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micromachines

Article

Dispositif microfluidique pour la microinjection de


Caenorhabditis elegans
1 2 2 1,*
Reza Ghaemi , Justin Tong , Bhagwati P. Gupta et P. Ravi Selvaganapathy
1
Département de génie mécanique, Université McMaster, Hamilton, ON L8S 4L8, Canadaÿ;
reza.rkh@gmail.com Département de biologie, Université McMaster, Hamilton, ON L8S 4L8, Canadaÿ;
2
homie_tong@hotmail.com (JT); guptab@mcmaster.ca (BPG)

* Correspondance : selvaga@mcmaster.ca ; Tél. : +1-905-525-9140 (poste 27435)

Reçuÿ: 9 février 2020ÿ; Accepté : 9 mars 2020 ; Publié: 11 mars 2020

Résumé : La microinjection est une méthode établie et fiable pour administrer des constructions transgéniques et
d'autres réactifs à des emplacements spécifiques dans les vers C. elegans. Plus précisément, la microinjection d'une
construction d'ADN souhaitée dans la gonade distale est la méthode la plus largement utilisée pour générer la
transformation de la lignée germinale de C. elegans. Bien que la méthode de microinjection actuelle de C. elegans soit
efficace pour produire des vers transgéniques, elle nécessite un micromanipulateur à plusieurs degrés de liberté (DOF)
coûteux, une procédure d'alignement d'injection minutieuse et un opérateur qualifié, ce qui la rend lente et ne convient
pas à une mise à l'échelle à haut débit. Quelques microinjecteurs microfabriqués ont été développés récemment pour
résoudre ces problèmes. Cependant, aucun d'entre eux n'est capable d'immobiliser un animal librement mobile tel que
le ver C. elegans en utilisant un mécanisme d'immobilisation passif. Ici, un microinjecteur microfluidique a été
développé pour immobiliser passivement un animal librement mobile tel que C. elegans et effectuer simultanément
une microinjection en utilisant un mécanisme simple et rapide pour l'actionnement de l'aiguille. L'ensemble du
processus de la microinjection prend environ 30 s, ce qui comprend 10 s pour le chargement et l'alignement du ver, la
pénétration de l'aiguille 5 s, l'injection de réactif 5 s et le déchargement du ver 5 s. Le dispositif est adapté à haut débit
et peut être potentiellement utilisé pour créer des C. elegans transgéniques.

Mots clés : C. elegans ; microinjection; microfluidique; mécanisme conforme

1. Introduction

Le ver Caenorhabditis elegans est un organisme modèle bien développé pour les maladies neurodégénératives
telles que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson [1,2] en raison de sa petite taille (ÿ1000 cellules
somatiques), de sa connectivité neuronale bien cartographiée, de sa transparence, de son cycle de vie court (ÿ2,5
jours ), et la capacité de générer de nombreux descendants en un temps relativement court. La microinjection est la
méthode la plus fiable pour délivrer des produits chimiques, des biomolécules et des toxines à des endroits spécifiques
à l'intérieur de la cellule ou des organes cibles afin de sonder ou de perturber les réseaux biochimiques à l'intérieur des
organismes. Dans le cas du ver C. elegans, la micro-injection est utilisée pour administrer des réactifs biologiques tels
que des constructions transgéniques et d'autres composés chimiques, dans le bras distal de la gonade pour des
applications telles que toxicologique [3], transgénique [4], dépistage de médicaments [5] et des études génétiques. Les
méthodes de microinjection actuelles de C. elegans fonctionnent dans l'espace libre, nécessitent des manipulateurs à
plusieurs degrés de liberté (DOF) coûteux, des procédures d'alignement d'injecteur détaillées et un opérateur qualifié,
ce qui rend le processus d'injection lent (10 min/ver) et ne convient pas à une mise à l'échelle élevée. -débit. La
microinjection à haut débit permet de tester rapidement un plus grand nombre de candidats chimiques, génétiques ou
pharmacologiques. Grâce à ce processus, des composés actifs, des anticorps ou des gènes, qui modulent une voie
biomoléculaire particulière, peuvent être identifiés rapidement. Par exemple, la microinjection à haut débit peut accélérer
les tests qui nécessitent la livraison des constructions transgéniques dans le ver, ce qui crée généralement des mutations dans la progéniture

Micromachines 2020, 11, 295 ; doi:10.3390/mi11030295 www.mdpi.com/journal/micromachines


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Récemment, la technologie microfluidique a été utilisée pour automatiser la manipulation des cellules, des embryons et des petits organismes car

ceux-ci ont la même taille que les canaux microfluidiques [6-20]. Plus précisément, des dispositifs microfluidiques ont également été utilisés pour augmenter

la vitesse du processus d'injection [21-29]. Par exemple, Zhao et. Al. [27] ont démontré un dispositif microfluidique avec une chambre ouverte pour la

microinjection sur puce de C. elegans. Dans leur conception, les vers étaient immobilisés à long terme sur la paroi latérale d'une chambre ouverte par

aspiration. Cela peut remplacer le besoin d'huile halocarbone, qui est utilisée dans la microinjection conventionnelle pour arrêter la locomotion du ver

pendant la microinjection. Ensuite, un micro-manipulateur externe a été utilisé pour effectuer la microinjection. Bien que le dispositif microfluidique ait

permis une immobilisation rapide des vers, le système nécessitait encore une aspiration active pour positionner les vers pour l'injection et un positionnement

axial précis de la gonade était difficile à réaliser. Alternativement, Gilleland et. Al. [28] ont présenté une plateforme de microinjection assistée par ordinateur,

qui immobilisait les vers dans un hydrogel sensible à la température à l'aide d'une plateforme multipuits standard. Ensuite, des microinjections ont été

réalisées sous le contrôle d' un microscope automatisé à l'aide d'une robotique de précision. Ce système pourrait fonctionner à un taux d'injection d' environ

25 s/ver avec une fatigue minimale de l'utilisateur. Cependant, le processus nécessite encore un matériel robotique complexe pour manipuler le ver à

aiguilles dans un espace multi-DOF pour obtenir ce taux d'injection.

En résumé, les systèmes existants nécessitent soit des mécanismes d'immobilisation actifs qui utilisent
des commandes complexes, soit utilisent encore des manipulateurs multi DOF pour effectuer une injection
précise. Un mécanisme d'immobilisation actif tel que l'aspiration [28] ou le gradient de température dynamique
[29] ajoute plus de complexité au processus de microinjection tandis que l'utilisation d'huile halocarbone peut
ne pas être bien adaptée à l'injection à haut débit et au traitement des vers. Par conséquent, un dispositif de
microinjection, qui peut simultanément immobiliser le ver de manière passive et injecter des réactifs via un
mécanisme d'injection simple adapté à une microinjection à haut débit, est nécessaire. Pour atteindre cet
objectif, une conception simple dans le plan qui permet de visualiser le processus d'injection et augmente la
vitesse du processus de microinjection a été conçue, fabriquée et testée.

2. Conception de l'appareil

La conception du microinjecteur microfluidique est composée de six parties comme le montre la figure
1ÿ: (i) canal de chargement pour transférer les vers de l'entrée dans la puce, (ii) canal d'immobilisation pour
arrêter le mouvement et la locomotion du ver pour l'injection, (iii) micro-aiguille pour créer un passage à
travers le corps des vers, (iv) mécanisme d'actionnement de l'aiguille pour insérer précisément la micro-
aiguille dans la gonade, (v) système d'administration de réactif pour transférer le réactif souhaité dans le ver
après l'insertion de l'aiguille et (vi) déchargement canal (canal de lavage) pour transférer les vers injectés du
canal d'immobilisation vers le réservoir de sortie. Pour effectuer ce processus, tout d'abord, les jeunes vers
adultes C. elegans ont été transférés de la plaque de gélose à l'appareil via le système de chargement. Un
mécanisme d'immobilisation passive (canal rétréci) a été utilisé pour piéger et immobiliser le ver mobile pour l'insertion de l'aiguill
Une fois le ver immobilisé, l'aiguille d'injection a été déplacée avec précision dans le ver pour la livraison des réactifs en utilisant un mécanisme conforme

à un seul degré de liberté (DOF) couplé à un micropositionneur. Ensuite, le réactif a été délivré dans la gonade du ver au moyen d'une technique de

microinjection à pression capillaire (CPM), qui utilise un écoulement sous pression. Enfin, les vers ont été transportés vers la chambre de sortie à l'aide du

tampon M9 du canal de lavage, puis ils ont été transférés sur une plaque d'agar d'alimentation à l'aide d'une micropipette.

2.1. Système de chargement

Un canal de chargement a été conçu pour transférer les jeunes vers adultes C. elegans (d'une longueur et
d'un diamètre de 45 µm et 1000 µm, respectivement et d'un schéma de nage sinusoïdal dans le plan avec une
amplitude de 100 µm) de leur plaque de culture d'alimentation sur laquelle ils ont poussé jusqu'à la zone d'injection.
Pour ce faire, un système de chargement composé d'une seringue, d'un tube en plastique souple et des
microcanaux sur la puce microfluidique a été conçu (Figure 1). Initialement, les vers ont été lavés et transférés
de la plaque de gélose en utilisant du tampon M9 (3,0 g KH2PO4, 6,0 g Na2HPO4, 0,5 g NaCl, 1,0 g NH4Cl
Porter à 1 L avec H2O) dans une seringue, qui était attachée à l'entrée de le dispositif. Ensuite, les vers ont été
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introduit dans le dispositif en pressurisant la seringue. La largeur et la profondeur du canal de chargement étaient
définis comme étant respectivement de 300 µm et 65 µm. Le diamètre du réservoir a été fixé à 3 mm et l'intérieur
et le diamètre extérieur du tube flexible (ID de 1/32" et OD de 3/32") ont été choisis. Pour transférer le
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vers le tube, une seringue de 3 mL a été choisie qui était contrôlée par une pompe à seringue.

Figure 1. Schéma des cinq parties du microinjecteur dont un canal de chargement, immobilisation
Figure 1. Schéma des cinq parties du microinjecteur, y compris un canal de chargement, un mécanisme, un
mécanisme d'actionnement de l'aiguille, un système de distribution de réactif et un canal de déchargement.
mécanisme d'immobilisation, mécanisme d'actionnement d'aiguille, système de distribution de réactif et canal de
déchargement.
2.2. Canal d'immobilisation

Un mécanisme
2.1. Système de d'immobilisation était nécessaire pour piéger et immobiliser le jeune adulte mobile
chargement du ver C. elegans pour l'insertion de l'aiguille, après avoir chargé le ver dans l'appareil. Pour répondre à ce besoin,
Un canal de chargement
canal d'immobilisation composé dea été conçu
deux pourrétrécies
parties transférer
aules jeunes
début et àvers
la finadultes
(le bleuC. elegans (avec la longueur d'un
et diamètre
2a,b), de 45 µm
et une région et 1000
élargie µm, respectivement
au milieu et schéma de
du canal d'immobilisation (le nage sinusoïdal dans le plan avec canaux dans la figure
l'amplitude
canaux deentre
jaunes 100 µm)
deuxà canaux
partir derétrécis
leur plaque
de la de culture
figure d'alimentation
2a,b), sur laquelle
a été développée. ils ont
Les deux seété cultivés
sont jusqu'aux
rétrécis
a zone d'injection. et
une profondeur Pour
unece faire, un
largeur de système
25 µm et de
55 chargement composéPendant
µm, respectivement. d'une seringue, d'un
ce temps, la tube en plastique
profondeur souple et du canal
dans l'agrandissement
microcanaux
du sur la puce microfluidique
canal d'immobilisation, appelée «zonead'injection»,
été conçu (Figure 1). Initialement,
avait une les vers
longueur de 100 ontune
µm et étéprofondeur
lavés région
de
et chargé
été transféré de la
dans le plaque de gélose à l'aide
canal d'immobilisation parde tampon M9
application (3,0pression
d'une g KH2PO4, 6,0 g Na2HPO4, 0,5 g NaCl, 65 µm. Le ver a
positive
pousse-seringue. De plus, en raison de la charge de compression de la vis sans finde
1,0 g NH4Cl Porter à 1 L avec H2O) dans une seringue, qui a été fixée à l'entrée l'appareil.
dans le à l'entrée à l'aide du
Ensuite,
canal, les vers ont
le frottement été la
entre introduits
vis sansdans
fin etleles
dispositif
parois duencanal
pressurisant la seringue.
permettent La largeur
une position préciseetde
la l'échelle
profondeur du
micrométrique
du canal
était de2020,
chargement
Micromachines x veraaxialement
11, du été défini comme
le long étant respectivement
du canal de 300du
afin que la gonade µmver
et 65 µm. être
puisse Le diamètre du réservoir
alignée sur 3 sur 17
l'aiguille.
fixé à 3 mm et le diamètre intérieur et extérieur du tube flexible (ID de 1/32" et OD de 3/32") ont été choisis. Pour
transférer les vers dans le tube, une seringue de 3 ml a été sélectionnée, contrôlée par une pompe à seringue.

2.2. Canal d'immobilisation

Un mécanisme d'immobilisation était nécessaire pour piéger et immobiliser le jeune ver C.elegans adulte mobile
pour l'insertion de l'aiguille, après avoir chargé le ver dans le dispositif. Pour répondre à ce besoin, un canal
d'immobilisation composé de deux parties rétrécies au début et à la fin (les canaux bleus sur la figure 2a,b) et une région
élargie au milieu du canal d'immobilisation (les canaux jaunes entre deux canaux rétrécis sur la figure 2a,b), a été
développé. Les deux Figure 2. (a,b) La conception schématique du système d'immobilisation. Le canal rétréci avait 25 µm
Figure 2. (a,b) La conception schématique du système d'immobilisation. Le canal rétréci avait 25 canaux
rétrécis ayant une profondeur et une largeur de 25 pm et 55 pm, respectivement. Pendant ce temps, la profondeur de
profondeur avec
profondeur une largeur
µm avec de 55de
une largeur µm.55Laµm.
profondeur au milieu
La profondeur audu canaldu
milieu rétréci
canald'une longueur
rétréci de 100 µm était
d'une longueur
de 100 dans la région élargie du canal d'immobilisation, appelée "zone d'injection", avait une longueur de 100
augmentée
µm à 65 µm
a été augmenté à 65où
µmappelée
où appelé"zone
« zoned'injection".
d'injection ».(c)
(c) Les canaux du microinjecteur
Le microinjecteur composés
canalise µm et une profondeurde
dequatre
65 µm. Le ver a été chargé dans le canal d'immobilisation par application de canaux : canal de chargement, canal d'aiguille, canal
d'immobilisation
composé et canal
de quatre de déchargement.
canaux : canal de chargement, canal d'aiguille, canal d'immobilisation et une pression
positive à l'entrée à l'aide du pousse-seringue. De plus, en raison du chargement de compression du canal de
déchargement. la vis sans fin dans le canal, les frottements entre la vis sans fin et les parois du canal permettent un
positionnement précis à l'échelle micrométrique de la vis sans fin axialement le long du canal afin que la gonade de la vis
sans fin puisse 2.3. La taille de l'aiguille doit être alignée sur l'aiguille.

La fonction de la pointe de l'aiguille est de créer un passage à travers le tissu dans lequel elle est insérée. La forme
de la pointe et sa taille (diamètre intérieur (ID) et diamètre extérieur (OD) à la pointe) jouent un rôle important dans
l'interaction tissu-aiguille et les lésions tissulaires. Des aiguilles avec des tailles de pointe dans la gamme de 3 µm à 6 µm
ont été considérées comme appropriées pour minimiser les dommages aux tissus tout en étant suffisamment grandes
pour permettre une livraison facile des réactifs en forme cylindrique C. elegans ver avec un diamètre de ~ 45 µm. contrairement à
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2.3. Taille de l'aiguille

La fonction de la pointe de l'aiguille est de créer un passage à travers le tissu dans lequel elle est insérée. La forme
de la pointe et sa taille (diamètre intérieur (ID) et diamètre extérieur (OD) à la pointe) jouent un rôle important dans l'aiguille tissulaire
interaction et lésions tissulaires. Des aiguilles avec des tailles de pointe comprises entre 3 µm et 6 µm ont été prises en compte
adapté pour minimiser les dommages aux tissus tout en étant suffisamment grand pour permettre une livraison facile des réactifs
en ver C. elegans de forme cylindrique d'un diamètre d'environ 45 µm. Contrairement aux C. elegans conventionnels
microinjection qui utilise des capillaires avec OD/ID de 1000/500 µm pour la fabrication d'aiguilles, silice fondue
microcapillaires avec OD/ID de 90/20 µm ont été choisis pour la fabrication de l'aiguille. Cette sélection permet une
ajustement optimal et intégration simple de l'aiguille avec des dispositifs microfluidiques où les dimensions du canal
sont de 50 à 100 µm, ce qui n'était pas possible avec l'aiguille utilisée dans la microinjection conventionnelle de C. elegans.
Pour tirer les microcapillaires en silice fondue, une machine de tirage capillaire en silice fondue sur mesure a été conçue
et construit qui permet de fabriquer des micro-aiguilles coniques avec des tailles de pointe comprises entre 3 µm et 6 µm.

2.4. Actionnement de l'aiguille

Le but de la microinjection est d'injecter des biomolécules dans la gonade du ver, lorsqu'il est
immobilisé. La gonade du ver C. elegans est de forme cylindrique avec le diamètre et la longueur de
20 µm et 200 µm, respectivement. Un simple mécanisme de plainte DOF unique (comme illustré à la figure 3a,b)
a été utilisé à la place du micromanipulateur multiDOF conventionnel pour injecter dans le bras distal du
gonade. Le système était composé de trois parties : un bloc mobile, un bloc fixe et un fin flexible
membrane qui relie les deux blocs (voir Figure 3a,b). La micro-aiguille était attachée au mobile
bloc et il pourrait se déplacer par rapport au bloc fixe à l'intérieur du canal d'aiguille d'une manière similaire à

joints prismatiques. Lorsque le bloc mobile était poussé par un micropositionneur (le déplacement "D"
sur la figure 3b), il dévie la membrane flexible et, par la suite, déplace la micro-aiguille à l'intérieur du
canal de l'aiguille (le déplacement "d" sur la figure 3b). Après le déchargement du bloc mobile, le stocké
l'énergie potentielle dans la membrane (la membrane PDMS a été utilisée comme ressort) repousse le bloc mobile
Micromachines 2020, 11, x à la condition de la figure 3a). 4 sur 17
au point stationnaire (similaire

Figure 3. (a,b)
Figure La conception
3. (a,b) conceptuelle
La conception du mécanisme
conceptuelle conforme.conforme.
du mécanisme (a) Avant actionnement. (b) Après actionnement.
(a) Avant actionnement. (b)
Après que le mouvement du micromanipulateur "D" ait dévié la membrane
actionnement. Le mouvement du micromanipulateur "D" a dévié la membrane PDMS par PDMS, il a ensuite déplacé "d" le
la suite
l'aiguille
déplacéà l'intérieur du canal
"d" l'aiguille de l'aiguille
à l'intérieur dansd'aiguille
du canal un bloc fixe. (c)leCe
dans blocschéma montre
fixe. (c) comment
Ce schéma le mécanisme
montre comment conforme
a été intégré aucompliant
mécanisme mécanisme de intégré
a été chargement et d'immobilisation.
au mécanisme Le bloc
de chargement et fixe a été étendu et
d'immobilisation. Lelebloc
chargement
fixe a
du été
canal
étendu
d'immobilisation
et un canal et
deont
chargement
été créés et
surd'immobilisation
celui-ci. (d) Vueade étédessous
créé surdu
celui-ci.
mécanisme
(d) Vue
dede
plainte.
dessous(e) Le
mécanisme
géométrie de plainte.
du canal (e) La géométrie
de l'aiguille. dudu
L'épaisseur canal
canalde était
l'aiguille. L'épaisseur
uniformément dedu
65canal
µm. était uniformément
de 65 µm.

2.5. Chambre de réactif

La conception du système de livraison de réactif est illustrée à la figure 4. Il se compose d'une chambre de
réactif et d'une micro-aiguille. Dans la micro-injection conventionnelle, la micro-aiguille elle-même a été utilisée
comme réservoir de réactif puisque le volume de maintien de la micro-aiguille tirée (généralement 50 mm de longueur
et ID de 0,5 mm) était d'environ 9 L, ce qui est supérieur au volume total de réactif requis pour un ensemble de
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Afin d'intégrer le mécanisme de plainte avec le système de chargement et d'immobilisation, le fixe


bloc aFigure
été étendu et le
3. (a,b) Lacanal de chargement
conception et d'immobilisation
conceptuelle y a été intégré
du mécanisme conforme. comme
(a) Avant indiqué dans
actionnement. (b) Après la
figure actionnement.
3c. Cette conception a permis
Le mouvement duàmicromanipulateur
l'aiguille d'être bien insérée
«ÿDÿ» danslalemembrane
a dévié canal d'immobilisation tandis «ÿdÿ»
PDMS, puis déplacé que sa pointe
canal d'immobilisation.
l'aiguille à l'intérieur
Étant
du donné
canal de
quel'aiguille
le diamètre
dansextérieur
un bloc fixe.
de la(c)
tige
Cede
schéma
l'aiguille
montre
était comment a été centré avec le
mécanisme
il se rétrécit compliant
doucement a été
jusqu'à la intégré aul'aiguille
pointe de mécanisme de 3de
à 6chargement et d'immobilisation.
µm, la dimension Le bloc sur
du canal de l'aiguille fixe 90 µm,
a été étendu et un canal de chargement et d'immobilisation a été créé dessus. (d) La vue
bloc fixe et mobile a été sélectionnée comme illustré à la figure 3e (la profondeur des canaux a été de dessous du
mécanisme
garantissait que lade plainte. (e) La
micro-aiguille géométrie
pouvait du canal
se déplacer ende l'aiguille.
douceur dansL'épaisseur duàcanal
un bloc fixe était tout
la pointe de 65
enµm).
étantCela
uniformément 65
µm. solidement attaché au bloc mobile.

2.5. Chambre
Chambre de réactif 2.5.
de réactif

conception du
La conception du système
système de
de distribution
livraison dede
réactif estest
réactif illustrée à la
illustrée figure
à la 4.4.
figure Il se compose
Il se composed'une
d'unechambre
chambredederéactif
réactif
et micro-aiguille.
d'une micro-aiguille. Dans
Dans la la micro-injection
microinjection conventionnelle,
conventionnelle, la micro-aiguille
la microaiguille elle-même
elle-même a étécomme
était utilisée utilisée réservoir
comme réactif
de réactif
réservoir
étant puisque
donné le volume
que le volume de maintien
de maintien de lade la micro-aiguille
micro-aiguille tirée (généralement
tirée (généralement 50longueur
50 mm de mm de longueur et mm)
et ID de 0,5 ID deétait
90,5
µL,mm) était
ce qui d'environ
est supérieur9 µL, ce qui est
au volume supérieur
total aunécessaire
du réactif volume total de un
pour réactif requis de
ensemble pour un ensemble(généralement
microinjection d' environ
=microinjection (généralement
~ 2 µL). Cependant, ~ 2de
le volume µL). Cependant,
maintien le volume
de l'aiguille deOD
(avec maintien de l'aiguille
= 90 µm, ID = 20 µm,(avec OD = 90
longueur deµm,
80 ID
mm)
20 µm, longueur
extrêmement petitde(~25
80 mm) utilisé
nL) et dans
ne peut cette
pas conception
contenir tout leest extrêmement
réactif nécessairepetit
pour (~25 nL) et ne peut pas être utilisé dans cette conception est
accueillir
la tous les
micro-aiguille a réactifs nécessaires
été connectée à une série
à un capillaire en d'injections. Par conséquent,
verre plus grand la micro-aiguille était un ensemble d'injections. Par conséquent,
(ID = 0,5 mm,
connecté
afin à un capillaire
de stocker en verre
le réactif lors de laplus grand (ID =comme
microinjection 0,5 mm, OD = 1 mm, longueur = 25 mm) afin de stocker le OD = 1 mm, longueur = 25 mm)
schématiquement
réactif pendant
illustré la microinjection
sur la figure comme
4. Le réservoir illustré
peut être schématiquement
connecté sursoit
ultérieurement la figure
à une4.source
Le réservoir peut être
de pression pourconnecté
ensuite
débit à une par
entraîné source de pression pour un écoulement entraîné par la pression.
la pression.

Figure 4. Schéma de la microaiguille (OD = 90 µm, ID = 20 µm, longueur = 80 mm) connectée au


Figure 4. Schéma de la microaiguille (OD = 90 µm, ID = 20 µm, longueur = 80 mm) connectée à la chambre
de réactif (ID = 0,5 (mm), OD = 1 (mm), longueur = 25 (mm)) .
chambre de réactif (ID = 0,5 (mm), OD = 1 (mm), longueur = 25 (mm)).
2.6. Déchargement et placage de vis sans fin
2.6. Déchargement et placage de vis sans fin
Une fois le réactif livré, le ver doit être déchargé du canal d'immobilisation
Une fois que le réactif a été livré, le ver doit être déchargé de l'immobilisation et plaqué sur une plaque de gélose standard pour la
récupération. Pour cette tâche, le réservoir de sortie a été laissé ouvert pour
canal et plaqué sur une plaque de gélose standard pour la récupération. Vers cette tâche, le réservoir de sortie
était l'atmosphère en perçant un trou de sorte qu'il n'y ait pas de zones mortes pour l'accumulation des vers comme
laissé ouvert à l'atmosphère en perçant un trou de sorte qu'il n'y ait pas de zones mortes pour l'accumulation de montré précédemment
dans la figure 1. Lorsqu'un ver individuel a été injecté, le canal de chargement a été fermé
leslevers
et ver comme indiqué
a été poussé précédemment
manuellement dansd'une
à l'aide la figure 1. Lorsqu'un
seringue vercanal
reliée au individuel a étéau
de lavage injecté, le chargement
réservoir de sortie ouvert. Le réservoir ouvert a également permis de ramasser facilement les vers individuels immédiatement
après injection à l'aide d'une micropipette, puis étalez-la sur une plaque de gélose comme illustré à la figure 1. Ensuite,
le cycle d'injection a été répété à un autre ver.

3. Fabrication de l'appareil

La fabrication du dispositif de micro-injecteur est un processus en plusieurs étapes consistant en la fabrication de puces PDMS
par technique de lithographie douce, fabrication du mécanisme compliant et assemblage final du
micro-aiguille avec la puce PDMS. Le flux de processus pour la fabrication de l'appareil est illustré à la figure 5.
Tout d'abord, le moule principal a été fabriqué en utilisant une combinaison de processus de photolithographie et d'imprimante 3D
(Figures 5a à c). Ensuite, les interconnecteurs ont été placés sur le moule principal et le prépolymère PDMS a été coulé
dessus (Figure 5d,e). Par la suite, une micro-aiguille a été créée à l'aide d'un extracteur d'aiguille sur mesure et
préparé pour le chargement de réactif (figure 5g, h). Ensuite, la puce élastomère PDMS a été pelée du moule
et il a été assemblé avec microneedle. Enfin, la puce a été collée sur une lame de verre (Figure 5f-k).
. ,
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processus et imprimante 3D (Figure 5a–c). Ensuite, les interconnecteurs ont été placés sur le moule principal et le prépolymère PDMS a été coulé dessus

(Figure 5d, e). Par la suite, une micro-aiguille a été créée à l'aide d'un extracteur d'aiguille sur mesure et préparée pour le chargement de réactif (figure 5g,

h). Ensuite, la puce élastomère PDMS a été pelée du moule et elle a été assemblée avec une micro-aiguille. Enfin, la puce Micromachines 2020, 11, 295 a

été collée sur une lame de verre (Figure 5f-k).


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Figure 5. Le flux de processus pour la fabrication de l'appareil. (a) Motif de la première couche de SU8 avec une épaisseur de
Figure 5. Le flux de processus pour la fabrication de l'appareil. (a) Pattering de la première couche SU8 avec une
épaisseur de 40 µm. (b) Pattering de la deuxième couche SU8 avec une épaisseur de 25 µm sur la première couche. (c) Saisie de
40 µm. (b) Pattering de la deuxième couche SU8 avec une épaisseur de 25 µm sur la première couche. (c) la pièce
en ABS (épaisseur de 2 mm) créée par une imprimante 3D pour fabriquer un moule maître hybride. (d) Placement
Fixation de la pièce en ABS (épaisseur de 2 mm) créée par imprimante 3D pour fabriquer un master hybride
des interconnecteurs (tubes en silicone) sur motif SU8. (e) Coulée de PDMS (1:10) sur le moule principal pour
mouler. (d) Placement des interconnecteurs (tubes en silicone) sur le modèle SU8. (e) La coulée de PDMS crée
une couche de dispositif de 3 mm et une membrane PDMS de 1 mm pour un mécanisme conforme. (f) Décollage du
(1:10) sur le moule mater pour créer une couche de dispositif de 3 mm et une membrane PDMS de 1 mm pour un substrat
PDMS conforme à partir du moule principal. (g) Extraction de la microaiguille du capillaire en silice fondue et (h)
mécanisme. (f) Décollage du substrat PDMS du moule principal. (g) Tirer sur la connexion de la micro-aiguille à un
capillaire plus grand pour stocker le réactif. (i) Assemblage de la micro-aiguille
micro-aiguille du capillaire de silice fondue et (h) connexion de la micro-aiguille à un capillaire plus grand et à une puce PDMS.
( k ) Collage de la puce PDMS à la lame de verre à l'aide d'une liaison à l'oxygène sec.
stocker le réactif. (i) Assemblage de la microaiguille et de la puce PDMS. ( k ) Collage de la puce PDMS à la lame
de verre
Pour à l'aide d'une
commencer liaison à l'oxygène
le processus, sec.
la première couche du photomasque (Figure 6a) a été modelée sur un SU8 de 40 µm
(SU-8-2075, Microchem Corp, Newton, MA, USA) qui a été centrifugé sur une tranche de silicium (76 mm de diamètre,
Université Wafer, South Boston, MA. ETATS-UNIS). Le même processus a été répété pour créer la deuxième couche
du motif (Figure 6b) sur la première couche avec une épaisseur de 25 µm. Pour créer les fonctionnalités
lié au mécanisme conforme, un bloc ABS avec la dimension de base de 3,5 × 3 mm2 et 2 mm
la hauteur a été imprimée en 3D et attachée aux structures SU8 sur une plaquette de silicium (à une distance de 1 cm de
le canal d'immobilisation) pour créer le moule composite final comme illustré à la figure 6c. Une fine couche
(~ 50 µm) de 1: 2 (PDMS à agent de durcissement) prépolymère PDMS a été utilisé comme colle. Enfin, le moule
a été chauffé (75 ÿC pendant 1h) pour durcir le PDMS. Afin d'avoir accès à l'entrée et au canal de lavage,
des tubes en silicone avec ID 1,5 mm et OD de 4,8 mm et 10 mm de longueur ont été utilisés. Les tubes ont été placés
sur les réservoirs correspondants sur le moule SU8 (voir Figure 6c,d). Cette méthode a permis de compléter
intégration des interconnexions avec le dispositif PDMS avec une excellente étanchéité.
chiffre c. n ayer ~ µm o : o curng agen le pré polymère a été utilisé comme colle
Machine Translated by Google
électronique. Enfin, le moule a été chauffé (75 ° C pendant 1 h) pour durcir le PDMS. Afin d'avoir accès au canal d'entrée et de lavage, des tubes en silicone

avec ID 1,5 mm et OD de 4,8 mm et 10 mm de longueur ont été utilisés. Les tubes ont été placés sur les réservoirs correspondants sur le moule SU8 (voir

Figure 6c,d). Cette méthode a permis une intégration complète des interconnexions avec le dispositif PDMS avec Micromachines 2020, 11, 295 excellente

étanchéité. 7 sur 17

Figure6.6.Le
Figure Lemodèle
modèle de microcanaux
microcanauxpour
pour(a)
(a)lalapremière
premièreetet
(b)(b)
la la
deuxième couche
deuxième desdes
couche microcanaux. (c)
microcanaux.
LeLe
(c) maître
moulemoule composé
maître dede
composé deux types
deux dede
types moules (profil
moules et et
(profil traits fins).
traits LeLe
fins). modèle SU8
modèle sursur
SU8
laLa plaquette
plaquette dede silicium
silicium a défini
a défini lesles caractéristiques
caractéristiques fines
fines avec
avec une
une résolution
résolution dede
1010
µmµm
et et
le le motif
motif ABSABS utilisé
utilisé pour
pour créer
créer le
delecours
parcours présente
de silicium uneune
avec résolution minimale
résolution de 100
minimale µm.µm.
de 100 (d) (d)
Le moule maître
Le moule après
maître avoir
après mismis
avoir desles
caractéristiques
tubes en silicone
(ID 1,5(ID
tubes mm 1,5de
mmet et
OD ODde
de4,8
4,8mm
mm et 10 mm
et 10 mmde
delongueur)
longueur)
sursur
les les motifsSU8
modèles SU8 afin
afin d'avoir
d'avoir accès au
un canal
d'entrée
accès auet canal
de lavage après
d'entrée et la
decoulée
lavagedu PDMS.
après la coulée du PDMS.

La
Laprochaine
prochaine étape après
étape la fabrication
après du moule
la fabrication était laétait
du moule coulée PDMS. PDMS.
la coulée Pour ce Pour
faire, le
cePolydiméthylsiloxane
faire, mélange de (PDMS)
prépolymères de polydiméthylsiloxane (kit Sylgard 184, Dow Corning Corp., Midland,
(PDMS) mélange de prépolymères (kit Sylgard 184, Dow Corning Corp., Midland, MI, États-Unis; MI, USAÿ;rapport
rapport10:10ÿ:ÿ1
1 de etde la base
agent de et
la base réticulation)
l'agent de aréticulation)
été coulé sur le moule
a été principal
coulé sur et durci
le moule maîtreà température ambiante pendant
et durci à température ambiante24pendant
h. Le volume
24 h. Le
prépolymère
le volume duPDMS distribuéPDMS
prépolymère (25 ml) dans une
distribué (25boîte de Pétri
ml) dans unede 10 de
boîte cm Pétri
(diamètre)
de 10 correspondait
cm (diamètre) àcorrespondait
un à une
épaisseur approximative
à une épaisseur de 3 mm
approximative deet31mm
mmetdans la dans
1 mm section de la PDMS
la puce puce PDMS et du mécanisme
et le mécanisme conforme,
conforme respectivement.
Ensuite,
section,l'élastomère PDMS aEnsuite,
respectivement. été décollé du moule maître,
l'élastomère PDMS le PDMS supplémentaire
a été décollé a étéprincipal, le surplus a été
du moule
coupé et les
Le PDMS chambres
a été coupé et de
lessortie ont été
chambres perforées
de sortie ont étéavec un outil
percées avecde
un biopsie d'un diamètre
outil de biopsie de 8 mm.
dont le diamètre du Puis,
substrat PDMS Ensuite,
8 millimètres. a été coupé le long PDMS
le substrat des lignes rouges
a été coupécomme
le long le montre
des ligneslarouges
figure 7a pour le
comme rendre le mécanisme
montre la figure 7a conforme.
pour
faire le Dans cette configuration, les blocs mobiles et fixes ont été connectés à la membrane PDMS via
mécanisme conforme. Dans cette configuration, les blocs mobiles et fixes étaient connectés aux lignes A" et "Line
"B" (lignes bleues),
Membrane PDMS via respectivement, comme
"Ligne A" et "Ligne B" illustré
(lignes àbleues),
la figure 7b. Habituellement,
respectivement commeune petite quantité
le montre la figure de
7b.PDMS
le
prépolymère s'infiltre
Habituellement, unedans
petitelequantité
tube de de
silicone pendantPDMS
prépolymère le processus
s'infiltrede coulée
dans PDMS
le tube en raison
de silicone dede
lors salafaible énergie
coulée du de surface.
PDMS . Par conséquent, après durcissement et décollement du PDMS, l'intérieur des interconnecteurs a été perforé.
à l'aide d'un outil de biopsie pour les ouvrir.
L'étape suivante est l'intégration de la micro-aiguille dans le substrat PDMS. Pour ce faire, le
Le substrat PDMS a été inversé et placé sous microscope optique (objectif 10–20x) de sorte que le
les fonctionnalités de microcanal étaient accessibles par le haut pour l'intégration de l'aiguille. Ensuite, la micro-aiguille a été
délicatement placé sur le substrat PDMS, positionné et aligné de manière à ce que la pointe de la micro-aiguille soit à
une distance d'environ 100 µm à 200 µm du canal d'immobilisation. Ensuite, la tige de la micro-aiguille
l'ensemble a été inséré dans le canal de l'aiguille sur le bloc mobile comme illustré schématiquement sur la figure 8a.
Étant donné que la taille du canal de l'aiguille sur le bloc mobile correspondait bien au diamètre extérieur du
l'aiguille elle-même, il maintenait fermement l'aiguille à cet endroit et empêchait tout autre mouvement de la
l'aiguille au cours des processus ultérieurs. Ensuite, une gouttelette (~ 1 µL) du prépolymère PDMS (rapport 4: 1 du
base et agent de réticulation) a été étalé sur le bloc mobile pour attacher complètement la micro-aiguille au mobile
Machine Translated by Google

Micromachines 2020, 11, 295 8 sur 17

Micromachines 2020, 11, x 7 sur 17

bloquer. Après
processus durcissement
en raison rapide
de sa faible de la colle
énergie PDMS Par
de surface. (voirconséquent,
le point noir après
sur le bloc mobile deet
durcissement la décollement
figure 8a) à l'aide
du d'un
PDMS, la flamme intérieure, la puce PDMS a été retirée du microscope pour
des interconnexions ont été perforées à l'aide d'un outil de biopsie pour les ouvrir. le collage (figure 8b).

Figure 7. Étapes et schéma de la coupe et de la mise en sac de la puce PDMS (a) La puce PDMS après la coupe et la mise en
poche. (b) La puce PDMS après avoir coupé et libéré le bloc mobile. (c)
Schéma des différentes parties de la puce PDMS après coulée.

L'étape suivante est l'intégration de la micro-aiguille dans le substrat PDMS. Pour ce faire, le substrat PDMS
a été inversé et placé sous microscope optique (objectif 10–20x) de sorte que les caractéristiques du microcanal
soient accessibles par le haut pour l'intégration de l'aiguille. Ensuite, la microaiguille a été doucement placée sur
le substrat PDMS, positionnée et alignée de sorte que la pointe de la microaiguille soit à une distance d'environ
100 µm à 200 µm du canal d'immobilisation. Ensuite, la tige de l'ensemble de micro-aiguille a été insérée dans le
canal d'aiguille sur le bloc mobile, comme illustré schématiquement sur la figure 8a. Étant donné que la taille du
canal d'aiguille sur le bloc mobile correspondait bien au diamètre extérieur de l'aiguille elle-même, elle maintenait
fermement l'aiguille à cet endroit et empêchait tout autre mouvement de l'aiguille au cours des processus ultérieurs.
Ensuite, une gouttelette (~ 1 µL) du prépolymère PDMS (rapport 4: 1 de la base et de l'agent de réticulation) a été
étalée sur le bloc mobile pour attacher complètement la microaiguille au bloc mobile. Après durcissement rapide
de la colle PDMS (voir le point noir sur la figure 7. Étapes et schéma de la découpe et de la mise en sachet de la
puce PDMS
Figure 7. Étapes(a) La puce
et schéma dePDMS après
la découpe et derognage
la mise en sachet de la puce PDMS (a) La puce PDMS après le bloc mobile de
la figureparage
8a) à l'aide
libéré leetblocd'une
mise flamme,
mobile. (c)(b)
en sac. la
Schémapuce PDMS a été retirée
La pucedePDMS après du microscope
avoir coupé et libéré lepour
bloclamobile.
mise en(c)poche. (b)(Figure
collage La puce PDMS
8b). après parties
différentes avoir coupé et
de la puce PDMS
Schéma après
des coulée.parties de la puce PDMS après coulée.
différentes

L'étape suivante est l'intégration de la micro-aiguille dans le substrat PDMS. Pour ce faire, le substrat PDMS a été inversé et placé sous
microscope optique (objectif 10–20x) de sorte que les caractéristiques du microcanal soient accessibles par le haut pour l'intégration de
l'aiguille. Ensuite, la microaiguille a été doucement placée sur le substrat PDMS, positionnée et alignée de sorte que la pointe de la microaiguille
soit à une distance d'environ 100 µm à 200 µm du canal d'immobilisation. Ensuite, la tige de l'ensemble de micro-aiguille a été insérée dans le
canal d'aiguille sur le bloc mobile, comme illustré schématiquement sur la figure 8a. Étant donné que la taille du canal d'aiguille sur le bloc
mobile correspondait bien au diamètre extérieur de l'aiguille elle-même, elle maintenait fermement l'aiguille à cet endroit et empêchait tout
autre mouvement de l'aiguille au cours des processus ultérieurs. Ensuite, une gouttelette (~ 1 µL) du prépolymère PDMS (rapport 4: 1 de la
base et de l'agent de réticulation) a été étalée sur le bloc mobile pour attacher complètement Figure 8 (a) Un schéma des processus
d'assemblage de l'aiguille et des différentes parties de la puce. (b) La micro-aiguille au bloc mobile. Après durcissement rapide de la colle
PDMS (voir le point noir sur la figure 8. (a) Un schéma des processus d'assemblage de l'aiguille et des différentes parties de la puce. (b) Le

Puce sur
bloc mobile PDMS après assemblage de l'aiguille.
l'aiguille.la figure 8a) à l'aide d'une flamme, la puce PDMS a été retirée du microscope pour la puce PDMS après l'assemblage de
collage (Figure 8b).
Le collage
étape était
de la la dernière
fabrication étape de d'injection.
du dispositif la fabrication
Ledu dispositif
substrat PDMSd'injection.
et Le substrat PDMS et un collage était la dernière
Des lames
plasma, delame
une verrededeverre
75 × de
25 75
mm2 ontmm2
× 25 été exposées à un à
a été exposée plasma d'oxygène
un plasma de 50de
d'oxygène W50
pendant 70 s.70
W pendant Depuis la machine
s. Depuis à
la machine à plasma
travaillé à bas de
à bas niveau niveau de pression,
pression, l'eau DI l'eau DI présente
présente à l'intérieur
à l'intérieur de la chambre
de la chambre delors
de réactif réactif lors de l'ouverture a travaillé
de l'ouverture
la pointe s'est évaporée. Par conséquent, après avoir retiré la puce PDMS de la machine à plasma, le réactif
chambre a été remplie de réactif qui est nécessaire pour la microinjection. Une fine couche de graisse était
puis étalé sur le bloc mobile pour réduire le frottement du mouvement lors de l'actionnement de l'aiguille.
Ensuite, la puce PDMS a été placée sous microscope et une seringue de 10 ml a été connectée au
chambre de réactif. En pressurisant la chambre de réactif, l'aiguille a été testée pour un fonctionnement approprié
et colmatage. Si l'aiguille était bouchée, un scalpel pointu et propre a été utilisé pour toucher doucement la pointe de
la micro-aiguille qui déloge tout résidu accumulé à la pointe et ouvre la micro-aiguille. Il est
Il est important de noter que la force pendant le toucher ne doit pas être élevée pour ne pas casser l'aiguille.
Enfin,Figure
la lame8 de verre
(a) Un a été des
schéma placée sur la d'assemblage
processus puce PDMS et dele processus
l'aiguille et desde collage aparties
différentes été terminé (voir(b) Le schéma 9).
de la puce.
Puce PDMS après assemblage de l'aiguille.

Le collage était la dernière étape de la fabrication du dispositif d'injection. Le substrat PDMS et une lame de
verre de 75 × 25 mm2 ont été exposés à un plasma d'oxygène de 50 W pendant 70 s. Étant donné que la machine à
plasma fonctionnait à faible niveau de pression, l'eau DI présente à l'intérieur de la chambre de réactif lors de l'ouverture
la chambre de réactif. En pressurisant la chambre de réactif, l'aiguille a été testée pour convenir à la
Machine Translated
chambreby
de Google
réactif. En pressurisant la chambre de réactif, l'aiguille a été testée pour un fonctionnement
approprié douce
opération et un colmatage. Si l'aiguille
et un colmatage. était bouchée,
Si l'aiguille un scalpel
était bouchée, pointu pointu
un scalpel et propre a été utilisé
et propre a été pour
utiliséune
pour toucher
ouvre doucement
le toucher la pointeladepointe de la micro-aiguille
la micro-aiguille qui délogequitout
déloge tout
résidu résidu accumulé
accumulé à la
à la pointe etpointe
ouvre etla
micro-aiguille . Il est important de noter que la force lors du toucher ne doit pas être
la micro-aiguille. Il est important de noter que la force lors du toucher ne doit pas être élevée pour ne aussi élevée que
pas
Micromachines 9 sur 17
et le casser l'aiguille.
processus 2020,
de Enfin,
11, a295
liaison la
étélame
cassedel'aiguille.
achevé verre
(voir alaété
Enfin,
placée
figure la
9) lame
asur
étéla
depuce
verrePDMS
achevé a étélaplacée
(voir etfigure
le procédé
sur
9) la puce
de collage
PDMS

Figure 99 (a)
Figure (a) Un
Un schéma
schéma et
et (b)
(b) une
une puce PDMS
PDMS du microinjecteur
microinjecteur final
final de
de C.
C. elegans
elegans ..
Figure 9. (a) Un schéma et (b)puce
une pucedu
PDMS du microinjecteur final de C. elegans.

4.
4. Configuration
4. Configuration
Montage expérimentale
expérimentale
expérimental
Le
La montage
montage expérimental
expérimental
configuration (Figure
(Figure
expérimentale 10)10)
se se composait
composait
(Figure de trois
10) sedecomposait
trois parties
parties principales
deprincipales
trois : principalesÿ:
Système
: Système
parties fluidique,
fluidique, optiqueoptique
le système
système Le
fluidique,
introduire le système
les vers et optique
le et le
dispositif dispositif microfluidique.
microfluidique. Le système Le système
fluidique fluidique
qui a servi qui
à a été
introduire utilisé
système et le dispositif microfluidique. Le système fluidique qui servait à introduire les vers dans l'appareil et l'appareil
les pour
vers dans
àles
délivrer lesdans
réactifs
l'appareil et réactifs dans
la vis
délivrer dessanslafin,
vis consistait
réactifs sans
dans fin, consistait
la visensans encomposé
un réservoir
fin, un d'air
réservoir
d'und'air
sous sous àpression
pression
réservoir 4 (bar)
d'air sous,àRégulateur
4pression
(bar), etààde4délivrer
pression
(bar),
d'un régulateur
Regulator, ARO,de pression
Ingersoll (2000
Rand, Series
Bryan, Regulator,
OH, USA) etARO,
une Ingersoll
électrovanneRand, Bryan, Ohio,
(S10MM-30-12-3,
régulateur de pression (2000 Series Regulator, ARO, Ingersoll Rand, Bryan, Ohio, USA) et une électrovanne solénoïde
USA) (2000
et d'un Series
(S10MM-30-12-3,
Pneumadyne,
vanne Inc.,3-Way
(S10MM-30-12-3, 3Normally
Plymouth,
voiesMN, Closed, Pneumadyne,
États-Unis).
normalement Le système
fermées, Inc., Plymouth,
optique
Pneumadyne, Inc.,MN,
utilisé USA). The
Plymouth, MN, 3-Way Normally
États-Unis). Closed,
Le système
optique
(modèle
Le utilisé pour observer,
500optique
système contrôler
utilisé pour et enregistrer
observer, le enregistrer
contrôler et processus d'leinjection
processusconsistait en un
d'injection microscope
consistait optique
en un
microscope
LumaScope, optique
Etaluma, (Modèle
Inc., 500 LumaScope,
Carlsbad, CA, USA),Etaluma,
un Inc,
appareil Carlsbad,
photo CA,
numériqueUSA), appareil
(Flea3
(microscope optique Flea3 (Modèle 500 LumaScope, Etaluma, Inc, Carlsbad, CA, USA), appareil photo photo
FLs-U3-32S2C, numérique
FLIR® Systems,
numérique (Flea3
FLs-U3-32S2C,
FLs-U3-32S2C,
Inc.,Systems,
FLIR®
FLIR®
Pittsburgh,
Systems, Inc.PA , USA)
Inc.
et logiciels
,, Pittsburgh,
Pittsburgh, (Labview©,
PA, USA)
PA, USA) logiciel
et logiciels
et logiciels flyCapture2©
(Labview©,
(Labview©,
, Version 2.13.3.61, FLIR®
flyCapture2©
flyCapture2©
logiciel,
logiciel, version Systems,
microfluidique,
version 2.13.3.61,Inc.,
2.13.3.61, FLIR®
FLIR® Systems,
Pittsburgh,
Systems,PA,Inc. ,, Pittsburgh,
Pittsburgh,
USA). Le dispositif
Inc. Pennsylvanie,
microfluidique, États-Unis).
qui aÉtats-Unis).
Pennsylvanie, Le dispositif
été utilisé pour
Le dispositif
effectuer l'injection
microfluidique,
dans
qui le ver
a été qui
poura effectuer
été constitué
C. elegans,
utilisé utilisél'injection
pour effectuer
d'une l'injection
puce le
dans dans(dont
microinjecteur le ,ver
ver C. elegans selaC. elegans d'une
fabrication
composait , aconsistait
étépuce en
décrite une puce
dans microinjecteur
les précédents
microinjecteur (dont la
fabrication
(dont a été décrite
d'un micropositionneur
la fabrication dans
décritele dans
a été(Micrometer chapitre
fine précédent)
focus
le chapitrelinearet d'un micropositionneur
stage,
précédent) Model ( chapitre
A LHFF, Ligne
et un micropositionneur Tool Micrometer
Co.,
(Micrometer finefine focus) et
focus
Allentown,
platine
linéaire, PA, USA).
linéaire,
modèle modèle
A LHFF,ALine
LHFF, Line
Tool Tool
Co., Co., Allentown,
Allentown, PA, USA). platine
PA, USA).

Figure
Figure 10.
Figure10. Configuration
10.Configuration expérimentale
Configurationexpérimentale utilisée
expérimentaleutilisée pour
utiliséepour la
pourla microinjection
lamicroinjection de
microinjectionde C.
deC. elegans
C.elegans composée
eleganscomposée de
composéede trois
detrois parties
troisparties principalesÿ:
partiesprincipales
principalesÿ:
: Fluidique
Système
système,fluidique,
système système
optique optique
et et micropuce.
micropuce.
Système fluidique, système optique et micropuce.

Le micropositionneur
Le micropositionneur
micropositionneur fixéau
attaché
attaché aubloc
bloc
au mobile
bloc mobile
mobile sur
sur puce
sur
pucepucemicrofluidique
microfluidique
microfluidique (voir
(voir
(voir Figure
9b)9b)
Figure
Figure 9b) aétait
devaitété utilisé
Le
déplacer
avec pour
utilisé précision la microaiguille
déplacer avec précision avec une résolution
la micro-aiguille derésolution
avec une 5 µm. Lederéservoir
5 µm. Lede pression
réservoir sousd'air étaitd'air
pression reliéa à
été utilisé pour déplacer avec précision la micro-aiguille avec une résolution de 5 µm. Le réservoir sous pression
d'air était àlalachambre
connecté chambrede réactif sur puce microinjecteur à traversvia
ununrégulateur de pression et une électrovanne
à la et. Ce
chambre de réactif sur ladepuce
réactif
de sur la puce de micro-injecteur
micro-injecteur via un régulateur régulateur
de pression et de
un pression
système et connecté
permet de générer
une impulsionet.deCe
électrovanne pression
système réglable
permet pour l'administration
deimpulsion
générer une de réactif.
impulsion L'électrovanne
de pression réglableétait l'électrovanne de réactif
et. Ce système permet de générer une de pression réglable pour le réactif pour
utilisé pour contrôler la durée
et le nombre d'impulsions pour chaque injection individuelle. La microfluidique
L'injecteur a été installé sous microscope optique (Light Microscope, Leica, Concord, ON, Canada) et un
La caméra CMOS montée dessus a été utilisée pour enregistrer la vidéo des processus d'injection. Après injection, un
Une micropipette de 200 µL a été utilisée pour transférer les vers injectés dans la croissance standard des nématodes (NG)
plaques de gélose pour récupérer après injection.
tous. La soeno vave a été utilisée pour conro e uraon un certain nombre de pus ou chaque injection individuelle.
Machine Translated
L'injecteurby Google a été installé sous microscope optique (Light Microscope, Leica, Concord, ON, Canada)
microfluidique
et une caméra CMOS montée dessus a été utilisée pour enregistrer la vidéo des processus d'injection. Après
l'injection, une micropipette de 200 µL a été utilisée pour transférer les vers injectés dans les plaques de gélose de
croissance de nématodes standard (NG) pour les récupérer après l'injection.
Micromachines 2020, 11, 295 10 sur 17

5. Résultats et discussion
5. Résultats et discussion
5.1. Caractérisation du système d'immobilisation 5.1.
Caractérisation du système d'immobilisation
Pour immobiliser le ver, d'abord, les vers N2 C. elegans de type sauvage ont été déplacés dans la bouche
Pour immobiliser
de la région le ver, d'abord,
de rétrécissement du canalles vers N2 C. elegans
d'immobilisation via le de typedesauvage
canal ont été
chargement déplacés
(Figure 11b)dans la bouche
en utilisant une du
région de constante
pression rétrécissement duseringue.
sur la canal d'immobilisation via le canal
Ensuite, la pression de chargement
a été (Figure
appliquée pour 11b) en
pousser le utilisant
ver dans une
la constante
pression sur la seringue. Ensuite, la pression a été appliquée pour pousser le ver dans
canal d'immobilisation (Figure 11c). Le ver a été comprimé sur les côtés via un canal à deux l'immobilisation
rétrécissements
canal (Figure 11c).
avec la profondeur Le ver de
et la largeur était
25comprimé sur les
µm et 55 µm, côtés via un La
respectivement. canal à deux
région rétrécissements
agrandie de la avec le
profondeur et de la largeur de 25 µm et 55 µm, respectivement. La région agrandie du canal d'immobilisation,
Le canal d'immobilisation, appelé « zone d'injection », avait une longueur de 100 µm et une profondeur de 65 µm
appelé
(voir « zone
Figure d'injection
11a). », avait
Par la suite, une longueur
la position desans
de la vis 100 fin
µmdans
et une profondeur
le canal et sonde 65 µm (voir
alignement avecFigure 11a). Ensuite,
la position de la
vis sans fin dans le canal et son alignement avec la position du canal de l'aiguille
la position du canal de l'aiguille a été ajustée en insérant (Figure 11d) ou en retirant (Figure 11e) a été
ajustée
le piston en insérant
dans (Figure
la seringue, 11d)échéant.
le cas ou en retirant (Figure
Les parties 11e) du
rétrécies le piston dans la seringue
canal d'immobilisation comme Les parties
conviennent.
rétrécies duune
permettrait canal d'immobilisation
visualisation permettraient
facile des de visualiser
organes internes facilement
ainsi qu'une immobilisation cohérenteÿ; les organes
internes ainsi que permettre une immobilisation cohérenteÿ;
tandis que la région agrandie au centre qui est reliée au canaltandis que la région élargie permettra
d'aiguille, au centre qui est
reliée
injectionau canalcomme
centrée d'aiguille, permettra
le montre la figureune
11f. injection centrée comme représenté sur la figure 11f.

Figure 11. (a) Un schéma du canal d'immobilisation. Le canal rétréci avait une profondeur de 25 pm µm etavec
une largeur de 55 pm. La profondeur au milieu du canal rétréci d'une longueur de 100 µm a été
avec une largeur de 55 µm. La profondeur au milieu du canal rétréci d'une longueur de 100 µm était de 65 augmentée à
µm, appelée
augmentée « zone
à 65 d'injection
µm où appelée «».zone
( b –d'injection
e ) séquence
». ( b d'images du processus
– e ) séquence d'images de
du chargement
processus dedu ver. (b) Leduver
chargement
ver. a été
(b) Le ver introduit dans le
a été introduit canal
dans le d'immobilisation, (c) le ver
canal d'immobilisation, a été
(c) le ver poussé dans le
a été poussé canal
dans le d'immobilisation
canal, (d) le ver a été
complètement inséré dans le canal d'immobilisation et (e) la gonade distale de
canal d'immobilisation, (d) le ver a été complètement inséré dans le canal d'immobilisation et (e) le ver a été aligné
avec
la le canal
gonade de l'aiguille
distale du ver apour l'insertion
été alignée de le
avec l'aiguille.
canal de (f)l'aiguille
un ver C. elegans
pour immobilisé
l'insertion de l'aiguille. (f) un immobilisé à
l'intérieur
C. elegansdever
la à
conception finale.
l'intérieur de L'image montre
la conception finale.que les parties
L'image montrerétrécies
que les du canalrétrécies
parties d'immobilisation
du permettaient une
visualisation facile des organes
le canal d'immobilisation internes
permettrait une ainsi qu'une immobilisation
visualisation cohérente.
facile des organes (g)ainsi
internes À qu'une pression de charge
inférieure à 50 (kPa), les vers ne pourraient pas être complètement insérés dans l'immobilisation
immobilisation régulière. (g) À la pression de chargement inférieure à 50 (kPa), les vers ne peuvent pas être
canalisés. Lorsqu'une
entièrement inséré danspression ded'immobilisation.
le canal 50 (kPa) a été appliquée
Lorsqu'une sur pression
les vers, de
seulement
50 (kPa)1/3 de la
a été longueursur
appliquée du les
ver vers,
pouvait
ils n'ont été comprimés que dans un canal rétréci et le reste du ver est resté dans le canal de chargement. (h) Le
1/3 de la longueur du ver pourrait être comprimé dans un canal rétréci et le reste du temps de chargement du ver
par resté
est rapport à lalepression
dans canal dede chargement.
chargement. (h)ALe
t =temps
120 s,de
la vis sans fin n'était
chargement pas complètement
en fonction de la pressionchargée et à t = 0 As,t la
de chargement.
= 120
le s, le ver
ver n'était n'acomplètement
pas pas été capturé dansetleàcanal
chargé t = 0 d'immobilisation. (i) capturé
s, le ver n'était pas Viabilitédans
des vers après
le canal immobilisation.
d'immobilisation.
Taux de reproduction des vers (n = 5 pour chaque plaque) 72 h après 5 min d'immobilisation par rapport à non
(i) Viabilité des vers après immobilisation. Vers (n = 5 pour chaque plaque) taux de reproduction 72 h animaux
témoins immobilisés.
après 5 min d'immobilisation par rapport aux animaux témoins non immobilisés.

Pour un certain canal d'immobilisation défini (25 µm de profondeur et 55 µm de largeur ici), la


le temps d'introduction et d'alignement des vers (par rapport à l'aiguille) dans le canal d'immobilisation était
dépend de la pression appliquée. Afin de caractériser la pression requise avec le temps de chargement,
une pression constante dans la plage de 50 à 200 kPa a été appliquée à l'intérieur du canal de chargement pour charger le ver dans
le canal d'immobilisation. Par la suite, le processus d'immobilisation (Figure 11b-e) a été observé
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Micromachines 2020, 11, 295 11 sur 17

et enregistré à partir duquel le temps de chargement requis a été calculé. Le résultat de l'expérience, le temps de
chargement en fonction de la pression de chargement, a été tracé sur la figure 11h. Les résultats ont montré qu'à une
pression de charge de 50 kPa ou moins, les vers ne pouvaient pas être complètement insérés dans le canal d'immobilisation.
Lorsqu'une pression de 50 kPa a été appliquée sur les vers, seul 1/3 de la longueur du ver a pu être comprimé
dans un canal rétréci et le reste du ver est resté dans le canal de chargement comme le montre la figure 11g.
L'expérience a été réalisée sur 5 vers et après 120 s, les vers ne pouvaient pas être insérés à plus d'1/3 de
sa longueur.
Dans le processus d'immobilisation, deux forces agissent sur le ver. L'une est la force due à la pression qui
pousse le ver à travers le canal étroit. L'autre est la force de friction sur le corps du ver. La force de fiction est
dépendante de la longueur du ver inséré dans le canal.
Aux basses pressions (<50 kPa), la force de frottement domine la pression appliquée. Par conséquent, le ver
s'arrête pour se déplacer à une certaine longueur (~1/3 du ver ici) comme le montre la figure 11g. À l'autre
extrême, à une pression de chargement de 200 kPa ou plus, le ver ne pouvait pas être piégé par un canal rétréci
et tous les vers (n = 5) passaient par le canal étroit (le temps de chargement était nul pour ces situations). La
raison en était que la pression de chargement dépassait considérablement la résistance de frottement et que la
vis sans fin était poussée au-delà du canal d'immobilisation. Les plages de pression de 75 à 150 kPa ont permis
un processus de chargement relativement rapide avec un contrôle d'immobilisation raisonnable à l'intérieur du
canal rétréci pour tous les vers (n = 5) dans cette géométrie. Dans cette plage de pression, l'équilibre entre les
forces de poussée et de friction était bien contrôlable. Étant donné que ce mécanisme d'immobilisation était de
conception passive, la force de friction causée par le canal d'immobilisation sur certains vers C. elegans dépendait
de la géométrie du canal. Par conséquent, la plage de pression optimale pour l'immobilisation peut être changée
en plage de pression inférieure en augmentant la largeur et/ou la profondeur du canal d'immobilisation et vice
versa. Le temps nécessaire pour charger les vers variait de 37 s à 3,5 s lorsque la pression était augmentée de
75 kPa à 150 kPa.
Bien que la compression ait été efficace pour immobiliser les vers à l'intérieur du canal rétréci, elle
pourrait potentiellement avoir un impact sur sa viabilité. Afin d'étudier l'effet du stress mécanique causé par la
compression dans un canal rétréci (dans cette géométrie spécifique) sur la viabilité et le taux de reproduction
des vers, un total de 15 jeunes vers adultes de type sauvage N2 C. elegans ont été chargés dans un canal
rétréci. consécutivement et immobilisé. Ensuite, ils ont été maintenus à l'intérieur du canal pendant 5 min,
puis déchargés et répartis uniformément (5 vers) sur trois plaques de gélose (plaques de gélose standard
pour la croissance des nématodes (NG) contenant OP50 Escherichia coli comme source de nourriture) pour
étudier la viabilité et la reproduction de la ver après 72 h. Un nombre similaire de vers du même lot a été
cultivé sur les plaques de gélose sans les faire passer à travers le microdispositif et utilisé comme contrôle pour la comparaison.
Le nombre de descendants sur la plaque après 72 h a été compté pour chaque plaque. Les résultats démontrent
que les vers se sont bien rétablis après avoir été immobilisés transférés sur des plaques de gélose ensemencées de
bactéries E. coli (OP50) (100 % viables après 72 h). Par rapport à l'échantillon témoin, ils se déplaçaient normalement
et ne se distinguaient pas des animaux témoins dans leur comportement de mouvement (la fréquence de leur
mouvement de curling était visuellement comparée à l'échantillon témoin et aucune différence significative n'a été observée).
De plus, leur reproduction (illustrée à la figure 11i) n'a pas été significativement affectée par rapport à
l'échantillon témoin (valeur p = 0,3058), ce qui indiquait qu'il y avait un minimum de stress ou de lésions
tissulaires dues à l'immobilisation dans ce format.

5.2. Caractérisation du mécanisme conforme


Le mécanisme conforme fournit une méthode simple mais rapide pour l'insertion de l'aiguille dans le
ver. Dans ce mécanisme, la pointe de l'aiguille est déplacée de sa position d'origine dans le canal
d'immobilisation en moins de 5 s (Figure 12a–c). La performance du mécanisme conforme attaché au
micropositionneur a été caractérisée en appliquant un déplacement connu au micropositionneur et en
mesurant le mouvement réel de la pointe de la microaiguille. Le mouvement de l'aiguille a été enregistré
au microscope, puis les vidéos ont été analysées pour obtenir le déplacement de l'aiguille en utilisant une
procédure de traitement d'image personnalisée. Le tracé de la figure 12d montre le déplacement appliqué par le microposition
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Micromachines 2020, 11, x

le micropositionneur a été caractérisé en appliquant un déplacement connu au micropositionneur et en mesurant le mouvement réel de la pointe de la

lemicroaiguille.
déplacementLe demouvement de l'aiguille
l'aiguille en utilisant uneaprocédure
été enregistré au microscope
de traitement Micromachines
d'image 2020,
personnalisée. 11, 295
Le tracé de la, puis les12d
figure vidéos ont le
montre été 12
analysées pour
déplacement surpar
17
obtenir
appliqué
(axe x) et le mouvement d'aiguille résultant tel que mesuré par analyse d'image (axe y). Depuis le

micropositionneur (axe x) et le mouvement résultant de l'aiguille tel que mesuré par analyse d'image (y la position initiale
de l'aiguille
axe). Étantn'était
donnépas
quelalamême pour
position tous de
initiale les l'aiguille
dispositifs, la position
n'était de l'aiguille
pas la même a étéles
pour tous normalisée
appareils, la position de l'aiguille à
laaposition
été normalisé à la position d'origine. On peut voir que la microaiguille peut et
d'origine. On peut voir que la micro-aiguille peut être déplacée de manière contrôlable être déplacée de
manière reproductible
contrôlable en utilisant
et reproductible à l'aide un micropositionneur
d'un micropositionneuret
etun mécanisme
d'un mécanismeconforme.
conforme.La
Le relation entre
déplacement
dela la pointeentre
relation de l'aiguille et celui dude
le déplacement micropositionneur ne sont
la pointe de l'aiguille pas linéaires.
et celui C'est peut-être
du micropositionneur parce
n'est pasque
linéaire. la raideur du micropositionneur n'était pas constante et variait avec le déplacement. Semblable à la
Cela peut être dû au fait que la rigidité du micropositionneur n'était pas constante et variait avec la microinjection
conventionnelle, la profondeur
déplacement. Semblable à de l'injection peut être
la microinjection contrôlée par l'opérateur
conventionnelle, dans de
la profondeur ce dispositif.
l'injection peut être Une
profondeur
contrôlé pard'insertion
l'opérateur d'environ 5 à 25 µm
dans cet appareil. Uneàprofondeur
partir de lad'insertion
paroi corporelle
d'environdu
5 àver
25 est
µm généralement visée
à partir de la paroi pour obtenir
corporelle de une
l'injection
le ver estréussie. Un marqueur
généralement destinéd'une injection
à réaliser une réussie
injectiondans la gonade
réussie. serait l'expansion
Un marqueur physique
pour l'injection réussie de la gonade lorsque
l'impulsion de pression est appliquée. Dans les cas où une telle expansion se manifeste
dans la gonade serait l'expansion physique de la gonade lorsque l'impulsion de pression est appliquée. Dans les réactifs
livrés sont
les cas oùrestés dans
une telle la gonade.
expansion seUne injection
manifeste, lesinfructueuse entraîne
réactifs délivrés sontlarestés
propagation duréactifs dans d'autres parties du
dans les
corps, notamment l'intestin. Par conséquent, selon les caractéristiques indiquées dans
gonade. Une injection infructueuse entraîne la propagation des réactifs dans d'autres parties du corps,
notamment
intestin. Par la figure 12d,selon
conséquent, le système conforme conçu
les caractéristiques dans cette
représentées sur laplate-forme est
figure 12d, le capable
système d'effectuer
compliant une une
a conçu aiguille précise
insertion dans
dans cette la gonade.
plate-forme est capable d'effectuer une insertion précise de l'aiguille dans la gonade.

Figure 12.(a–c)
Figure 12. (a–c)séquence
séquence d'images
d'images de l'insertion
de l'insertion de l'aiguille,
de l'aiguille, (a) la micro-aiguille
(a) la micro-aiguille a été alignéea avec
été alignée avec
la gonade
gonade
distale du ver,
distale du(b)
ver,la(b)
micro-aiguille a étéadéplacée
la micro-aiguille et pénétrée
été déplacée dans dans
et pénétrée le ver,le(c)
ver,la(c)
micro-
la aiguille a été insérée dans
lamicro-aiguille
gonade et adaptée à l'administration
a été insérée du réactif.
dans la gonade (d) Laàcaractérisation
et adaptée la livraison de réactif. (d) Le mécanisme conforme. Un
déplacement connu
caractérisation a été appliqué
du mécanisme au micropositionneur
conforme. Un déplacementet connu a été appliqué à la mesure du mouvement de la
micropositionneur
micro-aiguille et laàmesure
a été calculé du mouvement
l'aide d'images de la pointede
dela
la microaiguille
micro-aiguille. a été calculée à l'aide d'images
de
la L'expérience a été répétée L'expérience
pointe de la micro-aiguille. 8 fois sur un appareil. La résolution
a été répétée 8 fois surminimale du Le micropositionneur
un appareil.
était de 20 µm.
la résolution (e) Test
minimale de viabilité desétait
du micropositionneur versdeaprès
20 µm.insertion deviabilité
(e) Test de l'aiguille.
desVers (n = 5aiguille
vers après pour chaque
plaque) taux
insertion. de reproduction
Taux 72 hdes
de reproduction après
versl'insertion de chaque
(n = 5 pour l'aiguilleplaque)
par rapport
72 haux vers
après témoinsde
l'insertion non insérés.
l'aiguille par rapport
aux vers témoins non insérés.
Afin d'étudier l'effet de l'association de l'immobilisation et de l'injection sur la viabilité
et le taux
Afin de reproduction
d'étudier l'effet de des vers, une de
la combinaison série d'expériences
l'immobilisation et dea l'injection
été réalisée,
sur lacomme
viabilité, décrit ci-dessous.
des vers adultes de Jeune
type
sauvage
et le tauxN2
deC.reproduction
elegans (n =des15)vers,
ont été
uneimmobilisés dans un canal
série d'expériences rétréci, puis
a été réalisée, le décrit ci-dessous. Une micro-aiguille
comme
jeune a été insérée dans la gonade pendant 2 secondes, puis retirée. Par
des vers adultes de type sauvage N2 C. elegans (n = 15) ont été immobilisés dans la suite, lesunvers ontrétréci,
canal été puis déchargés et
plaqués pour examiner l'effet de l'insertion de la micro-aiguille et les lésions tissulaires qui en résultent
la microaiguille a été insérée dans la gonade pendant 2 s puis retirée. Par la suite, les vers sur la viabilité et la reproduction.
ont été déchargés et plaqués pour examiner l'effet de l'insertion de la micro-aiguille et du tissu qui en a
résulté.
dommages surLes résultats
la viabilité (voir
et la la figure 12c)
reproduction. ont démontré que le nombre de descendants pour les vers injectés
étaient
significativement (valeur
Les résultats p <la0,00001)
(voir réduites
figure 12c) (105 à 165 que
ont démontré descendances)
le nombre par
de rapport aux vers
descendants témoins
pour les vers injectés (238
descendants) en raison(valeur
étaient significativement de l'effet
de pde
< l'immobilisation
0,00001) réduiteset de àl'injection
(105 (la barre d'erreur
165 descendances) de àlal'figure
par rapport 12c des
écart type montre
vers le
témoins de trois échantillons
(238 descendants) en raisonprélevés
de l'effetpour compter le nombre
de l'immobilisation et dede descendances).
l'injection (la barre Depuis
d'erreurlede la figure 12c montre que l'
immobilisation
l'écart-type deseule n'entraîne pas
trois échantillons quideontdifférence significative
été prélevés dans le
pour compter le nombre
nombre dede descendants,
descendants).elle peut être
a conclu que l'insertion de
l'aiguille et lesque
Étant donné lésions tissulaires qui
l'immobilisation en résultent
seule entraînent
ne provoque aucuneladifférence
réduction significative
du nombre dans le nombre de descendants
produits par les vers. Cette diminution du nombre de descendants était similaire
descendants, on peut conclure que l'insertion de l'aiguille et les lésions tissulaires au qui
casen résultent sont à l'origine d'autres
procédures
réduction du denombre
microinjection pour C. elegans
de descendants produitsoùpar
la les
taille de la
vers. descendance
Cette diminutionest
du réduite
nombreàde
10taille
à 50% de la du couvain.
normale
L'observation des vers après injection sur plaque de gélose a montré que les vers
descendants était similaire au cas d'autres procédures de microinjection pour C.elegans où ils ont pu récupérer un
mouvement normal
la taille de la et étaient
progéniture est indiscernables
réduite à 10–50%du type
de lasauvage dans les
taille normale 24 h après
du couvain. Observation des vers après l' insertion de
l'aiguille.
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Micromachines 2020, 11, x 12 sur 17

l'injection sur plaque de gélose a montré que les vers étaient capables de retrouver un mouvement normal et
étaient indiscernables du type sauvage dans les 24 h suivant l'insertion de l'aiguille. 13 sur 17
Micromachines 2020, 11, 295

5.3. Caractérisation de la livraison de réactif


5.3. Caractérisation de la livraison de réactif
Dans la méthode d'écoulement piloté par pression pulsée, le volume de réactif délivré peut être contrôlé en
modifiant le niveaupiloté
d'écoulement de pression ainsi que
par pression la durée
pulsée, de l'impulsion.
le volume de réactifAfin de caractériser
délivré la livraison
peut être contrôlé par Dans la méthode
caractéristiques
modifier le niveaudu desystème,
pressionlaainsi
micro-aiguille
que la duréea été
de insérée dansAfin
l'impulsion. un de
bloccaractériser
de gel d'agar (1%) pour imiter la
la livraison
les caractéristiques du système, la micro-aiguille a été insérée dans un bloc de gel d'agarété
consistance de l'intérieur du ver (voir figure 13b). La durée de l'impulsion de pression a définie
(1ÿ%) pourselon
imiter la
à 1s et le régulateur
consistance de du
de l'intérieur pression
ver (voirrelié à la13b).
figure bouteille de gaz
La durée a été utilisé
de l'impulsion de pour contrôler
pression le niveau de pression
a été réglée
(200 kPa).
modèle à 1sLe
et bleu de méthylène
le régulateur dissousconnecté
de pression dans de àl'eau DI (0,01de
la bouteille M)gaza été utilisé
a été comme
utilisé pour réactif d'injection
contrôler le niveau de pression
(200 kPa). Le
visualiser bleu de méthylène
le mouvement dissous
du liquide. dans
Étant de l'eau
donné que DI (0,01 M)délivré
le volume a été utilisé
dans comme
chaqueréactif d'injection
impulsion modèle
était petit pour
et ne
peut pasleêtre
visualise facilementduvisualisé,
mouvement un ensemble
liquide. Étant donné que de 1000 impulsions
le volume délivré(fréquence de 0,5 Hz)était
à chaque impulsion a été délivré
faible etpeut
et ne le total
pas
volume
être injectévisualisé,
facilement calculé par le déplacement
un ensemble deimpulsions
de 1000 l'interface (fréquence
de solutionde dans
0,5 la chambre
Hz) de réactif.
ont été délivrés et le volume total
leLedéplacement
volume délivréde à chaque impulsion
l'interface a étédans
de la solution calculé en divisant
la chambre simplement
de réactif. le volume total délivré injecté calculé par
Le volume
par le nombre
délivré d'impulsions
dans chaque appliquées
impulsion et estentracé
a été calculé poursimplement
divisant cinq tentatives différentes
le volume total sur la figure
délivré par le13b. Les résultats
nombre de montrent
que
de le système
variation d'administration
appliquées était constamment
et sont tracés capable
pour cinq tentatives d'administrer
différentes sur laenviron 160ÿpL
figure 13b. Lespar impulsion
résultats et les que
montrent impulsions
la livraison
leentre les différentes
système tentativescapable
était constamment était faible, ce qui répond
de délivrer ~160ÿpLaux
parcritères de conception
impulsion pour
et la variation la livraison.
entre Un vertentatives
les différentes typique à son
stade
était de reproduction
petite, principal
ce qui répond a un volume
aux critères d'environ
de conception 1,4lanL.
pour Dans laUn
livraison. microinjection
ver typique àconventionnelle, la quantité
son premier stade injectée
de reproduction
ales
unvolumes étaient
volume de ~ 1,4 d'environ 15 % (200 ±conventionnelle,
nL. En microinjection 20 pL) ou plus du
lesvolume
volumescorporel
injectésdu ver. Par
étaient conséquent,
d'environ le volume
15ÿ% (200 de ou
± 20ÿpL) la
chambre de régent
raisonnablement qui étaitdud'environ
supérieur corps du1,5 µm
ver. serait
Par suffisant le
conséquent, pour une injection
volume d'environ
de la chambre de 100 vers
régent quiavec
étaitun volume 1,5 µm
d'environ
le volume
serait mortpour
suffisant du système
~ 100 injections de vers avec un volume mort raisonnable du système

Figure
Figure13.
13. (a)
(a) Schéma
Schéma de la configuration
configuration expérientielle
expérientielleutilisée
utiliséepour
pourcaractériser
caractériserlele système
système dede livraison
livraison dede réactif.
réactif.
La
La microaiguille (OD
microaiguille (OD = µm,
= 90 90 µm,
ID = ID = 20longueur
20 µm, µm, longueur
= 80 mm)=connectée
80 mm) connectée
à la chambreàde
laréactif
chambre(ID = de
(ID réactif
= 0,5
(mm), OD =OD
0,5 (mm), 1 (mm), longueur
= 1 (mm), = 25= (mm)).
longueur ( b)(b)
25 (mm)). LaLa
caractérisation dedu
caractérisation lasystème
livraisonde
delivraison
réactif de réactif. système. Pour
chaque impulsion,
Pour chaque 200 kPa
impulsion, 200ont
kPaétéont
appliqués pendant
été appliqués une durée
pendant de 1 s.de
une durée En1 moyenne, 160 pL160
s. En moyenne, de pL
réactif peuvent
de réactif être
peuvent
être
pourdélivrés
chaquepour chaqueEn
impulsion. impulsion. Enlacontrôlant
contrôlant durée deslaimpulsions
durée desou
impulsions
le niveauou
delepression,
niveau de
le pression, le produit
volume délivré peut délivré
être
contrôlé pour
peut être obtenir
contrôlé un obtenir
pour réactif injecté inférieur
un réactif injectépar impulsions.
inférieur par impulsions.

5.4. Microinjection du ver et sa visualisation


5.4. Microinjection du ver et sa visualisation
Afin de visualiser la livraison des réactifs dans le corps du ver, le bleu de méthylène (0,05 M)
Afin de visualiser la livraison des réactifs dans le corps du ver, du bleu de méthylène (0,05) a été
injecté dans le bras distal de la gonade à l'aide du dispositif de microinjection. La séquence des étapes
M) a été injecté dans le bras distal de la gonade à l'aide du dispositif de microinjection. La séquence des
impliqués dans le processus de microinjection est illustrée à la figure 14. Le N2 de type sauvage L4 C. elegans à 56 h
les étapes impliquées dans le processus de microinjection sont illustrées à la figure 14. Les elegans N2 de type
sauvage L4 à ont été chargés à l'entrée. Par la suite, ils ont été poussés dans le canal d'immobilisation et un
56 h ont été chargées à l'entrée. Par la suite, ils ont été poussés dans le canal d'immobilisation et des deux gonades
a été aligné avec la pointe de l'aiguille (Figure 14a), pneumatiquement sous contrôle visuel
l'une des deux gonades était alignée avec la pointe de l'aiguille (Figure 14a), pneumatiquement sous rétroaction.
Suite à cela, un micropositionneur relié au mécanisme de plainte a été utilisé pour
rétroaction visuelle. Suite à cela, un micropositionneur relié au mécanisme de plainte a été utilisé pour déplacer
progressivement l'aiguille et pénétrer l'extrémité distale de la gonade (Figure 14b). Puis, en appliquant 2
pour déplacer progressivement l'aiguille et pénétrer l'extrémité distale de la gonade (Figure 14b). Ensuite, par
des impulsions de pression d'une amplitude de 200 kPa et d'une durée de 1 s, le réactif dans la micro-aiguille a été
en appliquant 2 impulsions de pression d'une amplitude de 200 kPa et d'une durée de 1 s, le
réactif est délivré dans la gonade (Figure 14c). Ensuite, le ver a été déchargé et transféré dans la sortie
la micro-aiguille a été délivrée dans la gonade (Figure 14c). Ensuite, le ver a été déchargé et logé (Figure 14d).
transféré dans la chambre de sortie (figure 14d).
Les résultats ont montré que le réactif pouvait être injecté avec succès dans le ver et le colorant
a été distribué dans le ver après injection. Comme illustré sur la figure 14d, le colorant injecté n'est pas venu
hors du point d'injection pendant le processus de déchargement, ce qui indique que la pression de compression dans
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Micromachines 2020, 11, x 13 sur 17

Les résultats
montré que leont montré
réactif que être
pouvait le réactif pouvait
injecté être injecté
avec succès dansavec succès
le ver et quedans le ver etétait
le colorant le colorant.
distribuéLes résultats
dans le ver ont
après injection.
injection. Comme
déchargement, Comme
ce illustréillustré surla
à la figure
qui indique que la figure
14d 14d,
de le
, le colorant
pression colorant injecté
injecté n'est
compression n'est
pas
hors pas
dusorti venu
points'est
dud'injection
point répartipendant
d'injection
pendant dans le le
verprocessus
le processusaprès de17
de 14 sur
déchargement, ce quià indique
capacité du colorant que la
rester dans le pression
ver dans de
un compression
dans le canaldans le le canal d'immobilisation
d'immobilisation n'a pas affecté lan'acapacité
pas affecté la
du colorant
à rester
une dans le ver dans un le canal d'immobilisation n'a pas affecté la capacité du colorant à rester dans le ver dans
importante
manière significative.
significative. Cependant,Cependant, la visualisation
la visualisation au bleu
avec du bleu de méthylène
de méthylène n'a n'a
paspas fourni
fourni un contraste
un contraste suffisant
suffisant à lade manière
manière.
Cependant,
le
identifier
mouvement la visualisation
le mouvement
du colorant au bleu de
duàcolorant
l'intérieur méthylène
à l'intérieur
du dun'a
ver après ver pas fourni
l'injection.
après unconséquent,
contraste
l'injection.
Par suffisant
Par conséquent, pour
uneidentifier
une solution d'ADN a le
solution lié
d'ADN
le mouvement
liée identifie
du colorant
au colorant
colorant à l'intérieur
fluorescent
fluorescent duété
a
a été verutilisé
après
utilisé dansl'injection.
dans Par
la section
la section conséquent,
suivante
suivante pourpour une solution
étudier
étudier d'ADN duliéedu
la distribution
la distribution à colorant
des dans
colorant dans la gonade
la gonade le au
colorant
après a été utilisé dans la section suivante pour étudier la distribution de le colorant dans la gonade après injection.
injection.

Figure
La 14.de
séquence
séquence Lade
séquence
quatre
quatre de quatre
étapes
étapes laétapes
pour
pour pour la microinjection
la microinjection
microinjectionÿ: : (a)
(a) : (a)etchargement
chargement
chargement et immobilisation,
et immobilisation,
immobilisation, (b)(b) (b) aiguille
aiguille Figure
aiguille 14. Figure
La 14.
pénétration, (c) injection de réactif et (d) déchargement.

5.5. Injection
5.5. Injectiond'ADN
d'ADN

Une solution
Une solution d'ADN
d'ADN étiquetée
marquée avec
avec un
un colorant
colorant fluorescent
fluorescent vert
vert aa été
été injectée
injectée dans
dans la
la gonade
gonade en
en utilisant
utilisant le
le même
même
processus
processus que celui
tel que
du processus décrit
décrit
tel que dans
dans
décrit la section précédente
la section
dans précédente
la section afin
précédente de visualiser
afinafin la
de visualiserdistribution
de visualiser du colorant
la distribution à l'intérieur
du colorant
la distribution du colorant du corps
à l'intérieur
à
l'intérieur
corps duaprès
du ver
post-injection. ver après
Tout d'abord,l'injection.
l'injection. leTout
réactif Tout d'abord,
d'abord,
d'ADN le réactif
lefluorescent
réactif ADN ADN
fluorescent
consistait fluorescent
en 1consistait en consistait
1 µL
µL de solution d' de
ADN en sperme
corps
de 1 µL UltraPure™
UltraPure™ du ver Salmon
UltraPure™
(concentration
Solution
ON., d'ADN
Solution de 10 mg/mL,
de
d'ADN sperme
de spermeThermofisher
de saumon Scientific,
de saumon Brampton,
(concentration ON,
de 10
(concentration Canada),
mg/mL,
de Thermofisher
10 mg/mL, Scientific,
Thermofisher Brampton,
Scientific,
Brampton,
Canada), 1ON.,
1 µL d'acridine 1 µL d'orange
µL d'acridine
orange orange d'acridine
de (concentration
(concentration
(concentration 10 mg/mL, de 10 mg/
de 10SIGMA-ALDRICH,
mg/mL, mL, SIGMA-ALDRICH,
SIGMA-ALDRICH, 1 mLOakville,
Oakville,
Oakville, ON, ON, DION,
Canada),
d'eau Canada) et
a été
préparé
Canada) (les composants
et 1 mL
et 1 mL d'eau DI ad'eau ont été
DI a été(les
été préparé mélangés
préparé et la solution
(les composants
composants a été conservée
ont été mélangés
ont été mélangés 30 min
et laasolution
et la solution à température
a été conservée
été maintenue ambiante
au Canada)
à température, puis
stockée
30 dans
minutes un réfrigérateur
à température à -20ÿ puis
ambiante ). L'acridine
conservé
stocké auorange
au est un colorant
réfrigérateur
réfrigérateur deL'acridine
à -20°).
à -20°). liaison aux
L'acridine acides
estnucléiques
orange
orange est
unun acide
acide quinucléique
émet
nucléique
à fluorescence
colorant verte
de liaison
fluorescence rougequi lorsqu'il
quiémet
émetune est lié à l'ADNdb
unefluorescence
fluorescencevertetel que le sperme
vertelorsqu'il
lorsqu'ilest
estlié (fluorescence
liéààl'ADNdb
l'ADNdbtel rouge
telque lorsqu'il
quelelesperme est
( ARN dede liaisonouà
lié
sperme(colorant à l'ADNsb
fluorescence
lorsqu'il est rouge).
étaitlié Ensuite,
liéà àl'ADNss
l'ADNsb laàchambre
ouou àl'ARN). de réactif la
l'ARN).Ensuite,
Ensuite, de 2chambre
µL a étéde
lachambre remplie
deréactifavec
dede2la2µL
réactif solution
µLa aété
étéd'échantillon.
remplie
remplieavec , le
avec N2 de type sauvage
l'échantillon
l'échantillon
Solution.
Ensuite, les N2 C.C.elegans
Ensuite, les N2 C.ade
elegans été
typechargé,
elegans sauvage injecté
de type étéetchargés,
sauvage
ont déchargé comme
ont été injectés
chargés, décritetprécédemment
etinjectés
déchargés déchargés comme
comme décrit, et la
les l'image
solution
vers fluorescente
décrite.
injectés ont de
été enregistrés et et
précédemment illustrés
l'imageà lafluorescente
figure 15a,c. Afin
des de comparer,
vers injectésd'autres vers ont été et montrée sur la figure injectée
a été enregistrée
à plusieurs
15a,c.
Afin deAfin endroits
de comparer,
comparer, en utilisant
d'autres d'autres
vers ontlavers
méthode
étéont étéconventionnelle
injectésinjectés et l'image
à plusieurs
à plusieurs endroits endroits
à l'aidefluorescente
en
deutilisant de15a,c
le l'injection
vers conventionnelsconventionnel.
ont été
enregistrés
La méthode
l'image et illustrés
et l'image
fluorescente des à la figure
fluorescente 15b,d.
des
vers injectés vers
ont étéinjectés ont été
enregistrées etenregistrées
illustrées à laetfigure
illustrées à la figure 15b,d. La méthode et
15b,d.

Figure15.
Figure
solution 15.LaUne
d'ADN solution
solution
fluorescent ad'ADN
d'ADN été fluorescent
fluorescent
délivrée a été la
dans agonade
été délivrée
délivrée dans dans
(a,b)laetgonade la(a,b)
l'intestin gonade
et dans
(c,d) (a,b)
l'intestin et l'intestin
(c,d)
les deux dans les(c,d)
méthode deux dans les15.
Figure deux
conventionnelle La

droite)
d).
méthode etconventionnelle
méthodemicrofluidique (à(àgauche).
conventionnelle droite) etLa
(à droite) etbarre d'échelle
microfluidique
microfluidique montrée
(à gauche).en
La(a)
(à gauche). Laest
barre la même
barre
d'échelle en (b–d).
d'échelle
montrée
montrée
en (a)
en (a)
est est
la même
la même
en (b–
en (b–d).

On peut
On
êtrepeut voir
voir
vu sur sur
lasur la
figurelafigure
figure 15a,b
15a,b15a,b
que laqueque lalasolution
solutionsolution
d'ADN d'ADN
d'ADN était
était
était située située
située
sur dans
dans
une une
petiteune petite
petite
région région
région
de de du Ilcorps,
la que
la tandis peut
dans
corps,le cas
alors de
quela figure
dans le 15c,
cas d,
de le
la réactif
figure a été
15c,d, distribué
le dans
réactif était tout le corps
distribué du
dans ver.
tout leCe
corps
que dans le cas de la figure 15c,d, le réactif était distribué dans tout le corps du peut s'expliquer par le du corps, tandis
lieu de livraison . Les figures 15a,b sont typiques lorsque l'injection s'est produite
dans la gonade située dans la partie médiane du ver. Les figures 15c,d sont typiques de la livraison
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Micromachines 2020, 11, x 14 sur 17

Ver de terre.
lorsque Cela Micromachines
l'injection peut s'expliquer2020,par le11,
lieu295
de s'est
livraison. Les figures
produite dans la15a,b
gonade sont
quitypiques
est située
15 sur 17
dans la section médiane du ver. Les figures 15c,d sont typiques de la livraison dans l'intestin
qui s'étend sur toute l'étendue du ver. Afin de pénétrer dans l'intestin qui s'étend sur toute
l'étendue
identifier du ver. Afin
la probabilité d'identifier
d'injection dans lales
gonade, un groupe de 30 jeunes vers adultes C. elegans ont été probabilité
d'injection dans
immobilisé, la gonade,
gonade alignée un
surgroupe de 30 jeunes
la micro-aiguille vers adultes
et injectée C. elegans
avec une ont étédans
solution d'ADN immobilisés,
le microdispositif. gonade
alignée surdes
L'analyse la micro-aiguille et injectée avec
images fluorescentes aprèsune solution d'ADN
l'injection dans
a révélé quele microdispositif.
63ÿ% (19 vers) Analyse de
des injections étaient des
images dans
délivrés fluorescentes après
la gonade et 37 %l'injection a révélé
(11 vers) dans que 63ÿ%
l'intestin. Le taux(19
de vers) des
réussite injections
dans ont été
ce système étaitadministrées dans
la gonade et 37%
(11 vers) dans
supérieur l'intestin. Le taux
aux performances dedela réussite dans ce
microinjection système était supérieur
conventionnelle (taux de àréussite de 30 %) [30]. La raison de la
performance
que 37 % desde la microinjection
injections conventionnelle
dans l'intestin peuvent être(taux de réussite
expliquées sur lade 30%)
base de [30]. La raison
l'orientation en pour
coupelaquelle 37 % des
transversale
lescorps
du injections dans
du ver avecl'intestin peuvent
la pointe être expliquées
de la micro-aiguille sur la base
au moment de l'orientation
de l'injection, comme enillustré
coupeàtransversale du croix
la figure 16. La corps du ver
avec
La la pointe
coupe d'un de la micro-aiguille
jeune ver C. elegansauadulte
moment de l'injection,
montre comme illustré
que si l'orientation de laàgonade
la figureétait
16. La coupe
alignée transversale
avec des jeunes
celle du ver
adulte C.(Figure
l'aiguille elegans montre
16a), que sisel'orientation
l'injection ferait dansde la gonade
la gonade. était alignée
Cependant, toutavec l'aiguille (Figure
désalignement 16a), se produirait
de l'injection
entre
dans lal'aiguille et la gonade
gonade. Cependant, conduirait l'injection
tout désalignement à l'aiguille
entre l'aiguille et dans l'intestin du ver la gonade
conduirait
(voir Figurel'injection à l'aiguille
16b) qui s'est produitdans
dansl'intestin
37 % desduinjections
ver (voirdansFigure 16b)
cette qui était Ces deux sont
expérience.
arrivés
les dansne37%
situations despas
peuvent injections de cette
être distinguées les expérience.
unes des autres, Cescardeux situations
le mécanisme ne peuventest
de visualisation être distinguées
descendant et
2D.
les unes des autres, puisque le mécanisme de visualisation est descendant et 2D.

Figure 16. La coupe transversale des jeunes adultes C. elegans et son alignement par rapport à la microaiguille
à l'intérieur
Figure 16. Laducoupe
micro-injecteur.
transversale(a)
desLajeunes
micro-aiguille
adultes C.est correctement
elegans alignée avec
et son alignement par la gonade
rapport à ladistale
micro- (b) la
aiguille est aligné
micro-aiguille avec l'intestin
à l'intérieur au lieu de la(a)
du micro-injecteur. gonade distale et le est
La micro-aiguille réactif est délivréalignée
correctement dans avec la gonade
distale de l'intestin.
(b) la micro-aiguille est alignée avec l'intestin au lieu de la gonade distale et le réactif est délivré dans l'intestin.
6. Conclusions

6. Conclusion
En résumé, un dispositif microfluidique pour la microinjection du ver C. elegans a été développé. Ce
Le micro-injecteur était capable d'immobiliser simultanément de manière passive un animal librement mobile tel que
En résumé, un dispositif microfluidique pour la microinjection du ver C. elegans a été développé. Ce C. elegans
et effectuant une microinjection en utilisant un mécanisme simple et rapide pour l'actionnement de l'aiguille.
le micro-injecteur était capable d'immobiliser simultanément passivement un animal librement mobile tel que
L'ensemble du processus de la micro-injection prend environ 30 s, dont 10 s pour le chargement et l'alignement des vers,
C.elegans et effectuant une microinjection en utilisant un mécanisme simple et rapide pour l'actionnement de l'aiguille.
Pénétration d'aiguille de 5 s, injection de réactif de 5 s et déchargement de ver de 5 s. Par rapport au conventionnel
L'ensemble du processus de la microinjection prend environ 30 secondes, dont 10 s pour la microinjection de
chargement de vers qui prend des dizaines de minutes pour effectuer une injection, ce système peut augmenter la vitesse
et alignement, pénétration de l'aiguille 5 s, injection de réactif 5 s et déchargement du ver 5 s. Par rapport à la
microinjection de manière significative. L'intégration du mécanisme de plainte 1 DOF avec le passif
microinjection conventionnelle qui prend des dizaines de minutes pour effectuer une injection, ce système peut canal
d'immobilisation, pourrait simplifier considérablement le processus de microinjection par rapport au conventionnel
augmenter considérablement la vitesse de la microinjection. L'intégration des méthodes de plainte 1 DOF. Le système
de livraison pourrait fournir avec précision 160 pi des réactifs dans la gonade. Les resultats
mécanisme avec le canal d'immobilisation passif, pourrait simplifier considérablement la micro-injection a montré que
la solution d'ADN pouvait être injectée avec succès (avec un taux de réussite de 63%) dans la partie distale
processus par rapport aux méthodes conventionnelles. Le système de livraison pourrait livrer précisément 160 pL de
gonade. Cependant, la solution d'ADN utilisée dans cette expérience n'était qu'un réactif modèle pour suivre la
les réactifs dans la gonade. Les résultats ont montré que la solution d'ADN pouvait être utilisée avec succès (avec
distribution du réactif après injection. Une injection similaire mais avec des plasmides peut être utilisée pour créer
taux de réussite de 63 %) injecté dans la gonade distale. Cependant, la solution d'ADN utilisée dans ce vers transgénique.
l'expérience n'était qu'un réactif modèle pour suivre la distribution du réactif après injection. Une injection similaire
mais avec des plasmides peut être utilisée pour créer des vers transgéniques.
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Micromachines 2020, 11, 295 16 sur 17

Contributions des auteursÿ: RG, JT, BPG, PRS, RG et PRS ont conçu et conçu le dispositifÿ; RG, BPG, PRS ont développé la méthodologie ; RG
et JT ont mis en place les expériences et les ont menéesÿ; RG a recueilli les données, les a analysées et a préparé le projet original du manuscritÿ;
RG, PRS et BPG ont examiné le projet et l' ont éditéÿ; PRS et BPG ont obtenu le financement de la recherche et PRS a administré le projet. Tous
les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement : Cette recherche a été financée par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada.

Remerciements : Les auteurs tiennent à remercier Pouya Rezai et Scott Amon pour les discussions lors du développement de cet appareil et de
sa méthodologie.

Conflits d'intérêts : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

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