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La dynamique enzymatique dans l'état de transition

Les enzymes parviennent à accomplir une catalyse chimique prodigieuse, tout


en gardant une préférence exquise pour des substrats spécifiques et en intégrant
une sensibilité à leur environnement biologique. Notre compréhension de la
façon dont les enzymes accomplissent ces tâches complexes est en cours de
révision et est un sujet de débat animé, même après plusieurs décennies
d'études.
Les théories les plus influentes sur l'action enzymatique présentent l'état de
transition comme obligatoire.
‒ L'enzyme se lie plus fortement à l'état de transition lors de la
transformation des réactifs en produits, et cette liaison libère l'énergie
nécessaire afin d'abaisser l'énergie libre de la barrière de réaction.
• La preuve expérimentale de l'exactitude de ce concept provient :
‒ des géométries de l’état de transition, qui peuvent être déduites
d’expériences concernant l’effet isotopique cinétique.
‒ De la stabilisation électrostatique des états de transition.
• À partir de ces géométries, des modèles basés sur des calculs de
mécaniques quantiques de l'état de transition peuvent être construits, et il est
possible d'en déduire des propriétés telles que le potentiel électrostatique et
la surface de Van der Waals de l'état de transition.
‒ La synthèse chimique peut alors être utilisée pour imiter ces propriétés
de la mécanique quantique, et des analogues stables de l'état de
transition sont les plus forts inhibiteurs enzymatiques connus.
Ces points semblent apporter un soutien ferme, mais circonstanciel à
l'hypothèse d'état de transition obligatoire.
Il existe, cependant, des preuves expérimentales aussi fortes que ce concept
est incorrect.
Les anticorps catalytiques sont des enzymes artificielles qui reconnaissent un
ligand apparenté aux réactifs; de la même façon que le système immunitaire
produit des d'anticorps afin de se défendre contre des menaces d'invasion.
• Si la liaison à l'état de transition est la caractéristique déterminante de
l'action enzymatique, une enzyme conçue de manière à se lier fortement à l'état
de transition devrait s’avérer être un catalyseur exceptionnel.
• Ce n’est pas par manque d'effort, mais de telles enzymes artificielles ont

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Concept Anticorps catalytique

L'anticorps catalytique
représenté ici, entrée PDB
1c1e, effectue la réaction
de condensation de Diels-
Alder indiqué sur le
schéma ci-bas.
Ce type de réaction
n'est pas effectuée
par des enzymes http://www.rcsb.
naturelles. Ces ‘abzymes’ org/pdb/101/mot
pourront avoir des
applications en tant
qu'agents thérapeutiques
potentiels - le cancer, le VIH

http://www.rcsb.org/pdb/101/mot
http://oregonstate.edu/instr
uct/bb10/spring13/c5/f5.26
z087.jpg

Abzyme

• Les catalyseurs "abzyme" ne sont jamais


aussi efficaces que les enzymes pour de
nombreuses raisons. Très souvent l’abzyme
se lie fortement au produit de la réaction,
inhibant son efficacité. Condensation
• De plus, l’abzyme ne peut pas effectuer la de Diels-Alder
catalyse covalente.
été assez décevantes; les améliorations catalytiques obtenues de 10 à 12 ordres
de grandeur inférieures à celles réalisées par les enzymes.
Il devient ainsi évident qu’un élément important présent dans les enzymes
réelles est absent dans ces enzymes artificielles.
Des calculs récents en enzymologie computationnelle ont montré qu'il n’y a
pas de liaison étroite dans l'état de transition.
• Dans deux enzymes, la lactate déshydrogénase (LDH) et la purine
nucléoside phosphorylase (PNP), le temps de séjour dans l'état de transition est
extrêmement court – d’1 à 10 femtosecondes, ce qui n’est pas assez pour une
liaison forte (ou l’équilibration).
Qu’est l'enzymologie computationnelle?
L’enzymologie computationnelle enquête sur des questions mécanistiques et
autres; questions difficiles à aborder par l'expérience seule.
• Les états de transition ne peuvent être étudiés expérimentalement
directement en raison de leur très courte durée de vie.
 La mécanique quantique combinée avec la mécanique moléculaire (QM /
MM) sont les méthodes utilisées pour étudier ces états et les réactions
chimiques associées catalysées par des enzymes.
‒ La mécanique moléculaire (MM) fournit une bonne description de la
structure des protéines et leur dynamique, mais elle ne peut pas
modéliser les réactions chimiques.
‒ La mécanique quantique (QM) est utilisée pour traiter des
réarrangements de la structure électronique lors de la rupture et de la
formation des liaisons dans les réactions chimiques.
 Des protocoles mathématiques d’échantillonnage du chemin réactionnel,
couplés avec une analyse de probabilité sont utilisés pour analyser les
coordonnées des chemins réactionnels.
‒ L'état de transition est caractérisé par les conformations (états) qui ont
une probabilité de 0.5 de briser leur lien, puis d’effectuer une liaison
chimique nouvelle.
La dynamique des enzymes
Une des principales raisons faisant que l'étude de la catalyse enzymatique est
si complexe est la grande variété des échelles de temps mises en jeu dans
l’évolution de la réaction.

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Cette gamme d'échelles de temps est due à la complexité de la structure de
l'enzyme, et met en évidence les grandes questions concernant l'évolution des
enzymes.
Trois questions essentielles peuvent être associées à la question de la
complexité des enzymes :
1. Tout d'abord, quelle est la raison de la si grande taille des enzymes ?
‒ La nature gaspille rarement des acides aminés des séquences de
protéines inutiles; de sorte que la grande taille de la plupart des
enzymes conduirait à supposer la nécessité d'une telle architecture
complexe.
• Dans certains cas, l'architecture multimérique des enzymes
améliore leur stabilité physique dans des environnements
extrêmes, mais même dans les mésophiles ces architectures
quaternaires semblent être importantes.
2. Il y a des millions de séquences primaires retrouvées dans la nature, mais il
y a seulement un nombre relativement restreint de motifs de repliements
‒ De l'ordre d’une centaine de motifs – en magnitude largement
inférieure à la variabilité observée en séquences primaires
3. Quelle est la raison expliquant que la conception des enzymes artificielles
ait été un tel échec?
‒ Les enzymes artificielles sont au moins 6 et souvent 12 ordres de
grandeur moins compétente que les enzymes naturelles.
• Si l'on prend les anticorps catalytiques à titre d'exemple, la
reconnaissance de l'état de transition n'est pas le principe unique
dans la conception de catalyseurs biologiques très efficaces.
Lactate déshydrogénase (LDH)
Une réponse potentielle aux deux
premières questions proviendrait de la
détermination des véritables
coordonnées réactionnelles de transfert
d'hydrure et de proton catalysé chez la
lactate déshydrogénase; détermination
effectuée grâce à la mécanique quantique et les simulations moléculaires. Les
coordonnées réactionnelles ont en plus montré des mouvements attendus pour
un hydrure et un transfert de proton, une compression par le biais du site actif
ainsi qu'un allégement subséquent du côté distal de la poche de liaison.

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Ceci est représenté pour un monomère de LDH du cœur humain dans la figure 1.
 La nécessité de créer une architecture protéique permettant à l'énergie
d’être canalisée le long d’un chemin qui n'est pas linéaire (et non pas le
long d'une hélice par exemple), représente une explication possible de la
taille et la complexité des enzymes.
 L’absence d'un tel principe dans la conception d'enzymes artificielles, par
exemple des anticorps catalytiques, pourrait expliquer pourquoi, même en
considérant leur parfaite reconnaissance de l'état de transition, les
enzymes artificielles sont toujours insuffisantes en compétence catalytique.

Figure 1 montre la
“vibration promotionnelle”
au sein d’un monomère de
la LDH de cœur humain.
Cette caractéristique est
une part essentielle de la
formation / rupture des
liens.

vibration promotionnelle

Les calculs, comme le montre la figure 2, indiquent que le transfert d'hydrure


du donneur au cofacteur (distance hydrure:cofacteur) correspond au moment
précis auquel la protéine réalise la compression maximale du site actif dans la
vibration promotionnelle (réduction de la distance entre Val31 et site actif). Il en
résulte que dans l'enzyme LDH Bacillus, le transfert d'hydrure et du proton est
presque simultané, et lui-même synchronisé avec la vibration promotionnelle.

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Figure 2. Distances
montrant le
transfert d’hydrures
et la compression
des sites actifs dans
Bacillus LDH.

Les calculs montrent que le temps de séjour dans la région de l'état de


transition est beaucoup trop court (plus petit que la femtoseconde) pour tout
équilibre. La figure 3 montre que le temps d’engagement dans l’état de transition
correspondant à 0,5 probabilité est de l'ordre de la femtoseconde.

Figure 3.

Purine nucléoside phosphorylase (PNP)


Un court temps de séjour dans la région de l'état de transition a également été
démontré dans une réaction très différente, celle catalysée par la purine
nucléoside phosphorylase. Cette réaction est beaucoup plus compliquée qu'une

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réaction de transfert d'hydrogène simple. La réaction chimique catalysée par le
PNP est représentée par la figure 4.
Figure 4.

En chimie des solutions, cette réaction serait considérée comme une réaction
SN2 avec attaque nucléophile par le phosphate. Les résultats des calculs montrent
que la réaction enzymatique passe par un mécanisme chimique complètement
différent dans l'enzyme et est illustrée par la figure 5.

Figure 5. Le point de départ


d’un film montrant les
mouvements de la protéine et
du réactif lors de la traversée
de la barrière dans la PNP
humaine.

Le point de départ montre la guanosine et le phosphate en tant que réactifs,


avec les distances (en Å) entre les acides aminés de la protéine impliquée dans le
passage de la barrière. Les réactifs sont traités par QM et la protéine par MM. Le
groupe ribosyl est centré dans la figure avec l’oxygène 4‘ du ribose en rouge. La
grappe d’atomes bleus montrée dans le coin supérieur droit est le bord du groupe

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guanine partant. Les interactions multiples dans l'activation du phosphate ne sont
pas représentées ici, mais tous les atomes de la protéine et du réactif ont été
inclus dans les calculs QM / MM.
Étapes de la phosphorolyse de la guanosine par le PNP récapitulées dans la
figure 6.
Figure 6.

a) PNP comprime un empilement de trois d'oxygène afin de polariser le lien


ribosidique et créer un ribocation.
b) Création du ribocation, avec une séparation complète du groupe partant, la
guanine.
c) La migration du cycle du ribose vers le nucléophile phosphate.
d) Formation du produit avec un nouveau lien pour former le α-D-ribose-1-P.

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Caractéristiques de l'état de transition PNP.
1. Dans le complexe de Michaelis, les interactions Van der Waals faibles et les
ponts hydrogène sont formés avec des parties distinctes de l'ensemble du site
catalytique (Fig. 6a).
2. Les interactions ponts hydrogènes avec le groupe partant de la base purine
sont d’environ 3 Å et fluctuent sur l'échelle du temps (ordre des
femtosecondes). De même, la distance entre His257, en contact par pont
hydrogène avec l'oxygène 5'-hydroxyle, varie de > 3 Å à environ 2,7 Å dans le
temps (femtosecondes).
3. Le nucléophile phosphate positionné sous le ribosyl est situé de telle sorte que
l'oxygène anionique et nucléophile est > 3 Å du carbone anomère (1’).
4. Fluctuations dynamiques impliquant plus d'une douzaine d'interactions
d’enzyme-réactif se produisent simultanément sur l'échelle de temps
femtoseconde.
5. La longue durée de vie du complexe de Michaelis (millisecondes) conduisant à
l'état de transition, dont la durée de vie est de 10 fs, permet une recherche
dynamique vaste pour produire la minimisation simultanée des interactions
nécessaires à la formation d'état de transition.
6. Pour atteindre l'état de transition, une vibration promotionnelle impliquant
His257 provoque une compression des 3 oxygènes empilés, en même temps
que les interactions avec la purine et le groupe partant sont réduites au
minimum, aidant ainsi le départ de la purine (Fig. 6b).
7. Le ribocation, ainsi formé, est attiré vers l'anion phosphate pour achever les
coordonnées de réaction (Fig. 6c-d). Les interactions ponts hydrogènes et
ioniques entre l'enzyme et le phosphate, qui sont plus de 9, contribuent
également à coordonner la réaction globale puisque le phosphate dans le site
actif est fortement polarisé.
La nature complexe de ce processus de transition de la barrière est
représentée par la distribution de probabilité en figure 7. Le processus implique
une durée de vie sensiblement plus longue que la réaction catalysée par la lactate
déshydrogénase. La durée de vie de l'état de transition (0,5 de probabilité) est
d'environ 10 fs. Ce temps est cependant trop court pour atteindre l'équilibre.
Bien que la durée de vie de l'état de transition soit d'environ 10 fs, le temps
des coordonnées de réaction est d'environ 50 fs. L'observation d’un état
ribocation symétrique de transition est cohérente avec l'analyse KIE.

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Figure 7.

Implications
• La perception conventionnelle d'un état de transition fortement lié et en
équilibre thermodynamique avec le complexe de Michaelis et ses produits n’est
pas conforme avec ces exemples.
• L'état de transition possède une durée de vie courte, il est beaucoup trop
court pour qu'il y ait un équilibre complet entre l'enzyme.
• Il n'existe aucune preuve d’un équilibré avec liaison forte lors du passage à
travers la barrière.
• La formation de l'état de transition par le PNP est mieux décrite en termes
de probabilité dynamique que par la chimie d'équilibre.

L'analyse des trajectoires réactives


1. La réaction chimique n’est pas le résultat d’une attaque nucléophile, mais
plutôt, la liaison glycosidique est d'abord brisée à l'aide d'une vibration
promotionnelle de la protéine.
2. La vibration promotionnelle de la protéine polarise la liaison C1’-N9 pour
former un bon groupe partant.
3. Après la scission de ce lien, des mouvements supplémentaires dans la protéine
déplacent le ribosyl vers le phosphate, rigidement tenu.
4. Il y a formation ensuite du produit ribose-1-P.

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Points importants:
• La dynamique protéique est au cœur de la réaction chimique, il n'y a pas
suffisant de temps pour établir un véritable équilibre dans la région de l'état de
transition, et les mécanismes chimiques sont complètement distincts de la
réaction SN2 attendue en solution organique.
• La réaction n'est en aucune façon dépendante du mouvement du
nucléophile, mais plutôt du déplacement de la protéine, qui, en deux étapes,
polarise d’abord la liaison glycosidique afin de faciliter le départ du groupe
partant, et deuxièmement, amène la rotation du ribosyl vers un phosphate
verrouillé en place.
• Compte tenu du temps extrêmement court du passage à travers la
barrière, et que les vibrations promotionnelles qui permettent le passage sont de
l'ordre des picosecondes ou moins, pourquoi l'enzyme ne prend-elle pas dans
l‘ordre de la milliseconde pour un cycle catalytique?
• Ainsi, la question n'est pas pourquoi l'enzyme est si rapide, mais plutôt,
pourquoi est-elle si lente? La compréhension de ce mystère permettra d’élucider
la nature de la barrière de la réaction catalysée par une enzyme.

Comment cette analyse de la catalyse impacte la conception d'inhibiteurs


ciblant l’état de transition?
- Cela ne l’affecte pas.
• Les inhibiteurs de l'état de transition captent les fluctuations dynamiques
qui existent pour faciliter le passage à travers la barrière et les transforment en un
état thermodynamiquement stable.
• Les analogues d'état de transition sont des molécules stables, capables de
figer le mouvement dynamique de l'état de transition enzymatique.
• Le potentiel dynamique utilisé par la catalyse est transformé en énergie
thermodynamique, permettant ainsi la formation de complexes enzyme-
inhibiteur de longue durée de vie.

Comment ces déplacements sur une large échelle de temps peuvent-ils être
couplés en catalyse ?
Les enzymes sont impliquées dans une exploration complexe et stochastique à
travers l’espace-temps. Les mouvements configurationnels lents (microseconde à
la milliseconde) sont connus pour être vitaux pour l'activité enzymatique.

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‒ Ces déplacements comprennent les mouvements des boucles et des
domaines.
Ce qui devient de plus en plus évident, c’est qu’alors même que ces
mouvements lents sont exécutés, il se produit simultanément une recherche à
travers des dynamiques beaucoup plus rapides.
La thermodynamique associée à la catalyse n'est pas celle d'une liaison forte à
l’état de transition, mais peut être considérée comme une recherche de
probabilité dans l'espace configurationel où la chimie réactionnelle devient
possible.
Cette analyse laisse présager que les implications seront importantes pour la
conception d’enzymes artificielles, ou même la modification enzymatique.
‒ Des déplacements petits et subtils du squelette de la protéine, et même des
résidus qui sont éloignés du site catalytique, sont importants dans la fonction
de catalyseur.
‒ Les anticorps catalytiques ou sites actifs artificiels sont insuffisants pour
accomplir le type d'augmentation de la vitesse que l'évolution a sélectionné
pour les enzymes.
‒ Les nouveaux principes de conception intégrant les contributions de la
dynamique à la catalyse sont nécessaires pour réaliser les mouvements subtils
avec un ‘timing’ exquis nécessaire à la catalyse de haute efficacité.
Des fluctuations conformationnelles d'une enzyme
Le panneau ici-bas montre le regroupement des conformations uniquement celles
qui possèdent une distance donneur – accepteur étroite permettant ainsi le
transfert d’un hydrogène.

Conformations regroupés selon l'analyse


topologique après identification des
conformations stables à faible distance
donneur-accepteur. 94 structures distinctes
réparties en quatre grappes.

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Figure 8. Superposition des résidus du site actif
représentant les conformations provenant des 4
grappes. Résidus appartenant à la même
conformation sont représentées avec la même
couleur. Au haut de l'image, la boucle du site actif
est montré (résidus 96-106, ses résidus 100 et 106
sont présentés explicitement) Les quatre résidus
au fond de la figure sont liés les uns aux autres par
un simple déplacement. Cependant, les résidus
importants His193, Arg106, Gln100 et Asp194
sont poussés par la boucle du site actif (qui a une
position différente fermés dans chacune des
quatre conformations), et leur agencement
géométrique est différent d'une manière non
négligeable parmi les quatre conformations.

La surface réelle d'énergie potentielle d'une protéine repliée est très


complexe, et toutes les conformations ne sont pas directement liées à la catalyse.
‒ Dans le cas de la LDH la vibration promotionnelle, qui fait partie des
coordonnées de réaction, ne sera pas efficace à moins que le donneur et
l'accepteur, le cofacteur NAD et le substrat, soient assez proches les uns des
autres. Sinon les vibrations de faible amplitude promotionnelle ne pourront
être efficaces.
‒ Seulement une petite minorité
de conformations conservent
cette distance étroite entre les
donneurs et les accepteurs.
‒ Afin de comprendre la
dynamique, la voie de l'énergie
potentielle minimale entre deux
grappes de configurations ayant
cette distance étroite a été
analysée. Un graphique Figure 9
représentatif de l’énergie
potentielle est montré figure. 9. Figure 9. La voie de l'énergie potentielle minimale entre
deux conformations ayant une petite distance entre
donneur et accepteur.

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Le graphique de l'énergie libre résultant de la transformation entre les deux
grappes de configurations présentées dans la figure 9 est montré en figure 10.

Figure 10

Figure 10. Le profil de l'énergie libre correspondant à la transformation de


conformation entre les deux grappes des états enzymatiques (C et D) ayant la
distance entre le donneur et l’accepteur représentée à la figure 9.
À première vue, ce résultat est très étonnant, le minimum d'énergie libre est
en fait entre les deux minima potentiels ! Ce résultat semble paradoxal puisque
les points indiqués par les flèches, qui sont dans des potentiels énergétiques
minimums dans le haut de la figure 9, ont d'énergie libre plus élevée que le point
au milieu de l'énergie potentielle barrière, représentée dans la partie supérieure
de la figure 9. L'explication de ce résultat est qu'il y a très peu de conformations à
courte distance donneur - accepteur. Il s'agit d'une contribution entropique aux
conformations rares, celles ayant une distance de donneur - accepteur court, qui
résulte dans une grande énergie libre.
La figure 10 montre que le minimum d'énergie libre qui permettra à la
vibration promotionnelle d’être efficace (petite distance accepteur donneur) est
10 - 20 kcal par mole.
 La présence d’une barrière d'énergie libre d'origine entropique associes avec
ces conformations compétentes (petite distance donneur-accepteur) suggère

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qu’une description appropriée de la catalyse de cette enzyme est une
recherche de ces conformations rares par l’enzyme, suivie par l'événement
réactionnel qui est assisté par des déplacements protéiques rapides à l’échelle
femto-seconde.
 Cette vue est très différente de celle de la catalyse standard.
Cette image de la catalyse enzymatique ne nie aucunement l'importance des
effets tels que la stabilisation électrostatique dans des réactions dans lesquelles
un état de transition développe une charge significative; les structures de
stabilisation les plus chargées auront moins d'obstacles.

Récapitulation
• Les calculs montrent que les fluctuations protéiques se produisent sur une
échelle de temps très rapide – picosecondes – et ils sont centraux au
mécanisme chimique dans les cas de LDH et de PNP.
• Les conformations de protéines qui créent des distances donneur /
accepteur (substrat / cofacteur) qui sont suffisamment petites sont assez
rares; ces conformations permettent aux "vibrations promotionnelles"
d’être efficaces lors de rupture / formation de liaison.
• Les réarrangements conformationnels lents vers des bassins potentiels
stables dans lequel les distances donneur / accepteur sont courtes
représentent des transformations à des états de haute énergie libre.
• Originellement, on pensait l'enzyme capable de réduire les barrières
d'énergie libre pour achever l’état de transition.
• Plus récemment, il a été imaginé que le rôle de l'enzyme est de rendre les
barrières plus minces, et ainsi de favoriser l’effet tunnel.
• Des calculs très récents indiquent que le rôle dominant de l'enzyme est
d’effectuer des recherches stochastiques à travers l'espace
conformationnel afin de minimiser une barrière, et les énergies libres
mesurées seront un reflet du profil de probabilité de cette exploration.

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Références

1. Saen-Oon S, Quaytman-Machleder S, Schramm VL, Schwartz SD. (2008) Atomic


detail of chemical transformation at the transition state of an enzymatic reaction.
Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 16543-8.
2. Schwartz SD, Schramm VL. (2009) Enzymatic transition states and dynamic
motion in barrier crossing. Nat Chem Biol. 5, 551-8.
3. Machleder SQ, Pineda ET, Schwartz SD. (2010) On the Origin of the Chemical
Barrier and Tunneling in Enzymes. J Phys Org Chem. 23, 690-695.
4. Pineda ET, Antoniou D, Schwartz SD. Slow Conformational Motions That Favor
Sub-picosecond Motions Important for Catalysis (2010) J. Phys. Chem. B, 114,
15985–15990

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