FILIERE : SCIENCES DE LA VIE

PARCOURS 2 : BIOLOGIE APPLIQUEE ET ENVIRONNEMENT

Module : Microbiologie Appliquée

Partie V- Méthodes de dénombrement des

bactéries indicatrices de la pollution fécale
(Filtration)
PR. R MIMOUNI
FACULTÉ DES SCIENCES AGADIR
2012/2013
1

METHODES

y Méthodes: deux principales méthodes existent :

y la méthode du nombre le plus probable en utilisant

des milieux liquides (NPP)

y la méthode de filtration sur membrane en utilisant

des milieux solides.

2
 Méthode de filtration : concentration
y La méthode de filtration sur membrane en utilisant des milieux solides
y Permet l’élimination des substances qui inhibent la croissance microbienne
y Concentre l’échantillon et permet de tester de petits comme de grand volumes

Unité de filtration
1 poste

Entonnoir  Support pour 
membrane

Fiole à vide
Rampe de filtration à 3 postes 

Pompe à vide

Méthodes (filtration)

Entonnoir

Bactéries 
Membrane de filtration

Sens de 
passage 
de l’eau

Fiole à vide

Pore de la membrane: 
0,45 µm
 Déroulement de la manipulation
Désinfectant 
1- Désinfecter le poste
de travail

2- Stériliser la rampe de
Filtration (entonnoir, grille et couvercle)

Essuyer avec 
un torchant
propre 

Déroulement de la manipulation

Pince à bouts courbés et plats Quadrillage La face quadrillée en haut 

5- Déposer
3- Stériliser 4- Retirer une
la membrane
les bouts membrane
sur une grille
de la pince quadrillée
stérilisée par
stérile
flambage
 Déroulement de la manipulation

7- Ensemencement :
6- Verser stérilement La membrane est 8- Incubation :
le volume d’eau à filtrer: Posée sur la gélose Durée et température
100 mL (ne pas dépasser Face quadrillée appropriées
la graduation 100 mL inscrite en haut
à l’intérieur de l’entonnoir)

Lecture des résultats: Escherichia coli et Coliformes

LECTURE DES RESULTATS

Escherichia coli  Escherichia coli  Escherichia coli 

Colonies fluorescentes  Escherichia coli et Coliformes  Escherichia coli et Coliformes 

d’E. coli sous lampe UV d’une eau de rivière d’une eau résiduaire
 Norme Marocaine
ISO 9308-1

Indice de classement NM 03.7.003

Qualité de l'eau - Recherche et

dénombrement des Escherichia coli et des
bactéries coliformes

Calcul du nombre d'E. coli susceptibles d'être présents

dans 100 mL d'échantillon.
Compter les colonies oranges 
entourées par un halo jaune
Comptage des colonies présentes sur
la membrane et pouvant produire de
l'indole à partir du tryptophane
présent dans le milieu de culture
gélosé comme étant des E. coli.

Indole +

1. Test d’oxydase: Après incubation, à 44°C, la

Ce test est essentiel pour orienter présence d’indole est indiquée
l’identification des bacilles par l’apparition d’une couleur
et des coques à Gram- . rouge dans la phase alcoolique du
réactif de Kovacs.
Recherche et dénombrement des Bactéries coliformes dans les eaux traitées (NM ISO 9308-1
année 2006) Méthode par filtration sur membrane

Echantillon 
TEST PRESOMPTIF de 500 mL

Filtrer
100mL

Tergitol - 7 - TTC Membrane 0.45µm

36°C ± 2°C /21H ± 3H jusqu’à 44H ± 4H

Dénombrer les colonies typiques (Jaunes avec halo jaune) et les

colonies atypiques (différentes couleurs et morphologies)
Isoler
TEST CONFIRMATIF
TSA
36°C ± 2°C /21H ± 3H

Verser sur papier filtre 2 à 3 gouttes du réactif à l’Oxydase

Etaler une partie de la culture sur le papier filtre préparé

Apparition d’une coloration bleue / violet foncée dans les 30 ‐ +

secondes Ä réaction positive Incolore Violet

Considérer toutes les colonies ayant une réaction négative à l’oxydase

comme étant des bactéries coliformes

Nombre de colonies confirmées en UFC\100mL

Recherche et dénombrement des Escherichia coli dans les eaux traitées (NM ISO 9308-1
année 2006). Méthode par filtration sur membrane

TEST PRESOMPTIF  Échantillon de 

500 mL 

Filtrer 100mL

Membrane 0.45µm
Tergitol - 7 - TTC
44°C ± 0.5°C /21H ± 3H jusqu’à 44H ± 4H

Dénombrer les colonies typiques (jaunes avec halo jaune) et les

colonies atypiques (différentes couleurs et morphologies)
Isoler
TEST CONFIRMATIF TSA
36°C ± 2°C /21H ± 3H
Ensemencer sur eau peptonnée exempte d’indole
44°C ± 0.5°C /21H ± 3H
Réaction d’indole Ajouter 0.2 à 0.3 mL du réactif de
Kovacs dans les tubes d’eau peptonnée

Apparition d’une coloration rouge à la surface du milieu confirme

la production de l’indole Ä présence d’E. coli

Nombre de colonies Confirmées en UFC/100 mL