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Protéomique

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Protéomique

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La protéomique désigne la science qui étudie les protéomes, c'est-à-dire l'ensemble des
protéines d'une cellule, d'un organite, d'un tissu, d'un organe ou d'un organisme à un moment
donné et sous des conditions données.
Dans la pratique, la protéomique s'attache à identifier de manière globale les protéines
extraites d'une culture cellulaire, d'un tissu ou d'un fluide biologique, leur localisation dans les
compartiments cellulaires, leurs éventuelles modifications post-traductionnelles ainsi que leur
quantité.
Elle permet de quantifier les variations de leur taux d'expression en fonction du temps, de leur
environnement, de leur état de développement, de leur état physiologique et pathologique, de
l'espèce d'origine. Elle étudie aussi les interactions que les protéines ont avec d'autres
protéines, avec l'ADN ou l'ARN, avec des substances.
La protéomique fonctionnelle étudie les fonctions de chaque protéine.
La protéomique étudie enfin la structure primaire, secondaire et tertiaire des protéines.

Sommaire
[masquer]
• 1 Histoire de la protéomique
• 2 Pourquoi le protéome ?
• 3 Différentes approches de la protéomique
○ 3.1 Extraction
○ 3.2 Séparation
 3.2.1 Principe de la séparation des protéines par électrophorèse
bidimensionnelle
 3.2.2 Recherche des protéines d’intérêt par analyse d’image
○ 3.3 Identifier, caractériser et quantifier les protéines
 3.3.1 Identification par spectrométrie de masse (SM)
 3.3.2 Interrogation des bases de données
○ 3.4 Quantification de l'expression des protéines
○ 3.5 Les interactions protéiques
○ 3.6 Protéomique fonctionnelle
○ 3.7 Protéomique structurale
• 4 Les enjeux de la protéomique
○ 4.1 La recherche de biomarqueurs
○ 4.2 De nouveaux outils thérapeutiques
• 5 Notes et références
• 6 Voir aussi
○ 6.1 Articles connexes
○ 6.2 Bibliographie
○ 6.3 Liens externes

Histoire de la protéomique[modifier]
Le terme de protéomique est récent. Il a été utilisé pour la première fois dans une publication
scientifique en 1997 par James P.[1] dans son article Identification des protéines dans l'ère
post-génomique : l'ascension rapide de la protéomique. Il dérive de protéome, terme inventé
en 1995, par analogie avec génomique qui dérive lui-même du terme génome, l'ensemble des
gènes d'un organisme. L'analyse protéomique est une étude dynamique. Un seul génome peut
conduire à différents protéomes en fonction des étapes du cycle cellulaire, de la
différenciation, de la réponse à différents signaux biologiques ou physiques, de l'état
physiopathologique... Le protéome reflète les répercussions de ces événements cellulaires au
niveau tant traductionnel que post-traductionnel. De ce point de vue, seule une analyse
protéique directe peut donner une image globale des systèmes biomoléculaires dans leur
complexité.
Les scientifiques se sont intéressés aux protéines bien avant la naissance de la protéomique.
Dès 1833, Anselme Payen et Jean-François Persoz isolèrent d'un extrait de malt une enzyme
capable de catalyser la dégradation de l'amidon en sucre. en 1965, André Lwoff, François
Jacob et Jacques Monod reçurent le prix Nobel de médecine « pour leurs recherches sur la
manière dont la production des enzymes est réglée au niveau des gènes »[2], publiées en 1961).
De nombreuses techniques, encore largement utilisées, ont été développées.
La technique d'électrophorèse a été développée en 1892 par S.E. Linder et H. Picton. Le
principe de la chromatographie date de 1861 par Friedrich Goppelsröder.
// mettre une fresque reprenant la chronologie de l'étude des protéines
Depuis une dizaine d'années, la protéomique est devenue une science à part entière, avec ses
techniques propres et ses méthodes.
Elle a emprunté de nombreuses technologies, auparavant utilisées dans d'autres disciplines, et
les a appliquées à l'étude des protéines. On peut citer par exemple l'utilisation de la
spectrométrie de masse, provenant de la physique et de l'analyse chimique, dans
l'identification des protéines, dans la quantification de l'expression des protéines, dans la
localisation de peptides dans un tissu, dans la recherche de biomarqueurs spécifiques de
pathologies.
Pourquoi le protéome ?[modifier]
• Les grosses protéines ont souvent une structure spatiale complexe, où des sous-unités
compactes sont reliées entre elles par des chaînes flexibles qui jouent un rôle dans les
interactions entre protéines ou avec d'autres substances. L'analyse de la structure des
protéines aux rayons X montre qu'elles sont bâties autour d'un réseau cristallin rigide,
qui empêche ou réduit la flexibilité des sous-unités.
• La somme d'informations issue de l'analyse génomique ne répond pas à toutes les
questions que vise l'analyse protéomique (difficile et coûteuse).
Des événements clés ont conduire du stock d’informations que constitue le génome à
la production des molécules qui vont déterminer et réguler la vie cellulaire, les
protéines. En théorie, la séquence de chaque gène sera transcrite (ou non) en un ARN
messager (ARN-m), lui-même traduit en protéine. En fait, les gènes des cellules
eucaryotes sont souvent morcelés et contiennent des régions (introns) absentes de
l’ARN-m. Une transcription partielle sera permise par l’épissage d’un ARN
précurseur, copie du gène, pouvant donner naissance à différents ARN-m, chacun de
ceux-ci pouvant aboutir à plusieurs protéines. On peut donc avancer une série de
raisons plaidant en faveur du développement de l'analyse protéomique :
• L'identification et l'estimation des taux de protéines sont cruciales pour obtenir une
image complète de nombreux processus biologiques. Or, l'abondance des protéines à
l'intérieur de la cellule n'est pas seulement régulée à un niveau transcriptionnel, mais
aussi aux niveaux traductionnels et post-traductionnels, de telle sorte qu'aucune
relation simple ne peut être établie entre taux d'ARN-m et de protéines. Le fait qu’un
gène unique, et même un ARN-m unique, puisse conduire à plusieurs protéines
distinctes par leur(s) fonction(s) rend hasardeuse cette corrélation. Enfin, certaines
protéines ont une durée de vie longue, c’est-à-dire que même synthétisées à faible
vitesse elles peuvent s’accumuler dans la cellule en demeurant fonctionnelles, alors
que d’autres - à durée de vie brève - sont rapidement éliminées. Donc, même si leur
synthèse est rapide et elles se retrouveront à un faible taux.
• Une protéine selon son état cellulaire (différenciation, prolifération, apoptose) se
retrouvera dans un compartiment donné (cytoplasme, noyau, mitochondrie) ou sera
secrétée par la cellule. Sans l’analyse du protéome, une modification de localisation de
la protéine nécessaire à son activité biologique passera inaperçue.
• La plupart des protéines ne deviennent biologiquement active qu'après des étapes de
maturation co- et post-traductionnelles (telles que glycosylation, phosphorylation,
déamination...). Elles sont également les indicateurs de l’état de la machinerie
cellulaire.
Finalement, les enjeux et résultats de projets de séquençage (du génome humain notamment)
justifient une étude approfondie du protéome. La découverte « surprenante » que ce génome
contenait bien moins de gènes que prédits démontre l'importance des protéines comme acteurs
centraux des processus biologique
Différentes approches de la protéomique[modifier]
Les méthodologies mises en œuvre pour l’analyse du protéome peuvent schématiquement être
séparées en deux grands groupes : dans le premier peuvent être regroupées les méthodes
expérimentales réalisées dans le « laboratoire réel » (wet laboratory), reposant principalement
sur les techniques de séparation et d’analyse des protéines. Un second groupe de méthodes,
mises en œuvre dans le « laboratoire virtuel » (dry laboratory), fait appel à l’analyse d’images
et à la bio-informatique. Laboratoires réel et virtuel sont mis à contribution lors des
principales étapes de l’analyse.
Dans la pratique, les protéines sont d’abord extraites d’une population cellulaire ou d’un tissu,
puis séparées avant d’être identifiées.
Extraction[modifier]
La première étape consiste généralement à extraire les protéines d'un échantillon biologique.
Cette étape est cruciale : une mauvaise extraction peut produire la dégradation des protéines et
compliquer, voir rendre impossible, l'identification des protéines. Les protéines
membranaires, comportant de nombreux acides aminées hydrophobes et donc peu soluble,
restent difficiles à étudier.
Certaines techniques ne nécessitent pas d'extraire les protéines du tissu étudié. Dans
l'immunolocalisation, le tissu est fixé puis découpé en fines lamelles de quelques microns
d'épaisseur. Les protéines sont ensuite détectées in situ par des anticorps marqués. Dans
l'imagerie par spectrométrie de masse, des coupes de tissus sont analysées directement par un
spectromètre de masse de type MALDI-TOF.
Pour simplifier l'analyse, l'extraction est souvent réalisée en éliminant les modifications post-
traductionnelles. Seule la structure primaire des protéines, c'est-à-dire leurs séquences, est
conservée. Mais si le sujet de l'analyse est l'étude de ces modifications post-traductionnelles,
il convient de prendre les précautions nécessaires pour les garder.
Séparation[modifier]
La seconde étape permet de séparer les protéines en fonction de leurs caractéristiques
physiques ou chimiques ou en fonction de leurs affinités pour un ligand.
L'électrophorèse sépare les protéines dans un gel polyacrylamide en fonction de leur taille
lorsqu'elles sont soumises à un champ électrique. La méthode d'électrophorèse de référence
pour la protéomique est l’électrophorèse bidimensionnelle (2-DE).
La chromatographie utilise la différence d'affinité des protéines entre une phase mobile et une
phase stationnaire.
Principe de la séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle[modifier]
L'électrophorèse bidimensionnelle permet à partir de mélanges protéiques complexes de
séparer et visualiser des centaines voire des milliers de protéines sous forme de taches ou
« spots ». La résolution obtenue est suffisante pour mettre en évidence la présence
d'isoformes.
Son principe consiste à effectuer dans un premier temps une séparation des protéines en
fonction de leur charge (isoélectrofocalisation, IEF), suivie d'une séparation orthogonale, en
fonction de la taille. La résolution de la première dimension est de l'ordre de 0.01 unités pH.
Les gels obtenus sont ensuite colorés, puis numérisés. Le résultat est une semi-quantification.
Recherche des protéines d’intérêt par analyse d’image[modifier]
Il existe aujourd’hui deux grandes approches partant de l’analyse d’images des gels 2-DE
permettant d’aborder la protéomique quantitative. L’une de ces méthodes utilise une
comparaison statistique entre plusieurs gels et l’autre utilise un procédé chimique de
dérivation des protéines par des sondes fluorescentes permettant l’analyse combinée de
plusieurs échantillons sur un gel unique. Pour ce faire on utilise dans les deux cas des logiciels
d'imagerie. En effet, il est impossible d’appréhender individuellement le nombre considérable
de spots (parfois jusqu’à 2000) résolues sur un gel 2D (Fig. 5). Ces multiples spots
correspondent aux isoformes des protéines séparées en deux dimensions. La position sur le
gel des spots polypeptidiques est reproductible dans les systèmes de séparation en gradient
d’Immobilines. Un changement de position est par conséquent un indicateur d’une
modification post-traductionelle affectant sa charge et/ou sa taille.
L’analyse d’images repose sur la numérisation de l’image du gel 2-DE après coloration. Au
cours de cette étape le logiciel découpe l’image en pixels (contraction de picture element)
pour la transmission et le stockage des données. Chaque pixel de l’image est enregistrée à une
position en x et en y associée à une valeur de densité optique (DO) proportionnelle à
l’intensité du signal enregistré par la caméra ou le scanner. Pour que la DO soit un bon
paramètre de mesure et un reflet de l’expression de la protéine, la coloration appliquée doit
présenter une gamme dynamique importante et si possible linéaire. Dans un gel, en termes de
DO le rapport d’intensité entre le plus petit spot détectable et le spot le plus gros est de l’ordre
de 104 alors que la dynamique d’expression des protéines dans la cellule est comprise entre
105 et 106. On constate donc un déficit important de la gamme analytique qui doit être pris en
compte au cours de l’analyse.
La coloration des protéines en gel 2-DE reposent principalement sur l’emploi de colorants
organiques tel que le bleu de Coomassie, de métaux tels que le nitrate d’argent, ou encore par
sur des sondes fluorescentes. La gamme de détection varie d’un facteur d’environ 10000 entre
les méthodes utilisant le bleu de Coomassie (détection de spots contenant une quantité de
protéine de l’ordre du µg) et celles utilisant le nitrate d’argent qui permettent d’atteindre
0,1 ng. Les colorants fluorescents sont moins sensibles que le nitrate d’argent, cependant ont
une plus grande reproductibilité et gamme dynamique.
Les logiciels d’analyses d’images actuels incorporent des éléments de visualisation 3D des
spots du gel, permettant des changements d’angles en x, y, et z qui sont extrêmement utiles
pour séparer des spots proches. La quantification est ainsi améliorée. L’utilisation de tels
outils permet d’élargir considérablement le goulot d’étranglement lié à l’analyse des gels.
Cependant, une analyse différentielle fiable nécessite d’établir une comparaison entre des
séries d’au moins trois à quatre gels. Des tests statistiques comme l’analyse heuristique ou
l’analyse par correspondance permettent objectivement de déterminer la dispersion entre les
gels de différentes séries expérimentales.
La multiplication des gels 2D nécessaire à l’obtention d’une quantification différentielle
statistiquement fiable est cependant un handicap aux analyses à haut débit pour lesquelles la
technique du gel unique est intéressante. L’analyse différentielle sur un gel unique:
(technologie DIGE pour differential in gel-electrophoresis) a été introduite sur le marché par
GE (anciennement) Amersham Biosciences. Le principe repose sur le marquage covalent à
l’aide de cyanines fluorescentes (p. ex. Cy2, Cy3 et Cy5) des protéines contenues dans deux
extraits à analyser. Trois structures sont disponibles avec des spectres de fluorescences
différents. Elles possèdent en outre un groupement N-hydroxy-succinimidyl ester qui permet
par une réaction de substitution nucléophile avec le groupe amine en epsilon des lysines des
protéines de former une amide. L’analyse d’images d’un gel DIGE est plus aisée puisque les
deux échantillons ont migré sur le même gel. Les images acquises aux deux longueurs d’onde
sont superposées et comparées quantitativement à l’aide de logiciels adaptés avec l’ajout
d’une référence interne. L’étude comparative en deux couleurs aboutit à la mise en évidence
des protéines qui différent ou qui sont identiques dans les deux échantillons. La possibilité
offerte d’avoir un étalon interne augmente la fiabilité des mesures quantitatives. Quelle que
soit la méthode d’analyse utilisée, les spots d’intérêt une fois détectés sont excisés du gel afin
d’être identifiés par des méthodes spectrométriques (spectrométrie de masse en mode
MALDI-TOF ou en mode tandem MS/MS). En plus de l’analyse différentielle, l’analyse
d’images permet de construire et d’annoter des cartes de référence servant de base à des
banques de données consultables sur le WEB.
Identifier, caractériser et quantifier les protéines[modifier]
• La masse réelle des protéines est souvent mesurée par spectrométrie de masse, avec
une précision allant de 0,1 dalton à 10 daltons ; La digestion d'une protéine par une
enzyme telle que la trypsine produit des fragments de taille spécifique. La masse des
fragments est ensuite mesurée par spectrométrie de masse (technique du
fingerprinting).
• Par la technique de spectrométrie de masse en tandem et le séquençage d'Edman, il est
possible de séquencer les peptides. Mais ces méthodes considèrent les protéines
comme des structures figées, alors qu'elles sont mouvantes, et qu'elles peuvent parfois
brièvement s'associer à des substances réactives en s'y liant, avant de s'en séparer.
• Une nouvelle méthode renseigne mieux sur la structure spatiale de protéines, en les
étudiant en solution et en combinant des procédés connus, dont l'analyse aux rayons X
ou RMN classique, avec une spectroscopie RMN associée à un nouveau logiciel
d'analyse qui donne accès à des détails atomiques fins de la structure spatiale. Dans la
protéine-même, on introduit des groupes nitroxyl possédant un électron non apparié.
Ces derniers servent à mesurer les écarts entre les sous-unités puis à en déduire la
structure tridimensionnelle de la protéine ou de plusieurs protéines associées
(complexes de protéines, même de grandes tailles). Ceci permet de mieux étudier la
liaisons des protéines avec leurs partenaires, et d'en déduire certains mécanismes
complexes de régulation biologique [3],[4].
Identification par spectrométrie de masse (SM)[modifier]
L'identification par SM repose sur une mesure précise de la masse de peptides ionisés. D’une
façon très générale les protéines sont digérés par une endopeptidase (le plus souvent la
trypsine) et, ensuite analysées par SM.
Une des approches utilisée est l’établissement de cartes peptidiques massiques (« peptide
mass fingerprinting »). La masse des peptides obtenus après digestion protéasique est
comparée aux cartes de masses théoriques des protéines répertoriées dans les banques de
données. Différents algorithmes ont été développés pour faciliter cette recherche. Les logiciels
d’analyse de données de SM vont rechercher une série de protéines (selon des critères définis
par l’expérimentateur) dans une base de données de séquences et générer pour chacune un
spectre théorique pour voir lequel se rapproche le plus du spectre expérimental.
Selon des logiques différentes pour chaque algorithme, ils établiront un score pour chaque
séquence analysée « in silico » qui conduira à un classement des protéines candidates. Cette
approche souffre pourtant de limites objectives et dans le cas d’identifications difficiles
différents logiciels fourniront des listes de protéines candidates différentes. Par exemple, un
logiciel prenant en compte le nombre de masses communes entre le spectre théorique de la
protéine candidate et le spectre expérimental favorisera les protéines de haute masse
moléculaire pour lesquelles un plus grand nombre de peptides virtuels peuvent être déduits de
la séquence.
Le problème est contourné en séquencant partiellement les protéines par spectrométrie de
masse tandem (MS/MS). Certains fragments peptidiques analysés lors d'une première SM
sont alors choisis et fragmentés. Les pics de masse obtenus constituent une représentation de
la séquence protéique, dans laquelle deux pics adjacents diffèrent par la masse d’un acide
aminé perdu lors de la fragmentation du peptide analysé. Une analogie à la courte séquence
protéique peut alors être cherchée dans les banques de données. Si ces séquences sont
communes à un groupe de protéines, le point isoélectrique et la masse apparente déterminés
lors de la séparation par électrophorèse permettent de trancher. Recouper des informations
(courtes séquences de quelques acides aminés, localisation d’une fenêtre comprenant le spot
en électrophorèse 2D, espèce animale et type cellulaire dont provient l’échantillon) augmente
la fiabilité de l'identification d'un polypeptide.
Au lieu de simplement déterminer une séquence peptidique à partir du spectre de masse d’un
peptide et de l’utiliser pour miner une base de données de protéines ou d’ADN, le spectre
MS/MS peut être comparé à une série de spectres MS/MS virtuels dérivés des séquences
protéiques des bases de données. Sur le même principe, on peut d'abord séparer les peptides
issus de la digestion trypsique par une nanométhode de chromatographie liquide (nanoLC) et
réaliser une MS/MS sur ces différents peptides. La multiplication des informations sur
différents segments de la protéine permettra alors non seulement de conforter l’identification,
mais également d’obtenir des informations structurales en particulier sur les modifications
post-traductionnelles, telles que l’addition de groupements phosphates (phosphorylation) ou
de chaînes d’oligosaccharides (glycosylation). D’un point de vue fonctionnel, ces
informations sont fondamentales. Les phosphorylations sont à la base de la conduction de
signaux dans la cellule, de l’extérieur de celle-ci par ses récepteurs membranaires jusqu’au
noyau où sont centralisées les informations régulant la vie cellulaire. Quant aux chaînes
oligosaccharidiques, elles jouent un rôle crucial dans la modulation des propriétés chimiques
de certaines protéines (glycoprotéines) et gouvernent parfois leur activité biologique. Pour
identifier ces groupements, la SM utilisera les fragments résultant de leur séparation de la
chaîne peptidique ou de leur propre fragmentation.
Interrogation des bases de données[modifier]
C'est la dernière étape pour le protéomicien, permise par les progrès de la bio-informatique.
Les différentes informations récoltées sur les protéines (masse apparente, masse réelle, point
isoélectrique, taille des fragments après digestion enzymatique, séquence partielles) sont
comparées aux bases de données génomiques ou protéomiques en ligne. Les logiciels
fournissent alors une liste de protéines et leurs probabilités associées.
Cas d'organismes dont le génome n'a pas encore été séquencé ;
Seuls certains organismes, dits « organisme modèle », ont un génome complètement séquencé
et disponibles en ligne. les autres organismes sont étudiés par homologie avec les organismes
connus.
Quantification de l'expression des protéines[modifier]
Elle permet de quantifier les variations de leurs taux d'expression en fonction du temps, de
leurs environnements, de leurs états de développement, de leurs états physiologiques et
pathologiques, de l'espèce d'origine.
Les techniques les plus couramment utilisées sont :
• Électrophorèse des protéines
• Enzyme-linked immunosorbent assay
• Spectrométrie de masse
Les interactions protéiques[modifier]
Elle étudie aussi les interactions que les protéines ont avec d'autres protéines, avec l'ADN ou
l'ARN, avec des substances.
Une autre manière de considérer les interactions protéiques est de faire du double hybride. En
criblant une banque d'ADNc avec sa protéine en tant qu'appât on peut déceler tous les
interractants dans un organisme ou un tissu spécifique (animal ou végétal). Correctement
utilisée, cette technique est très efficace. La qualité des résultats dépend souvent de la qualité
de la banque et de l'efficacité de la transformation de la levure ou de la bactérie.
Protéomique fonctionnelle[modifier]
La protéomique fonctionnelle étudie les fonctions de chaque protéine.
Protéomique structurale[modifier]
La protéomique étudie enfin les structures primaires, secondaires et tertiaires des protéines.
Les enjeux de la protéomique[modifier]
La recherche de biomarqueurs[modifier]
De nouveaux outils thérapeutiques[modifier]
Cette section est vide, insuffisamment détaillée ou incomplète. Votre aide est la bienvenue !
Notes et références[modifier]
1. ↑ P. James, « Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics. », dans
Quarterly reviews of biophysics, vol. 30, no 4, 1997, p. 279–331
2. ↑ http://www.nobel-prize.org/FR [archive]
3. ↑ Simon B, Madl T, Mackereth CD, Nilges M and Sattler M. (2010) ; An efficient protocol for NMR-
based structure determination of protein complexes in solution ; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. in press,
online DOI:10.1002/anie.200906147 résumé en anglais [archive]
4. ↑ Communiqué de la Technische Universität München [archive], du 2010/09/19, repris par le BE
Allemagne numéro 472 [archive] (24/02/2010) - Ambassade de France en Allemagne / ADIT
Voir aussi[modifier]
Articles connexes[modifier]
• Génomique
• Transcriptomique
• Relation entre génomique, transcriptomique et protéomique
• Folding@Home
• Métabolomique
• Double hybride
• Interactomique
Bibliographie[modifier]
• Greg Gibson, Spencer V. Muse, Précis de génomique, Editions De Boeck Université,
2004, ISBN 2804143341.
• Reiner Westermeier, Tom Naven, Protéomics in practice, Wiley-VCH, 2002, ISBN
3527303545.
• Thierry Rabilloud, Proteome reserch : Two-dimensionnal gel electrophoresis an
identification methods, Springer Verlag Berlin Heidelberg, 2000, ISBN 3540657924
• Marc R. Wilkins, Keith L. Williams, Ron D. Appel, Denis F. Hochstrasser, Proteome
research : New frontiers in functional genomics, Springer Verlag Berlin Heidelberg,
1997, ISBN 3540627537.
Liens externes[modifier]
• Société Française d'électrophorèse et d'analyse protéomique Congrès, bourses,
electrophorum
• Société de BioChromatographie et Nanoséparations Réunions scientifiques,
informations. S'intéresse en particulier à la séparation des peptides et protéines par
chromatographie ou par micro- et nano-méthodes
• Site du master protéomique de Lille Actualité scientifique, dates de congrès,
présentation du master.
• Hybrigenics: Site d'une société faisant du double hybride Société faisant du double
hybride et permettant de trouver des interractions protéiques pour une protéine appat
donnée.
• The state of the art in the analysis of two-dimensional gel electrophoresis images
Ce document provient de « http://fr.wikipedia.org/wiki/Prot%C3%A9omique ».
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Adressage

Adressage des protéines

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Cet article est une ébauche concernant la Protéomique.
Vous pouvez partager vos connaissances en l’améliorant (comment ?) selon les
recommandations des projets correspondants.
Dans une cellule, la localisation d'une protéine est essentielle à son bon fonctionnement. Or le
lieu de production d'une protéine est souvent différent de son lieu d'action. L'adressage est
l'ensemble des mécanismes qui permettent à une protéine d'être dirigée vers la bonne position.
À noter que les ARNm sont aussi sujet à un adressage.

Sommaire
[masquer]
• 1 Signal d'adressage
• 2 Chez les eucaryotes
• 3 Adressage au Noyau
• 4 Adressage aux chloroplastes
• 5 Adressage aux mitochondries
• 6 Adressage aux peroxysomes
• 7 Voie de sécrétion

Signal d'adressage[modifier]
Article détaillé : Peptide signal.
Le signal d'adressage est une courte séquence d'acide aminés, généralement situé à l'extrémité
N-terminale de la protéine, servant à désigner les protéines devant être adressées, et indiquer
leur destination. Bien que très répandus, les signaux d'adressage ne sont pas une
caractéristique universelle, par exemple, les protèines localisées dans la membranes externes
des chloroplastes ne comportent généralement pas de signaux d'adressage.
Chez les eucaryotes[modifier]
Cette section est vide, insuffisamment détaillée ou incomplète. Votre aide est la bienvenue !
Adressage au Noyau[modifier]
Adressage aux chloroplastes[modifier]
Adressage aux mitochondries[modifier]
Adressage aux peroxysomes[modifier]
Voie de sécrétion[modifier]
Il est essentiel que les vésicules contenant le contenu produit par la cellule déverse ces
produits dans un compartiment approprié : le système d'adressage est alors mis en oeuvre par
le biais des protéines SNARE. Chaque vésicule a dans sa membrane des protéines V-Snare (V
pour vésicule) qui ne peuvent se fixer qu'à une seule protéine T-SNARE ( T pour target)
ancrée sur le compartiment de destination. Ces protéines servent à la fois de moyen de
reconnaissance et de moyen d'ancrage.

• Portail de la biologie cellulaire et moléculaire

Ce document provient de « http://fr.wikipedia.org/wiki/Adressage_des_prot%C3%A9ines ».
Catégorie : Biologie cellulaire | [+]
Catégories cachées : Wikipédia:ébauche protéomique | Portail:Biologie cellulaire et
moléculaire/Articles liés | Portail:Biologie/Articles liés
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SSynthèse des protéines

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Procédé général
La synthèse des protéines est l'acte par lequel une cellule assemble une chaîne protéique en
combinant des acides aminés isolés présents dans son cytoplasme, guidé par l'information
contenue dans l'ADN. Elle se déroule en deux étapes au moins : la transcription de l'ADN en
ARN messager et la traduction de l'ARN messager en une protéine.
Chez les eucaryotes, il existe une étape intermédiaire, la maturation de l'ARN prémessager,
qui se passe dans le noyau. L'ARN prémessager subit l'ajout d'une coiffe de 7-
méthylguanosine triphosphate à l'extrémité 5' et d'une queue poly(A) (50 à 250 nucléotides
d'adénine) à l'extrémité 3'. Par la suite, l'ARN prémessager subit une excision de ses introns
(les parties du gène qui ne codent pas un polypeptide) et l'épissage de ses exons (les brins
codant). L'ARN prémessager est maintenant à maturité et prend le nom d'ARN messager. La
transcription se déroule dans le noyau, la traduction, dans le réticulum endoplasmique. Une
dernière étape de glycosylation (liaison covalente d'oses aux protéines) a lieu dans l'appareil
de Golgi. Chez les procaryotes, les deux étapes ont lieu dans le cytoplasme et peuvent être
simultanées, la traduction débutant alors que la transcription n'est pas encore achevée. Cette
simultanéité donne lieu à un important type de régulation de la traduction.

Sommaire
[masquer]
• 1 Première approche : mécanisme global
○ 1.1 Mise en évidence du mécanisme global de synthèse (pulse-chase)
○ 1.2 Complémentarité des bases azotées
• 2 Transcription de l'ADN
○ 2.1 Modification post-transcriptionnelle
○ 2.2 Exemple de transcription
• 3 Traduction de l'ARNm
○ 3.1 Activation de l'acide aminé
○ 3.2 Initiation
○ 3.3 Elongation
○ 3.4 Terminaison
○ 3.5 Reprenons notre exemple
○ 3.6 Liste des acides aminés en fonction de l'anti-codon
• 4 Sources
• 5 Voir aussi
○ 5.1 Liens internes
○ 5.2 Liens externes

Première approche : mécanisme global[modifier]

Mise en évidence du mécanisme global de synthèse (pulse-chase)[modifier]
Il est légitime de se demander comment les biologistes ont découvert la succession d'étapes
qui mène à l'achèvement des protéines. La technique principale est celle du pulse-chase ou
pulse-chasse, qui se déroule en quatre étapes principales.
On prélève à intervalles réguliers des cellules de ce nouveau milieu ; on dispose alors de deux
techniques d'exploitation de cette expérience. La première est l'autoradiographie ; la seconde
passe par une ultracentrifugation et donne une meilleure précision dans les résultats. On
prépare une coupe de la cellule, par fixation puis découpage au microtome. Sur la plaquette
obtenue, on dépose un film photographique contenant des grains d'argent, et on laisse le tout
reposer quelques semaines à l'obscurité. Les électrons issus de la désintégration des noyaux
radioactifs assimilés par la cellule réduisent les ions Ag+ en grains noirs d'argent, donnant
ainsi une « photographie » de la localisation de la radioactivité cellulaire. On peut ainsi
retracer, par observation de lames minces à temps de « chasse » différents, le trajet cellulaire
des protéines lors de leur synthèse. Cependant les électrons de la lame mince peuvent marquer
la plaque photographique assez loin de leur zone d'émission (précision de l'ordre du demi-
micromètre). Ainsi, on ne peut pas savoir par exemple, si la radioactivité dans un organite est
à l'intérieur ou éventuellement juste à l'extérieur de ses parois. On centrifuge à haute vitesse
chaque prélèvement de cellules du second milieu. On obtient ainsi, après plusieurs
centrifugations successives à des accélérations croissantes, différentes fractions de cellule,
classées suivant leur masse. On connaît la correspondance entre les divers organites
(réticulum endoplasmique, appareil de Golgi, noyau) et les fractions après centrifugations.
Ainsi, si on mesure la radioactivité de chaque fraction, on peut savoir dans quel organite les
acides aminés marqués se trouvaient au moment du prélèvement. On en déduit des courbes de
répartition de radioactivité en fonction du temps pour chaque compartiment cellulaire, ce qui
permet de retrouver le trajet des acides aminés nouvellement assemblés en protéines.
Complémentarité des bases azotées[modifier]
Il est important de savoir, avant de procéder, qu'il existe une complémentarité entre les bases
azotées de l'ADN et de l'ARN. C'est cette complémentarité, due à des liaisons hydrogène, qui
permet la réplication, la transcription et la traduction des acides nucléiques.
Il existe 5 bases azotées :
• Adénine (A)
• Guanine (G)
• Thymine (T) qu'on ne trouve que dans l'ADN
• Cytosine (C)
• Uracile (U) qu'on ne trouve que dans l'ARN
A et G sont des purines (2 cycles)
T, C et U sont des pyrimidines (1 cycle)
A et T sont complémentaires
G et C sont complémentaires
A et U sont complémentaires
La transcription et la traduction utilisent cette complémentarité lors de la création d'ARN et de
l'approche de l'ARNt.
Transcription de l'ADN[modifier]
Article détaillé : transcription (biologie).
Processus de transcription de l'ADN
La première étape de la synthèse des protéines est la transcription d'un gène de l'ADN en une
molécule d'ARN messager (ARNm ou acide ribonucléique messager). L'étape se déroule à
l'intérieur même du noyau d'une cellule eucaryote et dans le cytoplasme des procaryotes.
Cette différence va avoir des conséquences importantes sur le traitement de l'ARN synthétisé.
L'ADN est une molécule constituée d'une succession de nucléotides. Aucune particularité
physique ne différencie un gène d'une portion non codante de l'organisme. Le repérage des
gènes le long de la molécule d'ADN (et d'une manière générale toute information de
régulation le long de la chaîne d'ADN) va se faire de la même façon que celui du repérage des
fichiers sur une bande magnétique : des marquages consistant en une séquence particulière de
nucléotides vont indiquer le début du gène. Ces marques spéciales sont appelées séquences
consensus, il ne s'agit en effet pas de séquences exactes mais de séquences approchées d'une
séquence moyenne mais différant seulement par quelques paires de bases. Les deux utilisées
pour repérer le début d'un gène sont les boîtes CAAT et TATA, du nom des nucléotides
formant le cœur de la séquence moyenne et situées dans une zone précédant le gène appelée
promoteur car elle initie la transcription du gène.
La transcription consiste à faire une «copie de travail» de l'ADN. L'ADN est une molécule
unique dans la cellule. Outre le fait que la synthèse d'un ARN intermédiaire permet de limiter
les dommages de l'ADN par suite de trop de manipulations, cela permet de multiplier les
copies disponibles pour la phase de traduction et donc de synthétiser la protéine beaucoup
plus rapidement.
La synthèse de l'ARN fait intervenir un ensemble protéique très complexe, l'ARN polymérase.
La première étape de la transcription est la reconnaissance du gène à transcrire. Cette étape
fait intervenir des mécanismes variés qui dépendent de la protéine à transcrire, mais qui
reposent tous sur le principe d'une protéine spécifique du ou des gènes à transcrire, qui se fixe
en un endroit précis de l'ADN, situé dans le promoteur. Cette protéine va servir de point
d'ancrage au système ARN polymérase, cette phase n'ayant lieu naturellement que si les deux
boîtes CAAT et TATA sont présentes. Ce complexe va parcourir la molécule d'ADN pour la
lire. Elle va tout d'abord dérouler la molécule d'ADN, puis séparer les deux brins, puis
assembler les bases azotées en se servant du brin complémentaire comme matrice pour aboutir
à la molécule d'ARN. Derrière elle, les deux brins se réassemblent et l'ADN se réenroule.
Quand l'ARN polymérase rencontre le site de terminaison de gène, elle se sépare de l'ADN, et
l'ARN est libéré de la chaîne d'ADN.
Modification post-transcriptionnelle[modifier]
Article détaillé : Modification post-transcriptionnelle.
L'ARN transcrit n'est pas toujours directement utilisable, il est d'ailleurs souvent appelé ARN
pré-messager, il peut nécessiter différentes modifications avant de pouvoir être traduit. Les
modifications les plus connues sont l'épissage, et chez les eucaryotes, l'ajout d'une coiffe et
d'une queue poly (A).
L'ARNm va maintenant pouvoir passer par la phase suivante de la synthèse protéique : la
traduction
Exemple de transcription[modifier]
Une molécule d'ADN est constituée de deux brins :
le brin d'ADN transcrit (ou brin codant): A T G G C
G T T C A G A A C T G A T A C G T A A
le brin d'ADN non transcrit : (ou brin matrice ou brin non codant) T
A C C G C A A G T C T T G A C T A T G C A T T

le brin d'ARN : A U G
G C G U U C A G A A C U G A U A C G U A A

Traduction de l'ARNm[modifier]
Article détaillé : Traduction génétique .

Processus de traduction de l'ARN en protéine

Activation de l'acide aminé[modifier]
L’acide aminé va être fixé par une liaison anhydride (élimination d’une molécule d’eau) sur
un AMP. Cette activation se fait par une Amino acyle-ARNt synthétase. Puis l’acide aminé
activé va être transféré à l’extrémité 3’ de l’ARNt (fixation par une liaison ester). C’est la
même enzyme qui reconnait, active et transfert l’acide aminé.
Initiation[modifier]
Une fois que le brin d'ARNm a atteint le cytoplasme, où a lieu la traduction, il se fixe à un
ribosome, composé d'une petite sous-unité (40s) et d'une grande sous-unité (60s), qui va
assembler une séquence d'acides aminés selon les "instructions" du code génétique : chaque
codon (groupe de 3 nucléotides de l'ARNm) correspond à un acide aminé, sauf 3 codons,
appelés codons-stop, qui provoquent l'arrêt de la traduction. Le codon AUG, appelé codon-
initiateur, va permettre de commencer la traduction, comme son nom l'indique, en formant
l'acide aminé méthionine, qui se détachera plus tard de la chaîne polypeptidique.
Elongation[modifier]
Le ribosome va parcourir le brin d'ARNm codon par codon (translocation) et va par
l'intermédiaire d'un ARN de transfert (ARNt) ajouter un acide aminé à la protéine en cours de
fabrication selon le codon lu.
Terminaison[modifier]
Une fois le codon-stop atteint (UAA, UGA, UAG), la protéine est complète: le ribosome se
détache de la protéine et du brin d'ARNm, et la protéine est libérée dans l'organisme. Le
ribosome va se disloquer en ses deux sous-unités (60s et 40s) et pourra faire une autre
synthèse sur un autre ARNm. S'entame alors le transport des protéines, qui les mène hors de
la cellule et dans le système sanguin ou encore à l'intérieur même de la cellule l'ayant
synthétisé.
Le même filament d'ARNm peut servir à la fabrication simultanée de plusieurs molécules de
protéines, lorsque plusieurs ribosomes s'en chargent. Avant d'être détruite, cette molécule
participe en effet à la synthèse de 10 à 20 protéines.
Reprenons notre exemple[modifier]
Le brin d'ARN messager est A U A G C G U U C A G A A C U G A U A C
G U A A

Les différents codons sont donc AUA - GCG - UUC - AGA - ACU - GAU - ACG
- UAA

Les ARN de transfert se fixent UAU CGC AAG UCU UGA CUA UGC
AUU
par complémentarité et apportent | | | | | | |
|
les acides aminés appropriés Ile Ala Phe Arg Thr Asp Thr
X (stop)

Liste des acides aminés en fonction de l'anti-codon[modifier]

Article détaillé : Code génétique.
Chaque anti-codon code pour un acide aminé ou un codon stop. La liste suivante peut être
utilisée comme référence :
• GCA, GCC, GCG, GCU : code pour la formation de l'acide aminé alanine (A, Ala)
• AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU : code pour la formation de l'acide aminé
arginine (R, Arg)
• AAC, AAU : code pour la formation de l'acide aminé asparagine (N, Asn)
• GAC, GAU : code pour la formation de l'acide aminé acide aspartique (D, Asp)
• UGC, UGU : code pour la formation de l'acide aminé cystéine (C, Cys)
• CAA, CAG : code pour la formation de l'acide aminé glutamine (Q, Gln)
• GAA, GAG : code pour la formation de l'acide aminé acide glutamique (E, Glu)
• GGA, GGC, GGG, GGU : code pour la formation de l'acide aminé glycine (G, Gly)
• CAC, CAU : code pour la formation de l'acide aminé histidine (H, His)
• AUA, AUC, AUU : code pour la formation de l'acide aminé isoleucine (I, Ile)
• CUA, CUC, CUG, CUU, UUA, UUG : code pour la formation de l'acide aminé
leucine (L, Leu)
• AAA, AAG : code pour la formation de l'acide aminé lysine (K, Lys)
• AUG : code pour la formation de l'acide aminé méthionine (M, Met)
• UUC, UUU : code pour la formation de l'acide aminé phénylalanine (F, Phe)
• CCC, CCA, CCG, CCU : code pour la formation de l'acide aminé proline (P, Pro)
• UCA, UCC, UCG, UCU : code pour la formation de l'acide aminé sérine (S, Ser)
• ACA, ACC, ACG, ACU : code pour la formation de l'acide aminé thréonine (T, Thr)
• UGG : code pour la formation de l'acide aminé tryptophane (W, Trp)
• UAC, UAU : code pour la formation de l'acide aminé tyrosine (Y, Tyr)
• GUA, GUC, GUG, GUU : code pour la formation de l'acide aminé valine (V, Val)
• UAA, UAG, UGA : ces codons sont des codons stop (qui ne codent donc aucun acide
aminé). La chaine polypeptidique se détache du ribosome et la traduction est terminée.
Sources[modifier]
• Neil A. Campbell et Jane B. Reece, Biologie, traduit par Richard Mathieu, Éd.
Éditions du Renouveau Pédagogique Inc., Saint-Laurent (Québec), 3 mars 2004, 1400
pages, ISBN 2-7613-1379-8.
Voir aussi[modifier]
Liens internes[modifier]
• Cellule
• Protéine
• Génétique > ADN > Gène > Synthèse des protéines > ARN
• Transcription
• Traduction
Liens externes[modifier]
• Baptiste Deleplace (2003), La traduction (une approche ludique de la traduction de
l'ARN m en chaine polypeptidique).
• Voir la vidéo en 3D de la synthèse des protéines dans l'encyclopédie vulgaris-
medical.com

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globulaire
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Expression des gènes

Introduction à la Théorie fondamentale de la biologie moléculaire • ADN • ARN •
génétique Protéine • Code génétique • Synthèse des protéines
Régulation de la Facteurs de transcription • ARN Polymérase
transcription • Promoteur • Amplificateur
Modifications post-transcriptionnelles •
Transcription
Régulation post- Édition • Épissage • Épissage alternatif •
transcriptionnelle Polyadénylation • Dégradation des ARNm
non-sens
Régulation de la Facteurs d'initiation • Ribosome • ARNt •
traduction IRES • Coiffe
Modifications post-traductionnelles (ajout
Traduction
Régulation post- de groupe fonctionnels, peptidiques,
traductionnelle modifications structurelles ou chimiques) •
Phosphorylation • Protéolyse
Extinction de gène • Méthylation de l'ADN • Code des Histones •
Contrôle épigénetique
Gène Hox • Gène soumis à empreinte

• Portail de la biologie cellulaire et moléculaire

• Portail de la biochimie
Ce document provient de « http://fr.wikipedia.org/wiki/Synth%C3%A8se_des_prot
%C3%A9ines ».
Catégories : Synthèse chimique | Expression génétique | Génétique | Physiologie cellulaire |
Protéomique | [+]
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Synthèse des protéines

Procédé général
La synthèse des protéines est l'acte par lequel une cellule assemble une chaîne protéique en
combinant des acides aminés isolés présents dans son cytoplasme, guidé par l'information
contenue dans l'ADN. Elle se déroule en deux étapes au moins : la transcription de l'ADN en
ARN messager et la traduction de l'ARN messager en une protéine.
Chez les eucaryotes, il existe une étape intermédiaire, la maturation de l'ARN prémessager,
qui se passe dans le noyau. L'ARN prémessager subit l'ajout d'une coiffe de 7-
méthylguanosine triphosphate à l'extrémité 5' et d'une queue poly(A) (50 à 250 nucléotides
d'adénine) à l'extrémité 3'. Par la suite, l'ARN prémessager subit une excision de ses introns
(les parties du gène qui ne codent pas un polypeptide) et l'épissage de ses exons (les brins
codant). L'ARN prémessager est maintenant à maturité et prend le nom d'ARN messager. La
transcription se déroule dans le noyau, la traduction, dans le réticulum endoplasmique. Une
dernière étape de glycosylation (liaison covalente d'oses aux protéines) a lieu dans l'appareil
de Golgi. Chez les procaryotes, les deux étapes ont lieu dans le cytoplasme et peuvent être
simultanées, la traduction débutant alors que la transcription n'est pas encore achevée. Cette
simultanéité donne lieu à un important type de régulation de la traduction.

Première approche : mécanisme global[modifier]

Processus de transcription de l'ADN

La première étape de la synthèse des protéines est la transcription d'un gène de l'ADN en une
molécule d'ARN messager (ARNm ou acide ribonucléique messager). L'étape se déroule à
l'intérieur même du noyau d'une cellule eucaryote et dans le cytoplasme des procaryotes.
Cette différence va avoir des conséquences importantes sur le traitement de l'ARN synthétisé.
L'ADN est une molécule constituée d'une succession de nucléotides. Aucune particularité
physique ne différencie un gène d'une portion non codante de l'organisme. Le repérage des
gènes le long de la molécule d'ADN (et d'une manière générale toute information de
régulation le long de la chaîne d'ADN) va se faire de la même façon que celui du repérage des
fichiers sur une bande magnétique : des marquages consistant en une séquence particulière de
nucléotides vont indiquer le début du gène. Ces marques spéciales sont appelées séquences
consensus, il ne s'agit en effet pas de séquences exactes mais de séquences approchées d'une
séquence moyenne mais différant seulement par quelques paires de bases. Les deux utilisées
pour repérer le début d'un gène sont les boîtes CAAT et TATA, du nom des nucléotides
formant le cœur de la séquence moyenne et situées dans une zone précédant le gène appelée
promoteur car elle initie la transcription du gène.
La transcription consiste à faire une «copie de travail» de l'ADN. L'ADN est une molécule
unique dans la cellule. Outre le fait que la synthèse d'un ARN intermédiaire permet de limiter
les dommages de l'ADN par suite de trop de manipulations, cela permet de multiplier les
copies disponibles pour la phase de traduction et donc de synthétiser la protéine beaucoup
plus rapidement.
La synthèse de l'ARN fait intervenir un ensemble protéique très complexe, l'ARN polymérase.
La première étape de la transcription est la reconnaissance du gène à transcrire. Cette étape
fait intervenir des mécanismes variés qui dépendent de la protéine à transcrire, mais qui
reposent tous sur le principe d'une protéine spécifique du ou des gènes à transcrire, qui se fixe
en un endroit précis de l'ADN, situé dans le promoteur. Cette protéine va servir de point
d'ancrage au système ARN polymérase, cette phase n'ayant lieu naturellement que si les deux
boîtes CAAT et TATA sont présentes. Ce complexe va parcourir la molécule d'ADN pour la
lire. Elle va tout d'abord dérouler la molécule d'ADN, puis séparer les deux brins, puis
assembler les bases azotées en se servant du brin complémentaire comme matrice pour aboutir
à la molécule d'ARN. Derrière elle, les deux brins se réassemblent et l'ADN se réenroule.
Quand l'ARN polymérase rencontre le site de terminaison de gène, elle se sépare de l'ADN, et
l'ARN est libéré de la chaîne d'ADN.
Modification post-transcriptionnelle[modifier]
Article détaillé : Modification post-transcriptionnelle.
L'ARN transcrit n'est pas toujours directement utilisable, il est d'ailleurs souvent appelé ARN
pré-messager, il peut nécessiter différentes modifications avant de pouvoir être traduit. Les
modifications les plus connues sont l'épissage, et chez les eucaryotes, l'ajout d'une coiffe et
d'une queue poly (A).
L'ARNm va maintenant pouvoir passer par la phase suivante de la synthèse protéique : la
traduction
Exemple de transcription[modifier]
Une molécule d'ADN est constituée de deux brins :
le brin d'ADN transcrit (ou brin codant): A T G G C
G T T C A G A A C T G A T A C G T A A
le brin d'ADN non transcrit : (ou brin matrice ou brin non codant) T
A C C G C A A G T C T T G A C T A T G C A T T

le brin d'ARN : A U G
G C G U U C A G A A C U G A U A C G U A A

Traduction de l'ARNm[modifier]
Article détaillé : Traduction génétique .

Processus de traduction de l'ARN en protéine

Les différents codons sont donc AUA - GCG - UUC - AGA - ACU - GAU - ACG
- UAA

Les ARN de transfert se fixent UAU CGC AAG UCU UGA CUA UGC
AUU
par complémentarité et apportent | | | | | | |
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les acides aminés appropriés Ile Ala Phe Arg Thr Asp Thr
X (stop)

Liste des acides aminés en fonction de l'anti-codon[modifier]

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Techniques d'analyse du protéome. Introduction à la
protéomique
Les étapes principale de la Protéomiques sont: 1. EXAMEN -- TD
Extraction des protéines et préparation des échantillons -- TP-TD
(extraction des protéines), 2. Séparation des protéines
(électrophorèse bidimensionnelle, Chromatographie
liquide), 3. Détection et quantification des protéines et 4. Haut du formulaire

01485392525448
Identification des protéines par spectrométrie de masse
1. DEFINITION DU PROTEOME UTF-8
- Le protéome est l'ensemble des protéines produites par un
génôme (ordre de 60000 protéines chez l'Homme).
- Le protéome résulte de la traduction du génôme en
protéines dans des conditions de vie définies. Il varie selon le
type des cellules, leurs activités et leur environnement. Rechercher
- La taille du protéome est plus importante que celle du
génôme, car un gène peut coder pour plusieurs protéines en
considérant les modifications introduites par la maturation des
w w w .takw een.c
mRNA et les modifications post-traductionnelles
(glycosylation, phosphorylation,...). Le protéome est
dynamique, le génome est constant. Bas du formulaire

2. PRINCIPALES ETAPES DE LA Protéomique

- Extraction des protéines et préparation des échantillons
- Séparation des protéines (électrophorèse
bidimensionnelle, Chromatographie liquide)
- Détection et quantification des protéines
- Identification des protéines par spectrométrie de masse

2.1. Extraction des protéines et préparation des

échantillons
La protéomique exige l'utilisations d'échantillons biologiques
de qualité. L'extraction de protéines à partir de tissus, de
cellules isolées ou de liquides physiologiques est réalisée à
l'aide de tampons appropriés, mis au point en considérant la
nature des protéines à étudier (protéines cytosoliques,
membranaires, nucléaires…).
Les tampons d'extraction à pH bien déterminé, sont
constitués dans des proportions variables, de mélanges
d'agents réducteurs, de détergents, voire de solvants
organiques. Ils sont généralement supplémentés d'inhibiteurs
de protéases. Les protocoles experimentaux doivent éviter
les contaminations par des acides nucléiques, des lipides et
les sels.
Ces contaminants peuvent perturber la séparation des
protéines par électrophorèse bidimensionnelle ou par
chromatographie liquide. Les protéines hydrophobes telles
que les protéines membranaires sont difficiles à solubiliser.
De même, les protéines très basiques, telles que les histones
et les protéines ribosomales, sont peu visibles sur un gel 2D
après une isoélectrofocalisation.
De façon générale, la protéomique fait appel à l'utilisation de
l'électrophorèse bidimensionnelle (2D) hautement
résolutive et la spectrométrie de masse qui associée à
l'analyse informatisée des gels, permet de visualiser et de
mesurer des variations de quantité de protéines entre
différents échantillons. Les protéines identifiées par
spectrométrie de masse sont comparées aux protéines des
banques de données disponibles sur internet.
2.2. Séparation des protéines par électrophorèse
bidimensionnelle (2D)
L'électrophorèse 2D est la méthode de choix pour séparer
les protéines puisqu'elle permet de séparer simultanément
plusieurs milliers de polypeptides d'un mélange complexe en
fonction de deux propriétés différentes : la charge éléctrique
et le poids moléculaire.

Dans la première dimension, les protéines sont soumises à

une électrophorèse dans un gel présentant un gradient de pH
continu. Au cours de cette étape, appelée
isoélectrofocalisation (IEF), elles migrent dans le gel
jusqu'à une position où la valeur du pH est égale à celle de
leur point isoélectrique (pI) où leur charge globale devient
nulle. Cette première séparation est délicate et dépend
beaucoup de la préparation des échantillons biologiques qui
doit permettre une solubilisation maximale des protéines et
empêcher leur agrégation et leur dégradation. Dans la
deuxième dimension, les protéines sont séparées par la
technique SDS-Page (sodium-dodécyl sulfate-polyacrylamide
gel electrophoresis). La résolution s'effectue sur un gel
réticulé constitué de polyacrylamide en présence d'un agent
dénaturant, le sodium-dodécyl sulfate (SDS).
Grâce à la réticulation plus ou moins importante du gel de
polyacrylamide, les protéines sont séparées par tamisage
moléculaire, leur vitesse de migration dans le gel étant
inversement corrélée à leur taille. Comme pour l'IEF, plus le
gel de deuxième dimension est grand, plus la résolution (et
donc le nombre de spots séparés) augmente.
2.3. Détection et quantification des protéines
Après électrophorèse bidimensionnelle, les protéines
séparées sont détectées par coloration des gels. Plusieurs
procédés de sensibilité différente existent et sont choisis en
fonction de l'utilisation ultérieure des gels 2D : le bleu de
coomassie permet de détecter un minimum de 100 ng de
protéine par spot et présente l'avantage de donner une
intensité de coloration proportionnelle à la quantité de
protéines. Etant mille fois plus sensible que le bleu de
coomassie, la coloration au nitrate d'argent permet de
détecter des spots contenant 0,1 ng de protéines. Elle
présente néanmoins certains inconvénients : la
stœchiométrie de la coloration n'est pas totalement linéaire, la
reproductibilité est difficile à obtenir et certaines protéines
sont peu ou pas colorées par cette méthode. Plus
récemment, la détection des spots par fluorescence (Sypro
Orange, Sypro Red, Sypro Ruby) a été développée, avec une
sensibilité et une linéarité d'intensité de coloration équivalente
à celle de l'argent, mais avec une reproductibilité, une facilité
et une rapidité meilleures que celles de la coloration au
nitrate d'argent.
En dernier lieu, notons que l'autoradiographie des gels 2D
après incorporation dans les protéines d'isotopes radioactifs
comme le 35S ou le 32P/33P est extrêmement sensible. En
effet, elle permet de visualiser des quantités très faibles de
protéines (de l'ordre de 1 à 100 pg).
Depuis les années 1970, les méthodes d'analyse des gels ont
évolué grâce aux progrès combinés de l'informatique et de
l'analyse d'images. La digitalisation des gels consiste en
une transformation de l'image expérimentale en une
information numérique utilisable par l'ordinateur.
Les gels 2D peuvent être comparés aux gels inscrits dans les
bases de données comme celle de SWISS-2-DPAGE
(http://expasy.org/swiss-2dpage/ )
Lien utile: électrophorèse 2D.
3. IDENTIFICATION DES Protéines
Spectrométrie de masse et recherche dans les banques
de données
L'avancée majeure en termes d'identification des protéines
des gels 2D (1993-1994) correspond à l'utilisation conjointe
de la spectrométrie de masse et des banques de données.
En s'adaptant à la biologie structurale, la spectrométrie de
masse a permis de déterminer avec une sensibilité et une
précision extrêmes la masse des molécules. Un spectromètre
de masse se compose d'une source où s'effectuent
l'ionisation et la désorption des ions, d'un analyseur où les
ions sont séparés en fonction de leur rapport masse sur
charge (m/z) et d'un détecteur permettant l'enregistrement et
la quantification des ions.
Pour l'étude des composés peptidiques, deux modes
d'ionisation sont principalement utilisés :
- la désorption/ionisation laser assistée par matrice (Maldi-
Tof) qui permet de réaliser une empreinte peptidique après
digestion protéolytique (empreintes peptidiques)
- la spectrométrie de masse en tandem en mode nanospray
(MS-MS) qui permet d'obtenir une microséquence en acides
aminés.
Liens utiles
Bases de données disponibles sur internet:
Mascot : http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?
FORMVER=2&SEARCH=PMF
Aldente : http://www.expasy.org/tools/aldente/
Autres liens
- Electrophoresis 2D & proteomics:
http://www.aber.ac.uk/~mpgwww/Proteome/Tut_2D.html
- Spectromètre de masse:
http://www.rocler.qc.ca/pdubreui/masse/Ms1/spectro_masse1
.html
- Protéomique:
http://perso.orange.fr/fguillonneau/Protéomique.html
- Protein identification by peptide mass fingerprinting tutorial:
http://www.aber.ac.uk/~mpgwww/Proteome/MS_Tut.html

Protéomique. électrophorèse bidimensionnelle

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La protéomique : princ...
Tags:
génétique, protéines, ...
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La protéomique : principales
techniques et outils
informatiques dédiés à l'étude
des protéines Cédric
PIONNEAU
pionneau@chups.jussieu.fr
Plate-forme PLa protéomique :
principales techniques et outils
informatiques dédiés à l'étude
des protéines Cédric
PIONNEAU
pionneau@chups.jussieu.fr
Plate-forme Post-génomique
de la Pitié-Salpétrière (P3S)
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génétique | protéines | les |
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protéom
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l’ensemb
le des
protéines
constitua
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comparti
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(ex: les
protéines
nucléaire
s),-une
cellule
,-un
tissu
-ou un
organism
e
vivant
entier
…-
permet
notamm
ent :
•la
recherch
e
et l
’identific
ation

systémati
que
de l
’ensembl
e
desprotéi
nes
constitua
nt un
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e, un
tissu…•l’
identifica
tion
des
protéines
constitua
nt un
complex
e
protéique
(interact
ions
protéines
-
protéines
)•la
recherch
e
et l ’
identifica
tion
de
protéines
impliqué
es dans
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ion
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