Les techniques d’extraction de l’ADN à

partir d’un échantillon sanguin

Annales de Biologie Clinique. Volume 57, Numéro 1, 77-84, Janvier - Février 1999, Pratique
quotidienne

Résumé  

Auteur(s) : T. Bienvenu, C. Meunier, S. Bousquet, S. Chiron, L. Richard, A. Gautheret-Dejean,

J.-F. Rouselle, D. Feldmann, Laboratoire de biochimie et génétique moléculaire, Hôpital Cochin,
123, boulevard de Port-Royal, 75014 Paris.

Résumé : Au cours de ces dernières années, la biologie moléculaire a modifié considérablement

le diagnostic de routine des maladies infectieuses, génétiques et néoplasiques. Toute étude de
génétique moléculaire implique la disposition d'échantillons d'acides nucléiques. Les
applications médicales (diagnostic moléculaire et anténatal de maladies héréditaires et de
maladies infectieuses, identification génétique en cas de recherche de paternité...) concernent en
général l'étude du génome lui-même, c'est-à-dire de l'ADN ; toutefois, l'étude des ARN est
nécessaire dans certains cas précis : quantification d'ARN viral, étude de l'expression de certains
gènes (cytokines, récepteurs...) dans des tumeurs...

Illustrations

ARTICLE

Au cours de ces dernières années, la biologie moléculaire a modifié considérablement le

diagnostic de routine des maladies infectieuses, génétiques et néoplasiques. Toute étude de
génétique moléculaire implique la disposition d'échantillons d'acides nucléiques. Les
applications médicales (diagnostic moléculaire et anténatal de maladies héréditaires et de
maladies infectieuses, identification génétique en cas de recherche de paternité...) concernent en
général l'étude du génome lui-même, c'est-à-dire de l'ADN ; toutefois, l'étude des ARN est
nécessaire dans certains cas précis : quantification d'ARN viral, étude de l'expression de certains
gènes (cytokines, récepteurs...) dans des tumeurs...

Dans la plupart des études de routine en médecine, les leucocytes sanguins représentent la source
majeure d'ADN. Les autres sources cellulaires peuvent être des biopsies (biopsie de villosités
choriales...) ou des cultures de cellules (amniocytes, fibroblastes, lignées lymphoblastiques...).
La détection de la présence d'un ou de plusieurs micro-organismes et virus peut se réaliser dans
d'autres milieux biologiques tels que sérum, liquide céphalorachidien, urine, salive, crachat,
exsudat, écouvillonnages (gorge, œil...), etc.

Dans la grande majorité des cas, la technique d'extraction des acides nucléiques doit être adaptée
à l'échantillon biologique, à la nature du génome (cellulaire, exogène), au nombre de copies dans
l'échantillon et aux méthodes de biologie moléculaire utilisées ultérieurement (polymerase chain
reaction (PCR), Southern-blot, électrophorèse en champ pulsé...).

Au cours de ces vingt dernières années, de très nombreux procédés d'extraction des acides
nucléiques ont été décrits, et des kits sont actuellement proposés par un certain nombre
d'industriels. L'objectif de ces méthodes de purification est notamment d'éliminer les
contaminants qui pourraient perturber les techniques ou réactions effectuées par la suite. Par
exemple, l'hème est un puissant inhibiteur de la Taq polymérase, qu'il est nécessaire d'éliminer
au cours de l'extraction. Il en est de même de l'héparine. C'est la raison pour laquelle il est
préférable de prélever stérilement le sang frais sur un anticoagulant du type EDTA, qui, de plus,
est un inhibiteur des nucléases. De préférence, l'extraction de l'ADN doit être réalisée sur du sang
frais, voire, en cas d'impossibilité technique, sur du sang stocké au maximum 1-2 j à 25 °C
(envoi possible par courrier) ou 7 j à 4 °C, sous peine notamment de réduire le rendement de
l'extraction d'au moins 15 %. En effet, la cristallisation lors de la congélation suivie de la
décongélation provoquent des contraintes mécaniques qui se traduisent par de nombreuses
cassures de la molécule d'ADN.

Ce texte a pour objectif de décrire les principaux procédés d'extraction des acides nucléiques et
de donner au biologiste les principaux éléments nécessaires au choix de la technique d'extraction
des acides nucléiques à partir d'un échantillon sanguin la plus adaptée à son laboratoire.

Les principaux procédés d'extraction des acides nucléiques

Les méthodes d'extraction des acides nucléiques peuvent se classer en trois principales classes en
fonction du principe auquel elles font appel : les méthodes utilisant des solvants organiques, les
méthodes utilisant des solvants non organiques, les méthodes basées sur l'utilisation de
microcolonnes de résines échangeuses d'ions.

Quelle que soit la méthode d'extraction des acides nucléiques utilisée à partir du sang
fraîchement recueilli ou décongelé, le sang doit être initialement vigoureusement mélangé à une
solution hypotonique pour faire éclater les globules rouges. Les solutions de lyse des globules
rouges sont nombreuses et variées. Par exemple, les solutions suivantes peuvent être utilisées : a)
Tris 10 mM/MgCl2 10 mM/NaCl 10 mM, b) NH4CO3H 0,9 mM/NH4Cl 131 mM, c) Tris 20 mM
pH7,5/MgCl2 5 mM et d) Tris 10 mM pH7,4/EDTA (ethylene diamine tetra-acetic acid) 10 mM.
La lyse est en général réalisée à 4 °C pendant 20 à 30 minutes.

Le lysat est centrifugé (15 min, 1 500 g) et, après élimination du surnageant, le culot cellulaire
contenant les leucocytes (0,3 % des cellules circulantes) est repris dans une solution saline (NaCl
0,15 M/EDTA 0,1 M pH 10,5, par exemple) et est traité par une solution de lyse des globules
blancs. Il existe un grand nombre de solutions de lyse en fonction de la nature du détergent
anionique utilisé. Par exemple, les solutions aqueuses suivantes peuvent être utilisées : a) TPNS
(tri-iso-propyl-naphtalene-sulfonique acid) 6 %/butanol-2 8 %/SDS (sodium dodecyl sulfate) 3
%, b) Tris 10 mM pH 7,4/EDTA 10 mM pH 8/NaCl 50 mM/Sarcosyl 2 %, c) Tris 20 mM pH
7,5/NaCl 400 mM/EDTA 2 mM/Sarcosyl 2 %. L'ADN nucléaire libéré dans le milieu est alors le
plus souvent traité par une protéinase très active, la protéinase K, qui a pour but de digérer les
protéines qui lui étaient associées. En fonction des protocoles, le traitement par la protéinase K
(10 mg/ml) est effectué 1 à 2 h à 65 °C ou 30 min à 1 h à 55 °C ou 3 à 18 h à 37 °C.

C'est à ce stade en général que les procédés d'extraction et de purification varient.

Méthodes utilisant des solvants organiques

* Méthode au phénol-chloroforme [1]. Dans cette méthode dite « de référence », le principe

consiste à traiter le lysat cellulaire dans un premier temps par du phénol volume à volume, puis,
après centrifugation (3 000 g, 10 min) à éliminer la phase phénolique, par un mélange
chloroforme-alcool isoamylique (24:1), qui a notamment pour objectif d'éliminer les traces
éventuelles de phénol qui auraient pu être emportées avec la phase aqueuse et qui sont fortement
inhibitrices des réactions enzymatiques. Le phénol, équilibré à pH 8,0, saturé en eau, dégazé,
avec ou sans agent anti-oxydant (8-hydroxyquinoléine), est un puissant agent déprotéinisant dans
lequel les acides nucléiques ne sont pas solubles. D'autres alternatives à son utilisation ont été
préconisées, telle que l'utilisation du perchlorate de sodium à 5 M (Nucleon-Bacc, Amersham
Pharmacia Biotech) [3].

* Méthode au chlorure de guanidium [2]. Le principe consiste à traiter le lysat cellulaire

obtenu après action de la solution de lyse des globules rouges par une solution d'un agent
chaotropique, le chlorure de guanidium (hydrochloride de guanidium 6 M 10 ml/acétate
d'ammonium 7,5 M 0,5 ml), puis par une solution détergente et déprotéinisante (protéinase K 10
mg/ml, 300 ml/sarcosyl 5 % 1,5 ml) 2 h à 56 °C.

Méthodes utilisant des solvants non organiques [4]

Dans ces méthodes, le principe consiste à traiter uniquement le lysat cellulaire par une solution
saline, dont l'objectif est d'éliminer par précipitation sélective les protéines. En fonction des
protocoles, des étapes de prétraitement par la RNase sont proposées. Différentes solutions salines
ont été préconisées : par exemple, NaCl 2,5 M. Quelques kits commercialisés par des industriels
utilisent ce procédé.

Méthodes basées sur l'utilisation de colonnes résines échangeuses d'ions

Ces méthodes d'extraction et de purification des acides nucléiques sont les dernières récemment
apparues. Elles sont basées sur la propriété qu'ont les particules de silice d'adsorber
sélectivement les acides nucléiques. Les solutions de lavage permettent de se débarrasser des
contaminants tels que l'hémoglobine, les protéines plasmatiques ou les ions Fe2+.

Quelle que soit la méthode utilisée pour l'extraction et la purification des acides nucléiques, la
récupération des acides nucléiques se fait en général par une élution, puis par une précipitation.

La précipitation est le plus souvent réalisée par l'alcool éthylique absolu froid à haute
concentration (2,5 volumes par volume d'échantillon) à haute force ionique (acétate d'ammonium
2,5 M). Dans ces conditions, l'ADN précipite sous forme de filaments, visibles à l'œil nu, qui
peuvent être récupérés par enroulement sur une fine baguette de verre. Le temps de précipitation
varie en fonction de la concentration des acides nucléiques, de 15 min à 10 h. Une alternative
séduisante à l'alcool éthylique consiste à utiliser l'isopropanol ; dans ce cas, le sel n'est pas
nécessaire, la précipitation se fait en général volume à volume et est particulièrement adaptée
aux grands volumes.

Dans tous les cas, le précipité est ensuite lavé avec une solution d'alcool éthylique à 70 °C pour
se débarrasser des traces éventuelles de sels ou d'isopropanol, puis séché et resuspendu dans une
solution d'hydratation (en général, Tris 10 mM pH 7,5/EDTA 1 mM).

Place des méthodes basées sur l'utilisation des microcolonnes de résines échangeuses d'ions

Au cours de ces vingt dernières années, la majorité des études de biologie moléculaire ont été
réalisées à partir d'ADN génomique extrait du sang total, soit par la méthode au phénol-
chloroforme, soit par une méthode basée sur la précipitation sélective des protéines [1]. À titre
d'exemple, sur les 26 laboratoires de biologie moléculaire effectuant le diagnostic moléculaire de
la mucoviscidose en France, 10 utilisent la méthode au phénol-chloroforme, 6 la méthode au
chlorure de guanidium, 5 la précipitation saline, 5 autres des méthodes rapides de lyse cellulaire
et 1 des colonnes de résine échangeuse d'ions [5]. Si la méthode au phénol-chloroforme est
reconnue comme la méthode de « référence » permettant l'extraction d'un ADN hautement
purifié débarrassé de la très grande majorité des contaminants possibles, elle a l'inconvénient
majeur d'utiliser le phénol, produit toxique, qui doit être manipulé avec grande précaution. Cette
méthodologie est donc peu adaptée au laboratoire d'analyse médicale de ville. Une alternative
séduisante repose sur l'utilisation de colonnes de résine échangeuse d'ions.

Dans le cadre de l'évaluation de ce procédé d'extraction de l'ADN à partir du sang total, nous
avons comparé les méthodes d'extraction de l'ADN basées sur l'utilisation de colonnes de silice
avec les méthodes basées sur l'utilisation de solvants organiques (phénol-chloroforme et chlorure
de guanidium).

Matériels et méthodes

* Produits concernés. a) Colonnes Nucleospin Blood® (cat n° 740951) (Macherey-Nagel),

préconisées pour l'extraction d'ADN génomique et pour permettre d'utiliser de petites quantités
de sang total (200 µl) (intérêt pour l'analyse du sang fœtal, du sang de nouveau-né et de
nourrisson). Les différentes solutions sont passées par centrifugation.

b) Colonnes Nucléobond AXG 100® (cat n° 740508) (Macherey-Nagel), préconisées pour

l'extraction d'ADN génomique à partir de 2 à 5 ml de sang total. Les différentes solutions passent
par sédimentation.

c) Colonnes Quiagen Blood Kit Maxi® (cat n° 24164) (Quiagen SA), préconisées pour
l'extraction d'ADN génomique à partir de 10 ml de sang. Les différentes solutions sont passées
par centrifugation.

* Échantillons. Trente prélèvements sanguins de sujets adressés aux différents laboratoires pour
un diagnostic moléculaire d'une maladie génétique (consentement écrit des sujets) ont été testés,
comprenant chacun 16 ml de sang total recueilli sur EDTA, conservé à 4 °C au maximum 1 j.
Pour chaque prélèvement, 200 µl ont été utilisés pour la méthode Nucleospin Blood®, 5 ml pour
la méthode Nucleobond AXG 100® et 10 ml pour la méthode de « référence » au phénol-
chloroforme. Par ailleurs, 30 autres prélèvements sanguins ont été testés, comprenant chacun 10
ml de sang total recueilli sur EDTA, conservé à 4 °C au maximum 1 j. Pour chaque prélèvement,
5 ml ont été utilisés pour la méthode Quiagen Blood Maxi® et 5 ml pour la méthode de «
référence » au phénol-chloroforme ou pour la méthode basée sur l'utilisation du chlorure de
guanidium.

* Techniques

a) Nucleospin blood®. Le protocole utilisé a été celui proposé par le fabricant ; les tampons B3,
B5 et la protéinase K ont été préparés suivant ses recommandations. À 200 µl de sang total sont
ajoutés 25 µl de la solution de protéinase K (20 mg/ml) et 200 µl de tampon B3. Après
homogénéisation et incubation 10 min à 70 °C, 210 µl d'éthanol absolu sont ajoutés. La solution
obtenue est alors déposée sur une colonne nucleospin, puis centrifugée 1 min à 6 000 g. La
colonne est ensuite lavée à deux reprises avec 500 µl de tampon B5, suivi d'une centrifugation de
1 min à
6 000 g. Après une nouvelle centrifugation 2 min à
6 000 g, l'ADN est élué par 200 µl de tampon Tris-HCl 10 mM pH 9 préchauffé à 70 °C suivi
d'une centrifugation 1 min à 6 000 g.

b) Nucleobond AXG 100®. À 5 ml de sang sont ajoutés 5 ml de tampon G1 et 15 ml d'eau

distillée. Après agitation par retournement, la solution est incubée 10 min dans la glace. Après
centrifugation 15 min à 1 300 g à 4 °C, le culot est repris par 1 ml de tampon G1 et 3 ml d'eau
distillée. Après une nouvelle centrifugation 15 min à 1 300 g à 4 °C, le culot est resuspendu dans
5 ml de tampon G1 et 100 µl de protéinase K (20 mg/ml) et incubé 60 min à 50 °C. La solution
additionnée de 5 ml de tampon N2 est déposée sur la colonne, préalablement équilibrée avec 2
ml de tampon N2. Après écoulement de la solution par sédimentation, la colonne est lavée avec
le tampon N3. L'ADN est ensuite élué avec 2 fois 4 ml de tampon N5. L'ADN est ensuite
précipité par l'adjonction d'une solution d'isopropanol (0,7 volume), puis la solution est
centrifugée à 5 000 g à 4 °C pendant 25 min. Le précipité est lavé avec une solution d'alcool
éthylique à 70 %. Après centrifugation à 6 000 g à 4 °C, le culot est dissous dans 250 µl de
tampon Tris-EDTA 10/1 pH 8.

c) Méthode de « référence » au phénol-chloroforme. À 10 ml de sang total sont ajoutés 30 ml de

solution de lyse des globules rouges (Tris 20 mM pH 7,5/MgCl2 5 mM). Après incubation 15
min dans la glace, la solution est centrifugée 5 min à 4 °C à 2 900 rpm. Le culot est resuspendu
dans 3,5 ml d'une solution NaCl 400 mM/EDTA 2 mM. Après addition de 200 µl de SDS à 10 %
et 80 µl de protéinase K (10 mg/ml), la solution est incubée 4 h à 56 °C. Une solution de phénol
saturée avec anti-oxydant est additionnée volume à volume. Après centrifugation à 4 000 rpm
pendant 5 min, la phase aqueuse est recueillie et traitée volume à volume par le mélange
chloroforme-alcool isoamylique 24:1. Après une nouvelle centrifugation de 10 min à 4 000 rpm,
la phase aqueuse est recueillie et l'ADN est précipité par l'addition d'une solution d'éthanol
absolu (2 volumes) et de NaCl 5 M. Après centrifugation à 6 000 g à 4 °C, l'ADN est lavé par
une solution d'éthanol à 70 %, puis séché et redissous dans 500 µl de tampon Tris-EDTA 10/1
pH 8.

d) Quiagen Blood Kit Maxi®. Le protocole utilisé a été celui proposé par le fabricant. À 5 ml de
sang total sont ajoutés 500 µl de la solution de protéinase K (20 mg/ml) et 6 ml de tampon AL.
Après homogénéisation et incubation 10 min à 70 °C, 6 ml d'éthanol absolu sont ajoutés. La
solution est alors déposée sur une colonne QiAmp maxi, puis centrifugée 3 min à 1 850 g. La
colonne est ensuite lavée avec 5 ml de tampon AW1 suivi d'une centrifugation de 1 min à 4 500
g. Elle est de nouveau lavée avec 5 ml de tampon AW1. Après centrifugation 1 min à 4 500 g et
évaporation des restes d'alcool éthylique à 70 °C pendant 10 min, l'ADN est élué par 1 ml de
tampon AE équilibré à température ambiante suivi d'une centrifugation 5 min à 4 500 g.

e) Méthode au chlorure de guanidium. À 5 ml de sang total sont ajoutés 30 ml de solution de

lyse des globules rouges (Tris 10 mM pH 7,4/EDTA 10 mM). Après incubation 30 min dans la
glace, la solution est centrifugée 10 min à 4 °C à 4 000 rpm. Le culot est resuspendu dans 40 ml
d'une solution Tris 10 mM pH 7,4/EDTA 10 mM. Après incubation 10 min dans la glace, la
solution est centrifugée 10 min à 4 °C à 4 000 rpm. Le culot est resuspendu dans 2 ml d'une
solution Tris 10 mM pH 7,4/EDTA 10 mM pH 8/NaCl 50 mM, additionnée de 10 ml de chlorure
de guanidium 6 M et de 500 µl d'acétate d'ammonium 7,5 M. Après agitation pendant 1 h, et
addition de 1,5 ml de sarcosyl à 5 % et 300 µl de protéinase K (10 mg/ml), la solution est
incubée 2 h à 56 °C. L'ADN est ensuite précipité par l'addition d'une solution d'éthanol absolue
(2,5 volumes). L'ADN est récupéré à l'aide d'une baguette en verre, puis lavé à deux reprises par
une solution d'éthanol à 70 %, puis séché et redissous dans 500 µl de tampon Tris-EDTA 10/1
pH 8.

* Critères d'évaluation de la qualité de l'ADN

Les critères d'évaluation des différents procédés ont été :

La taille des fragments d'acides nucléiques. La taille des fragments a été contrôlée par
électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8 %. Deux à 5 µl (selon le procédé) de la solution d'ADN
ont été déposés dans chaque puits d'un gel d'agarose à 0,8 % soumis à une migration sous un
courant de 100 volts pendant 2 h. Cette analyse permet, par ailleurs, d'observer une éventuelle
dégradation de l'ADN survenue au cours de l'extraction.

Le rendement de l'extraction. La concentration de l'ADN extrait a été déterminée en mesurant

l'absorbance à 260 nm des solutions diluées au 1/100 ou 1/50 (selon le procédé), sachant que 1 U
DO correspond à 50 mg/ml d'ADN. Le rendement a été calculé en réalisant le rapport entre la
quantité d'ADN obtenue et le volume initial de sang total utilisé.

La pureté. La contamination de l'ADN extrait par des protéines a été appréciée en mesurant la
densité optique des extraits à 260 et 280 nm et en effectuant le rapport DO 260 nm/DO 280 nm.
La pureté a été aussi appréciée en vérifiant l'amplification d'un fragment d'ADN par la Taq
polymérase. L'amplification d'une région de 255 pb contenant l'exon 4 du gène codant pour la
protéine SpB du surfactant ou l'amplification d'un fragment de 91 pb correspondant à l'exon 10
du gène CFTR ont été ainsi réalisées. Les fragments amplifiés par PCR ont été contrôlés par
électrophorèse sur un gel d'agarose à 2 %. La pureté a enfin été vérifiée en appréciant l'efficacité
de la simple digestion par Bcl I, et de la double digestion par les enzymes de restriction EcoRI et
EagI. Les produits de digestion ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8 %,
transférés sur une membrane Neutral (Appligène-Oncor) et hybridé avec la sonde StB12 ou la
sonde A [6].

La rapidité. Le temps nécessaire pour réaliser une extraction a été déterminé : temps réel et
temps de travail.

Résultats

Les principaux résultats quantitatifs sont regroupés dans le tableau 1. Le rendement moyen de
l'extraction de l'ADN, calculé en réalisant le rapport de la quantité d'ADN obtenu et du volume
initial de sang, était plus élevé avec les méthodes utilisant les solvants organiques qu'avec les
méthodes basées sur l'utilisation de colonnes de résine échangeuse d'ions. Avec la méthode
Nucléobond AXG 100®, le rendement pouvait varier selon l'échantillon de 4,5 à 42,6 µg/ml de
sang frais. Pour ces mêmes échantillons situés aux valeurs extrêmes, le rendement obtenu avec la
méthode « de référence » au phénol-chloroforme était de 31,7 et de 35,5 µg/ml, respectivement.
La pureté, appréciée en effectuant le rapport DO 260 nm/DO 280 nm, est correcte quelle que soit
la méthode utilisée. On observe une plus grande variation inter-échantillon avec la méthode
Nucléobond AXG 100® qu'avec la méthode « de référence ». Les rapports de DO 260 nm/DO
280 nm varient de 1,2 à 2,05 avec la méthode Nucléobond AXG 100®, alors que ce rapport ne
varie que de 1,52 à 1,97 avec la méthode « de référence ». Avec la méthode au chlorure de
guanidium, ce rapport varie de 1,62 à 1,82. Avec la méthode Quiagen Blood Maxi®, les rapports
se répartissent entre 1,62 et 1,93. Avec la méthode Nucléospin Blood®, les rapports de DO 260
nm/DO 280 nm étaient inexploitables variant de 0,6 à 3,2. Ces rapports sont la conséquence de la
coloration brunâtre des solutions d'ADN obtenues avec cette méthode, due probablement à
l'impossibilité d'éliminer la totalité de l'hémoglobine. Cette purification imparfaite de l'ADN est
probablement à l'origine de la dégradation de l'ADN lors de sa conservation à 4 °C (4
échantillons/30 en un mois). Les concentrations finales d'ADN étaient plus élevées avec les
méthodes utilisant les solvants organiques qu'avec les méthodes basées sur l'utilisation de
microcolonnes de résine échangeuse d'ions. Avec la méthode « de référence », les concentrations
variaient de 385 ng/µl à 1 140 ng/µl. Au contraire, avec la méthode Nucléobond AXG 100®, les
concentrations variaient de 60 à 852 ng/µl. De même, avec la méthode Quiagen Blood Maxi®, les
concentrations finales étaient relativement faibles de 150 à 495 ng/µl en fonction du volume final
(350 à 700 µl).

Sur un plan qualitatif, l'amplification du fragment de 255 pb ou de 91 pb a été réalisée avec

succès pour tous les échantillons extraits par les méthodes au phénol-chloroforme, au chlorure de
guanidium et par Quiagen Blood Kit Maxi®. Avec la méthode Nucléospin Blood®, l'amplification
du fragment d'ADN de 255 pb a été réalisée avec succès pour 26 des 30 échantillons dès le
premier essai. Les 4 échantillons n'ayant pas amplifié au premier essai ont été amplifiés
correctement lors d'une deuxième tentative, suggèrant plus un problème technique lors de
l'amplification que la présence d'inhibiteurs de réactions. Avec la méthode Nucléobond AXG
100®, l'amplification du fragment d'ADN de 255 pb a été réalisée avec succès pour 27 des 30
échantillons. Les 3 échantillons d'ADN n'ayant pas ou faiblement été amplifiés au premier essai
ont tous été correctement amplifiés au cours de la deuxième tentative.

Les contrôles réalisés par électrophorèse sur gel d'agarose ont permis d'apprécier la qualité et la
taille des ADN extraits par les différentes méthodes. Les ADN obtenus avec les méthodes au
chlorure de guanidium, au phénol-chloroforme, par Quiagen Blood Kit Maxi®, Nucléobond AXG
100® et Nucléospin Blood® sont en très grande majorité des fragments de grande taille (> 21 kb)
très faiblement dégradés. La concentration des ADN obtenus avec la méthode Nucléospin
Blood® est significativement plus faible (20 ng/µl environ) qu'avec les autres méthodes, mais la
variation inter-échantillon apparaît être faible.

Des échantillons d'ADN extrait par chacune des différentes méthodes (à l'exception de la
méthode Nucléospin Blood®) ont été digérés par les enzymes de restriction EcoRI et EagI et ont
été soumis à une analyse par Southern-Blot en utilisant la sonde StB12. La double digestion a été
correcte pour tous les échantillons d'ADN testés, ainsi que le transfert et l'hybridation. Les
fragments attendus de 2,8 et 5,2 kb ont été correctement visualisés avec tous les ADN testés
(figure 1). Par ailleurs, nous avons digéré par l'enzyme de restriction Bcl I des échantillons
d'ADN extrait par les méthodes phénol-chloroforme, chlorure de guanidium et Quiagen Blood
Kit Maxi® (figure 2). Les fragments d'ADN digérés ont été soumis à un Southern-blot en utilisant
la sonde A utilisée pour le diagnostic de l'inversion dans l'hémophilie A. Cette technique nous a
permis de vérifier la possibilité de détecter des fragments génomiques de grande taille de 21 Kb
avec les trois méthodes testées.

Commentaires

Quelle que soit la méthode d'extraction et de purification des acides nucléiques utilisée, nous
avons obtenu de l'ADN en qualité et en quantité suffisantes pour réaliser des actes de biologie
moléculaire. Le rendement moyen d'extraction était de 15 à 41 µg/ml de sang frais en fonction
des méthodes. Cette quantité permet de réaliser au minimum une analyse par Southern-blot et
plusieurs dizaines de réactions de PCR par ml de sang. La méthode Nucléospin Blood® ne
permet toutefois pas d'obtenir un ADN en qualité et en concentration suffisante pour réaliser
avec sécurité un Southern-blot. La pureté est considérée comme satisfaisante avec toutes les
méthodes testées. Le rapport de DO 260/280 nm a été notamment excellent avec la méthode
Quiagen Blood Kit Maxi®. En revanche, les concentrations en ADN sont nettement plus faibles
avec les méthodes basées sur l'utilisation de colonnes de résine échangeuse d'ions par rapport aux
méthodes utilisant des solvants organiques. Les concentrations en ADN obtenues avec les
méthodes Quiagen Blood Kit Maxi® et Nucléobond AXG 100® sont en moyenne de 217 et 306
ng/µl. Ces concentrations, bien adaptées à la méthode PCR, ne sont pas adaptées à des
expériences ultérieures de Southern-blot, nécessitant environ 10 µg dans un faible volume (10 à
30 µl). Il faut dans ces cas effectuer des concentrations par précipitation.

Les échantillons d'ADN extrait par les différentes méthodes testées ont été correctement
amplifiés par PCR et digérés par une ou plusieurs enzymes de restriction. Les techniques de
Southern-blot ont été réalisées avec succès avec tous les échantillons d'ADN testés, permettant
de détecter aisément des fragments de 20 kb.

En termes de temps, la méthode testée la plus rapide a été la méthode Nucléospin Blood® qui
permet d'obtenir un ADN en solution en 30 min (20 min de travail effectif). Cette méthode est
ainsi particulièrement adaptée aux échantillons sanguins de petit volume (sang fœtal, sang de
nouveau-né et de nourrisson...). La méthode Quiagen Blood Kit Maxi® permet d'obtenir un ADN
en solution en 2 h 30 (dont 1 h 35 de travail effectif). La méthode Nucléobond AXG 100®, en
l'absence de centrifugation, est plus longue, environ 5 h (dont 2 h 40 de travail effectif). Les
méthodes les plus longues sont celles utilisant les solvants organiques (6 h avec la méthode au
chlorure de guanidium et 6 h avec la méthode au phénol-chloroforme (dont 5 h 20 de travail
effectif, sans compter le temps de resuspension et d'homogénéisation de l'ADN en solution). Des
méthodes très rapides, adaptées uniquement à l'amplification par PCR de fragments génomiques,
ont été récemment commercialisées : Genereleaser® de ATGC Biotechnologie, qui consiste à
ajouter 1 µl de sang directement dans un tube PCR contenant une solution de lyse (10 mn), et
Dynabeads DNA direct® de Dynal, qui consiste à purifier de l'ADN dans un seul tube à partir de
10 µl de sang à l'aide de microbilles magnétiques (10 mn). L'avenir est probablement dans
l'automatisation de ces méthodes d'extraction de l'ADN.

En termes de coût en matériel et réactifs (tableau 2), les méthodes conventionnelles (phénol-
chloroforme, chlorure de guanidium) sont les moins coûteuses. La méthode Nucléospin Blood®
semble toutefois bien adaptée aux analyses par PCR limitées en nombre et dans le temps
(absence d'analyse complémentaire ultérieure). Les méthodes Quiagen Blood Maxi® et
Nucléobond AXG 100®, plus simples et plus rapides que les méthodes conventionnelles,
réduisent le coût en personnel et peuvent ainsi être des alternatives intéressantes dans certains
laboratoires.

Le tableau 3 récapitule les principales qualités et les principaux inconvénients des différents
procédés d'extraction des acides nucléiques à partir d'un échantillon sanguin et devrait ainsi aider
les biologistes à choisir la méthode d'extraction la plus adaptée à leur besoin.

La conservation des acides nucléiques n'a pas été testée dans cette étude. Il apparaît toutefois que
pour des préparations d'ADN purs conservés à 20 °C, l'ADN se conserve plus de 10 ans [7].

Article reçu le 7 juillet 1998, accepté le 26 octobre 1998.

REFERENCES

1. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York, 1989.

2. Jeanpierre M. A rapid method for the purification of DNA from blood. Nucleic Acids Res
1987 ; 15 : 9611.

3. Johns MB, Paulus-Thomas JE. Purification of human genomic DNA from whole blood using
sodium perchlorate in place of phenol. Anal Biochem 1989 ; 180 : 276-8.

4. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting-out for extracting DNA from human
nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988 ; 16 : 1215.

5. Atelier Biomed « Mucoviscidose », Créteil, 22-24 avril 1997.

6. Wion KL, Tuddenham EDG, Lawn RM. A new polymorphism in the factor VIII gene for
prenatal diagnosis of hemophilia A. Nucleic Acids Res 1986 ; 14 : 4535-42.

7. Madisen L, Hoar DI, Holroyd CD, Crisp M, Hodes ME. DNA banking : the effects of storage
of blood and isolated DNA on the integrity of DNA. Am J Med Genet 1987 ; 27 : 379-90.

Questions

Travail personnel ou de groupe

Copie individuelle

1- Quel est le titre de l’article ?

2- Quelles sont les applications médicales de la biologie moléculaire ?
3- Les études de biologie moléculaire se font généralement à partir de quoi
4- Est-ce que l’ARN peut être impliqué dans les études de biologie moléculaire ? quand ?
5- La biologie moléculaire a modifie le diagnostique de routine de quel type de maladie ?
6- Quelle cellule représente la source majeure d’ADN dans les études de biologie moléculaire de
routine en médecine ?
7- Quelles autres sources cellulaires peut-on avoir ?
8- Dans quel milieu biologique peut-on chercher les microorganismes et les virus ?
9- A quoi les techniques d’acides nucléiques doivent s’adapter ?
10- Quel est l’objectif des méthodes de purification ?
11- Pourquoi est-il important d’éliminer l’hème et l’héparine au cours de l’extraction ?
12- Quels est l’effet de l’EDTA sur les nucléases
13- Quel risque court-on quand on fait le prélèvement de l’ADN sur du sang qui a été stocké (non
frais)
14- Quelles sont les principales classes de méthode d’extraction
15- Décrivez brièvement les 4 premières étapes qui initient l’extraction
16- Avec qui fait-on le traitement
17- Principe de chacune des méthodes
18- Quels sont les critères d’évaluation qui ont été utilisés
19- Faite le résumé des 2 parties : résultat, commentaire