Produccion y Evaluacion Toxicologioca de Bacillus Thuringiensis

Dra. Rosa Altamirano D.
2011
El control de insectos plaga en la agricultura y de vectores de enfermedades humanas
se ha realizado principalmente con la aplicación de insecticidas químicos. Estos
insecticidas han generado problemas de contaminación ambiental, de toxicidad a
insectos no blancos y, de manera más importante, a los agricultores que los aplican.
Por otra parte, los insecticidas químicos han perdido su eficacia en el control de
insectos, ya que su aplicación ha generado la aparición de poblaciones de insectos
resistentes
. Una posible alternativa para solucionar este problema es el control biológico,
definido como el uso de un organismo natural o modificado genéticamente y/o sus
productos para reducir los efectos de insectos plaga.
Se ha reportado la existencia de más de 1500 especies de microorganismos
entomopatógenos con potencial para el control microbiano de insectos, en relación a su
diversidad se señalan: hongos, virus, protozoarios y bacterias, en donde las últimas
son las de mayor importancia. De las bacterias la más sobresaliente pertenece al
género Bacillus . Bacillus thuringiensis, es una bacteria GRAM positiva esporulada,
nativa del suelo, caracterizada por producir inclusiones paraesporales de constitución
proteica.
GUÍA PRACTICA DE BIOTECNOLOGIA
Dra. Rosa Altamirano Diaz

2011
Desde su descubrimiento en el siglo pasado, B. thuringiensis se
ha convertido en el entomopatógeno más utilizado a nivel
mundial, con ventas que representan de 90% del mercado de
bioplaguicidas, y además es aprovechado para obtener plantas
resistentes a insectos
En el siguiente informe se evaluó la actividad insecticida,
producidas en un Biorreactor, de la cepa nativa Bacillus
thuringiensis para ratificar su valor como alternativa para el
control biológico sobre plagas agrícolas.
1.-Evaluar su capacidad de bioinsecticida en los diferentes géneros de

lepidóptera.
2.- determinar en qué estadio larvario es mucho más eficaz la acción

de la toxina.
3.-determinar el tiempo de efecto de la toxina durante la aplicación.
4.-observar las características corporales que presentan las larvas

durante el bioensayo.
5.-determinar mediante la comprobación de la responsabilidad de la

toxina de Bacillus thuringiensis en la muerte de las larvas.

2011
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
1. Cepa de Bacillus thuringiensis
3. Hojas y granos de Maíz

2. 25 larvas de Heliothis sp.
(Lepidóptero)
1. Balanza analítica 3. Centrifuga
2. Microscopio 4. Biorreactor Loop air

2011
1. Matraz Erlenmeyer de 500 y

2000 mL 4. 10 tubos de centrífuga
2. Pipetas de 5 y 10 mL
5. porta y cubreobjetos
3. Vaso de precipitados de 250 y

6. vagueta
1000 mL
1. Asa microbiológica
3. Mechero o lámpara de alcohol
2. Espátula 4. Pinzas de disección

2011
1. Algodón
3. 4 tapers
4. Ligas
2. Papel aluminio 5. Cinta de pH
1. Agar nutritivo
3. Colorantes para tinción de

Gram
2. Azul de Comassie
MEDIO DE FERMENTACIÓN
Nutrientes (g) MnSO4 0.05

Glucosa 1 K2HPO4 0.5
Extracto de levadura 2 Agua destilada 1L
(NH4 )SO4 2
CuSO4 0.005
MgSO4 7H2O 0.2 Ajustar el pH, con NaOH 1 N. a 7.0.
Esterilizar 121°C durante 15 minutos.
FeSO4 7H2O 0.005
CaCl2 2H2O 0.025
ZnSO4 7H2O 0.005

2011
PROCEDIMIENTOS GENERALES
5.1 OBTENCIÓN DE BIOMASA DE Bacillus thuringiensis
5.2 OBTENCIÓN DE CRISTALES PROTEICOS TOXICOS.
5.3 EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE LOS CRISTALES PROTEICOS DE B.
thuringiensis SOBRE LARVAS DE INSECTOS PLAGA (BIOENSAYOS).
Repicar por estría una cepa nativa de B. thuringiensis en tubos con agar nutritivo.
Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
Nota: se realizo la preparación del medio larvita, que consistió en coger larvas de
Heliothis sp. se trituraron en agua destilada y se cogió un hisopo se sembro y se
incubo.

2011
- PROLIFERACIÓN CELULAR: sembrar en toda la superficie de 1 placa con agar

nutritivo e incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
- COSECHA CELULAR:
a. Añadir 3 ml de caldo nutritivo en la placa con el cultivo y 5 perlas de vidrio

estériles. Mover las placas suavemente hasta obtener una suspensión
celular.
b. Tomar la suspensión celular y colocarlo en un frasco schott de 150 ml

estéril y enrazar hasta 50 ml con caldo nutritivo.

2011
- OBTENCIÓN DEL INÓCULO:
a. Incubar el frasco schott con la suspensión celular en agitación a 150 rpm a

temperatura ambiente por 18 a 24 horas (alternativa estufa a 37 ºC).
b. Realizar el recuento celular mediante siembras por incorporación en agar

nutritivo de diluciones seriadas del cultivo hasta 10-5. (el recuento directo
con cámara de Petroff-Hausser).
CONCENTRACION
DEL INOCULO:
45 X 108 cel/ml
4.5 X 109 cel/ml

2011
Armar y esterilizar el biorreactor rector loop “air lift”.
MIDIENDO LOS VVM.
VOL REACTOR/VOL.DEL AIRE/MIN
200 ml 2s donde 3950 es vol de trabajo

x 60 s
x = 200 x 60 = 6000
2
Luego : 6000 / 3950 = 1.52 VVM
a. Colocar el inóculo y el medio de fermentación hasta un volumen de

trabajo de 3950 ml. en el biorreactor. (inicio del proceso 104 cél/ml).
DATOS:
Hallando la concentración inicial
C1 = 45 X 108cel/ml
de fermentación
V1 = 0.5 ml
C2 = X c1 v 1 = c 2 v 2
V2 =3950 ml
(45 x 108) x (0.5 ml) = c2 x (3950
ml)
CONCENTRACIÓN
INICIAL DE c2 = 0.005696 x 108
FERMENTACIÓN c2 = 5.6 x 104
6 x 105ufc/ml
c2 = 6 x 105

2011
b. Insuflar aire estéril a 1.5 VVM.

c. Poner en funcionamiento por espacio de 48 – 72 horas a temperatura
ambiente.
d. Dejar en reposo por 48 h para que las células esporulen y formen los
cristales proteicos.
Observar la turbidez del medio de cultivo cada 24 horas que indica el

crecimiento bacteriano y la formación de las endotoxinas por la aparición de
precipitados en el reactor y aclaración del medio.
CONCENTRACION FINAL DE
FERMENTACION:
1 x 1013 ufc / ml
Decantar el sobrenadante y mediante centrifugación a 6000 rpm por 5 min

separar las espora – cristal.

2011
Verificar la producción de cristales proteicos mediante una tinción con azúl de

coomassie (realizar la extensión, fijación del sedimento y colorear con el
colorante por 5 minutos, lavar con agua corriente y observar con el objetivo de
inmersión).
Resuspender el sedimento en 8 ml de una solución de NaCl 0.85 %, centrifugar a

6000 rpm por 5 min y eliminar el sobrenadante. Repetir el lavado.
Añadir al sedimento anterior 4 volúmenes de acetona y dejar reposar por 5’.

Centrifugar a 5000 rpm por 5 min. y eliminar el sobrenadante.

2011
Colocar el sedimento en una placa Petri por 24 horas y verificar el secado del
mismo. Extraer el sedimento seco con ayuda de una espátula y triturarlo en un
mortero hasta obtener un polvo fino. Conservar el complejo de espora-cristales
en un tubo Eppendorff a 4ºC.
Identificar larvas de lepidópteros de importancia agroindustrial que según

sus características morfológicas pertenezcan a estadios I y II.
Larva en Larva en
estadio I estadio II
DESCRIPCION DE LA LARVA DE Heliothis Sp.
DAÑOS:
El daño lo ocasiona la larva que se alimenta del choclo
destruyéndolo, en las zonas de Sierra alcanza 100% de
daño. Las infestaciones limitan la comercialización de
maíz y choclo.

2011
BIOLOGIA
La larva recién emergida es de color marrón
claro con cabeza oscura a medida que crece su
coloración es muy variada, se encuentran tonos
verdes, amarillo, rosado y negro. La larva
madura presenta cuatro manchas oscuras en
forma de trapecio en cada uno de los
segmentos abdominales.
Resuspender la toxina conservada en 100ml de SSF estéril(1 mg/mL)
Lavar cuidadosamente con agua destilada estéril la superficie de las hojas

que servirán de alimento de las larvas a ensayar.
Emplear 2 vasos descartables de 1 litro con tapa perforada y cubierta con

un tul: uno de ellos se utilizará como ensayo (E) y el otro como control
negativo (N).
E N

2011
Para el vaso E: colocar 2 a 3 hojas humedecidas en la superficie con la

suspensión de bioinsecticida en estudio.
Para el vaso N: colocar 2 a 3 hojas humedecidas en la superficie con SSF
estéril.
A cada vaso colocar 25 larvas con un mínimo 10 larvas de lepidóptero de I o
II estadio.
Observar cuidadosamente la ingestión de las hojas por parte

de las larvas y anotar el tiempo de efecto de la toxina hasta
un lapso de 72 horas y registrar los resultados.
Colocar hojas frescas en los controles después de 24 horas.

2011
Tabla 1. Susceptibilidad de diferente especies de Lepidópteras frente a

toxinas de Bacillus thuringiensis durante 72 horas.
*Ensayo: ensayo que obtuvo mayor numero de larvas muertas durante un

periodo de 72 horas.
Tabla 2. Susceptibilidad de Heliothis sp. (Grupo 1) frente a toxinas de

Bacillus thuringiensis durante 72 horas.
Evaluación Tiempo de Evaluación (horas) TOTAL

0 0.5 1 2 4 6 12 28 48 72 muertas % vivas %
Ensayo - - - - - 3 1 6 5 5 20 80 5 20 25
Negativo - - - - - 2 2 - - 3 7 28 13 72 25

2011
Grafica 1. Numero de larvas muertas VS tiempo en horas
25 y = 0,2608x + 1,9495
Numero de Larvas Muertas
R² = 0,974
20
15
larvas muertas
10 Lineal (larvas muertas)
0
0 20 40 60 80
Tiempo de evaluacion ( horas )
Grafica 2. Evaluación toxicológica de Bacillus thuringiensis frente a un

control negativo en larvas de Heliothis sp.
20
numero de larvas muertas
por unidad de tiempo
15
10
0
1 2 3 4 5 6
ENSAYO 0 3 4 10 15 20
NEGATIVO 0 2 4 7

2011
Grafica 3. Susceptibilidad de larvas de Heliothis sp. Comparada con larvas de

Spodoptera sp. Frente a la toxina de Bacillus thuringiensis
25
NUMERO DE LARVAS MUERTAS
20
15
10
0
1 2 3 4 5 6
heliothis 0 3 4 10 15 20
spodoptera 3 11 13 21
Grafica 4. Susceptibilidad de larvas de Heliothis sp. Comparada con larvas de Pectinophora

gossypiella frente a la toxina de Bacillus thuringiensis
25
20
por unidad de tiempo
15
10
0
1 2 3 4 5 6
Pectinophora gossypiella 1 2 3 3 4 20
Heliothis sp. 0 3 4 10 15 20

2011
Grafica 5. Susceptibilidad de larvas de Spodoptera sp. Comparada con larvas de

Pectinophora gossypiella frente a la toxina de Bacillus thuringiensis
25
20
por unidad de tiempo 15
10
0
1 2 3 4 5 6
Pectinophora
1 2 3 3 4 20
gossypiella
Spodoptera sp. 3 11 13 21
Grafico 6.-Evaluación de Cristales Tóxicos de Bacillus thuringiensis sobre 3

especies de Larvas de Importancia Agrosanitaria.
25
20
porunidad de tiempo
15
10
0
1 2 3 4 5 6
Pectinophora
1 2 2,8 3 4 20
gossypiella
Heliothis sp. 0 3 4 10 15 20
Spodoptera sp. 3 11 13 21

2011
PRUEBA CONFIRMATIVA si la Toxina que mato a las larvas era de Bacillus

thuringiensis se cultivo en placas con Agar Nutritivo y Plate Count observándose los
resultados:
RESULTADO: las colonias crecidas si pertenecen a Bacillus thuringiensis para ello

Se Observo Sus Características Morfológicas Y Observación
Microscópica Con Coloración Gram.

2011
1. Los biocristales de Bacillus thurigiensis son eficaces para un futuro control

de plagas en los campos de cultivo, puesto que se ha demostrado su
capacidad citotóxica en larvas de lepidópteros.
2. Las larvas presentaron características de muerte comunes: la parte ventral
(abdomen) adquiere una coloración negruzca, aspecto deshidratado que va
tornándose cada vez más oscuro y abarcando la totalidad del cuerpo.
3. La toxina de Bacillus thurigiensis es mucho más eficiente y mortífera,
cuando se aplica en estadios larval I.
4. La especificidad de la toxina de B. thurigiensis se demostró con un mayor
porcentaje, en las larvas del género de Spodoptera.
5. La periodicidad en el proceso de evaluación permitió el seguimiento y
verificación de la actividad citotóxica, a través de características
cualitativas observadas en las larvas.
Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram-positiva, aerobia estricta,

morfológicamente relacionada con Bacillus cereus y Bacillus anthracis.
Estas tres especies bacterianas, durante su ciclo de vida, presentan dos
fases principales, la fase de crecimiento vegetativo en donde las bacterias
se duplican por bipartición cada 30-90 min dependiendo del medio de
cultivo y la fase de esporulación (durante la fase estacionaria), la cual es
un programa de diferenciación de bacteria a espora, él, se dispara cuando
la bacteria se encuentra en limitación de nutrientes. La espora es una
forma de vida latente que puede permanecer en el ambiente por periodos
de tiempo muy largos (años) en ausencia de humedad y nutrientes. Cuando
la espora se encuentra de nuevo en un medio rico que contenga los
nutrientes necesarios puede germinar para comenzar de nuevo el
crecimiento vegetativo.

2011
Bacillus thuringiensis (Bt) es un patógeno de insectos y su actividad es

atribuida, amplia o completamente (dependiendo del insecto), a las ICPs y
su importancia radica en su tóxicidad contra larvas de insectos-plaga de
los ordenes lepidóptero, coleóptero, díptero, himenóptero, homóptero,
ortóptero, etc.
En el laboratorio tras reactivar el cultivo de Bacillus thuringiensis (Bt) se

logró inducir la esporulación de éste, al transferirlo a un reactor loop “air
lift” con pocos nutrientes, y para mayor seguridad del proceso, se dejo el
cultivo en reposo por 5 días.
En la etapa de bioensayos, empezamos el trabajo con un total de 25 larvas
por cada frasco (control y bioensayo) culminándose el monitoreo a las 72
horas.
La acción citotoxica en las larvas destinadas a los bioensayos produjo un
total de 20 larvas muertas, encontrando resultados similares con la mesa 3
y 5, quienes con la misma técnica reportaron 20 y 21 larvas muertas
respectivamente.
En relación con la mesa 2, quienes al igual que nuestra mesa, emplearon
como larva plaga a la especie Heliothis zea, nuestros reportes difieren,
obteniendo ventaja nuestra mesa, quienes al aplicar repetidas veces el
biocida observamos como resultado, mayor efectividad citotoxica.
Finalmente las semejanzas que se observo en todas las mesas, fue en el
envase control; en todos hubo un porcentaje no tan significativo de larvas
muertas, atribuyendo su causa a la mala manipulación de los ejemplares y/o
factores de nutrición. Y es así que nuestra mesa juntamente con la mesa 2,
4 ,5 y 6 representamos menos del 30% en obtener larvas muertes durante
el trabajo control.

2011
http://intimicro.blogspot.com//bacillus-thuringiensis-y-sus-
toxinas.html
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/ ulo_27.pdf
http://www.scielo.org.ar/pdf/ram/v40n2/v40n2a13.pdf
http://npic.orst.edu/factsheets/BTgen.pdf
http://www.controlbiologico.com
http://www.controlbiologico.com
http://whqlibdoc.who.int
http://web.catie.ac.cr
http://es.wikipedia.org.

2011
Bioreactor Loop
Airlife
Armar y esterilizar
el biorreactor (1.5
VVM)

2011
Decantar el bioreactor
Sedimento en los tubos con

cristales
Coloración con
Azul de comassi

2011

2011


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Dra. Rosa Altamirano D.

El control de insectos plaga en la agricultura y de vectores de enfermedades humanas

se ha realizado principalmente con la aplicación de insecticidas químicos. Estos

insecticidas han generado problemas de contaminación ambiental, de toxicidad a

insectos, ya que su aplicación ha generado la aparición de poblaciones de insectos

. Una posible alternativa para solucionar este problema es el control biológico,

definido como el uso de un organismo natural o modificado genéticamente y/o sus

productos para reducir los efectos de insectos plaga.

Se ha reportado la existencia de más de 1500 especies de microorganismos

entomopatógenos con potencial para el control microbiano de insectos, en relación a su

diversidad se señalan: hongos, virus, protozoarios y bacterias, en donde las últimas

son las de mayor importancia. De las bacterias la más sobresaliente pertenece al

género Bacillus . Bacillus thuringiensis, es una bacteria GRAM positiva esporulada,

nativa del suelo, caracterizada por producir inclusiones paraesporales de constitución

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Desde su descubrimiento en el siglo pasado, B. thuringiensis se

ha convertido en el entomopatógeno más utilizado a nivel

mundial, con ventas que representan de 90% del mercado de

bioplaguicidas, y además es aprovechado para obtener plantas

En el siguiente informe se evaluó la actividad insecticida,

producidas en un Biorreactor, de la cepa nativa Bacillus

thuringiensis para ratificar su valor como alternativa para el

control biológico sobre plagas agrícolas.

1.-Evaluar su capacidad de bioinsecticida en los diferentes géneros de

2.- determinar en qué estadio larvario es mucho más eficaz la acción

3.-determinar el tiempo de efecto de la toxina durante la aplicación.

4.-observar las características corporales que presentan las larvas

5.-determinar mediante la comprobación de la responsabilidad de la

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2. Microscopio 4. Biorreactor Loop air

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3. Vaso de precipitados de 250 y

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3. Colorantes para tinción de

Nutrientes (g) MnSO4 0.05

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- PROLIFERACIÓN CELULAR: sembrar en toda la superficie de 1 placa con agar

a. Añadir 3 ml de caldo nutritivo en la placa con el cultivo y 5 perlas de vidrio

b. Tomar la suspensión celular y colocarlo en un frasco schott de 150 ml

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a. Incubar el frasco schott con la suspensión celular en agitación a 150 rpm a

b. Realizar el recuento celular mediante siembras por incorporación en agar

4.5 X 109 cel/ml

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MIDIENDO LOS VVM.

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200 ml 2s donde 3950 es vol de trabajo

a. Colocar el inóculo y el medio de fermentación hasta un volumen de

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b. Insuflar aire estéril a 1.5 VVM.

Observar la turbidez del medio de cultivo cada 24 horas que indica el

Decantar el sobrenadante y mediante centrifugación a 6000 rpm por 5 min