Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical ARTIGO

31(1):19-26, jan-fev, 1998.

Diagnóstico de infecção congênita e perinatal por

citomegalovírus utilizando a reação
em cadeia da polimerase
Diagnosis of congenital and perinatal cytomegalovirus infection
by using the polymerase chain reaction

Aparecida Yulie Yamamoto, Victor Hugo Aquino, Luis Tadeu Moraes

Figueiredo e Marisa Marcia Mussi-Pinhata

Resumo Aplicou-se uma reação em cadeia da polimerase (PCR) no diagnóstico de infecção

congênita e perinatal por citomegalovirus, comparando-a com a técnica de isolamento viral em
cultura celular. Foram processadas 305 amostras de urina de crianças de 0 a 6 meses, por ambas
as técnicas. Utilizou-se na PCR os primers que amplificam parte do gene codificador do principal
antígeno precoce imediato de CMV. Detectou-se virúria em 47 amostras por PCR e comparando os
resultados com aqueles obtidos pelo isolamento viral, observou-se copositividade de 89,6% e
conegatividade de 98,5%. Estas amostras positivas tiveram o resultado confirmado por PCR
utilizando outros primers que amplificam regiões dos genes codificadores das glicoproteínas B e H
de CMV. O diagnóstico de infecção congênita e perinatal por CMV pela PCR mostrou sensibilidade
comparável à do isolamento viral e o uso de vários primers conferiu alta especificidade ao teste.
Palavras-chaves: Citomegalovirus. Diagnóstico da citomegalovirose. Reação em cadeia da
polimerase. Infecção congênita e perinatal.

Abstract The practical application of a polymerase chain reaction (PCR) amplification for the
diagnosis of congenital and perinatal cytomegalovirus (CMV) infections was evaluated. Three
hundred five urine samples were tested by PCR and conventional virus isolation in cell culture. Viruria
was detected in 47 urine samples by PCR using a primer pair which amplifies part of the major
immediate-early (MIE) CMV genome. The PCR compared to virus isolation showed 89,6% sensitivity,
98,5% specificity and 91,5% positive predictive value. PCR with primer pairs amplifying parts of the
glycoprotein B and glycoprotein H genes of CMV were used for confirmation of the positivity of the
47 urine samples. We concluded that this CMV PCR assay in urine has a suitable sensitivity for the
diagnosis of congenital and perinatal infections and its specificity is highly increased by use of more
than one pair of primers among the ones we used.
Key-words: Cytomegalovirus. Cytomegalovirus diagnosis. Polymerase chain reaction. Congenital
and perinatal infection.

Unidade Multidisciplinar de Pesquisa em Virologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP.
Trabalho financiado parcialmente pela FAPESP e CNPq.
Endereço para correspondência: Drª Aparecida Yulie Yamamoto, Unidade Multidisciplinar de Pesquisa em Virologia, FMRP/USP,
Av. Bandeirantes 3900, Campus da USP, Bairro Monte Alegre, 14049-900 Ribeirão Preto, SP. Fax (016) 633-6695.
Recebido para publicação em 03/01/97.

19
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 31:19-26, jan-fev, 1998.
Os citomegalovirus (CMV) representam
atualmente os agentes etiológicos mais comuns
de infecção congênita e perinatal em diversas
partes do mundo. A infecção congênita ocorre
em 0,2 a 2,2% dos recém-nascidos, com
incidência maior em populações de classe
sócio-econômica baixa1 18 23. A infecção perinatal,
como resultado da transmissão durante o parto,
pelo leite materno ou por transfusões de sangue,
é muito freqüente, com incidência de 5 a 38%1 15.
Os CMV pertencem ao gênero
Citomegalovírus, subfamília ß-Herpesvirinae
da família Herpesviridae. Medem 200nm e
possuem envelope, tegumento e capsídio
protéico com simetria icosaédrica. Seus genomas
são constituídos por ácido desoxirribonucleico
de fita dupla contendo cerca de 230000 pares
de bases3 14.
Na compreensão da história natural da
citomegalovirose grandes avanços tem ocorrido.
Sabe-se que a infecção congênita por CMV
pode resultar em sequelas importantes como a
surdez e o retardo do desenvolvimento neuro-
motor. A infecção perinatal pode estar associada
a pneumonites de longa evolução e gravidade
variável. Entretanto, por não se procurar o
diagnóstico rotineiro e precoce de citomegalovirose
nessas crianças, fica prejudicada a intervenção
com recursos terapêuticos que poderiam
minimizar a gravidade dos casos e particularmente
nas infecções congênitas, possibilitaria diminuir
a intensidade das seqüelas e também definir
uma população de risco para o desenvolvimento
de anormalidades futuras8 23.
O isolamento viral na urina é o método
clássico utilizado no diagnóstico da
citomegalovirose congênita e perinatal 20 .
Porém, atualmente, métodos alternativos vem
sendo utilizados para a detecção de virúria por
CMV4 13 21.
Objetivamos com este estudo avaliar a
aplicação no diagnóstico de infecção congênita
e perinatal por CMV de uma reação em cadeia
da polimerase (PCR) utilizando 3 pares de
iniciadores (primers) e comparar esta técnica
com o isolamento viral.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram testadas 305 amostras da urina de
204 crianças com idade entre 0 e 6 meses, que
foram atendidas no Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP), no
20
período de 1993 a 1995. Também, utilizou-se
amostra do protótipo de CMV humano cepa AD
169 em fluido da cultura de fibroblastos
humanos.
Isolamento viral na urina em cultura de
fibroblastos humanos com identificação do
CMV por imunofluorescência usando anticorpo
monoclonal 10 20. Cem µl de urina fresca tratada
por 1 hora com amicacina (500µg/ml) eram
inoculados em duplicata nas monocamadas de
uma linhagem celular diplóide de fibroblastos
humanos, cultivadas em meio mínimo essencial
com sais de Earle. As células eram mantidas em
microplacas plásticas de 24 orifícios, a 37oC e
em estufa de CO2. As culturas celulares eram
observadas diáriamente em microscópio
invertido (Zeiss, Alemanha), por período de até
30 dias, buscando detectar a infecção por CMV
através da visualização de efeito citopático
(ECP) característico. Neste caso, o ECP é
definido pela presença de células grandes e
arredondadas, dispostas em lesões focais ou
por toda a monocamada e contendo numerosas
granulações intranucleares e citoplamáticas.
Fazia-se confirmação posterior do isolamento
viral nas células infectadas utilizando teste de
imunofluorescência com anticorpo monoclonal
específico para CMV conjugado à fluoresceína
(Baxter, USA).
Reação de amplificação gênica em cadeia
catalisada pela polimerase (PCR) 5 6. Amostras
de urina frescas ou armazenadas a -70oC foram
testadas por PCR inicialmente utilizando o par
de primers MIE 3 6 (Tabela 1) que permite a
amplificação de uma região do gene que
codifica o principal antígeno precoce imediato
dos CMV. As amostras de urina nas quais foi
possível a detecção do ADN viral com os
primers MIE, foram testadas novamente por
PCR para confirmação da presença viral. Nos
testes confirmatórios, em todas as amostras
préviamente positivas com o primer MIE,
utilizou-se separadamente outros 2 pares de
primers, denominados gB e gH2 3 (Tabela 1),
que amplificam regiões do genoma dos CMV
co d i fi ca d o ra s d a s g l i co p ro te ín a s B e H ,
respectivamente. Em 11 dessas amostras positivas,
foi realizado também um PCR multiplex,
utilizando conjuntamente os 3 pares de primers
em um mesmo teste9. Os primers MIE foram
sintetizados no Laboratório de Hematologia do
H C FMR P-U SP e o s primers gB e gH por
GIBCO-BRL (USA).

Tabela 1- Seqüência dos primers utilizados na PCR para CMV.
Primer Seqüência
MIE 5’ CAGCACCATCCTCCTCTTCCTCTGG 3’
MIE 5’ CCAAGCGGCCTCTGATAACCAAGCC 3’
gB 5’ GAAACGCGCGGCAATCGG3’
gB 5’ TGGAACTGGAACGTTTGGC 3'
gH 5’ TGGTGTTTTCACGCAGGAA 3’
gH 5’ CCACCTGGATCACGCCGCTG 3’
A PCR era efetuada acrescentando-se a 2µl
da amostra de urina, 2,5µmol de cada um dos 4
trifosfatos de desoxinucleotídeo, 15 pmol de
cada primer, 5µl de tampão contendo 5mM de
Tris (pH 9,0), 750µM de MgCl2, 25mM de KCl e
água destilada e deionizada, completando um
volume de 50µl. A mistura era incubada a 94oC
por 6 minutos (hot start), adicionava-se 1U de
Taq ADN polimerase (Pharmacia) e a mesma
era submetida a 40 ciclos de amplificação, em
ciclador térmico (Techne, Inglaterra), a 95oC por
60 segundos, 55oC por 90 segundos e 72oC por
120 segundos, seguidos ao final por 3 minutos a
72oC. Utilizou-se como controle positivo da PCR
fluido da cultura de fibroblastos humanos
infectados com CMV cepa AD169 e como controle
negativo usou-se água deionizada.
Após eletroforese em gel de agarose a 2%,
os produtos da PCR eram corados em solução
de brometo de etídio e visualizados à luz ultra-
violeta.
Titulação do CMV AD169. Diluições decimais
e seriadas, até 1:1000, da amostra de CMV cepa
AD169 foram inoculadas, em quadruplicata,
10µl por orifício, numa microplaca de 96
orifícios contendo monocamadas de fibroblastos
humanos. As colônias foram observadas no 15º
dia pós-inoculação quando determinou-se os
orifícios em que as monocamadas apresentavam
ECP característico. Com base nesta leitura do
teste, calculou-se o título viral em dose infectante
para 50% das culturas celulares (TCID 50 ),
utilizando a técnica de Reed Muench11. As mesmas
diluições decimais e seriadas, até 1:1000, da
semente do CMV cepa AD169 foram testadas por
PCR, em quadruplicata, utilizando os 3 pares
de primers.
Análise estatística. Os resultados dos testes
PCR foram comparados com os obtidos pela
técnica padrão, o isolamento viral, utilizando
tabelas 2 x 2, com determinação da sensibilidade
e da especificidade do método. Análise da
associação entre PCR e isolamento viral foi feita
por teste qui-quadrado (p < 0,05).
Yamamoto AY et al
Tamanho do produto em pares de bases Localização no genoma
434 171074 a 171508
293 a 296 81874 a 82176
215 109961 a 110174
RESULTADOS
Os resultados observados com os controles
positivo (fluido da cultura de fibroblastos
infectados com CMV cepa AD169) e negativo
(água deionizada), foram compatíveis em todos
os testes efetuados.
Detecção do CMV na urina. Confor me
mostrado na Tabela 2, das 305 amostras de
urina testadas, isolou-se o CMV em 48 (15,7%)
e a amplificação de ADN do CMV com o par de
primers MIE foi possível em 47 (15,4%). Em 5
urinas das quais o CMV foi isolado, não se
conseguiu amplificação do DNA viral e em 4
amostras em que a PCR foi positiva, o vírus não
foi isolado. Assim, em 52/305 (17%) das urinas
foi possível a detecção do vírus, por isolamento
e/ou por PCR e, destas, 43/52 (82,7%) foram
positivas por ambas as técnicas.
Tabela 2 - Comparação entre resultados do isolamento viral e da
PCR.
Isolamento Isolamento
viral positivo viral negativo Total
PCR positivo 43 4 47
PCR negativo 5 253 258
Total 48 257 305
χ2 = 233,72 e p < 0,0001
As 52 amostras urinárias, nas quais a virúria
foi detectada por isolamento e/ou PCR, eram de
9 recém-nascidos com diagnóstico de infecção
congênita e de 15 lactentes com infecção perinatal
por CMV. Foram analisadas pelo menos 2
amostras da urina de cada uma destas crianças.
Comparação da PCR utilizando primers
MIE e o isolamento viral. Com base nos números
mostrados na Tabela 2, a copositividade entre
isolamento viral e PCR foi de 89,6% e a
conegatividade de 98,5%. O valor preditivo
positivo da PCR para o isolamento viral foi de
91,5% e o valor preditivo negativo de 98%. A
concordância entre os dois testes foi de 97%.
Observou-se alta associação entre as técnicas
(χ2 = 233,72 e p < 0,0001).
21
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 31:19-26, jan-fev, 1998.

Resultados obtidos com os diferentes pares de primers simultâneamente. Produtos genômicos

de primers. Em todas as 47 amostras de urina
positivas por PCR com os primers MIE, foi
possível a amplificação do ADN viral com os
primers gB e gH, utilizados isoladamente. Em
11 amostras, nas quais foi realizado um PCR
multiplex, ocorreu amplificação de 3 fragmentos
distintos do ADN viral, obtidos com os 3 pares
de CMV amplificados com o par de primers MIE
estão apresentados na Figura 1 e na Figura 2 os
produtos amplificados em PCR multiplex com os
primers MIE, gB e gH.
Titulação da amostra do CMV AD169 e
análise da sensibilidade da PCR. A detecção da
presença viral por PCR utilizando os primers

Figura 1 - Gel de eletroforese corado com brometo de

etídio mostrando na coluna 1 controle negativo (água
deionizada); colunas 2, 4 e 5 amostras de urina
negativas, colunas 3, 6, 7 e 8 amostras de urina
apresentando fragmento amplificado do ADN de CMV
com 430 pares de bases; coluna 9 controle positivo
(CMV AD 169); coluna 10 marcador de peso molecular.

Figura 2 - Gel de eletroforese corado com brometo de

etídio mostrando 3 fragmentos amplificados do
genoma de CMV, com 430, 296 e 215 pares de bases,
obtidos pela PCR com o uso simultâneo dos primers
MIE, gB e gH, respectivamente. Na coluna 8 encontra-
se o controle positivo (CMV AD169) e amostras
positivas de urina nas colunas 1, 2, 3, 4, 5 e 6. A coluna
7 corresponde ao controle negativo (água deionizada)
e a coluna 9 ao marcador de peso molecular.

22
 Yamamoto AY et al

MIE e gB, nos testes com as diluições decimais
da amostra de CMV AD169, ocorreu até a
diluição 1:100 e na PCR com o primer gH até a
diluição 1:10, conforme mostra a Figura 3.
A amostra do CMV AD169 mostrou título de
10 3,5 TCID 50 /ml, com base na detecção do
efeito citopático. Comparando este resultado
com aqueles obtidos por PCR nas diferentes
diluições da mesma semente viral (Tabela 3)
observou-se uma sensibilidade 50 vezes maior
d a PC R co m o s primers MIE e gB o que
permitiria detectar a presença viral em amostras
c o m t í t u l o v i ra l t ã o b a i x o q u a n t o 1 0 1,8
T C I D 5 0 / m l . Ta m b é m , o b s e r vo u - s e u m a
sensibilidade 5 vezes maior da PCR com os
primers gH, suger indo capacidade para
detectar amostras virais com título de 102,8
TCID50/ml.

Figura 3 - Gel de agarose mostrando produtos

amplificados a partir das diferentes diluições do CMV
AD169, com os 3 pares de primers pela PCR. Nas
colunas 2 (material puro), 3 (1/10), 4 (1/100) e 5
(1/1000) observa-se os resultados obtidos com os
primers MIE, nas colunas 6 (material puro), 7 (1/10), 8
(1/100) e 9 (1/1000) observa-se os resultados obtidos
com os primers gB e nas colunas 10 (material puro), 11
(1/10), 12 (1/100) e 13 (1/1000) observa-se os
resultados obtidos com os primers gH.

Tabela 3 - Positividade para CMV observada nas diferentes diluições da amostra de CMV AD169 pela inoculação em células (efeito
citopático) e pela PCR, avaliando separadamente os três pares de primers.
Diluições da amostra Efeito PCR com PCR com PCR com
de CMV AD169 citopático Primers MIE Primers gB Primers gH
nº % nº % nº % nº %
Não diluído 4 100 4 100 4 100 4 100
1:10 4 100 4 100 4 100 4 100
1:100 0 0 4 100 4 100 0 0
1:1000 0 0 0 0 0 0 0 0
Volume das diluições da semente viral inoculadas nas células: 10µl;
Volume das diluições da semente viral utilizadas na PCR: 2µl.

DISCUSSÃO
É conhecido que crianças com
citomegalovirose excretam grandes quantidades
de vírus na urina e por períodos prolongados.
As quantidades de vírus excretadas costumam
ser bem superiores às observadas em adultos
com infecção adquirida23. A detecção do CMV na
urina de recém-nascidos nas 3 primeiras semanas
de vida define a infecção congênita1 7 23. Por
outro lado, a infecção perinatal é diagnosticada
quando crianças em que a virúria era negativa

23
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 31:19-26, jan-fev, 1998.
ao nascimento, passam a apresentá-la entre a
4ª e 12ª semana de vida1 15 23. Assim, a observação
da presença viral na urina é a técnica mais
comumente utilizada para o diagnóstico dessas
infecções.
Método clássico para a detecção de virúria,
o isolamento viral, tem seu uso rotineiro
dificultado por necessitar recursos laboratoriais
dispendiosos que permitam a manutenção de
culturas celulares de fibroblastos humanos e
por exigir que as amostras de urina sejam
colhidas com assepsia rigorosa e inoculadas
logo após a coleta, uma vez que os CMV são
muito lábeis. Outro inconveniente desta
técnica é a demora na obtenção do resultado d o
ex a m e, u m a ve z q u e o s C M V s ã o d e
replicação lenta, podendo levar semanas para o
aparecimento do ECP20. A aplicação da PCR no
diagnóstico da infecção por CMV apresenta
algumas vantagens sobre o isolamento viral.
Para o teste utiliza-se volumes diminutos de
material (1 a 2µl) e o seu resultado pode ser
obtido em menos de 24 horas. Também,
as amostras clínicas a serem testadas por PCR
podem ser congeladas e armazenadas.
Utilizamos na PCR os primers MIE, gB e gH
com base em estudos prévios mostrando que
estes primers amplificam regiões distintas do
genoma altamente conservadas nas diversas
cepas do vir us e, também, possuem alta
especificidade para CMV, não amplificando o
ADN de outros herpesvirus2 5 8 16 17.
Analisando os resultados obtidos pela PCR
em nosso estudo e sua comparação com os
obtidos pelo isolamento viral, observamos
associação altamente significante entre as
técnicas (χ2 = 233,72 e p < 0,0001) e resultados
comparáveis, com sensibilidade (89,6%),
especificidade (98,5%) e valor preditivo
positivo (91,5%) adequados. Demmler e
colaboradores 6 , utilizando os primers MIE,
analisaram por PCR urinas de recém-nascidos
com infecção congênita e comparando estes
resultados com os obtidos pelo isolamento viral,
encontraram sensibilidade de 93%, especificidade
de 100% e valor preditivo positivo de 100%,
valores semelhantes aos observados em nosso
estudo.
Apesar de alguns trabalhos, como o de
Khan e colaboradores 12, demonstrarem que
existem inibidores na urina para a reação da
PCR, como a uréia, sabe-se que os recém-
nascidos, habitualmente, possuem baixos teores
de uréia, lipídios e proteínas urinárias, o que
24
reduz esta interferência com a ligação dos
primers e a amplificação do genoma viral.
Assim, a metodologia simplificada da PCR que
utilizamos neste estudo permitiu realizar teste
sem nenhum tratamento prévio com a
vantagem de evitar os complexos procedimentos
para extração do DNA viral5 16 17 21. Em nosso
estudo, observamos 5 amostras com isolamento
positivo e PCR negativa. Acreditamos que,
nestes casos, a presença de inibidores urinários
tenha interferido nos resultados, reduzindo a
sensibilidade da PCR. Estas urinas pertenciam
a 4 crianças com idade entre 3 a 4 meses e
por tanto, com teores ur inár ios de uréia
superiores aos observados nos recém-nascidos.
Neste trabalho, observamos uma adequada
sensibilidade da PCR utilizando os 3 pares de
primers. Em todos as urinas que tiveram
amplificação viral por MIE o teste mostrou-se
positivo quando utilizou-se gB ou gH. Também, a
adequada sensibilidade da técnica pode ser
observada nos experimentos com o CMV AD 169,
em que baixos níveis de vírus (101,8TCID50/ml)
mostraram-se detectáveis pelos primers MIE e
gB. Nestes experimentos a sensibilidade de gH
mostrou-se 10 vezes inferior (Tabela 3 e Figura 3).
A confirmação dos resultados obtidos na
PCR para CMV pode ser realizada através de
hibridação com seqüência de nucleotídeos
específica para a região do genoma amplificada,
marcada com isótopo radioativo ou enzima5 22.
Entretanto, tal técnica apesar de ser altamente
específica, aumenta a complexidade e o custo
do teste. A confirmação da seqüência dos
nucleotídeos de CMV obtida por PCR, também
pode ser feita por técnica denominada nested
PCR, em que se produz nova amplificação
genômica com o emprego de primers internos
à seqüência inicialmente amplificada19. Em
nosso estudo, foi possível a confirmação da
PCR para CMV utilizando mais de um par de
primers separadamente ou através de um PCR
multiplex, em que os diferentes pares de
primers são usados conjuntamente. Assim na
PCR multiplex, utilizando 3 pares distintos de
primers, amplificadores de regiões diferentes
do genoma de CMV, conseguimos obter de
forma rápida, o resultado característico com a
presença de fragmentos de tamanhos diferentes
(Figura 2), relacionados especificamente a cada
um dos primers. Nesta situação, cada produto
amplificado corresponde a um controle interno
da especificidade dos outros fragmentos
detectados no mesmo teste, dispensando

procedimentos posteriores para a confirmação
destes produtos9.
Portanto, a PCR tem uma grande aplicabilidade,
comparável ao isolamento viral no diagnóstico
da citomegalovirose, particularmente na infecção
congênita e perinatal e o uso simultâneo de
mais de um par de primers na PCR pode
aumentar a especificidade do teste, sua
rapidez, praticidade e economia.
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