche agronomique pour le développement devrait être
orientée vers de nouveaux paradigmes qui permettront l’amélioration des rendements de sorgho
sous le poids de contraintes abiotiques limitatives (Mittler, 2006). Sélectionner des plantes
cultivées plus tolérantes à la sécheresse deviendra, dans ce cas-là, un enjeu fondamental pour
la production agricole dans les prochaines décennies et en particulier dans un contexte de
changements climatiques qui bouleversent également la biodiversité (Ahuja et al., 2010).

Les résultats de recherche exceptionnels obtenus avec la biologie à haut débit ont montré
que la génomique fonctionnelle joue un rôle majeur dans des programmes d’amélioration
variétale tout en facilitant une meilleure compréhension des relations génotypes-phénotypes
des caractères complexes. Après Arabidopsis thaliana (Arabidopsis Genome Initiative, 2000)
et Oryza sativa (International Rice Genome Sequencing Project, 2005), le séquençage du
génome entier du sorgho est achevé en 2009 par l’équipe de Paterson et al. (2009). Le
séquençage complet va, par ailleurs, permettre de localiser plus facilement les gènes
responsables de la tolérance à la sécheresse du sorgho. Le sorgho, une graminée cultivée depuis
des millénaires, est un organisme diploïde (2n=20 chromosomes) avec un petit génome (732,2
Mbp), particulièrement rustique, mais peu productif. Le sorgho présente aussi une diversité
génétique extraordinaire, ce qui en fait une plante modèle pour l’analyse, la découverte de gènes
et la compréhension de l’adaptation des plantes à leur milieu à l’aide de la génomique
comparative, structurale et fonctionnelle (Paterson et al., 2009). Sous l’action de stress
abiotiques (basses et hautes températures, salinité, sécheresse), les plantes modifient leurs voies
de signalisation cellulaire afin de s’adapter aux changements intervenus dans leur
environnement. En effet, une étude transcriptomique faite chez le sorgho avec des puces à ADN
(microarrays) contenant 28 585 sondes génétiques uniques a permis une meilleure
compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la tolérance à la

1
sécheresse. Environ 4 % et 18 % des sondes sur la puce présentent une expression différentielle
respectivement dans des conditions de sécheresse et de choc thermique (Johnson et al., 2014 ;
Pandey et al., 2015). Pour comprendre plus précisément la fonction de ces nouveaux transcrits
dans les réseaux de signalisation cellulaire, l’analyse de l’expression de gènes par la PCR
quantitative en temps réel (RT-qPCR) constitue un outil simple, spécifique, juste et sensible
(Kane et al., 2013). La RT-qPCR permet d’établir des profils d’expression des gènes à partir
de quantités infimes d’acides nucléiques. Ainsi, la caractérisation fonctionnelle de gènes
d’intérêt identifiés avec des biopuces et la compréhension de leurs voies de signalisation
cellulaire conduiraient à de nouvelles cibles pour améliorer la tolérance des plantes aux stress.
Cette démarche sera particulièrement importante dans un contexte de changements climatiques
qui perturbent déjà la biodiversité et les capacités de production agricole mondiale. D’autre
part, la caractérisation de gènes marqueurs de la tolérance à la sécheresse pourrait contribuer à
la création de variétés améliorées.

Ce présent travail a pour objectif de comprendre les mécanismes de régulation de


l’adaptation à la sécheresse de mutants EMS de sorgho soumis à un déficit hydrique au stade
préfloral. Plus spécifiquement, nous avons cherché à :

- évaluer la variabilité phénotypique de mutants EMS de sorgho soumis à un déficit


hydrique au stade préfloral ;
- analyser l’expression différentielle de deux gènes, LEA D34 et RPM1, qui sont des
marqueurs de la tolérance à la sécheresse chez le sorgho ;
- déterminer l’impact fonctionnel des mutations non-sens sur les séquences de gènes
candidats dans l’adaptation à la sécheresse du sorgho.

Dans la première partie de ce travail, nous allons aborder à travers une analyse synthétique
de la bibliographie, quelques généralités sur le sorgho, sur les mécanismes moléculaires de
tolérance à la sécheresse et sur la technique de RT-qPCR, ainsi que son utilisation dans la
quantification de l’expression des gènes. Dans la seconde partie, le matériel végétal ainsi que
la démarche méthodologique adoptée au cours de nos expérimentations seront présentés. La
troisième partie du travail sera consacrée à la présentation des résultats et à la discussion. Enfin,
nous conclurons et dégagerons quelques perspectives de recherches.

2
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Généralités sur le sorgho

1.1. Origine et diffusion du sorgho

L’origine et la domestication du sorgho se situent dans le nord-est de l’Afrique ou dans la


zone soudano-sahélienne (Harlan et De Wet, 1972) il y a environ 5000 à 8000 ans (Smith et
Frederiksen, 2000). La domestication aurait eu lieu plus précisément à la marge sud-est du
Sahara, dans une zone occupée aujourd’hui par l’Éthiopie. C’est dans cette partie de l’Afrique
où se retrouve la plus grande diversité de sorgho dans le monde. À partir de là, le sorgho s’est
ensuite propagé en Afrique de l’Ouest et du Sud, et finalement en Asie (Madhusudhana et
al., 2015). La dispersion et la répartition actuelle de la diversité du sorgho sont liées à la fois
aux migrations humaines passées, aux traditions et aux usages des sociétés qui les cultivent et
aux conditions climatiques régionales.

1.2. Systématique et classification

Le sorgho (Sorghum bicolor [L.] Moench) appartient à l’embranchement des Angiospermes,


à la classe des Monocotylédones, à l’ordre des Glumales, à la famille des Poacées, à la sous-
famille des Andropogoneae, au genre Sorghum. Les premières classifications du sorgho ont été
faites par Snowden en 1936 sur les formes cultivées et sauvages. Cette taxonomie était basée
sur un inventaire complet et détaillé du genre. Actuellement, la classification d’Harlan et De
Wet (1972) est la plus utilisée. Cette dernière est basée sur des critères morphologiques des
épillets (glume et grain) et des panicules. Cinq races de sorgho de base sont distinguées à savoir
les races bicolor, guinea, caudatum, durra et kafir (Norman et al., 1995).

1.3. Description du sorgho

1.3.1. Morphologie du sorgho

Le sorgho est une plante herbacée de la famille des Poacées. Le plant de sorgho comporte
une tige principale glabre, cylindrique, dressée et très robuste (Figure 1). La tige principale
présente parfois un nombre variable de tiges secondaires, qui se forment à la hauteur du collet
des racines, appelées talles (House, 1987). Sur chaque tige se retrouve un empilement d’unités
morphologiques appelées phytomère. Le phytomère est constitué typiquement d’un nœud qui
forme un anneau à la base de la gaine foliaire, d’un entrenœud, c’est-à-dire un segment de la
tige compris entre deux nœuds successifs, et un bourgeon axillaire situé à la base de la feuille.

3
La formation des tiges se termine par un organe fructifère qui porte le nom de panicule chez le
sorgho. La panicule peut être courte ou compacte ou bien flasque et ouverte, et elle porte les
graines. La graine de sorgho est un caryopse avec un seul germe. Elle est composée de trois
parties principales : l’enveloppe externe qui constitue le péricarpe, le tissu de réserve ou
albumen, et le germe qui comprend l’embryon et le scutellum. Entre le péricarpe et l’albumen,
peut se retrouver une couche brune hautement pigmentée appelée testa. Au ras des entrenœuds
les plus basaux se forme un système racinaire très développé, puissant, avec de nombreux poils
radiculaires. Les ramifications émises par le système racinaire forment les racines latérales, qui
assurent l’exploration du sol en profondeur (Chantereau et Nicou, 1991).

Figure 1 : Plant de Sorghum bicolor (L.) Mœnch. Source: KANE

4
1.3.2. Physiologie du sorgho

Grâce à sa grande plasticité adaptative, le sorgho est cultivé dans des systèmes d’exploitation
agricole très variés et dans des conditions de température élevée et d’humidité faible
(Girijashankar et al., 2009). L’adaptation physiologique du sorgho est liée à l’agencement de
ces différents organes, à leur coordination fonctionnelle, et à leur capacité à répondre à la
variabilité des contraintes environnementales (humidité du sol, température, lumière). Le
sorgho est aussi considéré comme une plante monoïque et autogame préférentielle. Par rapport
aux plantes des régions tempérées, le sorgho présente un mécanisme de fixation du gaz
carbonique plus performant (photosynthèse en C4). En raison de son origine tropicale, le sorgho
est une plante photopériodique. La floraison est retardée d’autant plus que la phase végétative
s’opère en jour plus long. Cependant, l’adaptation du sorgho aux zones subtropicales, puis aux
zones tempérées a été rendue possible par la perte de la photosensibilité.

1.4. Production

Le sorgho, une plante herbacée d’Afrique apparentée à la canne à sucre et aux maïs, est la
cinquième céréale la plus cultivée dans le monde après le blé, le riz, le maïs et l’orge (Barnaud
et al., 2007). Le sorgho était cultivé en 2014 sur une superficie de 44 958 726 ha, pour une
production mondiale estimée à 68 938 587 tonnes. Le rendement moyen obtenu cette même
année était de 1,53 t/ha (FAOSTAT, 2014). Malgré sa grande capacité d’adaptation, le
rendement de sorgho reste très faible en Afrique subsaharienne (0,99 t/ha en 2014). Dans
certains pays comme le Sénégal, la situation est encore plus critique avec une production
nationale de 102 323 tonnes de sorgho en 2014, sur une superficie totale de 125 066 ha
(0,81 t/ha en 2014). Au cours de la période 1981 à 2013, la production mondiale de sorgho a
diminué de 13 à 15 % avec une moyenne de 0,75 % par an. Sur la même période, les superficies
cultivées ont diminué dans le monde de 9,9 % (Madhusudhana et al., 2015). Le déclin de la
production de sorgho contraste avec l’augmentation annuelle de la production des autres
grandes céréales comme le riz et le maïs. En Afrique, la stabilité de la production de sorgho sur
la même période est due à l’expansion de la superficie des terres cultivées en raison de la
croissance démographique, mais les rendements, par ailleurs faibles, n’ont pas augmenté sur la
même période (FAOSTAT, 2014). Les contraintes environnementales et socio-économiques
qui s’y exercent n’y favorisent pas l’intensification agricole.

5
1.5. Utilisation du sorgho

Le sorgho est une culture céréale importante pour l’alimentation de nombreuses populations
dans les régions tropicales sèches et subtropicales en Afrique, en Asie et en Amérique centrale
(Doggett, 1988). Il est utilisé à deux fins majeures : la nourriture humaine (farines, semoule,
boissons…) et l’alimentation animale (sorgho-grain, sorgho fourrager, ensilage). Le sorgho est
ainsi l’une des principales céréales consommées directement dans de nombreux plats
traditionnels surtout en Afrique soudano-sahélienne et en Asie (Rooney et al., 1987). Toutefois,
la consommation de sorgho pour la nourriture humaine a fortement diminué, alors qu’elle a plus
que doublé en tant qu’alimentation animale depuis les années 60, principalement dans les pays
développés (FAOSTAT, 2014). Par ailleurs, le sorgho est très riche en minéraux, mais la
biodisponibilité de ces éléments varie énormément, environ 1 % pour le fer, jusqu’à 90 % pour
le sodium et le potassium (Etuk et al., 2012). Les graines de sorgho sont aussi riches en facteurs
antinutritionnels, comme les tannins, qui peuvent induire une coloration de la farine et de la
préparation culinaire, généralement en les dépréciant. Lors du décorticage des graines,
l’élimination de ces substances peut s’avérer très difficile. Dans un contexte de prix croissants
des carburants fossiles, le sorgho constitue un réel intérêt pour la production de biocarburants
grâce à sa forte production de biomasse qui peut atteindre 40 t/ha (Rooney et al., 2007).
L’amidon contenu dans les grains de sorgho et le jus des tiges des sorghos sucrés riche en sucres
simples, après pressage des tiges, sont aisément exploitables pour la production d’agroéthanol
de première génération (Sipos et al., 2009). Le sorgho est également utilisé pour la fabrication
de pâte par l’industrie du papier (Belayachi et Delmas, 1997).

1.6. Contraintes liées à la production

En dépit de son importance croissante et de son utilisation diversifiée, le sorgho souffre


beaucoup de l’absence d’intrants externes comme les engrais chimiques, et de traitements
phytosanitaires en cours de culture dans les régions arides et semi-arides. Cette situation a
entrainé des rendements plus faibles pour les agriculteurs marginaux par rapport à d’autres
grandes cultures. Les dégâts causés par les oiseaux durant la phase de remplissage des graines
limitent aussi la production de sorgho dans certaines zones. En plus de ces contraintes, les
facteurs biotiques (moisissures, anthracnose, insectes nuisibles) et les facteurs abiotiques (haute
température, salinité, sécheresse) peuvent influencer le rendement et provoquer des pertes
importantes dans la culture du sorgho dans les pays en développement (Reddy et al., 2012). Les
pluies variables et irrégulières au cours des années constituent un frein important pour la
production de sorgho sous forme de cultures pluviales dans les régions tropicales semi-arides.
Cette situation entraine de grandes fluctuations entre les récoltes. Ces contraintes deviennent

6
plus critiques dans un contexte de changement climatique, facteur multiplicateur d’instabilité
dans ces régions (Reynolds et al., 2016).

2. Effets de la sécheresse et stratégies d’adaptation chez le sorgho

La sécheresse est le stress abiotique le plus important. Elle limite la production et la


performance des plantes cultivées dans le monde entier plus que toutes les autres contraintes
environnementales. La disponibilité de l’eau est donc d’une importance primordiale pour une
production végétale non limitative dans le scénario actuel de changement climatique mondial
en évolution (Boyer, 1982). Les effets du stress hydrique déclenchent un large éventail de
réponses adaptatives du niveau morphologique jusqu’au niveau moléculaire. Ces effets peuvent
être, par exemple, un ralentissement de la croissance de la plante, une baisse de l’activité
photosynthétique, une réduction du taux de transpiration et une diminution du potentiel
hydrique des tissus végétaux (Yordanov et al., 2003). Pour faire face aux incidences du stress
hydrique, les plantes provoquent le plus souvent une perte de turgescence des cellules de garde
et la fermeture des stomates (Waseem et al., 2011).

Une des principales conséquences de la sécheresse est la sénescence des feuilles, qui se
traduit par une dégradation de la chlorophylle. En effet, la perte importante d’eau cellulaire peut
conduire à la mort cellulaire et à la sénescence des tissus foliaires. La sénescence en réponse à
la sécheresse conduit également à une diminution de l’assimilation de la photosynthèse et une
allocation préférentielle des ressources aux organes reproducteurs. C’est un processus
génétiquement contrôlé, mais qui peut aussi apparaitre dans des conditions de stress biotiques
(maladies) et abiotiques (sécheresse). Les génotypes tolérants à la sécheresse ont la capacité de
réduire les pertes d’eau qu’ils subissent et limiter ainsi les chutes de leur rendement. Par contre,
les génotypes susceptibles à la sécheresse, reconnaissables par la sénescence précoce de leurs
feuilles, subissent des pertes considérables de rendements (Kassahun et al., 2010).

Ces perturbations sur le fonctionnement de la plante entrainent une diminution significative


du rendement chez le sorgho (Kapanigowda et al., 2013 ; Mutava, 2009). Cependant, les pertes
de rendement dû à la sécheresse dépendent du stade de développement de la culture où le stress
intervient, de la durée du stress hydrique et de sa gravité (Raman et al., 2012). L’élaboration du
rendement dépend en grande partie de la disponibilité de l’eau et de la quantité de carbone
photosynthétique que la plante absorbe. Par conséquent, les composantes du rendement peuvent
être de bons paramètres pour juger l’effet de la sécheresse sur l’activité photosynthétique et
pour la sélection de génotypes tolérants (Blum, 2011).

7
2.1. Mécanismes d’adaptation à la sécheresse

Les stress environnementaux déclenchent une grande variété de réponses végétales, allant
de la modulation passagère de l’expression génique et du métabolisme cellulaire, aux
changements apparents dans la croissance et la productivité de la plante. Des progrès
considérables sont accomplis pour déterminer les différents processus physiologiques et
biochimiques essentiels pour comprendre la capacité concurrentielle des plantes à survivre dans
différents environnements de stress (Chaves et al., 2003). Dans la nature, les plantes subissent
des pénuries d’eau fréquentes qui se développent lentement (des jours ou des semaines), ou font
face à des déficits hydriques à court terme (de quelques heures à quelques jours). Chez le
sorgho, on observe trois grands mécanismes de tolérance à la sécheresse à l’œuvre : l’esquive,
l’évitement et la tolérance (Levitt, 1972 ; Turner, 1986).

2.1.1. Esquive

L’esquive est la stratégie la plus importante utilisée par les plantes pour échapper à la
sécheresse. Ces plantes ont la capacité de réduire significativement leur cycle de
développement, de maintenir un taux de croissance végétative élevé et des échanges gazeux
optimaux, tout en utilisant les ressources disponibles à un niveau de consommation maximale
(Maroco et al., 2000 ; Mooney et al., 1987). L’esquive permet à la plante de réduire les effets
de la contrainte hydrique par une bonne adaptation de son cycle de culture à la longueur de la
saison des pluies ou à la disponibilité de l’eau. Les plantes qui utilisent la stratégie
d’échappement peuvent donc ajuster leur croissance et leur cycle de développement complet
avant le début de la sécheresse, accélérer la germination et raccourcir les phases de floraison,
de fructification et de maturation (Tardieu, 2005). L’esquive est observée chez les variétés de
sorgho à cycles courts ou des variétés photopériodiques aux cycles bien calés sur la fin de la
saison des pluies.

2.1.2. Évitement

Les plantes ont la capacité de maintenir des niveaux relativement élevés d’hydratations des
tissus en situation de stress hydrique. L’évitement se manifeste principalement par une
réduction de la transpiration, mais aussi par une optimisation de l’absorption de l’eau dans le
sol avec un système racinaire profond et puissant comme c’est le cas chez le sorgho (Chaves et
al., 2003). La stratégie d’évitement implique la minimisation des pertes d’eau à l’aide d’une
bonne régulation de la fermeture des stomates, ainsi que par la maximisation de l’absorption
d’eau. Cela se traduit par une chute de l’assimilation de CO2, donc une diminution de la

8
biomasse produite. Le sorgho utilise cette stratégie pour limiter les pertes d’eau des tissus et
favoriser une accumulation de carbone (Blum, 2011 ; Tardieu, 2005).

2.1.3. Tolérance

La tolérance à la sécheresse est la capacité des plantes à rester fonctionnelles et à prolonger


leur croissance en condition de faible teneur en eau des tissus (Oliveira et al., 2011). Le
maintien de la turgescence des cellules chez certains génotypes lors d’un déficit hydrique, par
une stabilité membranaire élevée, permet de retarder la fermeture des stomates (Mojayad et
Planchon, 1994), de maintenir le volume chloroplastique (Gupta et Berkowitz, 1987) et de
réduire le flétrissement foliaire (Jones et Turner, 1980). L’ajustement osmotique intervient à
l’aide d’un ensemble de mécanismes de résistance mécanique des tissus en condition de déficit
hydrique et de résistance biochimique à travers la synthèse des enzymes et des protéines
concernées. Les plantes tolérantes à la sécheresse accumulent des solutés (ions inorganiques,
sucres solubles, acides aminés, etc.), des acides aminés libres dans les racines et dans les
pousses des feuilles (Mohammadkhani et Heidari, 2008), des protéines protectrices des
membranes contre les dommages oxydatifs résultants (ROS) de la sécheresse ou des
températures élevées (Verslues et Juenger, 2011). L’expression différentielle de gènes et
l’accumulation de divers osmolytes, couplés à un système antioxydant efficace, sont souvent
les principaux mécanismes de tolérance au déficit hydrique (Ramanjulu et Bartels, 2002).

2.2. Les mécanismes moléculaires de la tolérance à la sécheresse

Au niveau moléculaire, la réponse de la plante à la sécheresse se traduit par l’induction ou


la répression de l’expression de nombreux gènes. Pour comprendre la différence qui existe entre
les plantes tolérantes aux stress des plantes sensibles, l’analyse de l’expression des gènes a
permis d’apporter des réponses pertinentes sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la
tolérance à la sécheresse. En réponse à la déshydratation, l’accumulation des transcrits des
gènes de tolérance change considérablement chez les plants de sorgho (1966 transcrits régulés
à la hausse et 224 régulés à la baisse) par rapport aux plantes non stressées, ce qui correspond
à environ 4 % des sondes sur la puce (Johnson et al., 2014). Cependant, chaque gène induit n’a
pas nécessairement un rôle dans l’adaptation à la sécheresse. Certains pourraient être induits en
raison des dommages oxydatifs provoqués par une plus grande concentration de solutés dans le
cytoplasme et par la production de ROS (Zhu, 2000). Identifier des gènes induits par le stress
s’avère donc nécessaire pour déterminer si le gène a un rôle effectif dans l’acquisition de la
tolérance, ou bien si le gène marque seulement un état de stress. Comment relier les profils

9
d’expression de ces gènes aux traits morphologiques et aux mécanismes physiologiques
préalablement définis ? Et comment les utiliser dans un schéma de sélection ?

Au niveau cellulaire, des récepteurs spécifiques perçoivent en premier lieu les signaux
moléculaires liés aux stress. Plus précisément, l’activation de cascades signalétiques
intracellulaires permet à la cellule d’adapter un programme d’expression génique aux signaux
et aux stress environnementaux. La perception du signal du stress entraine des changements de
la concentration de 𝐶𝑎2+ et l’accumulation de messagers secondaires comme les glycérolipides
(précurseurs), les intermédiaires des espèces d’oxygène réactives (ROS), l’ABA et d’autres
protéines associées au calcium. Ces derniers induisent des cascades de
phosphorylation/déphosphorylation par l’activation intracellulaire des protéines kinases telles
que la MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) et des protéines phosphatases qui modulent
à leur tour l’action de facteurs de transcription pour aboutir à des changements dans l’expression
de gènes en réponse aux stress (Bray, 1997 ; Knight et al., 2001). Les facteurs de transcription
agissent sur l’expression des gènes de tolérance impliqués dans le rétablissement de
l’homéostasie cellulaire, la protection ou la réparation des protéines et des membranes
endommagées (Chen et al., 2002).

2.3. Fonctions des gènes induits par la sécheresse

Les techniques de biologie moléculaire et de biotechnologie ont permis, au cours des deux
dernières décennies, d’identifier de nombreux gènes régulés lors du stress hydrique. L’analyse
de l’expression de gènes de plantes soumises à un stress hydrique permet de comprendre les
voies de régulation de ces gènes, mais aussi de connaitre les types de gènes induits pendant le
stress. Deux types de gènes sont induits par la plante pour répondre aux effets du stress
(Figure 2). D’une part, les gènes qui codent pour des protéines impliquées dans la lutte contre
les effets du stress, comme l’ajustement osmotique, la protection des membranes, et la
détoxification cellulaire. Et d’autre part, les gènes qui codent pour des protéines impliquées
dans la transduction du signal et le contrôle de la transcription, comme les protéines kinases et
phosphatases et les facteurs de transcription (Yamaguchi-Shinozaki et al., 2006).

10
Figure 2 : Schéma du processus de la perception du signal à la mise en place des mécanismes
moléculaires dans la régulation de l’expression des gènes impliqués dans la réponse aux stress
abiotiques (adapté de Wang et al., 2003).

11
2.3.1. Les protéines LEA

Les protéines LEA (Late Embryogenesis Abundant) ont été initialement identifiées au cours
de l’embryogenèse des graines de coton. Elles ont par la suite été découvertes dans les graines
d’autres espèces, ainsi que dans les tissus végétatifs des plantes en réponse à la déshydratation,
aux basses et hautes températures, à la salinité ou à des traitements exogènes à l’acide
abscissique (ABA) (Bartels et Sunkar, 2005). Les protéines LEA sont la plupart du temps de
petites molécules hydrophiles, excepté celles du groupe 5 qui confèrent une résistance à la
chaleur. La classification des protéines LEA, basée sur le regroupement de protéines au sein de
familles par des homologies de séquences de plusieurs domaines fortement conservées, permet
de les regrouper en six grandes classes. Les LEA des groupes 1 (D19), 2 (D11) et 3 (D7)
rassemblent la majorité des protéines, les groupes 4 (D13), 5 (D29) et 6 (D34) étant minoritaires
(Hundertmark et Hincha, 2008). Les protéines du deuxième groupe, LEA D11, sont aussi
appelées déhydrines. Les protéines LEA auraient une fonction protectrice, car elles
diminueraient l’agrégation de polypeptides partiellement dénaturés, conserveraient une
hydratation minimum des cellules en ralentissant les pertes d’eau, éviteraient une diminution
trop importante de la taille des cellules par la stabilisation des membranes (Ramanjulu et
Bartels, 2002).

2.3.2. Les protéines de choc thermique (Heat-Shock Proteins ou HSP)

Pendant les stress, les protéines Heat-Shock jouent un rôle crucial dans la protection, la
stabilisation, l’assemblage, le transport, la dégradation et la régulation de la conformation des
protéines dans de nombreux processus cellulaires et voies de transduction. En effet, sous
l’action combinée du déficit hydrique et de la chaleur certaines protéines sont fortement
dénaturées. Les chaperons moléculaires sont essentiels dans la mise en place de la tolérance au
stress. Les HSP sont divisées en cinq familles en fonction de la taille des protéines produites :
les Hsp70 (DnaK), Hsp40 (DnaJ), les Hsp60, les Hsp90, les Hsp100 (Clp) et les sHsp (small
HSP). Les protéines Hsp60, Hsp70 et Hsp90 interagissent avec de nombreuses autres protéines
co-chaperonnes comme les protéines de résistance à certaines souches de bactéries. Les HSP
vont également interagir entre elles pour former de véritables réseaux de protéines chaperonnes,
et agir en synergie avec les autres mécanismes de réponses aux stress (Wang et al., 2004).

2.3.3. Les Protéines de résistance à Pseudomonas syringae

Chez les plantes, les protéines de résistance (R) sont impliquées dans la reconnaissance
d’agents pathogènes et l’activation immédiate des réponses immunitaires. La plupart des
protéines de résistance contiennent un domaine de liaison nucléotidique central, dont les plus

12
importants sont les domaines NB-ARC et NB-LRR. Le domaine NB-ARC est composé de trois
sous-domaines : NB (site de liaison de nucléotides), ARC1 et ARC2. Alors que, le domaine
NB-LRR est constitué par des répétitions riches en leucine (LRR) (Dangl et Jones, 2001). NB-
ARC et NB-LRR sont des domaines de liaison ATPase fonctionnels et leurs états de liaison
avec les autres protéines du substrat sont proposés pour réguler l’activité des protéines de
résistance (Ooijen et al., 2008). La protéine RPM1 (Resistance to Pseudomonas syringae pv.
Maculicola 1), initialement trouvée chez Arabidopsis thaliana, est une protéine qui active la
résistance des plantes face aux maladies en réponse aux infections causées par cette souche de
Pseudomonas syringae (Hubert et al., 2003). L’activation des voies de biosynthèse de RPM1 à
l’intérieur de la cellule-hôte procure à la plante une adaptation physiologique qui se traduira par
la fermeture des stomates et la réduction des pertes d’eau (Beattie, 2011). RPM1 est donc la
première protéine cliente décrite pour les protéines HSP90 cytosolique des plantes. Le
complexe RPM1-HSP90 intervient dans la transduction du signal de stress pour permettre aux
autres protéines de se replier et d’adopter une conformation active en réponse au stress (Xu et
al., 2012). L’association de RPM1 avec des protéines chaperonnes induit une série de réponses
de défense, telle que l’activation de rafales oxydatives, de flux de calcium et d’ions, des
cascades de protéines kinases et phosphatases et l’induction de gènes de résistance (Belkhadir
et al., 2004 ; Hammond-Kosack et al., 2003 ; Nimchuk et al., 2003 ; Pedley et Martin, 2005).

2.3.4. Les aquaporines

Les aquaporines, très jolies protéines, jouent un rôle important dans le maintien de l’équilibre
de l’état hydrique des plantes. Ce sont des éléments essentiels dans le transport de l’eau dans la
plante. Les aquaporines sont en effet des canaux spécifiques de passage de l’eau située sur les
membranes plasmiques ou vacuolaires. Elles facilitent l’équilibre osmotique en contrôlant le
transport et la régulation de la conductivité hydraulique des membranes (Kjellbom et al., 1999).
Les aquaporines font partie d’une famille de protéines intramembranaires, les MIP (Major
Intrinsic Protein), qui jouent un rôle important dans la perméabilité des membranes cellulaires
et les flux d’eau dans les cellules. Certains gènes d’aquaporines sont induits par le stress
hydrique tandis que d’autres sont réprimés, permettant ainsi à la plante d’optimiser le flux d’eau
pendant le stress (Bartels et Sunkar, 2005). Selon Smart et al. (2001), les transcrits des gènes
d’aquaporines sont abondants dans les racines, les tiges et les fleurs, et la répression de certains
de ces gènes diminuerait la perméabilité à l’eau des membranes et permettrait la conservation
de l’eau dans les cellules en condition de stress hydrique.

13
2.3.5. La détoxification des effets du stress oxydatif

Les systèmes de défense de la plante éliminent les cellules qui produisent des composés
oxydants. La production et la dégradation de ces puissants agents oxydants sont en équilibre
dans les cellules non stressées. Lorsque les plantes sont exposées à des températures faibles ou
élevées, à la sécheresse, ou à d’autres types stress, les radicaux oxydants sont fortement induits
en réponse aux stress et possèdent des effets néfastes sur les structures cellulaires, comme
l’oxydation des acides nucléiques, des acides aminés et des lipides membranaires (Smirnoff,
1993). Un des effets de l’accumulation des ROS (espèces réactives de l’oxygène) dans les
cellules est la production accrue de produits de réactions qui impliquent le peroxyde
d’hydrogène 𝐻2 𝑂2 et les ions superoxyde O2− (Bartels et Sunkar, 2005). Pour se prémunir des
effets des ROS, les plantes développent des composés antioxydants qui neutralisent et protègent
la cellule contre les agents oxydants et déshydratants. Les antioxydants contrecarrent l’action
des radicaux libres en les « interceptant » et maintiennent ainsi l’intégrité du système
photosynthétique lors d’une contrainte hydrique (Reddy et al., 2004). Les plus puissants
antioxydants sont : les superoxydes dismutases (SOD), les ascorbates peroxydases (APX), les
catalases (CAT), les monodehydroascorbates réductases (MDAR), les dehydroascorbates
réductases (DHAR), les glutathions-S-transférases (GST) et les glutathions réductases (GR).
D’autres protéines, telles que les thioredoxines ou les sulfoxydes réductases, sont aussi
impliquées dans la détoxification des effets des ROS (Bartels et Sunkar, 2005).

2.3.6. La proline

La proline est un acide aminé hétérocyclique de formule (C5H8N)-CO2H, qui participe à la


synthèse des glucides. L’accumulation de la proline dans la cellule permet l’ajustement du
potentiel osmotique, qui constitue un paramètre essentiel dans la tolérance à la déshydratation
(Bray, 2000). Elle constitue, avec les sucres, les principales molécules pour maintenir
l’ajustement osmotique dans la cellule. La proline est synthétisée à partir de la L-Glutamate. La
P-5-C Synthase (P-5-CS) catalyse cette réaction, et la répression du gène de la proline
déshydrogénase (ProDH) va conduire à une accumulation de la proline pendant le déficit
hydrique (Yoshiba et al., 1997).

2.3.7. Les sucres

Dans des conditions de déficit hydrique, les plantes accumulent fortement des solutés,
particulièrement des sucres solubles (saccharose, tréhalose, raffinose, mannitol, glucitol,
pinitol, myoinositol et l’ononitol), pour maintenir un équilibre osmotique au niveau cellulaire
(Gorham et al., 1981). Les sucres sont les éléments carbonés primaires synthétisés et exportés

14
dans les différentes parties de la plante lors de la photosynthèse. Ils jouent également un rôle
non énergétique d’osmoprotectants des structures cellulaires.

Le principal sucre qui intervient dans la croissance et le développement de la plante est sans
doute le saccharose, mais d’autres rôles lui sont aussi attribués dans les mécanismes de
régulation de l’expression des gènes (Huber et al., 1996). Son accumulation, accrue pendant le
stress hydrique, augmente la capacité d’alimentation en eau de la plante (Geigenberger et
al., 1999). Malgré de faibles concentrations (0,5 µmol/g) dans les tissus, le tréhalose est
considéré comme l’osmoprotectant le plus efficace. Ce disaccharide non réducteur présente une
forte stabilité et offre une forte capacité de protection des cellules contre les stress abiotiques
tels que la salinité, la sécheresse et le froid (Penna, 2003). Le tréhalose procure à la plante une
meilleure tolérance à la sécheresse et une amélioration de la capacité photosynthétique. En plus,
une autre catégorie d’osmoticums est regroupée sous l’acronyme de RFO (oligosaccharides de
la famille du raffinose). Les RFO interviennent essentiellement dans les processus de
dessiccation des graines chez de nombreuses espèces. Taji et al. (2002) ont étudié
l’accumulation du galactinol et des RFO chez des plantes d’Arabidopsis thaliana exposées au
froid, au sel et à la déshydratation. Les teneurs en galactinol et en raffinose mesurées étaient
fortement élevées, conférant à ces plantes une nette tolérance à la sécheresse et une transpiration
foliaire réduite. Les auteurs ont alors émis l’hypothèse d’une induction de la production d’ABA
par le galactinol et le raffinose, et ont mis en évidence leurs rôles d’osmoprotectants sur les
membranes des chloroplastes.

3. Mutagenèse induite et Amélioration du sorgho

3.1. La mutagenèse chimique

La mutagenèse constitue un outil très puissant pour l’amélioration des plantes cultivées et
pour la création de matériels génétiques appropriés. Des erreurs dans la réplication ou la
réparation de l’ADN sont à l’origine de la plupart des mutations spontanément apparues dans
les cellules. Elles peuvent être induites par exposition à différents types de mutagènes présents
dans notre environnement. Les mutations peuvent arriver spontanément lors de la division
cellulaire (mutations spontanées) ou sous l’influence d’agents extérieurs appelés mutagènes
(mutations induites). Enfin, les éléments mobiles ou transposons se déplacent spontanément
d’une position à l’autre dans un génome ; ils sont à l’origine de mutations très variées, créées
par insertion de novo ou par excision imparfaite.

L’EthylMethaneSulfonate (EMS) est un composé organique de formule chimique, qui


cumule des effets mutagènes, tératogènes et cancérigènes. L’EMS produit des mutations

15
génétiques aléatoires par substitution de nucléotides. Ces mutations sont généralement des
−4 −2
mutations ponctuelles (SNP) qui apparaissent à une fréquence de 510 à 510 . Le groupement
éthyle réagit avec la guanine de l’ADN, de manière à former une base anormale O-6-
éthylguanine. La paire de bases G : C peut être remplacée par le couple A : T, après une série
de réplication de l’ADN (Greene et al., 2003).

Trois types de mutations principaux sont connues. Les mutations sont des modifications
permanentes dans l’ADN. Lorsque ces changements se produisent dans la séquence d’un gène
qui code pour une protéine, ils peuvent induire différentes conséquences. Tout d’abord, ils
peuvent provoquer le remplacement d’un acide aminé par un autre, il s’agit des mutations faux-
sens. Ils peuvent ensuite provoquer le remplacement d’un acide aminé par un codon-stop
provoquant l’arrêt de la synthèse de la protéine concernée, il s’agit alors de mutations non-sens.
Le dernier type de mutation concerne les délétions ou les insertions. Les délétions sont des
pertes d’ADN (qui peuvent aller d’une seule base à plusieurs dizaines de milliers). Les
insertions sont des gains d’ADN (d’une base à plusieurs milliers). Dans ces deux derniers cas
(délétions et insertions), le résultat pour la protéine concernée est ce que l’on appelle un
« décalage du cadre de lecture » qui provoque généralement l’apparition prématurée d’une
instruction « stop » provoquant l’arrêt de la synthèse de la protéine concernée. Selon la partie
du génome touchée, les conséquences d’une mutation peuvent varier. Une mutation synonyme
désigne une mutation silencieuse qui touche un exon, sans changer la séquence de la protéine.
À l’inverse, les substitutions non synonymes sont des mutations du génome qui entrainent un
changement de l’acide aminé. Les mutations faux-sens ont un impact modéré et les mutations
non-sens ont un grand impact sur l’expression du phénotype des mutants.

Le sorgho hybride, BTx623 a servi de parent pour développer plusieurs populations de


cartographie à la fois génétique et physique, mais aussi pour le séquençage du génome du
sorgho en 2009 (Paterson et al., 2009). BTx623 a ensuite permis le développement d’une
population de mutants de sorgho par une mutagenèse chimique avec l’EthylMethaneSulfonate
(Figure 3). Des résultats de nombreuses études suggèrent que l’utilisation de mutants induits
chimiquement et dont les mutations sont systématiquement annotées offre de nombreuses pistes
de recherche, en particulier celles axées sur la génomique fonctionnelle (Xin et al., 2009).
Récemment, des études transcriptomiques et bio-informatiques faites sur ces mutants EMS de
sorgho ont permis d’identifier des variations sur des séquences de gènes connus (Krothapalli et
al., 2013). Ces mutations peuvent s’avérer utiles dans la recherche de cultivars de sorgho
améliorés.

16
Figure 3 : Schéma classique de développement d’une population de mutants (Xin et al., 2008)

3.2. Mise en place de la plateforme de découverte de gènes fonctionnels pour


l'amélioration du sorgho

Les progrès de la génomique, de la mutagenèse ciblée, de la génétique inverse et du


séquençage de génomes peuvent permettre des découvertes génétiques efficaces pour
l’amélioration des plantes cultivées. Des chercheurs de l’université de Purdue (USA) ont
développé des ressources génétiques et génomiques pour combler les lacunes dans la
compréhension des variations phénotypiques chez le sorgho. En utilisant l’EMS comme agent
mutagène, 12 000 lignées de mutants de sorgho issus de BTx623 ont été développées et mises
à la disposition de la communauté internationale. Ces lignées serviront pour la recherche
génétique fondamentale et l’amélioration du sorgho de deux façons :

- génétique directe : criblage pour trouver de nouveaux phénotypes ;


- génétique inverse : criblage pour identifier les phénotypes utiles parmi les mutants
affectés aux gènes candidats.

Des analyses de séquences génomiques entières ont révélé approximativement 7 000


transitions de G vers A ou de C vers T, entrainant ainsi des polymorphismes unidimensionnels
(SNP) chez les mutants. Les études ont montré que cette population de mutants EMS de sorgho
est très adaptée à la découverte de nouveaux gènes et d’allèles, qui représenteront un intérêt
agronomique indéniable. Des séquences génomiques ont été générées pour 600 lignées de
mutants EMS de sorgho. Les mutations et leurs impacts sur les séquences de protéines ont été
prédits par un traitement bio-informatique des données (Mace et al., 2013). Ainsi, l’exploitation
des mutants permettra d’identifier et de comprendre le rôle des gènes candidats affectés par les
mutations par des techniques de biologie moléculaire comme la quantification génique.

17
4. La PCR quantitative

4.1. Principe de la PCR quantitative

Les premières expériences de PCR en temps réel ont eu lieu au début des années 90 (Higuchi,
Dollinger et al., 1992). Ces auteurs ont suivi l’intensité de la fluorescence émise par un milieu
réactionnel avec du bromure d’éthidium (EtBr), sans avoir à ouvrir l’échantillon où se déroule
la réaction biochimique. Ils ont alors constaté que le nombre de cycles requis pour détecter
l’accumulation des produits de la PCR, appelés amplicons, dépendait du nombre de copies de
départ dans l’échantillon. Les méthodes de PCR classique ne permettent pas de lier le nombre
de transcrits obtenu à la fin de la réaction à la quantité initiale d’ADN dans l’échantillon. Dans
ce cas, les produits d’amplification étaient visualisés à la fin de la réaction PCR. Par contre, la
PCR quantitative (qPCR) est une technologie puissante et rapide basée sur la fluorescence en
temps réel. C’est la méthode de choix pour la détection et la quantification de produits de PCR
(Bustin et al., 2009). En réalité, la qPCR mesure l’amplitude de la fluorescence pendant la phase
exponentielle de la réaction PCR, directement proportionnelle à la quantité d’amplifiats
(portion d’ADN définie par un couple d’amorces).

La RT-qPCR utilise deux principales technologies de fluorescences, qui mesurent toutes un


signal émis par une molécule fluorescente (Gasparic et al., 2010). Le SYBR Green I est le
marqueur fluorescent le plus utilisé par cette technique, à côté de la sonde d’hydrolyse Taqman
(Holland et al., 1991). Le SYBR Green I se lie préférentiellement à l’ADN double-brin.
Parallèlement, des thermocycleurs de plus en plus performants sont développés
continuellement, permettant notamment des vitesses de transition thermique de plus en plus
rapides (Pugnière, 2012). Cet appareil mesure la fluorescence émise par le SYBR Green I après
chaque cycle.

4.2. Notion de cycle de quantification

L’évaluation de la quantité de séquence cible nécessite la définition d’un paramètre de


quantification caractéristique de l’échantillon. Au bout d’un certain nombre de cycles
réactionnels, la fluorescence mesurée dépasse le bruit de fond. La mesure de ce paramètre,
appelé cycle seuil, ne peut être réalisée qu’au moment de la phase exponentielle de la réaction,
et ce, pour éviter tout biais possible dans la quantification (Wiesner, Beinbrech et al., 1993).
C’est ainsi que Bustin, Benes et al. (2009) ont proposé le terme générique de cycle de
quantification (Cq), qui rentre en accord avec les données standards de PCR RDML (Real-Time
PCR Data Markup Language ; www.rdml.org) (Lefever, Hellemans et al., 2009). Le suivi en
temps réel de l’accumulation de la cible détectée au cours de la réaction d’amplification

18
constitue véritablement une révolution pour la quantification des acides nucléiques. La PCR en
temps réel s’appuie sur deux principaux modèles de quantification : la quantification absolue et
la quantification relative.

4.3. Méthodes de quantification

4.3.1. Quantification absolue

La quantification absolue permet de comparer les valeurs de Cq obtenues pour chaque


échantillon après une série de dilutions construites avec des concentrations connues d’ADN
(Poitras et Houde, 2002). Cette méthode permet de déterminer la quantité précise d’ADN qui
se trouve dans un échantillon donné à partir d’une courbe de quantification (appelée courbe
standard externe) obtenue à partir de différentes concentrations connues (Mitra et al., 2003). La
quantification absolue rapporte toujours un résultat final de manière relative à une unité définie :
en nombre de copies par nanogramme d’ARN, par génome, par cellule ou par gramme de tissu.

4.3.2. Courbe de quantification

La première étape pour réussir une expérience de PCR en temps réel est l’optimisation de la
réaction PCR (spécificité des amorces, concentration des réactifs, paramètres du LightCycler,
etc.). Indépendamment de l’instrument utilisé pour réaliser la qPCR, des conditions sine qua
non doivent être respectées pour la réussite de l’expérience. Le dosage doit être robuste et
répondre à tous les critères recommandés dans les MIQE (Informations Minimales en vue de la
publication d’expérimentations effectuées en PCR quantitative en temps réel) (Bustin, Benes et
al., 2009). Une courbe standard réalisée avec un pool d’ADNc doit aboutir à une pente (p)
cohérente, un coefficient de détermination (R2) et un point d’intersection en y qui démontrent
respectivement une bonne efficacité, une haute précision et une forte sensibilité de la PCR
quantitative (Bustin, 2004). Ces procédures permettront de connaitre précisément la qualité des
acides nucléiques ainsi que les inhibiteurs qui les accompagnent (Hellemans et al., 2007). Les
courbes d’amplification doivent démontrer une amplification exponentielle et se situer dans les
limites de détection de l’instrument. Cette phase exponentielle correspond à la partie linéaire
de la courbe standard représentée en échelle semi-logarithmique. À ce moment précis,
l’efficacité de la réaction apparait maximale et peut facilement être déduite de manière précise
à partir de la courbe. Des contrôles appropriés devraient être inclus pour surveiller les
contaminations par l’ADN génomique et la sensibilité du dosage. Cette courbe standard sous
forme de droite permettra de connaitre plusieurs paramètres :

19
- La pente
1
𝑝=
𝑙𝑜𝑔 1 + 𝐸

Équation 1 : Pente de la courbe de quantification

- L’efficacité de la PCR (E)

La qPCR en temps réel permet de connaitre l’efficacité de la réaction PCR, c’est-à-dire la


capacité d’estimer si un doublement du nombre de copies est réalisé après chaque cycle de
quantification. La notion d’efficacité de la réaction est le premier élément de divergence entre
modèle et réalité. L’efficacité est souvent considérée sciemment comme constante et identique
entre tous les échantillons au cours d’une analyse dans le modèle exponentiel. En réalité, ce
paramètre présente une variabilité importante tout au long de l’amplification (Nogva et Rudi,
2004). L’efficacité de la PCR est exprimée en pourcentage, et la valeur obtenue est acceptable
quand elle est comprise entre 90 et 105 %. L’efficacité correspond exactement à la pente de la
droite au point d’inflexion.

E = 10−(1/p) − 1

Équation 2 : Calcul de l’efficacité (E) de la PCR, p représente la pente de la courbe de


quantification.

4.3.3. Quantification relative

La quantification relative est utilisée pour mesurer la quantité d’un gène cible, dans des
échantillons inconnus, par rapport à un gène de référence, dont l’expression est stable dans tous
les échantillons. Les niveaux de transcription des gènes de référence ne doivent pas varier dans
les tissus étudiés, de même que dans les différentes conditions expérimentales. Les gènes de
référence sont généralement des gènes qui codent des protéines essentielles dans les fonctions
cellulaires de base. Le choix d’un gène de référence repose sur des critères très stricts afin que
son utilisation soit validé dans une étude d’expression de gènes conformément aux
recommandations formulées par le consortium MIQE (Bustin, Benes et al., 2009). Effectuer
une normalisation avec un gène de référence permettra d’éliminer les fluctuations liées à la
qualité et à la quantité d’ARN extraits (Livak, 1997).

Le ratio de l’expression relative (du gène cible/gène de référence) est calculé en fonction de
l’efficacité de la qPCR et des valeurs de Cq enregistrées par le LightCyclerTM. L’analyse
quantitative des données RT-qPCR doit être rigoureuse pour obtenir des résultats acceptables

20
et pertinents, particulièrement pour l’étude de l’expression des gènes. Avec cette méthode de
quantification, la droite standard servira de support pour calculer l’efficacité réelle de la PCR,
et dans ce cas connaitre la valeur absolue du nombre de copies d’ADN des échantillons n’est
pas nécessaire. Les résultats obtenus sont exprimés par un rapport à une cible/référence de
chaque échantillon normalisé par le rapport cible/référence d’un échantillon appelé calibrateur
(échantillon non traité, pool d’ADNc de tous les échantillons avant traitement, ADN du
sauvage). Dans cette méthode, la précision du résultat dépend de l’efficacité de la PCR des
gènes cibles et des gènes de référence. La quantification relative, sans la normalisation des
données, considère que l’efficacité de la réaction PCR pour chaque paire d’amorces est de
100 % (E=2) pour le gène de référence et pour le gène cible (équation 3). Dans ce cas, le résultat
obtenu sera approximatif avec la possibilité d’introduire des biais dans les calculs. Par contre,
dans les conditions réelles de quantification, l’efficacité de la réaction diffère pour chaque
couple d’amorces et pour chaque condition expérimentale. La différence d’efficacité peut être
corrigée pour obtenir un résultat précis. L’équation 4 est alors utilisée pour calculer le ratio à
partir du rapport du Cq du gène cible/référence en utilisant l’efficacité de la PCR de chaque
paire d’amorces (Pfaffl, 2001).

𝛥𝐶𝑞 échantillon = 𝐶𝑞 (𝑔è𝑛𝑒 𝑐𝑖𝑏𝑙𝑒) − 𝐶𝑞 (𝑔è𝑛𝑒 𝑑𝑒 référence)

𝛥𝐶𝑞 calibrateur = 𝐶𝑞 (𝑔è𝑛𝑒 𝑐𝑖𝑏𝑙𝑒) − 𝐶𝑞 (𝑔è𝑛𝑒 𝑑𝑒 référence)

ΔΔCq = ΔCq (échantillon) − ΔCq (calibrateur)

Ratio (Expression relative) = 2−ΔΔCq

Équation 3 : Méthode de ΔΔCq sans correction de l’efficacité (E=2).

Δ𝐶𝑞 gène cible (𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒−é𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛)


(𝐸 gène cible )
𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 = Δ𝐶𝑞 gène référence (𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒−é𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛)
(𝐸 𝑔è𝑛𝑒 référence )
Équation 4 : Méthode de ΔΔCq avec correction de l’efficacité (E spécifique pour le gène cible
et pour le gène de référence) par Livak et Schmittgen (2001).

21
MATÉRIEL ET MÉTHODES
1. Matériel végétal

Le Centre d’Étude Régional pour l’Amélioration de l’Adaptation à la Sécheresse (CERAAS)


de Thiès possède actuellement une collection de 600 lignées de mutants EMS de sorgho
produites par autofécondation. Les graines utilisées proviennent de l’Université de Purdue des
États-Unis d’Amérique. Elles ont été conservées à 4°C dans la chambre froide du CERAAS.
Dans une stratégie de génétique inverse, 8 mutants (SbEMS 4848, SbEMS 0453, SbEMS 0700,
SbEMS 0753, SbEMS 2571, SbEMS 2660, SbEMS 3514 et SbEMS 4602) de sorgho
présentant des performances agro-morphologiques contrastées ont été sélectionnés dans cette
étude (Diao et Thiam, 2017). Les variétés B35 (tolérante au stress hydrique post-floral) et
Tx7000 (susceptible au stress hydrique post-floral) ont été utilisés comme témoins.

2. Station de l’étude

Deux expérimentations (irrigué et non irrigué) ont été conduites au champ à partir du 12
avril 2017 au Centre National de Recherche Agronomique (CNRA) de Bambey (14°42’N ;
16°28’W). La station de recherche de Bambey est nichée à 17 m d’altitude, et distante de 120
Km de Dakar. Le climat de la localité est caractéristique de la zone soudano-sahélienne avec
une courte saison des pluies. Les graines de chaque génotype ont été semées sur un sol « Dior »,
caractéristique des sols ferrugineux tropicaux faiblement lessivés plus humides et plus riches.
L’essai a été installé sur une parcelle rectangulaire de 58 m de longueur sur 26 m de largeur,
soit une superficie de 1508 m2. Juste avant le semis, un désherbage, un labour léger de 15 à
20 cm de profondeur, et un hersage ont été successivement effectués pour préparer le sol.

3. Méthodes

3.1. Conduite de l’essai

Le dispositif qui a été mis en place est un split-plot avec quatre répétitions ou blocs
(Annexe 1). Deux facteurs ont été étudiés : le régime hydrique (rh) en grande parcelle et la
lignée (lg) en petite parcelle. L’essai a été réalisé sur deux environnements, ETM (irrigué) et
STR (stressé), placés côte à côte et séparés par une distance de six (6) mètres. Chaque
environnement a été constitué par dix (10) petites parcelles, contenant chacune une lignée. La
parcelle élémentaire ou petite parcelle a été disposée en deux (2) lignes de quatre (4) mètres de
long. Les lignes ont été séparées de 60 cm et les poquets sur la ligne de 30 cm, conduisant à un
nombre total de 20 plants par petite parcelle.

22
Le semis en humide (irrigation avec 15 mm la veille du semis) a été réalisé dans la première
décade du mois d’avril à raison de six grains par poquet. Un démariage à deux plants par poquet
a été effectué à partir du 15e JAS. L’engrais NPK (15-15-15) a été épandu de façon homogène
sur les parcelles à une dose de 150 kg/ha. Après l’opération de démariage, la fumure d’appoint
(100 kg/ha d’urée) a été apportée dans toutes les parcelles. L’apport d’eau par irrigation a été
assuré par un système à rampes oscillantes. Les plantes en ETM ont été arrosées deux fois par
semaine à raison de 20 mm par irrigation. Les plantes en condition de stress hydrique ont été
irriguées normalement jusqu’au 30e JAS (120 mm). À ce stade, le déficit hydrique a été appliqué
pendant 30 jours. Les mesures de l’humidité du sol ont été exécutées deux fois par semaine par
une sonde Diviner 2000 (Sentek Pty Ltd, Australia). Des minipluviomètres ont également été
installés sur les parcelles pour mesurer la quantité d’eau apportée par irrigation.

3.2. Les paramètres étudiés

3.2.1. Mesures des paramètres physiologiques

Toutes les mesures des paramètres physiologiques ont été effectuées sur la troisième feuille
complètement développée en partant du haut. Trois plants ont été choisis au hasard sur le mètre
central de la parcelle. Les paramètres suivants ont été retenus : le rapport de la fluorescence
variable sur la fluorescence maximale (Fv/Fm), la teneur en chlorophylle (SPAD) et la
température foliaire (Thermo). Les mesures ont été réalisées à 0 jour (T0), 15e jour (T1) et 30e
(T2) jour après l’arrêt de l’irrigation, à partir du 30e JAS.

3.2.1.1. Le rendement quantique maximum de la photochimie du PSII (Fv/Fm)

La fluorescence chlorophyllienne a été utilisée comme outil de diagnostic de la tolérance des


plantes aux stress environnementaux. Plusieurs paramètres de la fluorescence ont été mesurés
à l’aide du fluorimètre à lumière continue, le PEA (Plant Efficiency Anylser, King’s Lynn,
Norflok, UK). La fluorimétrie est une technique qui permet de mesurer le pouvoir de
transformation de l’énergie lumineuse en énergie photochimique par l’appareil
photosynthétique. Les paramètres suivants ont été mesurés : la fluorescence minimale (Fo), qui
est la fluorescence lorsque les accepteurs d’électrons primaires du PSII sont oxydés au
maximum (les centres PSII sont ouverts), et la fluorescence maximale (Fm), qui est le niveau
de fluorescence lorsque les accepteurs d’électrons sont réduits au maximum (les centres PSII
sont fermés). La fluorescence mesurée provient dans la majeure partie des cas de la molécule
de chlorophylle a (absorbe à 680 nm), qui est associée au PSII (Krause, 1988).

23
Le rendement quantique maximum de la photochimie du PSII a été estimé par le rapport de
la fluorescence variable (Fv) sur la fluorescence maximale (Fm) des photosystèmes végétaux.
Sa valeur est d’environ 0,8 chez les plantes saines. Une diminution du ratio Fv/Fm indique une
photoinhibition et montre que la plante subit effectivement les effets du stress. La mesure des
paramètres de la fluorescence a été faite en deux étapes :

- une surface foliaire test a été préalablement adaptée à l’obscurité à l’aide de clips. Les
agrafes du clip ont été placées sur la feuille et fermées pour empêcher toute lumière
d’entrer dans cet endroit pendant au moins 30 min. Sur le plan physiologique, cette
opération inhibe le moteur énergétique de la photosynthèse et vide la chaine de transfert
d’électrons. Les centres réactionnels sont alors totalement disponibles ;
- les lectures de la fluorescence ont été ensuite effectuées en insérant la pointe du
fluorimètre et en ouvrant le volet du clip. Un flash lumineux provenant du fluorimètre
a été envoyé sur la surface-test pour saturer les accepteurs d’électrons du PSII. L’énergie
lumineuse est alors réémise sous forme de fluorescence selon une cinétique particulière.

3.2.1.2. La teneur en chlorophylle (en « unité de SPAD »)

La teneur en chlorophylle est un indicateur de la bonne santé des plantes. Ce paramètre


permet d’estimer la quantité d’azote qui se trouve dans les feuilles. Le SPAD-502 Plus (Soil
Plant Analysis Development, Minolta, SPAD-502 model, Tokyo, Japon) a été utilisé pour
réaliser des mesures rapides de la teneur en chlorophylle sans endommager les feuilles. Le
lecteur SPAD 502 a été reconnu comme étant le meilleur outil de diagnostic de l’azote
(Blackmer et Schepers, 1995). Les pinces de l’appareil SPAD 502 Plus ont été fixées sur une
feuille, tout en évitant la nervure principale. L’appareil émet deux faisceaux qui traversent la
feuille et qui sont captés par la cellule réceptrice. Les valeurs ont été déterminées à partir de la
quantité de lumière transmise par la feuille dans deux longueurs d’onde, 650 nm (lumière
rouge) et 940 nm (infrarouge). L’appareil fournit directement les valeurs de la teneur en
chlorophylle, qui sont comprises entre 0,0 à 99,9 en unités de SPAD.

3.2.1.3. La température foliaire

La température foliaire est un paramètre physiologique qui renseigne sur la sévérité du stress.
Les mesures de la température des feuilles ont été effectuées avec le thermomètre infrarouge
en forme de pistolet, sans toucher la feuille, pendant une journée claire et ensoleillée. Le laser
du pistolet a été pointé sur la feuille pendant quelques secondes et les valeurs de la température
foliaire ont été automatiquement enregistrées en degrés Celsius (°C).

24
3.2.2. Les Paramètres phénologiques

Les dates de levée, d’épiaison, et de floraison ont été suivies pendant toute la durée du cycle
pour tous les génotypes de sorgho. Selon les consignes du centre de recherche, les dates de
levée, d’épiaison et de floraison sont atteintes lorsqu’au moins 50 % des plants sur la ligne
parviennent à ces différents stades phénologiques. Le comptage de la levée (DSL) a été effectué
à partir du 3e JAS et poursuivi jusqu’à l’obtention d’un nombre maximum de plants. L’épiaison
(DSEPI) intervient lorsque la panicule sort de la gaine de la feuille paniculaire. La floraison
(DSFLO) est effective lorsque les premiers stigmates apparaissent au sommet de la panicule.

3.2.3. Les Paramètres de croissance et de développement

Les mesures des paramètres de croissance et de développement ont été représentées dans
cette étude par la hauteur sol-sommet panicule (HP) et le nombre de feuilles total (NFT).
L’estimation de la hauteur moyenne sol-sommet de la panicule (HP) a été effectuée sur trois
(3) plants dans chaque petite parcelle à la floraison avec une règle en bois graduée de 4 m de
long. Un suivi régulier du nombre de feuilles total (NFT) pour chaque plant a été réalisé jusqu’à
la floraison, permettant d’avoir des renseignements sur le développement des génotypes.

3.2.4. Le rendement et ses composantes

À la maturité, un carré de rendement, comprenant huit plants centraux, a été délimité dans
chaque parcelle élémentaire pour la récolte. Les panicules récoltées ont été ensuite mises dans
des enveloppes en papier kraft. Après séchage à température ambiante pendant une semaine, le
battage des panicules a été effectué. À la suite de cette opération, le rendement en grains (Rdt)
et le poids de mille grains (PMG) ont été déterminés sur chaque pied récolté. Les pesées ont
été réalisées avec une balance de précision (Adventurer Pro OHAUS corporation, Pine Brook,
NJ USA). Le comptage des 1000 grains a été effectué à l’aide d’un numigral (Tripette-Renaud,
France). Cet appareil est muni d’un système de détection de particules qui lui permet de compter
un nombre exact de grains préalablement programmé.

3.2.5. Analyses statistiques

Les données brutes ont été traitées avec le tableur Excel (version 2016). Les analyses de
variance (ANOVA) et de corrélation ont été effectuées avec les logiciels XLSTAT 2017
(version 19.5) et R (version 3.4.1). Les analyses en composantes principales (ACP) et la
classification hiérarchique ascendante (CHA) par la méthode Ward ont été réalisées avec le
logiciel XLSTAT 2017 (version 19.5).

25
3.3. Analyse de l’expression des gènes

3.3.1. Prélèvement et broyage des feuilles

Les échantillons de tissus foliaires ont été systématiquement collectés sur la dernière feuille
complètement développée (3e feuille en partant du haut). Trois périodes de prélèvement de
tissus foliaires ont été effectuées à 0 jour (T0), 15e jour (T1) et 30e jour (T2) après l’arrêt de
l’irrigation (à partir du 30e jour après semis), au moment de la réalisation des mesures
physiologiques, dans les plants de sorgho stressés et bien irrigués. Ces échantillons ont été
immédiatement congelés dans de l’azote liquide et stockés à -80°C.

3.3.2. Extraction des ARN totaux des feuilles de Sorghum bicolor

Cent (100) mg de tissus foliaires ont été broyés dans un mortier en présence d’azote liquide.
La poudre fine obtenue a été immédiatement homogénéisée avec 350 µl de tampon de lyse RA1
(Guanidinium thiocyanate, agents chaotropiques inhibant les ribonucléases) et 3,5 µl de ß-
mercaptoéthanol (agents dénaturants). Le mélange obtenu a été ensuite transféré dans des tubes
avec une colonne NucleoSpin® RNA Plant (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG,
Allemagne), homogénéisé par vortex, et centrifugé à 11 000 g pendant 1 min. La colonne
NucleoSpin avec un anneau violet permet de réduire la viscosité et d’éliminer le lysat.
L’écoulement contenant les acides nucléiques a été ensuite recueilli dans de nouveaux tubes
Eppendorf de 1,5 mL. À chaque tube a été ajouté un volume de 350 µl d’éthanol (70 %) et
l’ensemble a été immédiatement homogénéisé pendant 10 s. Les préparations ont été ensuite
chargées dans des colonnes NucleoSpin avec un anneau bleu en membrane de silice et
centrifugées à 11 000 g pendant 30 s. Cette opération permet de lier les acides nucléiques avec
la membrane de silice tout en laissant passer le liquide à travers. La colonne NucleoSpin
contient une résine échangeuse d’anions, formée d’un gel de silice macroporeux associé à un
ligand hydrophile qui lie spécifiquement les acides nucléiques. La colonne a été lavée avec
350 µl de MDB (Guanidinium thiocyanate) et centrifugée à nouveau à 11 000 g pendant 1 min
pour désaliniser la membrane de silice. Un mélange réactionnel de la rDNase (10 µl de rDNase
+ 90 µl de tampon de réaction pour la rDNase) a été ajouté à la membrane de silice pour digérer
l’ADN génomique résiduel. L’ensemble a été incubé pendant 15 min à température ambiante.
Un lavage de la colonne de silice avec 200 μl du tampon RAW2 (Guanidine hydrochloride) et
une centrifugation à 11 000 g pendant 30 s permettent d’inactiver la rDNase. La colonne a été
ensuite lavée deux fois de suite avec 600 μl et 250 μl du tampon de lavage RA3 pour débarrasser
l’ARN de toutes impuretés. L’ARN fixé sur la colonne a été élué avec 60 µl d’eau ultrapure par
une centrifugation à 11 000 g pendant 1 min. Les échantillons ont été conservés à -20°C.

26
3.3.3. Contrôle de la qualité de l’ARN

Le degré de contamination des extraits d’ARN en protéines a été évalué en utilisant le rapport
R = (Abs 260 - Abs 230) / (Abs 280 - Abs 230) obtenu grâce au spectrophotomètre Anthelie
Advanced II (Secomam, France). La moyenne des rapports des échantillons est de 2,05 ± 0,05
avec la méthode d’extraction sur colonne de silice. Ces valeurs témoignent de la pureté et de
l’absence de traces de composés aromatiques (phénol) ou organiques dans les extraits d’ARN.

L’intégrité des ARN a été évaluée par une électrophorèse sur gel d’agarose 2 %. La taille
des différentes sous-unités de l’ARN végétal (ARNr 25S, ARNr 18S, ARNt, et ARNr
chloroplastique) a été confirmée par une comparaison aux bandes du marqueur de taille
moléculaire, le SmartLadder (Eurogentex). Un minigel a été préparé avec 1,5 g d’agarose,
75 mL de TBE et 2,5 μl de BET (0,5 mg/µl). Le gel a été placé dans une cuve d’électrophorèse
remplie de tampon TBE (0,5 X). Un mélange constitué par 3 μl d’extraits d’ARN de chaque
échantillon et 7 μl de Bleu de Bromophénol (1X) a été ensuite déposé sur le gel. La migration
a été réalisée à 100 Volts pendant 30 min à l’aide d’un générateur EPS 300 (Pharmacia
Biotech). Après migration, les sous-unités de l’ARN ont été visualisées sous lumière UV.

3.3.4. Transcription inverse des ARN messager

À la suite des résultats de contrôle de la qualité des extraits d’ARN, les échantillons ont été
aliquotés à la même concentration de 2 µg dans un volume de 15 µl. La transcription inverse
de l’ARNm en ADNc a été réalisée avec le kit de transcription inverse d’Euromedex (M-MLV
RT RNase H Minus DNA Polymérase, Strasbourg, France) à partir de 2 µg d’ARN et de 1 µl
d’amorces oligo dT18 (10 µM). Ce premier mélange a été incubé à 70°C pendant 10 min dans
un thermocycleur. Un deuxième mélange constitué par 2,5 µl de dNTPs (250 µM), 10 µl de 5x
RT buffer 1 (avec MgCl2 et DTT, 0,25 M Tris-HCI, 0,5 M KCI, 30 MgC12), 0,5 μl de RNase
inhibitor (20 U) et 1 µl de M-MLV RT RNase H Minus DNA Polymérase 4 U/µl a été ensuite
ajouté au premier mélange. La synthèse d’ADNc a été réalisée à 37°C pendant 60 min. Une
dénaturation thermique a été réalisée à 95°C pendant 5 min afin de détruire l’ARN résiduel.
Les échantillons d’ADNc obtenus ont été ajustés à 200 µl (dilués 4 fois) et conservés à -20°C.

3.3.5. Design et Optimisation des amorces de qPCR

Le design des amorces constitue une étape importante pour empêcher le phénomène
d’hybridation non spécifique qui survient au cours de la PCR. Deux gènes de tolérance,
LEA D34 et RPM1, les plus fortement exprimés respectivement en condition de sécheresse et
de stress thermique ont été utilisés dans cette étude sur la base de résultats obtenus par

27
microarray chez diverses variétés de sorgho (Johnson et al., 2014). Pour la normalisation des
données RT-qPCR, cinq gènes de référence (MACP, EF-P, MDH, PP2A et PP2C) les plus
stables en condition de stress hydrique ont été aussi choisis (Reddy et al., 2016). Les amorces
de ces gènes ont été conçues avec le logiciel Primer3 (Primer3 Input, version 0.4.0). Les
séquences des amorces ont été synthétisées par la compagnie IDT (Integrated DNA
Technologies, Belgique). Les paramètres du design des amorces ont été définis comme suit
(Untergasser et al., 2012) : 56-62°C température d’hybridation, 20-22 pb longueur des
amorces, 45-55 % teneurs en GC, et 90 à 150 pb longueur des amplifiats (Tableau 3).

Pour évaluer l’efficacité de la RT-qPCR, six échantillons d’ADNc dilués en série (100 ; 50 ;
25 ; 12,5 ; 6,25 ; 3,125 ng) ont été utilisés comme matrices pour la construction de la courbe
d’étalonnage (Figure 6). Après l’amplification des échantillons, les logarithmes des
concentrations ont été tracés par rapport aux valeurs de Cq de l’échantillon correspondant. Les
conditions de réaction ont été optimisées afin d’obtenir une efficacité de réaction optimale. Le
coefficient de corrélation (R2), la pente (p) et l’efficacité (E) de la réaction PCR ont été calculés
à partir de la courbe standard. Afin de confirmer la spécificité des paires d’amorces et la taille
des amplifiats, une électrophorèse sur gel d’agarose (1,5 %) a été aussi réalisée (Figure 5).

L’identité du ou des amplifiats a été déterminée à la fin de la réaction RT-qPCR grâce aux
profils de fusions de ces derniers. Post-amplification, un gradient de température (2,2°C/s) entre
65 et 95°C a été programmé. À mesure que la température augmente, les doubles brins d’ADN
se séparent. Le colorant SYBR Green I présente une fluorescence lorsqu’il est en contact avec
l’ADNdb. Cette fluorescence diminue quand les brins de la double hélice se séparent. Un point
d’inflexion est obtenu lorsque 50 % des produits dans la réaction PCR sont dénaturés. Ce point
d’inflexion ou pic observé dans la courbe de fusion est spécifique à chaque séquence d’ADN
amplifiée. La dérivée primaire négative du signal (en unité de fluorescence relative = RFU) sur
la dérivée de la température (-dRFU/dT) permet d’obtenir une courbe en cloche. L’abscisse du
maximum représente la température de fusion (Tm) du produit PCR (50 % des produits sous
forme dénaturée). Cette température médiane dépend de la taille et de la séquence du produit
PCR, et est un marqueur de celle-ci dans une condition expérimentale donnée.

3.3.6. Analyse de l’expression des gènes par RT-PCR quantitative en temps réel

Après l’optimisation et la validation de toutes les conditions requises par les MIQE, la RT-
qPCR a été utilisée pour quantifier le changement du niveau d’expression des gènes LEA D34
et RPM1. Le gène de référence PP2A, le plus stable en condition de stress hydrique, a été utilisé
pour normaliser les données et pour éviter tout biais dans les calculs. Un seul gène de référence

28
a été utilisé ici en raison des triplicatas techniques des échantillons. L’expression du gène cible
a été déterminée en utilisant la méthode du ΔΔCq avec correction de l’efficacité (Équation 4).

Les réactions de la RT-qPCR ont été réalisées en utilisant un LightCycler™ (Roche


Diagnostics GmbH, Basel, Suisse), des plaques qPCR en polypropylène optique
(LightCycler 480 multiwell plate 96 white, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne),
scellées avec un film d’étanchéité ultra-claire. Les réactions RT-qPCR ont été réalisées dans un
volume total de 10 µl contenant 5 µl de SYBR Green I Master (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Allemagne), 2 µl d’ADNc dilué, 400 nM (0,4 µl) de chaque amorce et de l’eau
ultrapure. Après une phase de dénaturation initiale à 95°C pendant 5 min, 45 cycles
d’amplification ont été réalisés, comprenant chacun une étape de dénaturation à 95°C pendant
20 s, une étape d’hybridation des amorces à 56°C pendant 15 s, et une étape d’amplification à
72°C pendant 20 s. A chaque fin de cycle, un signal fluorescent a été enregistré. Un programme
de dissociation ou cycle de fusion a été réalisé post-amplification, constitué par une
dénaturation à 95°C pendant 15 s, puis une hybridation à 65°C pendant 15 s et une montée
progressive de la température de 65°C à 95°C à raison de 2,2°C/s.

3.3.7. Analyses statistiques

L’acquisition des données de fluorescence (Cq) a été réalisée avec le logiciel du LightCycler
(version 1.1.0.1320, Roche Diagnostics International Ltd, Zoug, Suisse). Les analyses
statistiques des données ont été réalisées avec le logiciel Prism® (GraphPad Software,
version 7.00, 2017, Inc., La Jolla, CA, USA). Les tests de Wilcoxon et de Tukey ont été utilisés
pour les analyses de variance et les comparaisons de moyennes de ratios. Ensuite, les
corrélations linéaires ont été évaluées avec le test de rang de Spearman. L’agrément entre deux
dosages a été estimé avec la méthode de Bland-Altman par la comparaison de ratios.

3.4. Identification des gènes mutés et méthode d’analyse des séquences

Le séquençage des mutants a été réalisé selon la méthode décrite par Krothapalli et al. (2013)
à l’Université de Purdue. Les données issues du séquençage des mutants contiennent diverses
informations sur les génotypes à savoir, les noms des gènes candidats mutés, la localisation des
mutations sur les chromosomes, l’impact des mutations sur la synthèse des protéines, et les
changements de codon associés. Les séquences des transcrits dans le génome du sorgho ont été
annotées en analogie avec celles déjà connues chez Arabidopsis thaliana et Zea mays (Mofini,
2015). Des études comparatives par alignement de séquences (BLAST) ont été réalisées pour
connaitre la fonction putative des gènes candidats. Enfin, les séquences homologues de ces
transcrits ont été extraites à partir du NCBI et des bases de données de Phytozome.

29
RÉSULTATS
1. Analyses de la variabilité des paramètres agro-morphologiques et physiologiques

Dans les conditions expérimentales au champ, quel que soit le régime hydrique considéré,
aucun plant du mutant SbEMS 0453 n’a atteint le stade de développement 5 feuilles. Un faible
nombre de plants levés est aussi observé dans les petites parcelles de l’essai où les graines de ce
mutant sont semées. Par conséquent, le mutant SbEMS 0453 n’a pas été pris en compte dans le
traitement des données. La richesse chimique des sols Dior qui se situe à un niveau très bas pour
tous les éléments ; la carence la plus accusée est celle du phosphore, serait à l’origine de la faible
levée de SbEMS 0453. À cela s’ajoutent la forte irrigation effectuée la veille du semis et le
complexe absorbant qui pourraient augmenter l’acidité du sol (Charreau et Fauck, 1965).

Le tableau 1 présente les résultats de l’analyse de variance des paramètres agro-


morphologiques et physiologiques en conditions irrigués (ETM) et de stress hydrique (STR). Un
effet significatif du stress hydrique est observé sur la majorité des variables agro-morphologiques
et physiologiques étudiées (NFT, HP, DSL, DSEPI, DSFLO, Rdt, PMG, Fv/Fm1, Fv/Fm2,
Fv/Fm3, SPAD2, SPAD3, Thermo2 et Thermo3), excepté pour SPAD1 et Thermo1. En effet, les
mesures de la teneur en chlorophylle (SPAD1) et de la température des feuilles (Thermo1) à T0
sont effectuées avant l’établissement du stress hydrique. L’étude montre aussi une grande
variabilité dans la réponse des lignées de sorgho en condition de déficit hydrique pour tous les
paramètres agro-morphologiques (HP, DSL, DSEPI, DSFLO, Rdt et PMG) et pour la plupart des
paramètres physiologiques (Fv/Fm1, SPAD2, SPAD3, Thermo1, Thermo2, Thermo3). À
contrario, aucune variation significative n’est observée pour les mesures du rendement quantique
maximum de la photochimie du PSII (Fv/Fm2, Fv/Fm3) chez les lignées pendant le stress
hydrique (P > 0,05). Une interaction significative entre lignée et régime hydrique (Lg x Rh) est
observée pour tous les paramètres agro-morphologiques et physiologiques mesurés pendant la
contrainte hydrique, suggérant des réponses différentes des génotypes en condition de sécheresse.
La hauteur de la plante à la floraison (HP), la durée semi-levée (DSL), le rendement en grains
(Rdt) et le poids de mille grains (PMG) ont présenté les plus grandes valeurs de coefficient de
variation (CV en %). Une valeur élevée de CV traduit une grande diversité de la collection de
mutants EMS de sorgho.

30
Tableau 1 : Analyse de variance des paramètres agro-morphologiques et physiologiques des plants de
sorgho en condition irriguée (ETM) et en condition de stress hydrique (STR)

Source de
SPAD1 SPAD2 SPAD3 Thermo1 Thermo2 Thermo3 Fv/Fm1 Fv/Fm2 Fv/Fm3 NFT HP DSL DSEPI DSFLO Rdt PMG
Variation

Min 30,1 41,03 33,5 28,9 28,87 31,27 0,48 0,498 0,51 13 48,33 5 54 59 10,43 9,18

Moyenne 44,35 48,48 44,56 30,9 33,36 34,98 0,76 0,74 0,76 17,82 78,42 9,16 64,96 70,77 320,2 20,08

Max 53,1 56,93 54,67 34 48 41,67 0,82 0,8 0,82 21 145,33 16 77 84 1391,3 32,19

CV (%) 9,9 8,15 12,1 3,78 10,2 6,57 11,04 9,87 6,20 11,26 27,54 39,10 8,24 9,13 97,34 28,38

Écart-type 4,39 3,95 5,39 1,17 3,4 2,3 0,08 0,07 0,05 2,01 21,6 3 583 5,36 6,46 311,68 5,7

R2 0,36 NS 0,4* 0,67*** 0,63*** 0,3* 0,67*** 0,64*** 0,28** 0,11* 0,55*** 0,75*** 0,84*** 0,8*** 0,89*** 0,45** 0,79***

Lignées (Lg) 1,18 NS 2,41* 0,47*** 4,14** 1,83* 1,28*** 6,175*** 0,69 NS 0,68 NS 1,03 NS 8,3*** 27,78*** 15,29*** 29,31*** 2,53* 9,75***

Blocs 2,03 NS 1,57 NS 7,29** 9,96*** 2,2 NS 1,11 NS 1,26 NS 3,57* 0,48 NS 1,09 NS 3,29* 2,06 NS 1,76 NS 0,86 NS 1,45 NS 1,73 NS

Régime
0,28 NS 8,43** 69,82*** 10,6 NS 9,52** 80,53*** 4,6* 8,66** 6,73* 45,54*** 70,85*** 0,19 NS 73,1*** 137,18*** 11,81** 88,61***
hydrique (Rh)

* * *** *** NS *** *** NS NS * * *** *** *** * ***


Lg x Rh

ETM 42,54a 49,86a 48,274a 30,68b 32,20b 33,34b 0,76a 0,77a 0,78a 19,0a 89,21a 9,6a 62,3b 67,3b 401,15a 23,36a

STR 44,48a 46,62b 40,82b 31,33a 34,87a 36,53a 0,70b 0,72b 0,75a 16,5b 64,46b 9,8a 68,26a 74,9a 173,02b 15,99b

ETM : en condition irriguée ; STR : en condition de stress hydrique.


SPAD1 : mesure de la teneur en chlorophylle à 30 JAS ;
SPAD2 : mesure de la teneur en chlorophylle à 45 JAS ;
SPAD3 : mesure de la teneur en chlorophylle à 60 JAS ;
Thermo1 : Température foliaire à 30 JAS ;
Thermo2 : Température foliaire à 45 JAS ;
Thermo3 : Température foliaire à 60 JAS ;
Fv/Fm1 : la fluorescence chlorophyllienne à 30 JAS ;
Fv/Fm2 : la fluorescence chlorophyllienne à 45 JAS ;
Fv/Fm3 : la fluorescence chlorophyllienne à 60 JAS ;
NFT : Nombre de feuilles total ; HP : Hauteur de la plante ;
DSEPI : Durée semi-épiaison ; DSL : Durée semi-levée ; DSFLO : Durée semi-floraison ;
Rdt : Rendement (en g/m2) ; PMG : Poids de Mille Grains.
* P < 0,05 ; ** P < 0,001 ; *** P <0,000 1 ; NS : non significatif (P> 0,05).

31
2. Corrélation entre les paramètres agro-morphologiques et physiologiques

Le Tableau 2 montre les corrélations réalisées entre variables agro-morphologiques et


physiologiques dans les deux traitements hydriques. Les variables phénologiques (DSL, DSEPI,
DSFLO) sont positivement corrélées entre elles en ETM comme en STR. En effet, les fortes
corrélations entre les variables d’une même famille sont dues au fait que la seconde variable est
calculée à partir de la première. Par contre, la corrélation entre la hauteur de la plante (HP) et le
nombre de feuilles total (NFT) n’est pas significative en ETM et en STR. Le rendement (Rdt) a
montré une corrélation modérée, mais significative avec le poids de mille grains (PMG) avec des
coefficients de corrélation variant de 0,40 en ETM et de 0,48 en STR.

L’étude des relations entre variables de groupes différents a révélé une forte corrélation entre
les variables de la phénologie (DSEPI et DSFLO) et les composantes du rendement (Rdt et PMG)
en condition irriguée. Cependant, les relations entre les variables de la phénologie et les
composantes du rendement diminuent fortement en condition de stress hydrique. Dans ce cas,
une durée du cycle de développement plus longue des plants de sorgho constitue une stratégie
d’adaptation à la sécheresse. La hauteur de la plante (HP) a montré une corrélation négative avec
les variables phénologiques (DSEPI et DSFLO). La corrélation entre la hauteur des plants et les
variables phénologiques est significative uniquement chez les plantes bien irriguées.

Tableau 2 : Corrélations entre les variables étudiées en condition irriguée (ETM) et en condition
de stress hydrique (STR)
Variables DSEPI Fv/Fm1 Fv/Fm2 Fv/Fm3 DSFLO HP DSL NFT PMG Rdt SPAD1 SPAD2 SPAD3 Thermo1 Thermo2

ETM Fv/Fm1 -0,46 *


Fv/Fm2 0,22 0,15
Fv/Fm3 -0,1 0,05 0,05
DSFLO 0,92 *** -0,60 ** 0,09 -0,25
HP -0,54 * 0,30 0,18 0,14 -0,54 *
DSL 0,58 ** -0,57 ** -0,01 -0,42 0,78 *** -0,4
NFT 0,04 -0,28 -0,14 0,29 0,12 -0,19 0,15
PMG -0,49 * 0,28 -0,27 0,40 -0,62 ** 0,41 -0,78 *** 0,06
Rdt -0,58 ** 0,24 -0,14 0,04 -0,57 ** 0,60 ** -0,41 -0,14 0,4
SPAD1 -0,04 0,53 * -0,05 0,21 -0,21 0,08 -0,36 0,21 0,37 0,19
SPAD2 -0,28 0,13 -0,06 -0,39 -0,31 -0,18 -0,21 0,05 0,11 0,1 -0,01
SPAD3 -0,57 ** -0,12 -0,40 0,28 -0,55 ** 0,04 -0,46 * 0,14 0,4 0,36 -0,18 0,37
Thermo1 0,57 ** -0,29 0,20 -0,31 0,69 *** -0,42 0,60 ** 0,19 -0,41 -0,62 ** -0,21 -0,18 -0,63
Thermo2 0,45 * -0,38 -0,13 0,16 0,45 * -0,16 0,50 * -0,10 -0,4 -0,33 -0,21 -0,54 * -0,22 0,03
Thermo3 0,02 0,13 -0,01 -0,34 0,04 -0,12 0,11 0,11 -0,03 -0,40 0,04 0,40 -0,03 0,13 -0,24

STR Fv/Fm1 -0,71 ***


Fv/Fm2 0,15 -0,29
Fv/Fm3 -0,01 -0,13 0,59 **
DSFLO 0,97 *** -0,72 *** 0,14 -0,09
HP -0,41 0,34 0,04 -0,01 -0,33
DSL 0,73 *** -0,58 ** -0,16 -0,46 0,78 *** -0,22
NFT -0,07 -0,46 * 0,42 0,23 -0,05 0,34 0,07
PMG -0,44 0,53 * -0,01 0,34 -0,43 0,16 -0,58 ** -0,32
Rdt -0,33 0,20 0,24 0,33 -0,23 0,45 -0,33 0,24 0,48 *
SPAD1 -0,27 0,47 * -0,28 0,01 -0,34 -0,08 -0,25 -0,24 0,41 -0,07
SPAD2 -0,57 * 0,33 -0,39 -0,32 -0,52 * 0,42 -0,22 0,05 0,16 0,07 0,27
SPAD3 0,20 -0,14 0,07 0,04 0,23 0,22 0,05 0,09 -0,26 0,03 -0,23 -0,14
Thermo1 0,46 * -0,35 -0,01 -0,17 0,49 * -0,04 0,52 * 0,05 -0,60 ** -0,25 -0,57 * -0,41 0,16
Thermo2 0,33 0,24 -0,16 -0,29 0,35 -0,13 0,37 -0,47 * 0,07 -0,15 0,24 -0,30 -0,24 0,29
Thermo3 -0,34 0,61 ** -0,04 -0,01 -0,45 -0,05 -0,47 * -0,37 0,28 -0,03 0,40 -0,09 -0,42 -0,16 0,30

*** : La corrélation est significative au seuil de 0,001 ; ** : La corrélation est significative au seuil de 0,01 ;
* : La corrélation est significative au seuil de 0,05. Légende : voir tableau 1.

32
3. Analyse en composantes principales (ACP)

À la suite de ces analyses préliminaires, les variables agro-morphologiques et physiologiques


les plus pertinentes (DSFLO, Rdt, PMG, SPAD1, SPAD2, SPAD3, Fv/Fm1, Fv/Fm2, Thermo1
et Thermo3) sont retenues pour la structuration de la variabilité des lignées par une analyse en
composantes principales (ACP). En effet, les variables fortement corrélées entre elles apportent
les mêmes informations. Ce choix est effectué pour éviter les redondances. Les trois premiers
axes de l’ACP expliquent 87,98 % de la variation observée (Figure 4).

L’axe 1 absorbe 50,98 % de la variabilité des paramètres agro-morphologiques et


physiologiques. Les principales variables qui participent à la composition de cet axe sont
notamment : la teneur en chlorophylle à 30 JAS (SPAD1, 37,9 %), la teneur en chlorophylle à
45 JAS (SPAD2, 21,1 %), le rendement (Rdt, 37,1 %) et le poids de mille grains (PMG, 41,7 %).
Cet axe oppose les mutants, SbEMS 2571 et SbEMS 2660, qui accumulent de fortes teneurs en
chlorophylle et de meilleurs rendements, aux mutants SbEMS 0753 et SbEMS 4602 avec des
teneurs en chlorophylle plus faibles et des rendements médiocres en condition de stress hydrique
préfloral (Figure 4).

L’axe 2 explique 22,37 % de l’inertie. La seule variable située sur cet axe est la fluorescence
chlorophyllienne à 45 JAS (Fv/Fm2, 61,8 %). Le mutant SbEMS 3514, situé sur la partie
négative de l’axe 2, présente donc le rendement quantique maximum de la photochimie du PSII
(Fv/Fm2) le plus faible par rapport aux autres génotypes après 45 JAS.

L’axe trois (3) représente 14,63 % de la variabilité. Il est défini par la teneur en chlorophylle
à 30 JAS (SPAD1, 29,2 %) et la teneur en chlorophylle à 60 JAS (SPAD3, 79,8 %). Les
génotypes situés sur cet axe accumulent de fortes teneurs en chlorophylle même 30 jours après
arrêt de l’irrigation.

4. Structuration de la diversité phénotypique

La collection de mutants EMS sorgho montre une très grande dispersion des lignées sur le
graphique de l’ACP. Cette dispersion confirme la grande diversité phénotypique des mutants.
Les génotypes de cette collection peuvent être classés en trois groupes en fonction de leur
capacité à répondre aux effets du déficit hydrique (Figure 4) :

- le premier groupe est situé du côté positif de l’axe 1 de l’ACP. Ce groupe renferme deux
mutants, SbEMS 2571 et SbEMS 2660, et les deux témoins internationaux, B35 et
Tx7000. Les génotypes de ce groupe sont capables de tolérer un déficit hydrique préfloral
en prolongeant leur croissance et en ralentissant leur métabolisme. Ils présentent une

33
durée du semis à la floraison inférieure à 69 jours, un rendement potentiel supérieur, un
bon remplissage des grains et une faible variation de la teneur en chlorophylle en
condition de stress hydriques (STR) ;
- le deuxième groupe s’oppose au premier groupe sur l’axe 1. Ce groupe contient trois
mutants, SbEMS 0753, SbEMS 4602 et SbEMS 4848, qui sont sensibles au déficit
hydrique. Ces génotypes enregistrent les composantes du rendement les plus faibles et un
cycle de développement très tardif en condition de stress hydrique ;
- le troisième groupe rassemble les mutants SbEMS 0700 et SbEMS 3514, qui sont situés
tout au long de l’axe 2. Les individus de ce groupe sont caractérisés par un cycle de
développement semi-tardif et des composantes du rendement qui baissent fortement en
condition de contrainte hydrique (STR). Le mutant SbEMS 3514, situe du côté négatif de
l’axe 2, présente un rapport Fv/Fm très faible après 45 JAS. La sénescence des feuilles
de SbEMS 3514 très forte au même moment pourrait expliquer cette situation.

Biplot (axes F1 et F2 : 73,36 %)


5

4 Fv/Fm2

3 SbEMS 4848

2
Tx7000
Rmdt
F2 (22,37 %)

1
SbEMS 4602 SbEMS 0700 SPAD3 SbEMS 2571
Fv/Fm1
0
DSFLO SPAD1
SbEMS 2660
-1 B35
SbEMS 0753 PMG

-2 Thermo1
SbEMS 3514 Thermo3
-3
SPAD2
-4
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
F1 (50,98 %)
variables actives observations actives

Figure 4 : Répartition des génotypes de sorgho sur le plan 1x2 défini par l’ACP

34
5. Analyse de l’expression des gènes par RT-qPCR

Quatre mutants de sorgho (SbEMS 4848, SbEMS 0753, SbEMS 3514 et SbEMS 2660) ainsi
que le témoin B35 sont sélectionnés pour l’analyse de l’expression des gènes de tolérance à la
sécheresse par RT-qPCR. Ces génotypes présentent des caractéristiques agro-morphologiques et
physiologiques contrastées en condition de stress hydrique.

5.1. Confirmation de la taille des amplifiats par électrophorèse sur gel d’agarose

Une électrophorèse sur un gel d’agarose 2 % est utilisée pour vérifier la taille des amplifiats
et confirmer les prédictions faites in silico. Des paires d’amorces pour deux gènes de tolérance
et cinq gènes de référence sont utilisées pour l’amplification par PCR quantitative d’ADNc de
sorgho (Figure 5). La photo du gel d’agarose montre des produits PCR uniques pour toutes les
paires d’amorces utilisées. La comparaison des bandes obtenues avec le marqueur de taille
moléculaire Smart Ladder permet de confirmer la taille attendue pour chaque amplifiat.

1- SmartLadder
2- PP2A
3- MACP
4- EF-P
5- MDH
6- PP2C
7- LEA D34
8- RPM1

Figure 5 : Profil d’amplification des produits PCR de 07 gènes chez le sorgho

5.2. Courbe standard et Efficacité de la PCR

La RT-qPCR permet d’obtenir des précisions sur l’efficacité de la PCR pour chaque paire
d’amorces. Les caractéristiques des paires d’amorces utilisées dans cette étude sont listées au
tableau 3. Les efficacités d’amplification (E) des gènes varient de 90 % (MDH) à 101 % (PP2C).
Une efficacité de 100 % signifie que le modèle d’amplification double après chaque cycle
d’amplification pendant la phase exponentielle. Les coefficients de régression (R2) varient quant
à elles de 0,979 (PP2C) à 0,999 (MDH). Une forte corrélation linéaire existe donc entre les points
de chaque courbe standard (Figure 6).

35
Tableau 3: Caractéristiques des couples d’amorces RT-qPCR

Numéro Longueur des Tm


Nom Nom du gène Fonction cellulaire Amorces 5’P – 3’OH R2 E (%)
d’accession amplicons (Pb) (◦C)

Biosynthèses d’acide GCATTGAGAACATCGGGGCTT


MACP Malonyl CoA-Acyl XM_002465363
gras 0,999 95 139 80,8
Carrier protein
ATGAGTGGAAACTTCGTTCCA

Synthèses de liaison TGAAGCGGGTGAGAAGATTGT


EF-P Elongation Factor P XM_002463651
peptidique 0,983 93 114 79,4
AGCCAAATCATACTCGCCCA

Gluconéogenèse et TGCAGTGGTGGTGAATGGAA
MDH Malate dehydrogenase XM_002467034
cycle de l’acide citrique 0,999 90 103 83,6
GCGTCTTCTCTTCCGACAGC

Contrôle la AACCCGCAAAACCCCAGACTA
PP2A Serine/threonine – Protein XM_002453490
dephosphorylation 0,997 99 138 81,2
Phosphatase
TACAGGTCGGGCTCATGGAAC

GTAACCCTTCCCGCGAAATCC
PP2C Protein Phosphatase 2C XM_002468507 Transduction du signal
0,979 101 140 84,2
GCGCTACACTTTGCTGCTTTT

Protection des
GCGCGTCCGCTATATAATGT
LEA D34 Late Embryogenesis XM_002467155 structures
0,981 99 123 87,4
Abundant Protein D-34 cytoplasmiques
CTTGCTGCTGTTGCTGTCTC

Interactions TGAGGAAGCTTGGGGTAATG
RPM1 Protéine de Résistance à XM_002463095 intramoléculaires
Pseudomonas syringae pv. 0,983 96 119 80,4
régulatrices CCCATAAGGACGCCAAAGTA
Maculicola 1

5.3. Analyse des courbes de fusion

La figure 7 montre les courbes de dissociation obtenues lors de la séparation de l’ADN double
brin. L’analyse des courbes de fusion montre un seul pic sur tous les profils. Les températures de
fusion (Tm) obtenues sont spécifiques à chaque paire d’amorces amplifiée. En plus, aucun pic
n’est visible pour le contrôle négatif dans les profils de fusion. Ce qui indique l’absence de
produits contaminants dans les réactions (Figure 7).

5.4. Etude de la régulation de l’expression des gènes LEA D34 et RPM1 chez le sorgho en
condition de stress hydrique

Des différences majeures sont observées dans l’expression relative des gènes LEA D34 et
RPM1 dans les feuilles des génotypes de sorgho en condition de stress hydrique. Les résultats
obtenus indiquent que les plants de sorgho tolérants à la sécheresse présentent les plus hauts
niveaux d’accumulation des transcrits de LEA D34 et RPM1. À l’inverse, l’accumulation des
transcrits de LEA D34 et RPM1 est très faible chez les génotypes de sorgho sensibles au déficit
hydrique, d’après les résultats de la caractérisation de traits agro-morphologiques et
physiologiques au champ (Figure 8).

36
Les résultats RT-qPCR montrent une forte augmentation des transcrits du gène LEA D34 dans
les feuilles des génotypes SbEMS 2660, SbEMS 3514 et B35 en réponse au stress hydrique par
rapport aux plantes témoins (Figure 8A). Dans les feuilles du mutant SbEMS 2660, l’expression
de LEA D34 augmente significativement avec des ratios de 6,19 à T1 et 3,04 à T2 par rapport
aux plantes témoins à T0. Le mutant SbEMS 2660 parvient donc à maintenir une hausse
significative des niveaux d’expression de LEA D34 à un ratio supérieur 2 pendant toute la durée
de l’application du stress hydrique. Les niveaux d’accumulation des transcrits du gène LEA D34
les plus élevés sont observés chez le témoin B35 après 15 jours de stress hydrique (T1) avec un
ratio de 21,4. Après 30 jours de stress hydrique (T2), l’accumulation de ces transcrits diminue
jusqu’à des niveaux très faibles chez B35. Chez le mutant SbEMS 3514, les transcrits de
LEA D34 sont également accumulés très significativement seulement 30 jours après l’arrêt de
l’irrigation (T2). L’expression de LEA D34 est régulée à la hausse par le stress hydrique plus de
7,24 fois par rapport à ses plantes témoins. Par ailleurs, aucune régulation de l’expression de
LEA D34 n’est observée après 15 jours de déficit hydrique chez SbEMS 3514. Dans les feuilles
des mutants SbEMS 4848 et SbEMS 0753, sensibles au stress hydrique, l’expression du gène
LEA D34 n’est pas régulée en réponse à la sécheresse.

RPM1 (gène de tolérance aux fortes températures) et LEA D34 (gène de tolérance à la
sécheresse) présentent les mêmes profils d’expression dans les feuilles des différents génotypes
de sorgho (Figure 8B). Toutefois, les niveaux d’accumulation des transcrits de RPM1 sont plus
faibles que ceux de LEA D34 dans les feuilles des génotypes. Chez les plantes en condition de
stress hydrique, la régulation significative de l’expression du gène RPM1 est observée seulement
dans les feuilles des plants de sorgho tolérants à la sécheresse. Par rapport aux plantes témoins
bien irriguées, l’accumulation des transcrits de RPM1 augmente significativement chez le
témoin B35 et le mutant SbEMS 2660 après 15 jours de stress hydrique (T1), respectivement
avec des ratios de 7,7 et 2,5. Après 30 jours de stress hydrique (T2), l’accumulation de ces
transcrits diminue très fortement dans les feuilles de B35 et SbEMS 2660. Chez le mutant
SbEMS 3514, l’expression du gène RPM1 est régulée à la hausse significativement par le stress
hydrique 30 jours après l’arrêt de l’irrigation (T2). Alors que 15 jours après arrêt (T1), aucune
accumulation significative des transcrits de RPM1 n’est décelée dans les feuilles de
SbEMS 3514. Par contre, l’expression de RPM1 dans les feuilles des mutants SbEMS 4848 et
SbEMS 0753 n’est pas régulée par le stress hydrique 30 jours après arrêt de l’irrigation.

37
Figure 6 : Courbes d'étalonnage : Cq = f (Log concentration).

Droite obtenue par dilutions en série d’un pool d’ADNc après PCR quantitative en temps réel. Les valeurs
de Cq obtenues sont reportées en fonction des logarithmes des concentrations du standard. L’efficacité
(E) de la PCR est calculée à partir de la courbe.

38
Figure 7 : Courbes de dissociation des produits amplifiés de 07 gènes.
Représentant de la dérivée première négative de la fluorescence en fonction de la dérivée de la
température (-dF/dT) en fonction de la température.

39
Figure 8 : Profils d’expression des gènes LEA D34 et RPM1 à trois (3) dates du stress hydrique
(T0, T1, T2) dans les feuilles des plants de sorgho.
Les données statistiques sont constituées par la moyenne ± l’erreur standard (SD) de trois répétitions.
Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives (P <0,05) entre les plantes témoins
(ETM) et stressées (STR).
T0 : 0 jour après l’arrêt de l’irrigation ; T1 : 15e jour après l’arrêt de l’irrigation ;
T2 : 30e jour après l’arrêt de l’irrigation.
* P < 0,05 ; ** P < 0,001 ; *** P > 0,000 1 ; **** P <0,000 1.

40
6. Identification des gènes candidats mutés impliqués dans la tolérance à la sécheresse

Le criblage des mutations sur les gènes candidats a permis d’identifier plusieurs variants d’un
même gène, y compris des insertions ou des pertes de nucléotides par « splice acceptor » ou
« splice donor » sur des exons. Certains variants induisent l’utilisation de sites d’épissage
alternatifs créant ainsi des protéines tronquées. Le phénotypage des mutants, les caractéristiques
des séquences de gènes mutés et leurs impacts sur la tolérance au déficit hydrique sont présentés
respectivement sur la figure 9 et les l’annexe 6 et 7.

L’analyse des séquences sur le génome du mutant SbEMS 4848 révèle la présence de 255
mutations ponctuelles. 11 mutations non-sens et 6 autres sur des sites d’épissage sur des gènes
candidats provoquent la perte de fonction des protéines correspondantes. 237 mutations faux-
sens qui présentent un impact modéré sur le développement de la plante sont aussi trouvées. Le
phénotype de SbEMS 4848 est par conséquent modifié.

Pareillement, 128 mutations sont trouvées dans le génome du mutant SbEMS 0753, dont 5
mutations non-sens, 8 mutations sur des sites d’épissage et 115 mutations faux-sens. L’analyse
des séquences de ce mutant montre la présence d’une mutation non-sens sur le gène
candidat RPM1 (Sb02g038425.1), marqueur de la tolérance aux fortes températures et utilisé
dans les analyses RT-qPCR (Figure 8B). Une substitution mononucléotidique de G vers A
intervient à la position 516, conduisant à un codon-stop prématuré (le codon tgG remplacé par le
codon-stop tgA). Cette mutation génère une protéine tronquée après la synthèse de l’acide
aminé W516* (Tryptophane, position 516). Le phénotype qui en résulte permet de définir la
fonction biologique de RPM1 en condition de stress hydrique.

Au total, 132 mutations sont également identifiées sur des séquences du mutant SbEMS 3514,
incluant 10 mutations non-sens et 4 mutations sur des sites d’épissage sur des gènes qui codent
essentiellement pour des sucres ou des transporteurs de sucres. Ces mutations entrainent un
phénotype mutant particulier qui est associé à la sénescence des feuilles de SbEMS 3514
(Figure 9).

Un faible nombre de mutations est observé sur le génome du mutant SbEMS 2660 (65
mutations). Par ailleurs, 3 mutations non-sens sont identifiées sur 3 variants du gène qui code
pour l’insulinase (Q282*, Q210*, Q282*), une enzyme dans la voie de biosynthèse de l’insuline.
Le rôle de ces protéines dans le phénotype de tolérance à la sécheresse pourrait être à l’étude
dans l’avenir.

41
Figure 9 : Phénotypes de plants de sorgho en condition de stress hydrique progressive.

42
DISCUSSION
1. Diversité agro-morphologique et physiologique des mutants EMS de sorgho

L’objectif de cette étude est d’évaluer la variabilité de quelques paramètres agro-


morphologiques et physiologiques en condition de stress hydrique préfloral chez des mutants
EMS de sorgho contrastés. Les résultats que nous avons obtenus indiquent des différences
significatives dans la réponse des différents génotypes de sorgho stressés. L’analyse de variance
révèle en effet un changement considérablement du comportement des génotypes en condition
de déficit hydrique préfloral pour la majorité des paramètres étudiés. Véritablement, une grande
variation du cycle, de la hauteur, des composantes du rendement, de la teneur en chlorophylle
et de la température foliaire est observée entre les plantes de sorgho stressées et les plantes bien
irriguées (Figueiredo et al., 2010 ; Sine, 2003).

En réponse au déficit hydrique préfloral, certains génotypes de sorgho allongent la durée de


leur cycle par un retard de l’initiation paniculaire (Tardieu et al., 2014). De plus, les fortes
corrélations significatives entre les variables phénologiques et les composantes du rendement
des plantes irriguées diminuent sensiblement chez les plantes en condition de stress hydrique.
Par conséquent, l’arrêt du développement des plantes au stade préfloral causé par le stress
hydrique affecte le remplissage des grains et entraine une baisse significative du rendement des
plantes de sorgho en condition de stress hydrique. Le rendement et ses composantes sont
déterminés pendant la période allant de l’initiation paniculaire à la floraison. En outre, ces
affirmations corroborent les résultats obtenus par Barro-Kondombo (2010). D’après cet auteur
les composantes du rendement et la durée du cycle de développement sont les paramètres les
plus importants pour la caractérisation des génotypes de sorgho. Parmi les paramètres de
croissance, la hauteur est la plus affectée par le stress hydrique puisque l’élongation des tiges
se déroule in extenso durant cette période préfloral. En effet, le stress hydrique préfloral entraine
une diminution de la hauteur des plants de sorgho. Ces résultats sont en accord avec ceux
obtenus chez le sorgho sucré par Tovignan et al. (2015). Ces auteurs ont mis en évidence la
liaison qui existe entre la hauteur des plants et les composantes du rendement. Ainsi, une
diminution de la hauteur provoque une baisse significative des composantes du rendement des
génotypes en condition de stress hydrique. Naturellement, les plantes de sorgho stressées,
comme SbEMS 2571 et SbEMS 2660, qui ont maintenu une taille sensiblement identique à
celle des plantes témoins bien irriguées présentent les meilleurs rendements (Olson et al., 2012).

Les génotypes de sorgho avec les températures foliaires les plus élevées pendant le stress
hydrique présentent en moyenne des valeurs de teneurs en chlorophylle les plus faibles et une

43
fluorescence chlorophyllienne moins importante dans les conditions de culture au champ. En
effet, la température foliaire est un bon indicateur de l’état de stress de la plante et de l’arrêt des
processus métaboliques. Ces résultats corroborent ceux obtenus par Fresneau et al. (2007) chez
le blé et Tezara et al. (2002) chez le tournesol. Ces auteurs ont montré qu’une augmentation de
la température des feuilles en condition de stress hydrique entraine un ralentissement de la
transpiration par une fermeture des stomates et une croissance des feuilles ralentie.

Ces résultats permettent de définir, sur le plan physiologique, une température foliaire
maximale en dessus de laquelle les plants de sorgho ne pourront plus tolérer les effets du stress
hydrique. Dans nos conditions expérimentales, ce seuil maximal est situé à 38°C chez le sorgho.
Cette hypothèse a été vérifiée notamment chez d’autres céréales. Lu et Zhang (1999) ont en
effet montré qu’une augmentation de la température foliaire supérieure à 35°C par le stress
hydrique occasionne une inactivation de l’appareil photosynthétique et une forte demande de
respiration chez le blé. Cependant, aucune différence significative dans le rapport Fv/Fm n’est
observée entre les plantes stressées et les plantes irriguées. Cousins et al. (2002) ont observé
que les indicateurs de fluorescence tels que le rapport fluorescence variable sur fluorescence
maximale (Fv/Fm) restent pratiquement inchangés chez le sorgho en condition de stress
hydrique. Cependant, les études concluantes menées par Baker et Rosenqvist (2004) ont révélé
que même une diminution mineure de la fluorescence des chlorophylles associée au PSII est
suffisante pour provoquer une régulation négative de la photosynthèse globale et diminuer le
gain total en carbone chez les plantes de sorgho en condition de stress hydrique. Comme le
montrent ces résultats, les mutants SbEMS 2571 et SbEMS 2660 qui présentent des
performances agro-morphologiques et physiologiques optimales en condition de stress
hydrique sont les plus tolérants à la sécheresse (Lin et Binns, 1988).

2. Expression des gènes (transcrits) en réponse à la contrainte hydrique

Cette étude a permis d’établir le profil d’expression des gènes LEA D34 et RPM1 dans les
tissus foliaires des plantes de sorgho. Les résultats que nous avons obtenus montrent une
régulation du niveau d’accumulation des transcrits de LEA D34 et RPM1 par le stress hydrique.
La comparaison des moyennes des ratios d’expression entre les plantes irriguées et les plantes
soumises à la sécheresse fournit également des informations sur la fonction des gènes. Le stress
hydrique entraine ainsi une augmentation hautement significative de l’expression des gènes
LEA D34 et RPM1 (hausse supérieure à 2) dans les feuilles des plantes de sorgho (SbEMS 2660,
SbEMS 3514 et B35) qui présentent une certaine tolérance à la sécheresse. Bartels et Sunkar
(2005) et Chaves et al. (2003) ont montré une accumulation des transcrits de LEA D34 à des
niveaux très élevés dans les feuilles des plantes en condition de déficit hydrique. Des études

44
transcriptomiques avec des puces à ADN effectuées chez des variétés de sorgho soumises à
différentes contraintes abiotiques indiquent que le gène RPM1 est différentiellement exprimé
dans les feuilles de sorgho uniquement en condition de stress thermique (Johnson et al., 2014).
Dans les conditions de culture au champ, RPM1 est vraisemblablement un gène candidat pour
la tolérance à la sécheresse chez le sorgho (Hubert et al., 2003).

Malgré les fortes accumulations des transcrits de LEA D34 (21 fois plus par rapport aux
témoins) et RPM1 (8 fois plus) dans les plantes de sorgho en réponse à la déshydratation, les
niveaux d’expression de ces gènes ne sont pas directement associés aux réponses
physiologiques à la sécheresse (Ramanjulu et Bartels, 2002). En effet, les génotypes avec des
ratios Fv/Fm et des teneurs en chlorophylle des feuilles comparables montrent de grandes
différences dans l’accumulation des transcrits de RPM1 et LEA D34 sous contrainte hydrique.
Les génotypes B35 et SbEMS 0753, avec respectivement les niveaux d’expression de LEA D34
et RPM1 les plus élevés (21 fois plus) et les plus faibles (5 fois moins que ses témoins),
présentent des rapports Fv/Fm et des teneurs en chlorophylle équivalentes sous déficit hydrique.
Par ailleurs, les températures foliaires supérieures à 38°C observées chez SbEMS 3514 et B35
coïncident avec les niveaux d’accumulation des transcrits de LEA D34 et RPM1 les plus faibles
pendant le stress hydrique. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Wang et al.
(2003). À des températures très élevées (supérieures à 38°C dans cette étude), les protéines
chaperonnes perdent leurs rôles de protection des structures cellulaire et de réparation des
dommages liés aux stress oxydatifs.

D’autre part, RPM1 et LEA D34 présentent des profils d’expression géniques similaires chez
les différents génotypes étudiés, malgré de plus fortes accumulations de transcrits notées pour
LEA D34. Ces résultats indiquent une forte corrélation dans l’expression de ces deux gènes de
tolérance à la sécheresse. Cette analyse suppose une co-expression de RPM1 et LEA D34 et une
interaction protéine-protéine par associations physiques ou fonctionnelles. Les travaux
effectués par Shirasu et Schulze-Lefert (2003) ont révélé qu’en condition de fortes températures
la protéine RPM1 s’associe avec la famille des protéines de choc thermique 90 (HSP90), grâce
à son domaine ATPase fonctionnel, et permet ainsi à HSP90 de retrouver une conformation
fonctionnelle. De la même manière, RPM1 pourrait aussi être une protéine co-chaperonne de
LEA D34 en condition de stress hydrique. Ces résultats permettent d’avancer l’hypothèse de
l’existence de réseaux d’interactions impliquant les protéines LEA D34 et RPM1 dans les voies
de signalisation de la tolérance à la sécheresse. Ces interactions entre protéines de tolérance à
la sécheresse et aux fortes températures consolident l’hypothèse de la coïncidence de plusieurs
types de stress dans les conditions de culture aux champs (Johnson et al., 2014).

45
3. Effets des mutations à haut impact sur l’adaptation à la sécheresse

La troisième partie de ce mémoire consiste en une analyse exhaustive des mutations non-
sens existantes dans la partie codante des gènes chez les mutants EMS sensibles à la sécheresse.
L’impact fonctionnel des mutations dans les séquences de gènes candidats a été étudié dans la
littérature par un lien génotype-phénotype. Ces études apportent des arguments majeurs pour
définir le caractère causal ou non d’une mutation et leurs impacts physiologiques.

Les séquences mutées chez SbEMS 0753 correspondent à des gènes qui codent : trois
marqueurs du stress hydrique, dont une protéine de résistance (RPM1) ; une protéine
phosphatase serine/thréonine (PBS1), et une protéine régulatrice F-box (OsFBX169). La
mutation non-sens (W516*) intervenue dans la séquence de RPM1, orthologue à AT3G07040.1
chez Arabidopsis thaliana, provoque la synthèse d’une protéine tronquée chez le mutant
SbEMS 0753. Cette mutation pourrait être à l’origine de la non-régulation de l’expression du
gène RPM1 par le stress hydrique comme le montre les résultats RT-qPCR. De plus, le
phénotype de SbEMS 0753 indique une grande sensibilité de SbEMS 0753 à la sécheresse. Ces
résultats confirment le rôle important de la protéine RPM1 dans les réseaux de signalisation
cellulaire de la tolérance à la sécheresse (McHale et al., 2006). RPM1 contient en effet des
domaines de liaison ATPase fonctionnels, NB-ARC et NB-LRR, qui sont des substrats
nécessaires au fonctionnement des autres protéines.

Le phénotype du mutant SbEMS 3514 est caractérisé par une sénescence de ses feuilles
apparente pendant toute la durée de son cycle de développement. Beaucoup de mutations non-
sens sont détectées suite au séquençage sur des gènes codants : un transporteur d’hexoses
(STP1) ; deux raffinose synthases, dont la glycosyltransférase non caractérisée et la
Méthyltransférase S-adénosyl-L-méthionine-dependents (SAMe) ; une protéine de la biogenèse
membranaire (OsTIL-2) ; une protéine de la biosynthèse des brassinostéroïdes
(cytochrome B561) ; quatre marqueurs du stress hydrique, dont une protéine de liaison (F-box),
une protéase à doigt de zinc (C3HC4-type RING finger), un facteur de transcription TFIIF et
une protéine phosphatase Serine/Thréonine. Les deux mutations non-sens intervenues sur deux
variants du gène STP1 (Q64* et Q31*) peuvent causer l’altération du transport des
osmoprotectants jusqu’au feuilles, et donc de la sénescence foliaire chez SbEMS 3514. En effet,
STP1 (homologue à AT1G11260 chez Arabidopsis thaliana) code pour une protéine
transporteur d’une large gamme d’hexoses et son expression augmente est fortement pendant
la nuit pour combler le manque d’activité photosynthétique, mais aussi pour accumuler des
réserves de glucose au début du déficit hydrique (Büttner et al., 2000 ; Cordoba et al., 2015).
STP1 s’avère être un facteur de tolérance majeur à la sécheresse. Pour les gènes qui codent pour

46
la glycosyltransférase non caractérisée et la Méthyltransférase S-adénosyl-L-méthionine-
dependents (SAMe), les transcrits résultants sont associés à la tolérance aux stress abiotiques
(Wu et al., 2009). Des études ont montré que la protéine lipocaline est impliquée dans la
protection de la membrane des plantes contre la chaleur, le froid et le stress oxydatif (Breton et
al., 2003 ; Charron et Sarhan, 2013). La région promotrice du gène OsTIL-2 (Oryza sativa
Temperature-induced lipocalin-2) contient en effet plusieurs éléments de réponse aux basses
températures (LTRE), à la déshydratation (DRE) et au choc thermique (HSE). En plus de la
sensibilité au stress hydrique, la mutation non-sens sur OsTIL-2 (Q171*) créant un codon-stop
prématuré et causant la synthèse d’une protéine tronquée pourrait aussi jouer un rôle important
dans la sénescence des feuilles de SbEMS 3514 (Conklin et Barth, 2004).

Le criblage des séquences de gènes candidats sur le génome du mutant SbEMS 4848 a
permis d’identifier plusieurs transitions nucléotidiques entrainant la production de protéines
tronquées. Ces gènes codent : un marqueur du stress oxydatif, la Glutathion S-transférases F11
(GST) ; deux marqueurs des stress abiotiques, dont une protéine de résistance (RPM1) et une
protéine de choc thermique (DnaJ) ; un tréhalose synthase (T6PS) ; une anthocyane synthase
(O-méthyltransférase) ; deux protéines régulatrices (GRAS, RBP47C). Comme chez
SbEMS 0753, les travaux de McHale et al. (2006) ont démontré l’implication du gène RPM1
dans beaucoup de réseaux de signalisation cellulaire. En effet, deux mutations non-sens (Q23*,
Q334*) sur deux variants de RPM1 chez SbEMS 4848 conduisent à la production de protéines
tronquées. Même si les liens génotype-phénotype sont difficiles à établir, il n’en demeure pas
moins que RPM1 joue un rôle important dans l’adaptation à la sécheresse. L’implication du
gène de la glutathion S-transférase dans la détoxification cellulaire a été confirmée par les
travaux de Rezaei et al. (2013). La mutation dans GST (Q107*) est aussi associée à la sensibilité
de SbEMS 4848 à la sécheresse. Le gène GST est en effet fortement induit au niveau des
feuilles, des racines et des tiges en condition de stress hydrique. Le gène qui code pour l’O-
méthyltransférase (OMT) est fortement induit en condition de stress hydrique (Nakabayashi et
al., 2014). La mutation non-sens sur le gène OMT (R358*) chez SbEMS 4848 confirme son
rôle dans l’adaptation à la sécheresse du sorgho. OMT est exclusivement exprimé dans les
racines et participe à l’élongation des racines, à la nutrition minérale (nitrates, ammoniac, urée)
et à l’absorption de l’eau. Le mutant SbEMS 4848, déficient pour l’O-méthyltransférase,
pourrait présenter un phénotype racinaire peu profond (Wu et Cosgrove, 2000). De plus, la perte
de fonction de T6PS (Trehalose-6-Phosphate Synthase) est associée à une réduction de la
protection des protéines et des membranes lipidiques contre la dessiccation (Karim et al., 2007).
Dans le cas précis du mutant SbEMS 4848, les résultats de la caractérisation de paramètres
agro-morphologiques et physiologiques viennent corroborer sa sensibilité au stress hydrique.

47
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Les résultats présentés dans ce mémoire illustrent une grande variabilité de réponses agro-
morphologiques et physiologiques des mutants EMS de sorgho soumis à un déficit hydrique au
stade préfloral. Ils démontrent une différence hautement significative entre les génotypes de
sorgho cultivés au champ pour la plupart des caractères étudiés. Les génotypes de sorgho
présentent en effet un large éventail de réponses en condition stress hydrique. Cette étude
confirme par ailleurs l’efficacité de la mutagenèse chimique induite EMS pour la création d’une
diversité génétique chez le sorgho. Certains mutants de sorgho, comme SbEMS 2571 et
SbEMS 2660, ont présenté des performances phénotypiques supérieures à celles des
témoins B35 et Tx7000. Ces mutants sont donc capables de tolérer un stress hydrique préfloral.
Ainsi, il serait pertinent d’envisager l’utilisation de ces mutants dans des programmes de
sélection de variétés tolérantes à la sécheresse.

L’analyse de l’expression différentielle des gènes LEA D34 et RPM1 chez cinq génotypes
de sorgho qui ont un comportement contrasté en situation de stress hydrique a confirmé
l’importance de ces gènes dans la réponse du sorgho au stress hydrique. En outre, ces résultats
suggèrent que LEA D34 et RPM1 sont simplement des marqueurs d’état de stress, étant donné
que les fortes augmentations de leurs transcrits en réponse au déficit hydrique ne sont pas
associées directement aux réponses physiologiques de tolérance à la sécheresse. Ces résultats
permettent donc d’envisager une utilisation de ces gènes comme marqueurs moléculaires de la
tolérance à la sécheresse chez le sorgho. Des travaux préalables ont permis l’optimisation de
21 amorces qPCR conçues pour 15 gènes de référence stable dans diverses conditions
expérimentales et pour 6 gènes de tolérance aux stress abiotiques. Ces amorces sont disponibles
au laboratoire de génétique moléculaire du CERAAS de Thiès.

En définitive, l’étude des niveaux d’expression et des mutations non-sens sur des gènes
candidats montre que le sorgho utilise des mécanismes multiples pour assurer la tolérance au
stress hydrique. Pour comprendre davantage la variabilité génétique pour la tolérance à la
sécheresse et pour la sélection de génotypes d’intérêt, ce travail préalable pourrait inciter à :

- effectuer d’autres mesures physiologiques plus pertinentes (conductance stomatique,


transpiration, concentration interne en CO2, ajustement osmotique) ;
- évaluer l’effet des mutations faux-sens identifiés ou SNP non synonymes sur la
tolérance à la sécheresse des mutants de sorgho ;
- utiliser la technique CRISPR cas9 pour comprendre l’impact de gènes candidats dans la
tolérance à la sécheresse.

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56
ANNEXES
Annexe 1 : Plan expérimental de l’essai

57
Annexe 2 : Caractérisation agro-morphologique des plants de sorgho en ETM (irrigués) et en STR (stressés)

NFT HP DSL DSEPI DSFLO Rdt PMG


Génotype
ETM STR ETM STR ETM STR ETM STR ETM STR ETM STR ETM STR

SbEMS 0700 20,2ᵃ 15,3ᶜ 81,0ᶜᵈᵉ 55,3ᵉ 13,0ᵃ 13,0ᵃ 64,5ᵇᶜᵈ 74,5ᵃ 72,0ᵇᶜᵈ 82,0ᵃ 485,8ᵃ 104,1ᵃ 21,7ᵃᵇᶜ 16,7ᶜᵈ

SbEMS 2571 20,3ᵃ 15,8ᵇᶜ 107,3ᵃᵇᶜ 84,2ᵇᶜᵈᵉ 07,5ᵇᶜᵈ 07,3ᶜᵈ 60,7ᵈᵉ 63,7ᵇᶜᵈᵉ 64,7ᵉᶠᶢ 71,0ᵇᶜᵈᵉ 606,7ᵃ 367,0ᵃ 26,1ᵃᵇ 21,3ᵃᵇᶜ

SbEMS 0753 18,7ᵃᵇᶜ 17,8ᵃᵇᶜ 73,1ᵈᵉ 60,2ᵉ 10,7ᵃᵇᶜ 11,7ᵃᵇᶜ 65,7ᵇᶜᵈ 73,3ᵃ 71,3ᵇᶜᵈ 80,7ᵃ 109,1ᵃ 55,4ᵃ 21,9ᵃᵇᶜ 11,7ᵈ

B35 19,7ᵃᵇ 16,2ᵃᵇᶜ 72,7ᵈᵉ 61,6ᵉ 05,0ᵈ 05,0ᵈ 61,0ᵈᵉ 64,0ᵇᶜᵈᵉ 64,0ᶠᶢ 68,7ᵈᵉᶠ 276,7ᵃ 161,7ᵃ 28,2ᵃ 18,7ᵇᶜᵈ

Tx7000 18,9ᵃᵇᶜ 17,7ᵃᵇᶜ 110,6ᵃᵇ 67,1ᵈᵉ 05,3ᵈ 05,3ᵈ 58,0ᵉ 62,5ᶜᵈᵉ 62,3ᶢ 67,5ᵈᵉᶠᶢ 650,6ᵃ 240,1ᵃ 27,4ᵃ 15,8ᶜᵈ

SbEMS 3514 18,5ᵃᵇᶜ 15,8ᵇᶜ 68,8ᵈᵉ 61,0ᵉ 14,0ᵃ 14,0ᵃ 64,5ᵇᶜᵈ 69,0ᵃᵇᶜ 70,5ᵇᶜᵈᵉᶠ 76,5ᵃᵇᶜ 276,7ᵃ 112,8ᵃ 23,4ᵃᵇᶜ 16,6ᶜᵈ

SbEMS 2660 19,3ᵃᵇᶜ 16,8ᵃᵇᶜ 120,8ᵃ 73,5ᵈᵉ 08,0ᵇᶜᵈ 07,0ᶜᵈ 58,0ᵉ 62,5ᶜᵈᵉ 62,0ᶢ 68,3ᵈᵉᶠ 749,2ᵃ 325,9ᵃ 26,1ᵃᵇ 20,0ᵃᵇᶜᵈ

SbEMS 4848 16,3ᵃᵇᶜ 15,9ᵇᶜ 93,6ᵃᵇᶜᵈ 57,7ᵉ 11,0ᵃᵇᶜ 13,0ᵃᵇ 63,0ᵇᶜᵈᵉ 75,5ᵃ 69,0ᵈᵉᶠ 82,5ᵃ 301,1ᵃ 77, 0ᵃ 18,3ᵇᶜᵈ 11,3ᵈ

SbEMS 4602 19,2ᵃᵇᶜ 17,3ᵃᵇᶜ 75,0ᵈᵉ 59,7ᵉ 12,0ᵃᵇᶜ 12,0ᵃᵇᶜ 65,3ᵇᶜᵈ 69,3ᵃᵇ 70,3ᶜᵈᵉᶠ 77,0ᵃᵇ 153,6ᵃ 113,2ᵃ 17,2ᶜᵈ 11,9ᵈ

Annexe 3 : Caractérisation physiologique des plants de sorgho en ETM (irrigués) et en STR (stressés)

SPAD 1 SPAD 2 SPAD 3 Thermo 1 Thermo 2 Thermo 3 Fv/Fm 1 Fv/Fm 2 Fv/Fm 3


Génotype
ETM STR ETM STR ETM STR ETM STR ETM STR ETM STR ETM STR ETM STR ETM STR

SbEMS 0700 42,1ᵃᵇᶜ 48,0ᵃᵇ 49,7ᵃ 41,7ᵃ 48,9ᵃᵇᶜ 41,7ᵇᶜᵈ 30,9ᵃᵇ 31,0ᵃᵇ 32,9ᵇ 34,9ᵃᵇ 32,2ᵉ 35,7ᵃᵇᶜᵈᵉ 0,78ᵃᵇ 0,75ᵃᵇ 0,76ᵃ 0,73ᵃ 0,78ᵃ 0,77ᵃ

SbEMS 2571 45,0ᵃᵇ 44,6ᵃᵇ 49,7ᵃ 51,2ᵃ 50,3ᵃᵇᶜ 40,3ᶜᵈ 30,1ᵃᵇ 30,4ᵃᵇ 32,3ᵇ 33,0ᵇ 34.0ᵇᶜᵈᵉ 36,5ᵃᵇᶜᵈ 0,78ᵃᵇ 0,79ᵃᵇ 0,76ᵃ 0,75ᵃ 0,78ᵃ 0,74ᵃ

SbEMS 0753 30,1ᶜ 45,2ᵃᵇ 55,2ᵃ 47,6ᵃ 53,2ᵃ 41,3ᵇᶜᵈ 31,6ᵃᵇ 32,2ᵃᵇ 32,8ᵇ 34,3ᵇ 33,1ᶜᵈᵉ 36,1ᵃᵇᶜᵈᵉ 0,52ᵃ 0,52ᶜ 0,78ᵃ 0,78ᵃ 0,77ᵃ 0,73ᵃ

B35 45,5ᵃᵇ 45,0ᵃᵇ 50,2ᵃ 47,7ᵃ 51,3ᵃᵇ 38,2ᵈ 30,1ᵃᵇ 31,2ᵃᵇ 31,8ᵇ 36,4ᵃᵇ 33,1ᶜᵈᵉ 38,6ᵃ 0,80ᵃ 0,79ᵃ 0,76ᵃ 0,74ᵃ 0,79ᵃ 0,74ᵃ

Tx7000 44,5ᵃᵇ 44,8ᵃᵇ 49,9ᵃ 46,9ᵃ 50,1ᵃᵇᶜ 41,7ᵇᶜᵈ 30,2ᵃᵇ 30,4ᵃᵇ 31,0ᵇ 32,8ᵇ 32,7ᵈᵉ 37,6ᵃᵇ 0,80ᵃ 0,79ᵃ 0,76ᵃ 0,76ᵃ 0,78ᵃ 0,76ᵃ

SbEMS 3514 43,7ᵃᵇᶜ 46,6ᵃᵇ 48,8ᵃ 45,4ᵃ 42,7ᵃᵇᶜᵈ 40,3ᶜᵈ 31,6ᵃᵇ 32,1ᵃᵇ 31,5ᵇ 43,1ᵃ 35,1ᵃᵇᶜᵈᵉ 37,9ᵃᵇ 0,80ᵃ 0,78ᵃᵇ 0,76ᵃ 0,69ᵃ 0,74ᵃ 0,78ᵃ

SbEMS 2660 44,9ᵃᵇ 49,9ᵃ 51,5a 50,3ᵃ 48,7ᵃᵇᶜᵈ 40,8ᵇᶜᵈ 29,7ᵇ 30,4ᵃᵇ 31,0ᵇ 33,8ᵇ 33,3ᶜᵈᵉ 36,8ᵃᵇᶜ 0,79ᵃ 0,77ᵃᵇ 0,78ᵃ 0,76ᵃ 0,78ᵃ 0,74ᵃ

SbEMS 4848 39,6ᵃᵇᶜ 40,0ᵃᵇᶜ 44,7ᵃ 42,1ᵃ 44,0ᵃᵇᶜᵈ 41,5ᵇᶜᵈ 30,5ᵃᵇ 31,6ᵃᵇ 34,2ᵇ 32,2ᵇ 32,7ᵈᵉ 34,9ᵃᵇᶜᵈᵉ 0,79ᵃ 0,51ᶜ 0,77ᵃ 0,78ᵃ 0,78ᵃ 0,79ᵃ

SbEMS 4602 47,5ᵃᵇ 36,2ᵇᶜ 49,1ᵃ 46,6ᵃ 45,3ᵃᵇᶜᵈ 41,8ᵇᶜᵈ 31,4ᵃᵇ 32,7ᵃ 32,3ᵇ 33,2ᵇ 33,9ᵇᶜᵈᵉ 34,7ᵃᵇᶜᵈᵉ 0,79ᵃ 0,63ᵇᶜ 0,78ᵃ 0,69ᵃ 0,76ᵃ 0,69ᵃ

ETM : en condition irriguée ; STR : en condition de stress hydrique.

Dans une colonne, les moyennes suivies par les mêmes lettres ne sont pas significativement différentes au seuil de 0,05.

58
Annexe 4 : Phénotypes des plants de sorgho

Annexe 5 : Évaluation de la qualité de la transcription inverse

Courbe d’amplification de cDNA ; RT-contrôle positif = ARN sans traitement avec la DNase,
RT-contrôle négatif = ARN avec un traitement avec la DNase ; Contrôle négatif = eau pure.

59
Annexe 6 : Description des gènes candidats mutés

Catégorie Rôle putatif dans la réponse à la Effet Acide


Mutant Code du gène Gène
fonctionnelle sécheresse mutation Aminée
Protéines kinase, catalyse
Sb01g028850.1 CASEIN KINASE-RELATED Voie de transduction du signal SPLICE_SITE_DONOR
la phosphorylation
Sb06g028560.1 Leucine-rich repeat SPLICE_SITE_DONOR
Proteins kinase Voie de transduction du signal
Sb06g028560.2 transmembrane protein (LRR) SPLICE_SITE_DONOR
Transducteurs de signaux et des
Sobic.002G316500.1 GRAS Facteur de transcription W118* tGg/tAg
activateurs de la transcription
Glutathion S-transférases F11 Détoxification cellulaire et tolérance
Sb01g048010.1 Détoxification Q107* Cag/Tag
(GST) au stress oxydatif
Sobic.005G181700.1 RPM1 (NB-ARC domain- Interactions intramoléculaires Q23* Caa/Taa
Co-Chaperons
Sobic.005G075100.1 containing disease) régulatrices Q334* Caa/Taa
SbEMS 4848
Épaississement de la paroi cellulaire
Biosynthèse des
Sb04g006885.1 O-méthyltransférase et maintien de la pression osmotique R358* Cga/Tga
Anthocyanes
intracellulaire
Chaperone/HEAT Protection des structures
Sobic.009G244700.1 Chaperone DnaJ SPLICE_SITE_ACCEPTOR
SHOCK PROTEINS cytoplasmiques
Sb02g026820.1, RNA-binding protein 47C Régulation post-transcriptionnelle des Q20* Cag/Tag
RNA recognition motif
Sb02g026820.2 (RBP47C) gènes Q20* Cag/Tag
Ajustement osmotique lié au
TREHALOSE-6-PHOSPHATE Biosynthèse des
Sb01g029590.1 métabolisme des Q380* Cag/Tag
SYNTHASE T6PP tréhaloses
sucres/osmoprotectants
RPM1 (NB-ARC domain- Interactions intramoléculaires
Sb02g038425.1 Co-Chaperons W516* tgG/tgA
containing disease) régulatrices
PBS1- Serine/Threonine-protein
Sb06g014310.1 Proteins phosphatases Voie de transduction du signal Q94* Cag/Tag
kinase NAK
Sb09g025120.1 F-box (OsFBX169) Protéine de liaison Régulation transcriptionnelle Q327* Caa/Taa
SbEMS 753 Sobic.002G120300.1 SPLICE_SITE_DONOR
Flavin-binding monooxygenase -
Sobic.002G120300.2 SPLICE_SITE_DONOR
CAS1-cycloartenol synthase 1 - Intramoléculaire
Sb04g003300.1 - SPLICE_SITE_DONOR
LANOSTEROL SYNTHASE transférase
Sobic.001G111100.1 Peptide transporter PTR2 - SPLICE_SITE_ACCEPTOR
Sb01g032050.1 Protéine à doigt de zinc Protéase/Facteurs Réparation des dégâts (dégradation SPLICE_SITE_DONOR
Sb01g032050.2 (C3HC4-type RING finger) Transcription des protéines) /protéolyses SPLICE_SITE_DONOR
Sb10g002520.1 Facteur de transcription IIF SPLICE_SITE_ACCEPTOR
Facteur de transcription Voie de transduction du signal
Sb10g002520.2 (TFIIF) SPLICE_SITE_ACCEPTOR
Sb02g011360.1 SERINE/THREONINE- Q205* Caa/Taa
PROTEIN KINASE AFC1, Protéines phosphatases Voie de transduction du signal
Sb02g011360.3 AFC2 (FUS3) Q103* Caa/Taa
Glycosyltransférase non Biosynthèse des RFO Ajustement osmotique lié au
Sb03g004540.1 caractérisée (biosynthèse du (Raffinose Family métabolisme des W545* tgG/tgA
stachyose) Oligosaccharides) sucres/Osmoprotectant
SbEMS 3514 Sb03g025600.1 Osmoprotectant Q64* Cag/Tag
Transporteur de sucres Osmorégulation
Sb03g025600.2 synthases Q31* Cag/Tag
Sb03g045620.1 F-box (OsFBX191) Protéine de liaison Régulation transcriptionnelle Q108* Cag/Tag
Cytochrome B561 (ferric integral component of
Sb06g021340.1 W85* tgG/tgA
reductase transmembrane) membrane
Réparation des membranes cellulaires
Temperature-induced lipocalin-
Sobic.007G140200.1 Biogenèse membranaire dans des conditions de stress sévères Q171* Cag/Tag
2 (OsTIL-2)
par peroxydation lipidique
Methyltransferases S-adenosyl- Ajustement osmotique lié au
Biosynthèse de la
Sb09g028520.1 L-methionine-dependents métabolisme des W186* tgG/tgA
stachyose et du raffinose
(SAMe) sucres/Osmoprotectant
Sobic.002G345700.1 Q282* Cag/Tag
Insulinase (Peptidase
Sobic.002G345700.2 - Q210* Cag/Tag
family M16)
Sobic.002G345700.3 Q282* Cag/Tag
SbEMS 2660 Sobic.009G123600.1
Tungus CG8253-PA -
SPLICE_SITE_DONOR
Sobic.009G123600.2 SPLICE_SITE_DONOR

Sobic.002G419800.1 REF4-related 1/structural - SPLICE_SITE_DONOR


constituent of the ribosome

60
Annexe 7 : Séquences protéiques

SbEMS 4848

> Sb01g048010 Q107* Cag/Tag QGKMQFAAEIETISRVQHRNLVRLYGCCLESKTPLLVYEYL


MASVKVFGSPTSAEVARVLMCLFEKEVEFQLIRVDAYRGT ENGSLDQALFGKGSLNLDWSTRFEICLGIARGIAYLHEEST
KRMPQYLKLQPHGEALTFEDESLTLSDSRGILRHISYKYAK VRIVHRDIKASNVLIDADLNPKISDFGLAKLYDDKKTHVST
KVAGTFGYLAPEYAMRGHMTEKVDVFAFGVVALEIVAGE
QGNPDLIGTGALERASIEQ WLQTEAQSFDSPSAEMVYSLAI
SNYQNTMEEDTTYIFERVWELYENGRPLEFVDPKLTEYNG
LPPTLPRQQNDNNGTGSGFNARDVAVGSNADASSGKRGV
YEVLRVIRVALHCTQGSPHKRPSMSRVVAMLTGDADTTED
AGSEQPAASQNQLSPQKEEEMLKLFGQRKKDLEKLLDIYE
VAKPSYITEWQVKQVADDVSGSFTSSQVGSSSTHQPVSSSL
QRLEEARFLAGDNFTIADLSHLPNADRLVSDPRSRRLFESR
SGGVQASPEPGGDLTPVVPSPLFTSIIDEGR*
KNVSRWWHDVSNRETWKYVKSLQRPPSTSTDASAMNAQ
GQQQHLPGSTDGHGVKNERHF* Séquence protéique de la Leucine-rich repeat (LRR)
Séquence protéique (acides aminés) du Glutathione S-
transferase GSTF14
> Sb04g006885 366 a a R358* Cga/Tga
MNMIPTPTSDELLQAHAELWCHSFAYLKSMALQSAIKLGIP
> Sb01g028850 1002 a a TAIHRCGGAASLSDLHASLPVPPSKWPCMSRLMKLLAVSGI
MPSQSDPRASPSTMDSGGGSSAEMERAWHLLTVLIRLGRP FKEDKPDMYCLTPVSRLLVEEDIDDGGGGGGGGTACQSQF
AAPSELAAAAAPSISTRAVEQLCCLPRSPLWISDDGVVTPSE TVMVTSPFHSAASQCLPEWLQSDDDHAVAETPFMMAHGA
TAVQAFLRFMGWDIPRPKVSLRPSEARRCLGKVSITYERKR TFYGVRGRDLEFGALFNEAMAADSRFVAEILTRQCGEMFA
QGSDARCFSAKRRRLLAADADLVEQTEHQSCQLVAQTCTT GVTSLVDVGGGDGTTAKAIAKAFPHVRCSVLELPQVVDKV
VATGEVHLEVMQKLQDRPPTLSTFLGEPSLGFSTGITLAPNI HVHGMVEFVAGDMMKFVPPADVVLLKFVLHNWSDEDCV
AKITMLGLQPKLYQPLRGDDGTVVGNMSLALVPTGFSDCP KILKQAMLAISTREPKGKVVIIDTVASSVSKQSLEAQLLMD
CSVNLPPLDAEKLKNINVEADSKSNKISESEQVSLLNCRVE LCMMMLTTGEERDEKKWNKLFLEAAFSGCKISHIFGSRSLI
DSDDLRKESVLPMVSHDVLVGESKYGADEDLNLVGKNHG EVYP*
SLINHNTKTTDSIEAFDMNLNQADALQYNSLNDGHHQNAP
SCVQEKNPLGASTYAEVCTDKTTQNLLQPSMGNKAGSIAP Séquence protéique de l’O-METHYLTRANSFERASE
QMNINVQSETLPQETTRQDGMNRKNLNIVSKNRDIRYLNH
GEQSLNKVEVNVSKNGRDKLAVKQKEKCKKNEQTKEDK > Sb02g026820 Q20* Cag/Tag
DHNAKTQKGHVAPKPLPVFKGFVIEEEEGSGGYGTVYRAQ
MQAAAVNGAGDVQKPHHHHQ QQPVVVGAPPPPAAVVPS
RTKDGKTFAIKCPHPNAHSHHVNNELKMLERFGGKSCVIK
HWVAMPFAPPPGAAAMVMQPHQMAPAPPHQFAAAHFVP
YECSLKSGDLDCFVLEHVEHDRPEILKKDITLLELQWYGHC
FHAVAPPPPRAAPVPAVALGSPAPHQAGHEENKTIWVGDL
LFRALASLHKEGVVHRDVKPGNFLFCRKLKRGYLIDFNLA
HYWMDENYLHSCFGYTGEVVAIKVIRNKQTGQSEGYGFV
NDLHQKFLKNCKSDATSSGKDTTSQALSTIAPVVHVKEPA
EFYSHAAAEKVLEGFSGHIMPNTDQPFRLNWASFSMGDRR
ADSKQPLPLKRKRSNRSPVDSARAPKIDNKSRHGNQAADV
SDVASDHSIFVGDLASDVNDATLLEAFSSRYSSVKGAKVVI
SGVTSAKDPTSTKTSLDRLKQPMPYKGRKELMNFLHETMQ
DANTGRSKGYGFVRFGDDSEKTHAMTEMNGVYCSSRPMR
SPKKSTMPTPVSQRKRVAAPFGSVDRKLFILTPMPLRSGGS
IGPATPRKSSGTSGSNGSSARSDGGDLTNTTVFVGGLDPNV
AVAGSGMFNNKGHGKHRREGPCVGTKGFRAPEVLLRSFH
SEEDLRQTFSQYGEISSVKIPVGKQCGFVQFAQRKNAEDAL
QGCKVDVWSAGVTLLYLIIGRTPFGGDPEQNIKEIAKLKGS
QGLNGSTIGKQTVRLSWGRNPANKQFRGDNGNQWNNGG
EELWEVAKLHSCESSYPSDLFDVKFPLCPVNLREWCAANT
MYYAASPFYNGYGYPAAPFPDPGMYAAPAYGAYPFYGNQ
RRPDLLEMIPTSFFNLVDKCLAVNPRCRLSSEDALRHEFFAP QQVS*
CHDSFRKPRMLRRSAGSDAACSSSHQNTALTAKQS*
Séquence protéique de RNA-binding protein 47C et 47A
Séquence protéique de la Casein Kinase-Related

> Sb06g028560 1054 a a >Sobic.001G240400 599 a a


MRKPRLSGCGLLHVCVSLSPVLLFLLLLPSSWRAAAQAQQ MEDSVQVACVIPSAADAAFQIYSLKRSAYAAVLRAFCAQS
APQTDPVEAAAVNAILSKLGLSAPPSWNISGNPCSGAATDD DILSRDKVRCLTELRNELKILQTEHAECLVKARSNKQIKSFS
TSIDDNPAFNPAIKCDCSDRNNTLCHVTRLKINTLDAVGPIP VGLHSKGNTCSTEVIKDFLGLACVLPDAGDTVFQIHCLERS
EELRNLTHLVKLDFRKNYFYGPLPAFIGELTNLESMTVGIN AYASVLRAFCAVTNHLSLLQVKLLSQLKNELRISHSEHKEV
ALSGPVPKELGNLTNLLSLALGSNSFNGTLPDELGKLTKLR LMKVSLNEHIKSLRKFSLANLSVVTKTNPAFDVHAVLHDKI
QIYIDSNDFSGPLPSTLSQLKNLSILWASDNNFSGQIPDYLGS GPTGQVCTSSTSCLSLIQQSSVSENSMSSTRDIGISDSSNGAE
LTNLTQLRLQGNSFQGPIPSSLSNLVNLKKLRIGDIVNGSSQ GPYFESHTVVSAKRLKTVNGHAPAYLKCGPSNQLRVAVSA
LAFIDNMTSLGELVLRNTKISDTLASVDFSKFVNLYLLDLSF VMVEKHSQLNAGQGPLSVDHTSQESGKRKTVVPEMSVSES
NNITGQIPQSILNLPSLSYLFLGNNSLSGSLPATKSPSLTNLD LDVMDRKYEIEYQKPKNKDSDLEHGSEIIKLCLTASLLSKV
FSYNHISGNFPSWATEKKLQLNLVANDFVMGSSNNSVLPW ERIFKENPDSANLEKAKLTLKAQEKDLLGALAKLSEVSYD
GLDCLQRSTPCFLGSPKSASFAVDSGGSRTISGSDSSIYQPD VVYFGANHNHRSVNLNEHGDGKGDEAVLPKLVSSSDETLP
NADLRAASYYVAGAPTWGVSGVGLFLDADAPNGSYIIYSS GARLGDGGTENKVKIQGIASIIVPLSSDPHQWHCQPIPAPPG
RQFENTLDSALFQTARMSPSSLRYYGIGLENGNYTVTLQFA PATARGRVFRPWPADGRGADLHALGAVQENQVHGGADG
EVDFPDMQSWRSRGRRVFDIYVQGERKEQNFDIRKAAGG ADAGVRGALWVVHPQGWCGSCRCLLHPDQRPSARLQEM
KSFTAVKKQYVVPVTKNFLEIHLFWAGKGTCCIPYKGYYG VKQQQVPRQDSTLCSAVAPPRSPGHHSAGTDD*
PAISALSATPNFVPTVRSSADSKSSRKTGVIVGVVVGVSVL Séquence protéique de Emsy N Terminus (Ent) And Plant
ALIVLAGIFLWCQKRRKLLLELEELYTIVGRPNVFSYSELRS
ATENFCSSNLLGEGGYGSVYKGKLSDGRVVAVKQLSQSSN Tudor-Like Domain-Containing Protein

61
SbEMS 0753

> Sb02g038425 589 a a >Sobic.002G120300.1 425 a a


KRIFGSTVNCPDNLKEISEKILGKCGGAPLAIVSIAGLLVSKPV MAAAAAAAADASSAEAPPSPPAASRVVWVNGPIVVGAGP
LSKDQWQKIYCSLGSELETSPSLERLKKILELSYNDLPYHLKTC AGLSVAACLRARGVPCVVLDRADCIASLWQRRTYDRLRLHL
FLYLSVYPEDHIIRRKSVLRRWVAERFVTEKRGLSVFEVAESY PRHFCELPGLPFPDNYPEYPTKRQFVDYLNAYAEQAGVQPR
FDEFINRSIIHPVDMSFTGKVKTFRVHDVMLEIIVSRSIEENFI FNQAVTSARYDAAAGFWRVRADDVVLAEDAAAVAAGATT
TLVGEQHTSVPREKIRRLSVHSGDMKDIATSKMLSHVRSLSI TEYIGRWLVVATGENAERIVPEFEGAEDFAGPVSHVSEYKSG
FSGGEILQFGWMKLLRILDLEGYGILRNRDLKNVCSLFQLEYL EAYRGKRVLVVGCGNSGMEVCLDLCDHNALPSMVVRDAK
SLRKTHIMELPAQIGNLLKLETLDIRETGVKHLPPGITYLPHLR VHVLPREMFGVATFSVAVFLLRFLPLWLVDAILVLLARLFLG
NLLGGRRFYNHNGLWRVSEYWGLHVPNKIGKLDALETLEQ DLDKLGIRRPAGGPLELKNTRGRTVLDIGALARIRSGHIQIVP
VEITEYASHSISELGKLSRLRKLGVMMFVDDDNSWASLVSAL GIKRLFRGGAELVDGRRVAADAVILATGYQSNVPQWLKGC
ENISSSLCSLLLWRPYGTMNFNSLDSLSRPPLFMRSINFRGQ DFFTQEGYPRVPFPHGWKGESGLYSVGFTRRGLSGVSSDAV
LRKLPKCAKEDLKVLARLPSLIYLRLHHSAYVETEFAVAASEFP KVAQDIAVEWEKQTSTI*
VLKLLVIHLAMFEAWRARFHEGALPRLEKLELSLFEQASIQEV
Séquence protéique de la Flavin-binding
SGIEFLPNLKEVSVSACPGNTMEDVIQSLKDDAEKNPSKPTV
monooxygénase
TFKSKKWVPMKARTDPPLHHRGNLRSSYLDHF*

Séquence protéique (acides aminés) de RPM1 (NB-


ARC domain-containing disease)

> Sb04g003300 739 a a


MWRLKVAQGDDGPWLRSTNNFVGRAVWEFDPDHGTPE
>Sobic.006G054700.1 484 a a
ERADVERLRREFSQHRFQRRESSDLLMRMQGTKQNRCQR
MGCFPCFGSTSDEELKYYGALGGNGGGVGRAAASSSSSSSA
AGGGGRAEEAVVAPPRVARDHAGADKARAKGNAGSKKEL DLPRIKLEEDDQVTEEIVLSSLRRALDQFSSLQASDGHWPGD
FSGIMFIMPGLIFALYVTGSLNAVISPEHRHEICRYIYNHQNE
SVLRDASGNVISAQTFTFRQLAAATKNFRDECFIGEGGFGRV
DGGWSTLVLGSSTMFGTCSNYITLRLLGEELYGNNDALAKG
YKGRLDMGQVVAIKQLNRDGNQGNKEFLVEVLMLSLLHH
RAWILSHGGATFIPQWGKIWLSVLGVFDWSGNNPIFPELW
QNLVNLVGYCADGDQRLLVYEYMPLGSLEDHLHDLPPDKE
LIPQFLPFHPGKFWCLTRMVYLPMAYLYGKKFVGPITPTILAL
PLDWNTRMKIAAGAAKGLEYLHDKAQPPVIYRDFKSSNILL
REEIYDTPYNKIDWSNARNECAKEDLICPRTLLQNVVWTSLY
GEGFHPKLSDFGLAKLGPVGDKSHVSTRVMGTYGYCAPEY
RCVEPVLSSWPVNKLRERALGNLMEHIHYEDENTQYLCICS
AMTGQLTVKSDVYSFGVVLLELITGRKAIDSTRPASEQNLVS
VNKALNMICCWVEDPNSDAFKHHLARVPDFLWLSEDGMK
WARPLFNDRRKLPKMADPGLEGRFPTRGLYQALAVASMCI
AQVYDGCQSWETSFIIQAFCGTDLVNEYGPTIQRAYEFMKN
QSEAASRPLIADVVTALSYLANQIYDPSLAHTSKKAGGSDQR
SQVLRNHPGDQSKWHRHRSKGSWTLSSADNGWAVSDTT
NRVGDSGRVLSKNDDAGSSGHRSPSKDRADSPREQFPGAA
GEALKAVLLVAKISNKNNLAGDPIEKQRLHDAMEIRNAILCN
NRGQDRERMVAEAKMWGENWREKRRAAQGSLDSPTGG
KDGTFSTYECKRSSSWIEILNPCESFPNMVVDYPYPECTSSVL
G*
QALILFQELYPGYRTKEIKTSIRNAATFIERSQQEDGSWLGT
Séquence protéique de PBS1 - serine/thréonine-protein WGVCFTYGAFFSIKGLVDYGRTYENNSFIRKGCHFLLSKQLT
kinase NAK TGGWGESHVSNETQNIQFINLLAYTFLIQDGARSNTITPCCK
RIDKYAVGDRRVPTARACRMLQLFSFLQLPQLPQLVPHLGS
R*

Séquence protéique de CAS1|cycloartenol synthase 1 -


LANOSTEROL SYNTHASE

62
SbEMS 3514

>Sb01g032050 479 a a > Sb03g025600 509 a a


MTSPGGVFSTALVAEDFPWVEREEEMGMAPDTYSEVFGL MAGGSFTEKGKQYPGKMTVFVFLACLVASSGGLIFGYDIGI
AQRGTLAFRDRRFDEAISCYTKAQNLRPDPIILGNRSLAFCR SGGVTSMDPFLEQFFPSVYAKEQEVVETNQYCKFDSVLLTL
LSQLLRERSAADSEYQPLNGLDPTTHAELALKDAEKILSINS FTSSHYLAALVASLFAGYITSRCGRRVSMLGGGVIFLVGAVL
NSPRPYLLKAYALILMEHYHEAREALLAGLQVDPLSHVLQT NGFAQNVAMLIIGRIFLGIGVGFSNQSVPLYLSEMAPAKM
CLNDLDRNTNIAAGARRASLDRTDDFECTLCFKLLYEPVTTP RGMLNISFQLMITIGILIANLINYFTAKIAGGWGWRIGLGLA
CGHSFCRSCLHQSMDHGNKCPMCRTVLFIGPRTYPLSVTL AVPAVIMVGGSIFLPDTPNSLVARGKVESARAMLRRIRGT
SNIIQRNFPQEYAERRSEHETMTYAGVDLMPLFVMDVVLP DDVSLEFDDLLAASEATKAIESPWRTLLQRRYRPQLVMAFL
SQKMALNIFEPRYRLMVRRIMEGNHRMGMVTIDSATGTV IPTLQQLTGINVVMFYAPVLFKTIGFGGTASLMSAVITGLV
ADCGCEVEILECEPLPDGRFYLEVEGTRRFRILRSWDQDGY NMFATFVSIATVDRLGRRKLLLQGGIQMILAQFVLGTLIAV
RVAEVEWLRDRPLPEGSQERRELMEMANEASEMARAYIR KFGTTGVAEISRSYAIGVVFCICVFVSAFAWSWGPLGWLV
RARETIRTARRTRHLDLEGMPGPQDPEKFSFWLVNLISLRP PSEIFPLEIRSAAQSAVVVFNMVFTFVIAQIFLMLLCRLKFGL
SDRLDMLRLRDTRERISSSIRLLSDAEQGCRVQ* FYFFGAWEIAMTLFVYFFLPETKGIPIEEMDRIWANHWYW
NRFVDAGRKVQLTSTAV*
Séquence protéique (acides aminés) de ZINC FINGER
(C3HC4-TYPE RING FINGER) Séquence protéique de sugar transporter 1

>Sb02g011360 424 a a >Sb03g045620 145 a a


MATECAAAAADLATGRPRKRARFGWDVAPAAEAQIGTFC MEEHLMCRRKKLKRCHKKPVFRQMSAEIQFSDLPVEFVLE
GQEVGDVASLLLSANPSDHTCSSLLPKGVARNASPPWRED QPVELIVCSPSLQDVLGTILCKLPPKEIVRASVLSNEWKHICT
DKDGHYVFAVGENLTSRYKIYRKMGEGTFGQVLECWDRE VCPKLRFDGAAMCGQDVAGKQHYIQKFIDNVNGVLKQYH
SKEMVAIKIVRSVKKYSDAAMIEIDVLQKLARNDAAGKHCV GKVVEEFVSHSHNSPLIQGTRHC*
QIRNWFDYRSHICIVCEKLGPSLYDFLQKTGFRPFPIDLVRQI
Séquence protéique de F-box domain containing protein –
GVQLLESVAFMHRLQLIHTDLKPENILLVSSDYVKLPDPKD
GSFSRKLPKSSAVKLIDFGSAAYHHQDRSYIVSTRHYRAPEV  OsFBX191
ILGHGWSYPCDIWSVGCILVELCSGETLFQTHENLEHLAM
MERVLGPLPRHMLERADQHAEKYVRRGRLNWPEGAATK
ESIRAVLKLPRLQNLVMQHVDHSAGDFIDLLKRLLAYEPSA >Sobic.007G140200.1 179 a a Cag/Tag Q171*
RLTAQEALSHVFFTRHGKNQ* MKVVRNLDLERYMGRWYEIACFPSRFQPRDGTNTRATYTLA
GDGAVKVLNETWTDGRRGHIEGTAYRADPVSDEAKLKVKFY
Séquence protéique de FUS3 — Serine/threonine-protein
kinase AFC2 VPPFLPIFPVVGDYWVLHVDDAYSYALVGQPSLNYLWILCRQ
PHMDEEVYGQLVERAKEEGYDVSKLKKTAHPDPPPETEQSA
GDRGVWWIKSLFGR*
Séquence protéique de OsTIL-2 Temperature-
induced lipocalin-2

63
Titre : Variabilité des réponses agro-morphologiques et physiologiques et analyse de
l’expression différentielle de gènes chez des mutants EMS de sorgho (Sorghum bicolor [L.]
Moench) sous contrainte hydrique.

Prénom et Nom : Elhadji Malick KANE

Nature du mémoire : Master en Biotechnologies Végétales et Microbiennes

Présenté et soutenu publiquement le 02 février 2018

Résumé

Le sorgho (Sorghum bicolor [L.] Moench) est la 5e culture céréalière la plus importante dans le
monde. Bien qu’il se développe très bien dans les régions arides et semi-arides du monde, les différents
stress abiotiques, y compris la sécheresse et les fortes températures, compromettent substantiellement
sa productivité. Les objectifs de cette étude sont les suivants : (i) évaluer la variabilité phénotypique de
mutants EMS de sorgho soumis à un déficit hydrique au stade préfloral, (ii) quantifier l’expression
différentielle de gènes de tolérance à la sécheresse par RT-qPCR, et (iii) déterminer l’impact des
mutations non-sens sur des séquences de gènes candidats dans l’adaptation à la sécheresse du sorgho.
Huit mutants de sorgho sont sélectionnés sur la base de leurs performances agro-morphologiques
contrastées et sont cultivés au champ avec deux traitements hydriques (irrigué et stressé). Les plantes
sont irriguées jusqu’au 30e jour après semis, puis exposées à un déficit hydrique préfloral pendant 30
jours. Quatre mutants et le témoin B35 sont ensuite choisis pour l’analyse de l’expression des gènes
LEA D34 et RPM1, impliqués respectivement dans la tolérance à la déshydratation et aux fortes
températures.
Les résultats de l’étude montrent qu’il existe une grande variabilité de réponses physiologiques et
agro-morphologiques entre les différents génotypes de sorgho étudiés en condition de stress hydrique.
Certains mutants, comme SbEMS 2571 et SbEMS 2660, ont montré une stabilité de leur rendement dans
les deux traitements hydriques, une grande capacité à accumuler la chlorophylle, et à conserver une
température foliaire basse durant le stress hydrique. En revanche, la sécheresse a considérablement
réduit le poids des grains, la hauteur des plants et la teneur en chlorophylle des feuilles de tous les
génotypes. L’analyse de l’expression des gènes LEA D34 et RPM1 dans les tissus foliaires des génotypes
de sorgho montre une régulation de l’abondance de leurs transcrits par le stress hydrique. LEA D34 et
RPM1 sont en effet fortement exprimés chez SbEMS 2660 et B35 dès les premiers jours du déficit
hydrique. L’accumulation des transcrits de LEA D34 et RPM1 intervient tardivement chez le mutant
SbEMS 3514, surement à cause de la sénescence précoce de ses feuilles. En revanche, l’expression de
LEA D34 et RPM1 n’est pas régulée dans les feuilles des mutants SbEMS 4848 et SbEMS 0753,
sensibles au déficit hydrique. Ces résultats montrent que LEA D34 et RPM1 jouent un rôle important
dans la tolérance à la sécheresse du sorgho, puisqu’ils s’accumulent fortement chez les plants de sorgho
avec les meilleurs rendements après la récolte. De plus, l’accumulation des transcrits de ces gènes de
tolérance n’est pas corrélée avec la teneur en chlorophylle des feuilles ou la régulation de la
photosynthèse en conditions de stress hydrique. Par conséquent, LEA D34 et RPM1 sont des marqueurs
de la tolérance à la sécheresse. Par ailleurs, les mutations non-sens sur des gènes candidats entrainent
une modification profonde du turn-over des protéines dans la réponse aux stress. Ces pertes de fonction
ont un impact significatif sur la tolérance à la sécheresse, l’osmorégulation et la détoxification cellulaire.
Éventuellement, la caractérisation moléculaire de ces mutations contribuera à la compréhension de
l’adaptation à la sécheresse et pour la sélection de génotypes d’intérêt.
Mots-clés : sorgho, mutant EMS, stress hydrique, RT-qPCR, LEA D34, RPM1

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